CN116064435A - 姜黄素还原酶CfcurA、编码基因及其应用 - Google Patents

姜黄素还原酶CfcurA、编码基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种姜黄素还原酶CfcurA及其编码基因，以及其在微生物催化制备四氢姜黄素中的应用。所述姜黄素还原酶CfcurA氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，其编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种姜黄素还原酶CfcurA及其编码基因，可用于酶法催化生产四氢姜黄素，该方法转化率较高，选择性较好，可在24h内催化20g/L的姜黄素生成16.4g/L的四氢姜黄素，具有较好应用前景。

Description

姜黄素还原酶CfcurA、编码基因及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种姜黄素还原酶CfcurA及其编码基因，以及其在微生物催化制备四氢姜黄素中的应用。
(二)技术背景
四氢姜黄素(Tetrahydrocurcumin，简称THC)是姜黄素在人体内代谢的主要产物之一，可由姜黄素加氢还原得到，具有多种生物学活性。其在稳定性、水溶解性和生物利用度等方面优于姜黄素，是一种天然功能性美白原料，其结构式如图1所示。THC具有抑制酪氨酸酶的强烈活性，能抑制黑色素的生成，美白效果优于熊果苷，抗氧化性能力高于姜黄素，能有效抑制氧自由基的生成并能清除已经形成的自由基，被广泛用于美白、祛斑、抗氧化的各类护肤品中。它同时还具有抗肿瘤、消炎、抗糖尿病、治疗神经性疾病等功效。
目前四氢姜黄素的合成方法主要有生物合成法和化学合成法。传统化学法制备THC的方法主要是通过姜黄素催化氢化得到，其收率较低，选择性较差，副产物复杂，主要副产物为六氢姜黄素和八氢姜黄素，产物纯化较困难。生物合成法是通过姜黄根茎中的内生真菌转化还原姜黄素而合成四氢姜黄素的研究开始被关注的(Chem Pharm Bull，2011，59，1042-1044)，但该方法转化的效率并不高，不适合放大生产。也有报道采用土壤或粪便中分离的酵母、丝状真菌和细菌等进行全细胞的一步生物转化法，比如库德里阿兹氏毕赤酵母、链格孢菌、短刺小克银汉霉、短密青霉、米根霉以及一些肠道微生物如大肠杆菌、弗格森埃希菌和巨大芽孢杆菌等等(J Agri Food Chem 2017,65,3305-3310；Appl BiochemBiotechnol 2013,170,1026-1037；食品与发酵工业,2019,45,45-51)。虽然这些微生物具备一步发酵法还原姜黄素而合成四氢姜黄素的能力，但也存在副产物复杂的问题，需通过基因工程改造从而提高其还原产物专一性的性能。此外，也有研究证实了一些动物细胞和微生物细胞中来源的酶，具有将姜黄素还原并生成四氢姜黄素的能力，这些酶包括马肝脱氢酶、大鼠肝脏细胞来源的脱氢酶、大肠杆菌和创伤弧菌来源的一些氧化还原酶包括姜黄素还原酶CurA等(Proc Natl Acad Sci USA，2011，108，6615-6620；J Agri Food Chem2006,54,756-764；)。酶催化转化具备产物相对专一的特点，且能实现一步生物转化合成，所以，生物酶法制备THC具备一定的优势。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种姜黄素还原酶CfcurA及其编码基因，以及其在微生物催化制备四氢姜黄素中的应用，实现了生物酶法高效生产四氢姜黄素。
本发明采用的技术方案是：
一种姜黄素还原酶CfcurA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还涉及编码所述姜黄素还原酶CfcurA的基因。优选的，所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还涉及含有所述编码基因的载体和重组基因工程菌。所述重组基因工程菌构建方法为：提取质粒pET28a，经过EcoRI/NdeI酶切后，将线性化质粒与克隆的姜黄素还原酶基因连接克隆到质粒pET28a上，获得重组质粒pET28a-CfcurA，将获得的重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组菌株。
