CN112662637B - 一种甲酸脱氢酶突变体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甲酸脱氢酶突变体及其制备方法和应用，属于生物工程领域。甲酸脱氢酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。将甲酸脱氢酶突变体的目的基因导入大肠杆菌获得含有该基因的基因工程菌，通过培养该基因工程菌和优化发酵工艺，实现重组甲酸脱氢酶的制备，并将其应用于生物催化反应制备(3R,5R)‑3,5‑二羟基己酸酯类化合物。本发明提供了一种催化活性和酶稳定性均较好的甲酸脱氢酶突变体，可用于(3R,5R)‑3,5‑二羟基己酸酯类化合物的合成，能够大幅度提高底物的转化率，得到高光学纯度的产品，极大地降低了医药中间体的生产成本。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种甲酸脱氢酶突变体及其制备方法和应用。
背景技术
羰基还原酶在医药中间体手性还原反应中具有广泛应用，羰基还原酶催化还原酮基制备手性醇的过程中绝大多数需要辅酶NADPH/NADH提供H+，但因辅酶价格昂贵，从而限制了羰基还原酶应用于生产，因此，构建高效、经济的辅酶再生体系可促进羰基还原酶应用于医药中间体手性醇的生产中，能够大幅度降低生产成本。
甲酸脱氢酶(FDH)属于D-2-羟基酸脱氢酶类，根据其四级结构，辅基的构象和类型以及底物特异性的区别，可以分为NAD+依赖型或NADP+依赖型。甲酸脱氢酶可以将甲酸氧化成CO2，同时催化NADP+还原成NADPH，实现辅酶循环。
通用的葡糖脱氢酶酶活性高，辅酶循环应用最为广泛，葡糖脱氢后的副产物葡糖氢钠，同时反应体系中有葡糖的残留，从而增大废水处理的压力。甲酸脱氢酶脱氢后，副产物为二氧化碳，不会对增加废水处理量，且反应条件温和，对环境友好，是适合应用于生产的辅酶循环酶。但是现有的甲酸脱氢酶存在转化率欠佳、所得产品的光学纯度不高等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种甲酸脱氢酶突变体。
本发明的另一目的是提供一种甲酸脱氢酶突变体的制备方法。
本发明的重要目的是提供一种甲酸脱氢酶突变体的应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种甲酸脱氢酶突变体，该甲酸脱氢酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。该甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还涉及一种含有上述甲酸脱氢酶突变体核苷酸序列的重组表达载体。
本发明还涉及一种一种能够表达上述甲酸脱氢酶突变体的基因工程菌。
本发明的甲酸脱氢酶突变体可通过甲酸脱氢酶重组表达工程菌发酵制得，具体步骤为：通过易错PCR方法对一株野生酵母菌株进行突变，获得甲酸脱氢酶突变体的目的基因，将目的基因导入表达质粒的EcoR I和Hind III酶切位点得到重组表达质粒，再将重组表达质粒转入E.coli DH5α感受态，挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体，最后将重组表达载体转入宿主细胞中，得到甲酸脱氢酶重组表达工程菌，发酵培养，离心收集菌体，洗涤并重悬，超声破碎，获得甲酸脱氢酶突变体粗酶液。
本发明中所指的野生酵母菌株(又称野生型FDH菌株)的氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示，该野生脱氢酶氨基酸NCBI登录号为OWB83932.1。
本发明中的表达质粒可选用pET或pRSFDuet-1。
本发明中的宿主细胞可选用大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。
本发明的甲酸脱氢酶突变体可应用在生物催化反应制备(3R,5R)-3,5-二羟基己酸酯类化合物方面。
一种应用本发明的甲酸脱氢酶突变体合成(3R,5R)-3,5-二羟基己酸酯类化合物的步骤包括：以化合物II为底物，在酮羰基还原酶(又称重组酮还原酶)、辅酶/辅酶循环氢供体NADP+/NADPH和甲酸脱氢酶突变体的存在下，生物催化反应生成(3R,5R)-3,5-二羟基己酸酯类化合物的合成，合成路线如下：
其中，Rl为氰基或氨基，R2为C1-5烷基。
在一种优选方案中，Rl为氰基或氨基，R2为叔丁基、甲基或乙基。
在上述步骤的一种具体方案中，需要先将酮羰基还原酶、甲酸脱氢酶、甲酸钠、NADP+/NADPH依次溶解于生理盐水，然后加入底物化合物Ⅱ的乙醇溶液，于搅拌下进行常温反应即可。
