CN110628849A - 氧化态烟酰胺类辅因子再生的方法 - Google Patents

氧化态烟酰胺类辅因子再生的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公布了一种氧化态烟酰胺类辅因子再生的方法，利用黄素还原酶、核黄素或者核黄素‑5‑磷酸(FMN)作用下，将还原态烟酰胺辅因子氧化为氧化态。本方法转化效率高，添加的共底物为催化剂量，并且共底物价格低廉，对环境影响小，为氧化还原酶的反应中氧化态烟酰胺辅因子再生提供了一条高效的途径。

Description

氧化态烟酰胺类辅因子再生的方法
技术领域
本发明属于生物催化领域，尤其涉及氧化还原酶的烟酰胺类辅因子再生的方法。
背景技术
氧化还原酶是继水解酶之后工业运用最广泛的酶，氧化还原酶可以氧化或者还原羟基、醛基、氨基、巯基等，相应地，氧化还原辅因子在反应中起传递还原当量氢、电子的作用。氧化还原辅因子主要包括烟酰胺类辅因子NAD(H)和NADP(H)、黄素类辅因子FMN/FAD、卟啉等。其中烟酰胺类辅因子中，大部分的氧化还原酶依赖NAD(H)，少部分氧化还原酶依赖NADP(H)。在氧化还原酶的转化过程中，需要与底物摩尔量相同的辅因子，但是烟酰胺类的辅因子价格昂贵，如果不能够原位使辅因子再生，则反应成本极高。通过辅因子再生不仅可以降低反应成本，驱动反应完成的同时也可简化产品的分离。
目前已知的报道中，能够具有潜在应用价值的实现氧化态辅因子NAD+，NADP+再生的方法主要为酶法，酶法再生由于选择性高、反应条件温和占据着主导地位。如利用α-酮戊二酸与谷氨酸脱氢酶偶联实现氧化态辅因子NADP+的再生(Sergio Riva, RobertoBovara,Piero Pasta,Giacomo Carrea J.Org.Chem.,1986,51,2902-2906)；利用丙酮酸与乳酸脱氢酶偶联实现氧化态辅因子NAD+的再生(Antjie Gupta,Anke Tschentscher,MariaBobkova EP2004838B1)。上述的酶方法需要加入α-酮戊二酸或者丙酮酸的摩尔量要高于所需转化的底物摩尔量，从而实现反应的完全进行。利用漆酶与Meldola’s Blue偶联实现氧化态辅因子NAD+的再生(Ferrandi Erica Elisa,Monti Daniela,Patel Ilabahen,KittlRoman,Haltrich Dietmar,Riva Sergio,Ludwig Roland Adv. Synth.Catal.2012,354,2821-2828，)但是该方法需要加入价格较为昂贵的Meldola’s Blue。如何能够开发一种高效的辅因子酶再生方法，能够利用催化量的底物，实现高浓度的目标底物转化仍然是急需解决的一个问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明利用黄素还原酶(FR)作为辅因子的再生酶、核黄素或核黄素-5-磷酸(FMN)作为共底物实现辅因子NAD+，NADP+的再生，该方法使用的黄素还原酶在pH 5.0-10.0范围内均能够保持高酶活，实现氧化态辅因子的再生。
本发明是通过利用如下技术方案实现的：
在反应体系中加入黄素还原酶，核黄素或者FMN，还原态辅因子即可转化为氧化态辅因子。
本发明提供了制备黄素还原酶制备的方法。
该制备方法包括以下步骤：(1)合成黄素还原酶基因并构建到pET21a表达载体上，获得带有目的酶基因的重组质粒。(2)将重组质粒转入宿主菌细胞(优选大肠杆菌BL21(DE3))，获得相应的工程菌株。(3)将上述的黄素还原酶基因构建到pET21a 表达载体上，获得带有目的酶基因的重组质粒(4)将重组质粒转入宿主菌细胞(优选大肠杆菌BL21(DE3))，获得相应的突变体工程菌株(5)将工程菌株接种至L-B培养基中，25℃培养16小时。(5)离心收集菌体，破菌留取上清液。
本发明还提供了利用黄素还原酶、核黄素或者FMN再生氧化态烟酰胺辅因子的方法。具体地，将黄素还原酶、核黄素或者FMN加入到还原态烟酰胺辅因子溶液中，即可以生成氧化态烟酰胺辅因子。
本发明的有益效果：本发明利用黄素还原酶的高活性，通过加入催化量的共底物核黄素或者FMN，还原态烟酰胺辅因子即可生成氧化态烟酰胺辅因子，从而实现氧化态烟酰胺辅因子的再生。本方法转化效率高，共底物用量少，并且操作简单方便、条件温和，适用于工业生产中氧化态辅因子的再生。
具体实施方式
下面的实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。
实施例1：黄素还原酶基因获得的
1.1黄素还原酶基因的合成及获得