本发明还涉及所述基因工程菌在微生物催化制备四氢姜黄素中的应用。
具体的，所述应用为：构建含有所述编码姜黄素还原酶基因的重组基因工程菌，以所述基因工程菌经发酵培养获得的菌体或者菌体经破碎获得的含酶制剂为催化剂，以姜黄素为底物，进行催化反应制得所述四氢姜黄素。
所述催化反应是在NAD(P)+/NAD(P)H辅酶循环系统协同作用下进行，所述辅酶循环系统可以选自葡萄糖脱氢酶/葡萄糖系统、甲酸脱氢酶/甲酸、醇脱氢酶/异丙醇等等，优选的辅酶循环系统为醇脱氢酶/异丙醇系统，其协同姜黄素还原酶的反应过程如图2所示。
本发明中，添加常用的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)来源的醇脱氢酶LbADH(J.Mol.Biol.(2005)349,801–813)和异丙醇作为辅酶NAD(P)+/NAD(P)H循环系统，并添加0.05-2.0mmol/L的NAD(P)+(优选0.2mmol/L的NADP+)作为辅酶因子。优选以姜黄素为反应底物，添加吐温-80为助溶剂，充分溶解底物后获得催化反应体系，在20～40℃(优选30℃)的搅拌条件下进行反应。
所述的催化反应体系中，细胞密度为5～50(优选细胞密度为20)，姜黄素添加量为1～50g/L(优选添加量为10g/L)，助溶剂吐温-80添加量为0.05％～5％(优选添加量为0.15％)，异丙醇的添加量为0.5％～5％(v/v)(优选添加量为3％，v/v)。
所述姜黄素还原酶的重组大肠杆菌工程菌可按如下方法制备：(1)首先进行基因扩增和表达菌株构建，将分离自生物肥料样本中的弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii IEF113)基因组DNA的基因组DNA作为模板，经过PCR扩增获得姜黄素还原酶的基因后，克隆至大肠杆菌表达质粒pET28a上，构建含姜黄素还原酶基因的重组菌株。将菌株进行摇瓶发酵获得发酵液，接种在含有50μg/mL卡那霉素的种子培养基中，37℃，200rpm培养到对数生长中期，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaHPO4·12H2O 8.9g/L、KH2PO4 3.4g/L、NH4Cl 2.67g/L、Na2SO4 0.71g/L、MgSO4·7H2O0.49g/L，溶剂为去离子水，pH7.0。将新鲜种子液以体积浓度1％的接种量接种到含卡那霉素50μg/mL的发酵培养基中，在37℃培养4h，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，在22-24℃继续培养12h，即获得含姜黄素还原酶细胞的发酵液。取发酵液离心，收集湿菌体细胞，用100mmol/L的磷酸缓冲液重悬菌体，采用高压细胞匀浆仪破碎细胞后，得到粗酶液，即为含姜黄素还原酶的细胞破碎液。所述发酵培养基质量终浓度组成：10g/L的蛋白胨、5g/L的酵母提取粉、15g/L甘油、9g/L Na2HPO4、3.4g/L KH2PO4、3g/L NH4Cl、0.71g/LNa2SO4、5g/LMgSO4，溶剂为去离子水，pH6.5～7.5。
进一步，所述的NAD(P)+/NAD(P)H辅酶循环系统为常用的辅酶循环系统，优选短乳杆菌(Lactobacillus brevis)来源的醇脱氢酶LbADH和异丙醇。醇脱氢酶LbADH粗酶液按如下方法制备：取出甘油管中冷冻保藏的含LbADH酶的重组大肠杆菌工程菌E.coli IEF-LbADH(CN112143764A)，经过含有50μg/mL卡那霉素LB平板划线活化。挑取单菌落接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养至对数生长中期，获得种子液。将新鲜种子液以体积浓度1％的接种量接种到含卡那霉素50μg/ml的发酵培养基中，在30～37℃培养4h，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，在22～25℃继续发酵12～18h，取发酵液离心，收集湿菌体细胞，用100mmol/L的磷酸缓冲液重悬菌体，采用高压细胞匀浆仪破碎细胞后，得到粗酶液。所述种子培养基与发酵培养基终浓度组成同上。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种姜黄素还原酶CfcurA及其编码基因，可用于酶法催化生产四氢姜黄素，该方法转化率较高，选择性较好，可在24h内催化20g/L的姜黄素生成16.4g/L的四氢姜黄素，具有较好应用前景。