在一种优选方案中，(3R,5R)-3,5-二羟基己酸酯类化合物包括：(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯、(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸甲酯、(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸乙酯、(3R,5R)-6-氨基-3,5-二羟基己酸叔丁酯等。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供了一种催化活性和酶稳定性均较好的甲酸脱氢酶突变体，可用于(3R,5R)-3,5-二羟基己酸酯类化合物的合成，能够大幅度提高底物的转化率，得到高光学纯度的产品，极大地降低了医药中间体的生产成本。
附图说明
图1是重组PRSFDuet-1质粒的构建示意图；
图2是野生型FDH菌株氨基酸序列与甲酸脱氢酶突变体氨基酸序列比对图；
图中，Query为甲酸脱氢酶突变体序列，Sbjct为野生型FDH菌株序列。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体的实施例和附图对本发明进行进一步的阐述。
实施例1
步骤1：甲酸脱氢酶重组基因工程菌的制备
甲酸脱氢酶基因来源于一株野生酵母菌株，野生脱氢酶氨基酸NCBI登录号为OWB83932.1(该野生型FDH菌株氨基酸序列如SEQ ID No.3所示)。将来源于酵母菌的甲酸脱氢酶基因通过易错PCR进行序列优化后，使用pRSFDuet-1作为表达质粒，双酶切位点为HindⅢ和EcoRI。
将重组表达质粒(图1)转入E.coli DH5α感受态，挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体，将重组表达载体载入E.coli BL21(DE3)细胞中，获得甲酸脱氢酶重组基因工程菌。
步骤2：甲酸脱氢酶突变体的制备
将甲酸脱氢酶重组基因工程菌接种到含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃培养16h，得到种子培养液。将种子培养液接种到含卡那霉素抗性的TB液体培养基中，接种量为含卡那霉素抗性的LB液体培养基体积的1％。然后置于37℃下培养至OD600值为0.8，加入终浓度为0.5mol/L的IPTG，置于18℃继续培养20h后，8000rmp，4℃下离心收集菌体，采用生理盐水将收集后菌株进行洗涤并重悬，通过超声波破碎仪进行破碎，超声破碎功率为120W，运行3S，间隔5S，共运行3min，获得甲酸脱氢酶突变体粗酶液(该突变型FDH的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示)，冻干后获得酶粉。
步骤3：甲酸脱氢酶突变体的应用
于250ml反应器中，加入60ml生理盐水，依次溶解800mg酮羰基还原酶粗酶(酮羰基还原酶来源为本公司保藏CCTCCM2012319菌种的基因工程菌BL21(DE3)KRED06自产)，86mg甲酸脱氢酶突变体酶粉，80mg甲酸钠，15mgNADP+/NADPH。1g底物化合物Ⅱ溶于6ml乙醇中，加入反应器，200rpm搅拌，于25℃下反应24h，得到化合物Ⅰ(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯。反应结果经HPLC检测，转化率89.90％，ee值99.9％。
其中，Rl为氰基，R2为叔丁基。
对比例1
步骤1：野生型甲酸脱氢酶的制备
将野生酵母菌株(野生脱氢酶氨基酸NCBI登录号为OWB83932.1)接种到含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃培养16h，得到种子培养液。将种子培养液接种到含卡那霉素抗性的TB液体培养基中，接种量为含卡那霉素抗性的LB液体培养基体积的1％。然后置于37℃下培养至OD600值为0.8，加入终浓度为0.5mol/L的IPTG，置于18℃继续培养20h后，8000rmp，4℃下离心收集菌体，采用生理盐水将收集后菌株进行洗涤并重悬，通过超声波破碎仪进行破碎，超声破碎功率为120W，运行3S，间隔5S，共运行3min，获得粗酶液，冻干后获得甲酸脱氢酶野生型酶粉。
步骤2：甲酸脱氢酶野生型的应用
于250ml反应器中，加入60ml生理盐水，依次溶解800mg酮羰基还原酶粗酶(酮羰基还原酶来源为本公司保藏CCTCCM2012319菌种的基因工程菌BL21(DE3)KRED06自产)，86mg步骤1制备的甲酸脱氢酶野生型酶粉，80mg甲酸钠，15mgNADP+/NADPH。1g底物(化合物Ⅱ)溶于6ml乙醇中，加入反应器，200rpm搅拌，于25℃下反应24h，得到化合物Ⅰ(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯。反应结果经HPLC检测，转化率60.87％，ee值80.3％。
其中，Rl为氰基，R2为叔丁基。
<110> 江苏阿尔法药业有限公司
<120> 一种甲酸脱氢酶突变体及其制备方法和应用
<160> 3
<210> 1
<211> 1095