黄素还原酶基因来源于Mycobacterium neoaurum的核黄素还原酶(MFR)(GenBank:WP_049744407.1)或者是来源于Escherichia coli的黄素还原酶(EFR)(GenBank:AUY29864.1)，根据大肠杆菌密码子偏好性对该基因优化后送公司合成，密码子优化后的基因，分别在5’端添加NdeI(CATATG)酶切位点、在3’端添加XhoI(CTCGAG) 酶切位点，克隆至PET21a载体上。
1.2重组质粒的转化
氯化钙法制备感受态大肠杆菌细胞。
将消化纯化后的PCR产物用化学转化的方法转入大肠杆菌中，转化过程为：
(1)取10μL重组质粒于50μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30min。
(2)42℃水浴热激90s，快速置于冰上1～2min。
(3)加入新鲜LB液体培养基600μL，于37℃振荡培养45～60min。
(4)取200μL菌液涂布于含有氨苄青霉素(1mg/mL)的LB固体培养基表面， 37℃培养12～16h至单菌落出现。
实施例2：黄素还原酶表达菌的构建及诱导表达
将消化纯化后的PCR产物用化学转化的方法转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中后，挑取单克隆至4mL含氨苄青霉素(1mg/mL)的LB培养基中，取新鲜菌液送测序公司测序，测序结果显示正确的表达菌。配置种子液50mL，培养基为LB 液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)，用接种环挑取基因工程菌单菌落接入培养基中，37℃，200rpm培养过夜。将过夜培养的种子液以1％的接种量转接到发酵培养基，25℃，200rpm培养20h。取发酵液5mL浓缩超声破菌后，检测脱水酶活力。
实施例3：黄素还原酶纯化
诱导表达后的发酵液6500rpm离心十分钟收集菌体，收集菌体用缓冲液(0.1mol/LpH 7.0磷酸钠缓冲液和0.5M NaCl)重悬洗涤一遍，采用同样方法离心缓冲液重悬，重悬液采用高压匀浆均质机进行破碎，破碎液6000rpm，4℃离心20min获得粗酶液，将获得的粗酶液采用His-Trap TM/FF亲和层析柱进行分离纯化，采用含咪唑的洗脱液 (0.1M磷酸钠、0.5MNaCl、0.25M咪唑，pH 7.0)，进行梯度洗脱，收集活性部分，采用SDS-PAGE检测酶蛋白纯度。
实施例4：黄素还原酶、核黄素或者FMN再生氧化态辅因子
在96孔板中加入适量的黄素还原酶，0.2mM FMN，0.5mM的NADH，检测在 340nm下的紫外吸收变化，获得MFR的比活为650U/mg，EFR的比活为480U/mg
实施例5：黄素还原酶、核黄素或者FMN再生氧化态辅因子的方法
在1mL反应体系中，加入鹅去氧胆酸(10mM)，7α-甾体脱氢酶(7α-HSDH)，辅因子NAD+(0.1mM)，黄素还原酶(MFR)，核黄素-5-磷酸(0.1mM)30℃反应， 12小时后检测，鹅去氧胆酸转化率>95％。
实施例6：黄素还原酶、核黄素或者FMN再生氧化态辅因子的方法
在1mL反应体系中，加入鹅去氧胆酸(10mM)，7α-甾体脱氢酶(7α-HSDH)，辅因子NAD+(0.1mM)，黄素还原酶(EFR)，核黄素-5-磷酸(0.1mM)30℃反应， 12小时后检测，鹅去氧胆酸转化率>95％。
实施例7：黄素还原酶、核黄素或者FMN再生氧化态辅因子的方法
在1mL反应体系中，加入鹅去氧胆酸(10mM)，7α-甾体脱氢酶(7α-HSDH)，辅因子NADH(0.1mM)，黄素还原酶(MFR)，核黄素-5-磷酸(0.1mM)30℃反应， 12小时后检测，鹅去氧胆酸转化率>95％。
实施例8：黄素还原酶、核黄素或者FMN再生氧化态辅因子的方法
在1L反应体系中，加入鹅去氧胆酸(10mM)，7α-甾体脱氢酶(7α-HSDH)，辅因子NAD+(0.05mM)，黄素还原酶(MFR)，核黄素-5-磷酸(0.1mM)30℃反应，
12小时后检测，鹅去氧胆酸转化率>95％。
实施例9：黄素还原酶、核黄素或者FMN再生氧化态辅因子的方法
在1L反应体系中，加入鹅去氧胆酸(10mM)，共表达了7α-甾体脱氢酶与黄素还原酶(MFR)的菌体，核黄素-5-磷酸(0.1mM)30℃反应，12小时后检测，鹅去氧胆酸转化率>95％。
实施例10：黄素还原酶、核黄素或者FMN再生氧化态辅因子的方法
在1L反应体系中，加入鹅去氧胆酸(10mM)，7α-甾体脱氢酶(7α-HSDH)的破菌液，黄素还原酶(MFR)的破菌液，核黄素-5-磷酸(0.1mM)30℃反应，12小时后检测，鹅去氧胆酸转化率>95％。
实施例11：黄素还原酶、核黄素或者FMN再生氧化态辅因子的方法
在1L反应体系中，加入鹅去氧胆酸(10mM)，7α-甾体脱氢酶(7α-HSDH)的破菌液，黄素还原酶(EFR)的破菌液，核黄素(0.1mM)30℃反应，12小时后检测，鹅去氧胆酸转化率>95％。
实施例12：黄素还原酶、核黄素或者FMN再生氧化态辅因子的方法