(四)附图说明
图1四氢姜黄素的分子结构式。
图2姜黄素还原酶催化姜黄素生成四氢姜黄素过程。
图3四氢姜黄素标样的液相色谱图。
图4姜黄素与四氢姜黄素混标的液相色谱图。
图5CfcurA反应终点样品的液相色谱图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。
LB培养基：酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L，溶剂为去离子水，pH＝6.8-7.0。
发酵培养基：酵母粉12.0g/L、蛋白胨15.0g/L、Na2HPO4·12H2O 8.9g/L、KH2PO43.4g/L、NH4Cl 2.67g/L、Na2SO4 0.71g/L、MgSO4·7H2O 0.49g/L，溶剂为去离子水，pH＝6.8-7.0。
100mmol/L磷酸缓冲溶液(pH 6.5)：Na2HPO4·12H2O 33.9g/L，NaH2PO4·2H2O0.41g/L。
实施例1：不同来源的姜黄素还原酶重组表达菌株的构建
(1)姜黄素还原酶基因curA的扩增。
以来源于实验室大肠杆菌Escherichia coli K-12的基因组DNA、分离自生物肥料样本中的弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii IEF113)基因组DNA、分离自酵素发酵中的Kosakonia cowanii IEF58基因组DNA、实验室保藏的肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica)ATCC13076的基因组DNA、野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonascampestris pv.campestris)8004(Beijing)的基因组DNA、分离自土壤样本中的琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii)的基因组DNA分别作为模板，应用如表1所示的引物，采用南京诺唯赞生物科技有限公司的高保真酶Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase进行PCR扩增，得到相应的姜黄素还原酶基因curA的PCR扩增产物，其PCR扩增程序为：95℃，3min；95℃，15s；53℃，15s；72℃，3min；30个循环；72℃，5min；4℃保存。用PCR产物回收试剂盒将所得的PCR产物纯化。
(2)将目的基因克隆到pET28a质粒上，得到重组质粒，将重组质粒转化到表达宿主E.coli BL21(DE3)中，具体操作如下：
提取质粒pET28a，经过EcoRI/NdeI酶切后，采用DNA胶回收试剂盒纯化酶切后的线性化质粒。将已纯化的PCR产物和线性化质粒进行重组连接反应，随后转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞，取10μL的重组质粒，加入到100μL的E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰水浴中放置30min。42℃热激45s，冰水孵育3min。加入900μL不含抗生素的LB培养基，37℃孵育60min。取200μL菌液，均匀涂布在含有50mg/mL卡那霉素的LB平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。经过菌落PCR验证为阳性克隆后，经过含有50μg/mL卡那霉素的LB平板划线纯化和LB液体培养基的摇床培养，提取质粒，并酶切验证和测序验证，最终获得重组大肠杆菌E.coil IFE-EccurA、E.coil IFE-CfcurA、E.coil IFE-KccurA、E.coil IFE-SecurA、E.coil IFE-XcccurA、E.coil IFE-AjcurA，用于催化活性分析。