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaaaattg ttctggttct gtatgatgca ggtaaacatg cagcagatga agaaaaactg 60
tatggctgca ccgaaaataa actgggtatt gcaaattggc tgaaagatca gggtcatgaa 120
ctgattacca ccagtgataa agaaggtggt aatagcgttc tggatcagca tattccggat 180
gccgatatta tcattaccac accgtttcat ccggcatata tcaccaaaga acgtatcgac 240
aaagccaaaa aactgaaact ggttgttgtt gccgttggta gtttcgatca tattgatctg 300
gattatatca atcagaccgg caaaaaaatc agcgtgctgg aagttaccgg tagcaatgtt 360
gttagcgttg cagaacatgt tgttatgacc atgctggttc tggtgcgcag gtattttgtt 420
ccggcacatg agcagattat taaccatgat tgggaagttg cagccattgc aaaagatgcc 480
tatgatattg aaggtaaaac cattgcaacc attggtgcag gtcgtattgg tggttatcgt 540
gttctggaac gtctggtaaa tccgtttaat ccgaaagaac tgctgtatta tgattatcag 600
gcactgccga aagatgccga agaagttggt gcccgtcgtg ttgaaaatat tgaagaactg 660
gttgcacagg ccgatattgt taccgttaat gcaccgctgc atgccggtac aaaaggtctg 720
attaacaaag agctgctgag aaacaagaaa ttcaaaggtg catggctggt taataccgca 780
cgtggtgcaa tttgtgttgc cgatgttgca gcagcactgg aaagcggtca gctgcgtggt 840
tatggtggtg atgttccgca gccagcatat ccgaaagatc atccgtggcg tgatatgcgt 900
aacaaatatg gtgccggtaa tgcaatgaca ccgcatagcg gtacaaccct ggatgcacag 960
acccgttatg cacagggcac caaaaacatt ctggaaagtt tttttaccgg caaattcgat 1020
tatcgtccgc aggatattat tctgctgaat ggtgaatatg tgaccaaagc ctatggcaaa 1080
cacgacaaaa aatga 1095
<210> 2
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Lys Ile Val Leu Val Leu Tyr Asp Ala Gly Lys His Ala Ala Asp
1 5 10 15
Glu Glu Lys Leu Tyr Gly Cys Thr Glu Asn Lys Leu Gly Ile Ala Asn
20 25 30
Trp Leu Lys Asp Gln Gly His Glu Leu Ile Thr Thr Ser Asp Lys Glu
35 40 45
Gly Gly Asn Ser Val Leu Asp Gln His Ile Pro Asp Ala Asp Ile Ile
50 55 60
Ile Thr Thr Pro Phe His Pro Ala Tyr Ile Thr Lys Glu Arg Ile Asp
65 70 75 80
Lys Ala Lys Lys Leu Lys Leu Val Val Val Ala Val Gly Ser Phe Asp
85 90 95
His Ile Asp Leu Asp Tyr Ile Asn Gln Thr Gly Lys Lys Ile Ser Val
100 105 110
Leu Glu Val Thr Gly Ser Asn Val Val Ser Val Ala Glu His Val Val
115 120 125
Met Thr Met Leu Val Leu Val Arg Arg Tyr Phe Val Pro Ala His Glu
130 135 140
Gln Ile Ile Asn His Asp Trp Glu Val Ala Ala Ile Ala Lys Asp Ala
145 150 155 160
Tyr Asp Ile Glu Gly Lys Thr Ile Ala Thr Ile Gly Ala Gly Arg Ile