在1L反应体系中，加入鹅去氧胆酸(10mM)，7α-甾体脱氢酶(7α-HSDH)的破菌液，黄素还原酶(EFR)的破菌液，核黄素(0.1mM)，NADP+(0.1mM)30℃反应，12小时后检测，鹅去氧胆酸转化率>95％。
实施例13：黄素还原酶、核黄素或者FMN再生氧化态辅因子的方法
在1L反应体系中，加入鹅去氧胆酸(10mM)，7α-甾体脱氢酶(7α-HSDH)的破菌液，黄素还原酶(EFR)的破菌液，核黄素(0.1mM)，30℃反应，12小时后检测，鹅去氧胆酸转化率>95％。
实施例14：黄素还原酶、核黄素或者FMN再生氧化态辅因子的方法
在1L反应体系中，加入鹅去氧胆酸(10mM)，7α-甾体脱氢酶(7α-HSDH)的破菌液，黄素还原酶(EFR)的破菌液，核黄素(0.5mM)，30℃反应，12小时后检测，鹅去氧胆酸转化率>95％。
实施例15：黄素还原酶、核黄素或者FMN再生氧化态辅因子的方法
在1L反应体系中，加入鹅去氧胆酸(10mM)，7α-甾体脱氢酶(7α-HSDH)的破菌液，黄素还原酶(EFR)的破菌液，核黄素(0.01mM)，30℃反应，12小时后检测，鹅去氧胆酸转化率>95％。
实施例16：黄素还原酶、核黄素或者FMN再生氧化态辅因子的方法
在1L反应体系中，加入鹅去氧胆酸(10mM)，7α-甾体脱氢酶(7α-HSDH)的破菌液，黄素还原酶(EFR)的破菌液，核黄素-5-磷酸(0.1mM)30℃反应，12小时后检测，鹅去氧胆酸转化率>95％。
实施例17：黄素还原酶、核黄素或者FMN再生氧化态辅因子的方法
在1L反应体系中，加入鹅去氧胆酸(10mM)，7α-甾体脱氢酶(7α-HSDH)的破菌液，黄素还原酶(EFR)的破菌液，核黄素-5-磷酸(0.1mM)，NADP+(0.1mM) 30℃反应，12小时后检测，鹅去氧胆酸转化率>95％。
实施例18：黄素还原酶、核黄素或者FMN再生氧化态辅因子的方法
在1L反应体系中，加入鹅去氧胆酸(10mM)，7α-甾体脱氢酶(7α-HSDH)的破菌液，黄素还原酶(EFR)的破菌液，核黄素-5-磷酸(0.1mM)，30℃反应，12小时后检测，鹅去氧胆酸转化率>95％。
实施例19：黄素还原酶、核黄素或者FMN再生氧化态辅因子的方法
在1L反应体系中，加入鹅去氧胆酸(10mM)，7α-甾体脱氢酶(7α-HSDH)的破菌液，黄素还原酶(EFR)的破菌液，核黄素-5-磷酸(0.5mM)，30℃反应，12小时后检测，鹅去氧胆酸转化率>95％。
实施例20：黄素还原酶、核黄素或者FMN再生氧化态辅因子的方法
在1L反应体系中，加入鹅去氧胆酸(10mM)，7α-甾体脱氢酶(7α-HSDH)的破菌液，黄素还原酶(EFR)的破菌液，核黄素-5-磷酸(0.01mM)，30℃反应，12小时后检测，鹅去氧胆酸转化率>95％。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 1. 氧化态烟酰胺类辅因子再生的方法
<130> 20180306
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 161
<212> PRT
<213> Mycobacterium neoaurum
<400> 1
Met Ser Ala Thr Asp Leu Ser Pro Thr Ser Leu Arg Glu Ala Phe Gly
1 5 10 15
His Phe Pro Ser Gly Val Ile Ala Ile Ala Ala Glu Val Asp Gly Thr
20 25 30
Arg Val Gly Leu Ala Ala Ser Thr Phe Val Pro Val Ser Leu Glu Pro
35 40 45
Pro Leu Val Ala Phe Cys Val Gln Asn Ser Ser Thr Thr Trp Pro Lys
50 55 60
Leu Lys Asp Leu Pro Ser Leu Gly Ile Ser Val Leu Gly Glu Ala His
65 70 75 80
Asp Thr Ala Ala Arg Thr Leu Ala Ala Lys Thr Gly Asp Arg Phe Ala
85 90 95
Gly Leu Glu Thr Glu Ser Arg Asp Ser Gly Ala Val Phe Ile Asn Gly
100 105 110
Thr Ser Val Trp Leu Glu Ser Ala Ile Glu Gln Leu Val Pro Ala Gly
115 120 125
Asp His Thr Ile Val Val Leu Arg Val Ser Asp Ile Val Ile Asn Glu
130 135 140
Ala Val Pro Pro Ile Val Phe His Arg Ser Ala Phe Arg Lys Leu Gly
145 150 155 160
Ala
<210> 2
<211> 233
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 2
Met Thr Thr Leu Ser Cys Leu Val Thr Ser Val Gly Ala Ile Thr Ala
1 5 10 15
Thr Val Thr Ala Val Ala Ile Val Pro Ala Ala Ala Pro Ser Pro Ala
20 25 30
Ala Gly Gly Thr Leu Met Val Val Met Ala Gly Ala Ala Leu Ala Pro
35 40 45
Pro Ser Met Ala Ser Thr Pro Ala Gly Leu Gly Pro Ile Gly Leu His
50 55 60
Ile Gly Ala Ser Gly Ile Ala Leu Thr Ala Leu Ala Val Met Ala Ala
65 70 75 80
Ile Leu Leu Ala His Gly Ile Val Val Ala Ile Pro His Gly Gly Ala
85 90 95
Thr Leu Ala Ala Ala Gly Gly Ala Pro Met Ile Leu Ile Ala Gly Gly
100 105 110
Thr Gly Pro Ser Thr Ala Ala Ser Ile Leu Leu Thr Ala Leu Ala Ala
115 120 125
Ala Pro Ala Ala Ala Ile Thr Ile Thr Thr Gly Gly Ala Gly Gly Gly
130 135 140
His Leu Thr Ala Leu Cys Gly Leu Gly Ala Leu Ser Leu Leu His Pro
145 150 155 160
Gly Leu Gly Val Val Pro Val Val Gly Gly Pro Gly Ala Gly Thr Ala
165 170 175
Gly Ala Thr Gly Thr Val Leu Thr Ala Val Leu Gly Ala His Gly Thr
180 185 190
Leu Ala Gly His Ala Ile Thr Ile Ala Gly Ala Pro Gly Met Ala Leu
195 200 205
Ile Ala Ala Ala Leu Pro Cys Ser Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala
210 215 220
Leu Pro Gly Ala Ala Pro Ala Pro Ile
225 230

Claims (5)

1.氧化态烟酰胺类辅因子再生的方法，将黄素还原酶、核黄素或核黄素-5-磷酸(FMN)加入到可生成还原态烟酰胺辅因子溶液中，从而实现氧化态烟酰胺辅因子的再生。
2.如权利要求1所述的氧化态烟酰胺类辅因子再生的方法，其特征在于，黄素还原酶的序列包含了来源于Mycobacterium neoaurum的核黄素还原酶(GenBank:WP_049744407.1)或者是来源于Escherichia coli的黄素还原酶(GenBank:WP_074551252.1)的具有至少80％序列相似性蛋白质，所述的黄素还原酶具有氧化还原态烟酰胺辅因子的活力。
3.如权利要求2所述的氧化态烟酰胺类辅因子再生的方法，其特征在于，黄素还原酶的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1，No.2所示。
4.如权利要求1所述的氧化态烟酰胺类辅因子再生的方法，其特征在于，还原态的烟酰胺辅因子为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或者烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)。
5.如权利要求1所述的氧化态烟酰胺类辅因子再生的方法，其特征在于，该方法可以应用于醇脱氢酶在氧化醇的反应中。
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CN112852911A (zh) * 2020-07-23 2021-05-28 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种熊去氧胆酸的制备方法

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