表1：不同来源curA基因扩增引物
Figure BDA0003983198400000051
Figure BDA0003983198400000061
实施例2：用于辅酶循环的醇脱氢酶LbADH的制备
姜黄素还原酶属于氧化还原酶，需要NADPH作为辅酶。应用辅酶NAD(P)+/NAD(P)H的循环系统，避免使用价格昂贵的NADH原料，改用价格相对较低的NAD(P)+为原料，且用量显著下降，降低生产成本。选择基于短乳杆菌(Lactobacillus brevis)来源的醇脱氢酶LbADH和异丙醇进行辅酶循环。将实验室保藏的含LbADH的重组大肠杆菌E.coli IEF-LbADH(CN112143764A)经过平板划线活化，挑取单菌落接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养至对数生长中期，获得种子液。
将新鲜种子液以体积浓度1％的接种量接种到含卡那霉素50μg/mL的发酵培养基中，在30-37℃培养4h，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，在22-25℃继续发酵12-18h，取发酵液离心，收集湿菌体细胞，用100mmol/L的磷酸缓冲液重悬菌体，采用高压细胞匀浆仪破碎细胞后，得到含LbADH粗酶液。
实施例3：诱导不同的重组大肠杆菌发酵表达姜黄素还原酶
将实施例1制备的不同的姜黄素还原酶的重组表达菌株，经过含有50μg/mL卡那霉素的LB平板划线活化，挑取单菌落接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养至对数生长中期，获得种子液。
将种子液以体积浓度5％的接种量接种到含卡那霉素50μg/mL的大肠杆菌发酵培养基中，37℃培养3h，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，控制发酵温度24℃，继续培养10h，获得发酵液。
将发酵液离心，用100mmol/L的磷酸缓冲液重悬菌体，采用高压细胞匀浆仪破碎细胞后，得到不同来源的姜黄素还原酶CurA的粗酶液。
实施例4：比较六种不同来源姜黄素酶催化姜黄素制备THC的活性
将上述的姜黄素还原酶CurA和醇脱氢酶LbADH的粗酶液用于酶法催化制备THC。催化反应体系如下：76％(v/v)的CurA粗酶液，19％(v/v)的LbADH粗酶液，10g/L姜黄素，0.2mmol/L的NADP+，5％的(v/v)异丙醇，0.15％的Tween 80。将上述10mL的反应液置于50mL的圆底烧瓶中，于30℃恒温水浴锅中磁力搅拌，反应12h。
将催化反应液用于HPLC分析，比较THC的产量，结果如表2所示，弗氏柠檬酸杆菌来源的姜黄素还原酶CfcurA对姜黄素的还原活性最高。
表2：不同来源的姜黄素还原酶对姜黄素的催化活性比较
Figure BDA0003983198400000071
液相色谱检测条件。样品前处理：在磁力搅拌的条件下，取500μL反应液于1.0mL的乙酸乙酯中萃取，12000rpm离心5min，取上层的乙酸乙酯溶液，并用氮吹除去乙酸乙酯后，用500μL色谱甲醇溶解；用0.22μm微孔滤膜过滤，将滤液加入液相样品瓶中，待液相检测分析。检测器：Agilent 1260高效液相色谱仪，色谱柱：Agilent Eclipse XDB-Cl8柱；柱温：30℃；流动相：C2H3N(乙腈)：H2O：CH3COOH(冰醋酸)＝45:55:0.01(体积比)；流速：1mL·min-1；检测器：紫外检测器；检测波长：280nm；进样量：10μL。底物姜黄素的出峰时间一般时间为13～14min，产物THC的出峰时间一般为5.3～5.4min和10～11min(具有酮式与烯醇式结构)的两个峰。图2为四氢姜黄素标样的HPLC色谱图。图3为姜黄素与四氢姜黄素混标的HPLC色谱图。
实施例5：CfcurA在制备四氢姜黄素的应用
(1)CfcurA与辅酶LbADH的发酵制备
将重组大肠杆菌E.coil IFE-CfcurA与重组大肠杆菌E.coli IEF-LbADH在分别在含有50μg/ml卡那霉素的种子培养基(同实施例3)中活化，37℃、200rpm培养至对数生长中期，获得种子液。
使用2L发酵罐分别制备E.coil IFE-CfcurA发酵液与E.coli IEF-LbADH发酵液。发酵条件控制如下：将新鲜培养的种子液以体积浓度5％的接种量接种到含50mg/L卡那霉素的大肠杆菌发酵培养基中；30℃培养4h，开始补加终浓度为40g/L的甘油，发酵到4.5h，开始补加终浓度为20g/L的乳糖，控制发酵温度为23℃，溶解氧DO控制大于20％，用25％的氨水控制发酵pH6.8，继续发酵12h，获得发酵液，分别记为CfcurA发酵液和LbADH发酵液。
CfcurA粗酶液与LbADH粗酶液的制备：4000×g，4℃下，分别离心CfcurA的发酵液与LbADH的发酵液收集细胞；用100mmol/L PBS缓冲液(pH6.5)分别重新悬浮离心收集的细胞，控制细胞悬浊液的OD600为40；采用高压细胞匀浆仪破碎细胞后，分别得到CfcurA的粗酶液与LbADH的粗酶液，需尽快用于催化反应，避免长时间保存。
(2)底物添加量为10g/L时四氢姜黄素的制备
取16mL的CfcurA粗酶液到50mL的圆底烧瓶中，再加入4mL的LbADH粗酶液与1mL的异丙醇，0.15％的Tween 80和终浓度为0.2mmol/L的NADP+，最后加入0.2g的姜黄素，即底物投料量为10g/L。在30℃，500rpm磁力搅拌下进行催化反应，催化24h后结束反应。取0.2mL的反应液到1mL的乙酸乙酯中，12000rpm离心5min，取上层的乙酸乙酯溶液，用氮吹除去乙酸乙酯，用1mL色谱甲醇溶解后经0.22μm微孔滤膜过滤，将滤液加入液相样品瓶中，待液相检测分析。检测器：Agilent 1260高效液相色谱仪，色谱柱：Agilent Eclipse XDB-Cl8柱；柱温：30℃；流动相：C2H3N(乙腈)：H2O：CH3COOH(冰醋酸)＝45:55:0.01(体积比)；流速：1mL·min-1；检测器：紫外检测器；检测波长：280nm；进样量：10μL。底物姜黄素的出峰时间一般时间为13-14min，产物THC的出峰时间一般为5.2～5.3min、10～11min(具有酮式与烯醇式结构)。反应16h后，底物姜黄素的转化率大于98％，根据HPLC色谱峰面积计算四氢姜黄素产量约为8.9g/L，含有少量的二氢姜黄素。
(3)底物添加量为20g/L时四氢姜黄素的制备
取16mL的CfcurA粗酶液到50mL的圆底烧瓶中，再加入4mL的LbADH粗酶液与1mL的异丙醇，0.15％的Tween 80和终浓度为0.2mmol/L的NADP+，最后加入0.4g的姜黄素，即底物投料量为20g/L。在30℃，500rpm磁力搅拌下进行催化反应，催化24h后结束反应，进行HPLC分析，结果如图5所示，底物姜黄素的转化率为90.3％，四氢姜黄素产量为16.4g/L，含有一定量的二氢姜黄素。
(4)底物添加量为30g/L时四氢姜黄素的制备
取16mL的CfcurA粗酶液到50mL的圆底烧瓶中，再加入4mL的LbADH粗酶液与1mL的异丙醇，0.15％的Tween 80和终浓度为0.2mM的NADP+，最后加入0.6g的姜黄素，即底物投料量为30g/L。在30℃，500rpm磁力搅拌下进行催化反应，催化48h后结束反应。进行液相分析，结果表明底物姜黄素的转化率为76.3％，四氢姜黄素产量为20.4g/L，同时含有一定量的二氢姜黄素。
因此，底物添加浓度以10～20g/L为宜，优选为10g/L。

Claims (7)

1.一种姜黄素还原酶CfcurA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.编码权利要求1所述姜黄素还原酶的基因CfcurA。
3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.含有权利要求2所述编码基因的载体。
5.含有权利要求2所述编码基因的重组基因工程菌。
6.权利要求5所述基因工程菌在微生物催化制备四氢姜黄素中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用为：构建含有所述编码姜黄素还原酶基因的重组基因工程菌，以所述基因工程菌经发酵培养获得的菌体或者菌体经破碎获得的含酶制剂为催化剂，以姜黄素为底物，进行催化反应制得所述四氢姜黄素。
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