165 170 175
Gly Gly Tyr Arg Val Leu Glu Arg Leu Val Asn Pro Phe Asn Pro Lys
180 185 190
Glu Leu Leu Tyr Tyr Asp Tyr Gln Ala Leu Pro Lys Asp Ala Glu Glu
195 200 205
Val Gly Ala Arg Arg Val Glu Asn Ile Glu Glu Leu Val Ala Gln Ala
210 215 220
Asp Ile Val Thr Val Asn Ala Pro Leu His Ala Gly Thr Lys Gly Leu
225 230 235 240
Ile Asn Lys Glu Leu Leu Arg Asn Lys Lys Phe Lys Gly Ala Trp Leu
245 250 255
Val Asn Thr Ala Arg Gly Ala Ile Cys Val Ala Asp Val Ala Ala Ala
260 265 270
Leu Glu Ser Gly Gln Leu Arg Gly Tyr Gly Gly Asp Val Pro Gln Pro
275 280 285
Ala Tyr Pro Lys Asp His Pro Trp Arg Asp Met Arg Asn Lys Tyr Gly
290 295 300
Ala Gly Asn Ala Met Thr Pro His Ser Gly Thr Thr Leu Asp Ala Gln
305 310 315 320
Thr Arg Tyr Ala Gln Gly Thr Lys Asn Ile Leu Glu Ser Phe Phe Thr
325 330 335
Gly Lys Phe Asp Tyr Arg Pro Gln Asp Ile Ile Leu Leu Asn Gly Glu
340 345 350
Tyr Val Thr Lys Ala Tyr Gly Lys His Asp Lys Lys
355 360
<210> 3
<211> 364
<212> PRT
<213> 酵母菌(Candida boidinii)
<400> 3
Met Lys Ile Val Leu Val Leu Tyr Asp Ala Gly Lys His Ala Ala Asp
1 5 10 15
Glu Glu Lys Leu Tyr Gly Cys Thr Glu Asn Lys Leu Gly Ile Ala Asn
20 25 30
Trp Leu Lys Asp Gln Gly His Glu Leu Ile Thr Thr Ser Asp Lys Glu
35 40 45
Gly Glu Thr Ser Glu Leu Asp Lys His Ile Pro Asp Ala Asp Ile Ile
50 55 60
Ile Thr Thr Pro Phe His Pro Ala Tyr Ile Thr Lys Glu Arg Leu Asp
65 70 75 80
Lys Ala Lys Asn Leu Lys Leu Val Val Val Ala Gly Val Gly Ser Asp
85 90 95
His Ile Asp Leu Asp Tyr Ile Asn Gln Thr Gly Lys Lys Ile Ser Val
100 105 110
Leu Glu Val Thr Gly Ser Asn Val Val Ser Val Ala Glu His Val Val
115 120 125
Met Thr Met Leu Val Leu Val Arg Asn Phe Val Pro Ala His Glu Gln
130 135 140
Ile Ile Asn His Asp Trp Glu Val Ala Ala Ile Ala Lys Asp Ala Tyr
145 150 155 160
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165 170 175
Tyr Arg Val Leu Glu Arg Leu Leu Pro Phe Asn Pro Lys Glu Leu Leu
180 185 190
Tyr Tyr Asp Tyr Gln Ala Leu Pro Lys Glu Ala Glu Glu Lys Val Gly
195 200 205
Ala Arg Arg Val Glu Asn Ile Glu Glu Leu Val Ala Gln Ala Asp Ile
210 215 220
Val Thr Val Asn Ala Pro Leu His Ala Gly Thr Lys Gly Leu Ile Asn
225 230 235 240
Lys Glu Leu Leu Ser Lys Phe Lys Lys Gly Ala Trp Leu Val Asn Thr
245 250 255
Ala Arg Gly Ala Ile Cys Val Ala Glu Asp Val Ala Ala Ala Leu Glu
260 265 270
Ser Gly Gln Leu Arg Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro
275 280 285
Ala Pro Lys Asp His Pro Trp Arg Asp Met Arg Asn Lys Tyr Gly Ala
290 295 300
Gly Asn Ala Met Thr Pro His Tyr Ser Gly Thr Thr Leu Asp Ala Gln
305 310 315 320
Thr Arg Tyr Ala Glu Gly Thr Lys Asn Ile Leu Glu Ser Phe Phe Thr
325 330 335
Gly Lys Phe Asp Tyr Arg Pro Gln Asp Ile Ile Leu Leu Asn Gly Glu
340 345 350
Tyr Val Thr Lys Ala Tyr Gly Lys His Asp Lys Lys
355 360
Claims (10)
1.一种甲酸脱氢酶突变体，其特征在于，该甲酸脱氢酶突变体的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
2.根据权利要求1所述的甲酸脱氢酶突变体，其特征在于，该甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.一种含有权利要求1所述甲酸脱氢酶突变体核苷酸序列的重组表达载体。
4.一种表达权利要求1所述甲酸脱氢酶突变体的基因工程菌。
5.一种权利要求1所述的甲酸脱氢酶突变体的制备方法，其特征在于，所述甲酸脱氢酶突变体通过甲酸脱氢酶重组表达工程菌发酵制得，具体步骤为：通过易错PCR方法对一株野生酵母菌株进行突变，获得甲酸脱氢酶突变体的目的基因，将目的基因导入表达质粒的EcoR I和Hind III酶切位点得到重组表达质粒，再将重组表达质粒转入E.coli DH5α感受态，挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体，最后将重组表达载体转入宿主细胞中，得到甲酸脱氢酶重组表达工程菌，发酵培养，离心收集菌体，洗涤并重悬，超声破碎，获得甲酸脱氢酶突变体粗酶液。
6.根据权利要求5所述的甲酸脱氢酶突变体的制备方法，其特征在于，所述野生酵母菌株的 甲酸脱氢酶 的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，所述的表达质粒为pET或pRSFDuet-1。
7.根据权利要求5所述的甲酸脱氢酶突变体的制备方法，其特征在于，所述的宿主细胞为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。
8.权利要求1所述的甲酸脱氢酶突变体在生物催化反应制备(3R,5R)-3,5-二羟基己酸酯类化合物方面的用途。
9.一种权利要求1所述的甲酸脱氢酶突变体的应用，其特征在于，所述甲酸脱氢酶突变体用于化合物I的合成，其步骤为：以化合物II为底物，在酮羰基还原酶、辅酶/辅酶循环氢供体NADP+/NADPH和甲酸脱氢酶突变体的存在下，生物催化反应生成化合物I，合成路线如下：
其中，Rl为氰基或氨基，R2为C1-5烷基。
10.根据权利要求9所述的甲酸脱氢酶突变体的应用，其特征在于R2为叔丁基、甲基或乙基。
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| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 223800 No.5 Yanshan Road, eco Chemical Technology Industrial Park, Suqian City, Jiangsu Province Applicant after: Jiangsu alpha Pharmaceutical Co.,Ltd. Address before: 223800 No.5 Yanshan Road, eco Chemical Technology Industrial Park, Suqian City, Jiangsu Province Applicant before: JIANGSU ALPHA PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. |
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| CB02 | Change of applicant information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |