JP2006503559A - D−マンニトールを製造するための方法並びに微生物 - Google Patents
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Abstract
本発明はD−マンニトールを製造するための方法並びに生物に関する。マンニトール−2−デヒドロゲナーゼ(MDH)及びギ酸デヒドロゲナーゼ(FDH、補因子−再生のため)を発現する生物を用い、その際にMDHの糖−基質及び/又は糖−基質前駆物質が非リン酸化糖−輸送系を経て生物中へ輸送される、D−マンニトールを製造するための方法及び微生物を提供することにより、改善されたD−マンニトール製造が達成されることができる。有利には糖−輸送系はジモモナス=モビリスからのグルコース促進体(GLF)である。
Description
本発明は、D−マンニトールを製造するための方法並びに微生物に関する。
糖アルコールであるD−マンニトール(D−マンニット)の世界的な年間需要は、年間30,000tに達する。D−マンニトールは、食品分野において歯を痛めない甘味剤として、医学において血漿増量剤及び血管拡張薬(ヘキサニトロ誘導体)として、並びに製薬工業において錠剤の製造のために使用される。
D−マンニトールの大規模生産は、これまで金属触媒上で出発物質としてのグルコース/フルクトース−混合物の接触水素化を経て行われる。接触水素化の欠けている立体特異性に基づいて、D−マンニトール収率は3倍の過剰量のD−ソルビトールと共に25〜30%に過ぎない(Makkee M, Kieboom APG, Van Bekkum H (1985), Production methods of D-mannitol. Starch/Staerke 37:136-140)。
D−マンニトール及びD−ソルビトールは、炭素原子C−2上のそれらの配置によってのみ異なるので(立体異性体)、望ましくないソルビトールの分離は困難と結びついており、かつ費用がかかる。
代案は、微生物によるバイオトランスフォーメーション法におけるD−フルクトースの酵素的水素化によるD−マンニトールの製造を提供し、その際に蛍光菌からの組換え型マンニトール−デヒドロゲナーゼ(MDH)が単離され、かつカンジダ=ボイジニからのギ酸デヒドロゲナーゼ(FDH)及びNADHと共に膜反応器中でインキュベートされる(Slatner, M.他 (1998) Biotransf. 16: 351-363)。ギ酸デヒドロゲナーゼの使用により、反応容器中の膜により引き留められるNADHの還元−酸化サイクルが作られる。それにより単にフルクトースの70〜90%のみがD−マンニトールに変換されることができた。さらに、使用されるマンニトール−デヒドロゲナーゼは乏しい安定性(半減期50h;ジチオトレイトールでの安定化後:100h)、>30℃の高い温度に対する並びにせん断力に対する感受性を有する。別の大きな欠点は、膜反応器が、単離される酵素、必要とされる補因子及び膜の高い費用に基づいて大工業的生産に適していないことにある。
D−マンニトール生産の別の可能性は発酵による方法を提供し、その際に約85%の収率は基質としてD−フルクトース/D−グルコース−混合物及び触媒する生物としてヘテロ発酵性乳酸菌であるリューコノストック=メゼンテロイデスATCC 12291の使用下に、成長する細胞を用いる発酵において得られた(Soetaert (1991) Synthesis of D-mannitol and L-sorbose by microbial hydrogenation and dehydrogenation of monosaccharides. PhD Thesis, University of Gent))。リューコノストック=プソイドメゼンテロイデスからのMDHの遺伝子及びそのキャラクタリゼーションは同様に公知である(J. Aarnikunnas他, Applied Microbiology and Biotechnology, 13. Juli 2002)。この際にD−マンニトールへのフルクトースの還元に必要な還元当量は、有機酸へのグルコースの酸化に由来する。D−マンニトールへの基質であるフルクトースの85%に過ぎない変換の問題に加えてD−グルコースの使用は不利である、それというのも、有機酸での目的生成物の汚染は発酵の間に生じ、かつこれらの有機酸は費用のかかるプロセス工程により除去されなければならないからである。成長する細胞を用いる発酵の場合に、生成物への基質の100%の変換が達成されることができない、それというのも基質の一部が細胞構築のためもしくは生物体量の新規形成のために消費されるからである。そのうえ、リューコノストック=メゼンテロイデスの発酵は難しく(スライム形成)、かつ複雑な培地に基づいて高価であり、かつ上澄みの後処理は故に同様に費用がかかる。
文献からは、3つの別のマンニトール−2−デヒドロゲナーゼが公知であり、かつそれらの生化学的性質及びヌクレオチド−/アミノ酸配列に関しても記載されている。これには蛍光菌DSM 50106から(Bruenker P, Altenbuchner J, Mattes R (1998) Structure and function of the genes involved in mannitol, arabitol and glucitol utilization from Pseudomonas fluorescens DSM 50106. Gene 206: 117-126.)、ロドバクター=スフェロイデスSi4から(Schneider KH, Giffhorn F, Kaplan S (1993) Cloning, nucleotide sequence and characterization of the manntiol dehydrogenase gene from Rhodobacter sphaeroides. J. Gen. Microbiology 139: 2475-2484)並びにツクリタケから(Stoop JM, Mooibroeck H (1998) Cloning and characterization of NADP-mannitol dehydrogenase cDNA from the button mushroom Agaricus bisporus、and its expression in response to NaCl stress. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4689 -4696.)のマンニトール−2−デヒドロゲナーゼが属する。最初に挙げた2つは、長鎖デヒドロゲナーゼ/レダクターゼタンパク質ファミリー(LDR)のグループに属し、最後に挙げたものは短鎖デヒドロゲナーゼ/レダクターゼタンパク質ファミリー(SDR)のグループに属する。
故に本発明の課題は、技術水準の記載された欠点を回避する、D−マンニトールの改善された製造方法を提供することである。
該課題は、マンニトール−2−デヒドロゲナーゼ(MDH)を発現する生物を用いるD−マンニトールの製造方法により解決され、その際にMDHの糖−基質及び/又は糖−基質前駆物質は非リン酸化糖−輸送系を経て生物中へ輸送されることにより特徴付けられる。
本発明による方法により、MDHと反応すべき糖が予めのリン酸化なしで直接にMDHによりD−マンニトールに変換されることができることが達成される。この直接変換により意外なことに、これまでの技術水準に比較して改善された反応上澄み中でのD−マンニトールの収率及び濃度が可能になる。部分的には、本発明による方法を用いて既に基質(グルコース)に対して100%までの収率が得られる。さらに40g/Lまでの濃度が本発明による方法を用いて達成される。
生物は単細胞並びに多細胞の生物、特に微生物であると理解される。
さらに、該課題はD−マンニトールの微生物により製造するための酵素である配列番号2によるMDH及び配列番号3によるFDHを発現し、かつMDHの糖−基質及び/又は糖基質前駆物質を微生物中へ輸送する非リン酸化糖−輸送系を有する微生物により解決される。
D−マンニトールという呼称は以下にD−マンニットでもあることが理解されるべきである。
本発明の範囲内で、マンニトール−2−デヒドロゲナーゼをコードする全てのヌクレオチド配列は“mdh−遺伝子配列”という呼称にまとめられる。酵素であるマンニトール−2−デヒドロゲナーゼは、以下に“MDH”という呼称にまとめられる。
相応して、ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする全てのヌクレオチド配列は、“fdh−遺伝子配列”という呼称にまとめられる。酵素であるギ酸デヒドロゲナーゼは、以下に“FDH”という呼称にまとめられる。
また、グルコース促進体(Glukosefacilitator)をコードする全てのヌクレオチド配列は“glf−遺伝子配列”という呼称にまとめられる。タンパク質であるグルコース促進体は、以下に“GLF”という呼称にまとめられる。
さらにヌクレオチド配列は、(i)表される配列に正確に相応するか;又は(ii)表される配列に遺伝暗号の縮重の範囲内で相応する少なくとも1つのヌクレオチド配列を含むか;又は(iii)ヌクレオチド配列(i)又は(ii)に対して相補性のヌクレオチド配列でハイブリダイズする少なくとも1つのヌクレオチド配列を含み、かつ場合により(iiii) (i)の機能中性なセンス突然変異を含む全てのヌクレオチド配列であると理解される。その際に、機能中性なセンス突然変異という概念は、化学的に類似のアミノ酸、例えばアラニンによるグリシン又はトレオニンによるセリンの交換を意味する。
本発明によれば、コードする領域(構造遺伝子)に先行する(5′−又は上流の)及び/又はその後の(3′−又は下流の)配列領域も含まれている。特にその中には調節機能を有する配列領域が含まれている。これらは転写、RNA−安定性又はRNAプロセシング並びに翻訳に影響を及ぼしうる。調節配列の例はとりわけプロモーター、エンハンサー、オペレーター、ターミネーター又は翻訳エンハンサーである。
それぞれの酵素には、同じか又は匹敵しうる基質−及び作用特異性を有する酵素として理解されるが、これらはしかしながら異なる一次構造を有するイソ形も含まれる。
修飾された形は本発明によれば、配列中、例えばポリペプチドのN−及び/又はC−末端上にか又は保存されたアミノ酸の領域中での変異が、しかし酵素の機能を妨害することなく存在する酵素であると理解されるべきである。これらの修飾は、公知方法によりアミノ酸交換の形で行われることができる。
有利には糖−輸送系は、好ましくは真核生物、例えば酵母に由来するヌクレオチド配列番号1によるグルコース促進体(GLF)である。好ましくはT.Conway他(Journal of Bacteriology, Dec. 1990, p.7227-7240)によりクローニングされたジモモナス=モビリスからのGLFも使用されることができる。
ドイツ連邦共和国特許出願第198 18 541.3号からは、グルコース−酸化する酵素の高められた活性を有し、かつグルコース又はグルコース−含有基質を酸化によりグルコノラクトン又はグルコネートへ並びにグルコネートのリン酸化により6−ホスホグルコネートへ変換する微生物が使用されることによる、芳香環代謝からの物質の製造方法が確かに公知であり、その際にオキシダーゼ及び/又はホスファターゼの酵素活性の増大に加えてPEPの存在する量の増大のために、ジモモナス=モビリスからのグルコース促進体(GLF)であってよいPEP−独立性グルコース−輸送タンパク質の活性が高められる。しかしながらマンニトールの製造方法は、これから引き出され得ない。
GLFはフルクトースに加えてグルコース又はキシロースも輸送することができ、その中で特にグルコースは安価なフルクトース−前駆物質として興味深い。グルコースは、さらに記載されるように、フルクトースに変換されることができる。
乳酸菌科の微生物、特にリューコノストック=プソイドメゼンテロイデスからのMDHをコードする配列は、これから合成されたMDHの高い活性及び安定性に基づいてD−マンニトールへの変換に特に適している。
好ましくは該生物はMDHをコードする配列番号2を発現する。
生物として、特に、バシラス属、シュードモナス属、ラクトバシラス属、リューコノストック属、腸内細菌科又はメチロトローフ酵母及び菌類からの微生物が適している。さらに食品工業において使用される全ての微生物が使用されることもできる。
特に好ましくは、使用される生物はアクロモバクター=パルボルス(parvolus)、メチロバクテリウム=オルガノフィルム(Methylobacterium organophilum)、マイコバクテリウム=フォルミクム(formicum)、シュードモナス スペック101、シュードモナス=オキサラティカス(oxalaticus)、モラキセラ種、アグロバクテリウム種、パラコッカス種、アンキロバクター=アクアティカス(Ancylobacter aquaticus)、マイコバクテリウム=バッカエ、蛍光菌、ロドバクター=スフェロイデス、ロドバクター=カプスラータス、ラクトバシラス種、乳酸短杆菌、リューコノストック=プソイドメゼンテロイデス、グルコノバクター=オキシダンス、カンジダ=ボイジニ、カンジダ=メチリカ(methylica)又はまたハンゼヌラ=ポリモルファ(polymorpha)、アスペルギルス=ニドゥランス又はアカパンカビ又は特に大腸菌又は枯草菌の群に由来する。
D−マンニトール−濃度の分析は、酵素により/測光法によりK. Horikoshiの方法(Horikoshi K. (1963) Meth. Enzym. Analysis, 第3版 6巻 H. U. Bergmeyer, 編集者, Verlag Chemie, Weinheim)に従ってか、又はLindroth他(Lindroth他 (1979) Analytical Chemistry 51: 1167-1174)により記載されたような高圧−液体−クロマトグラフィー(HPLC)により行われることができる。
酸化−還元サイクルの確立のためにギ酸デヒドロゲナーゼ(FDH)をコードする配列が使用されることができる。好ましくはこれはマイコバクテリウム=バッカエに由来し、かつ配列番号3によるヌクレオチド配列を有する。これはK. Soda他, Appl. Microbiol. Biotechnol (1995) 44, 479-483からわかるように公知である。
これにより、収率もしくはマンニトールへの基質であるフルクトースの転化率速度のかなりの増大が補因子−再生系の生成により可能になる。その際に、基質がマンニトールへのフルクトースの還元に必要な還元当量を準備するためにもはや消費されるのではなくて、第二の酵素系により準備される。それゆえに、補酵素であるNADHはマンニトールへの変換のために高められた範囲で利用可能である。最も頻繁に使用される系の1つは、例えばマイコバクテリウム=バッカエからの、ギ酸デヒドロゲナーゼでの再生である。好ましくはリューコノストック=プソイドメゼンテロイデスからの、任意のMDHと一緒のこの酵素の使用により、ギ酸が電子供与体として及びD−フルクトースが電子受容体として機能する酸化−還元サイクルが作られる。その際に酵素であるギ酸デヒドロゲナーゼはCO2へのギ酸の酸化を触媒し、かつ酵素であるMDHはD−マンニトールへのD−フルクトースの還元を触媒する(図1参照)。細胞内ニコチン酸アミド−アデニン−ジヌクレオチド(NAD)−プールは、双方の酵素間の電子−シャトルとして利用される。CO2へのギ酸の酸化は熱力学的に好都合である、それというのもCO2の自由標準生成エネルギーΔG0’は明らかに負であり、かつCO2はガスの逃げ出しにより反応平衡から取り除かれるからである。とりわけギ酸酸化から生じる、高められた細胞内NADH−濃度は、MDHにより触媒されるD−マンニトールへのD−フルクトースの還元についての還元力を上昇させる。
本方法の別の有利な態様において、既に挙げられた炭素源に加えて、製造のための基質としてD−グルコースが使用される。D−グルコースは、酵素であるD−グルコース/キシロース−イソメラーゼ(EC 5.3.1.5)でのD−フルクトースへの変換により変換されることができる(2)。変換は生物の内部並びに外部で可能である。D−マンニトールの生産方法における基質としてのD−グルコースの使用は、本方法の経済性の明らかな改善をもたらす。
記載された方法のためは、ギ酸デヒドロゲナーゼ及びMDHが導入される及び/又は強化される微生物だけでなく、既にギ酸デヒドロゲナーゼ又は場合によりMDHを有する微生物、例えばアクロモバクター=パルボルス、メチロバクテリウム=オルガノフィルム、マイコバクテリウム=フォルミクム、シュードモナス スペック101、シュードモナス=オキサラティカス、モラキセラ種、アグロバクテリウム種、パラコッカス種、アンキロバクター=アクアティカスも適している。これらには、微生物、例えば蛍光菌、ロドバクター=スフェロイデス、ロドバクター=カプスラータス、ラクトバシラス種、乳酸短杆菌、グルコノバクター=オキシダンス並びに好ましくはまたリューコノストック=プソイドメゼンテロイデス又は既に双方の酵素を有し、かつその都度それらの活性について強化される微生物が属している。さらに適しているのは、例えばメチロトローフ酵母、例えばカンジダ=ボイジニ、カンジダ=メチリカ又はまたハンゼヌラ=ポリモルファ、菌類、例えばアスペルギルス=ニドゥランス及びアカパンカビ並びに食品工業においても使用される全ての微生物でもある。
本発明による方法及び微生物を用いて、目下、生成物であるD−マンニトールへの基質の改善された変換を達成することが可能である。これまで公知の方法に比較して高められた生産性、並びに高められたD−マンニトール収率(100%まで)が達成される。既に40g/Lまでの濃度が達成された。本方法は故にD−マンニトールの大工業的に収益を生む製造に特に適している。ギ酸デヒドロゲナーゼを用いる再生系の生成を経て、NADHを消費するMDHについて高められた範囲で休止細胞での代謝に制限された副生物の不利な形成なしに生成物であるD−マンニトールへの基質の高められた変換が可能になりうる。
本発明には、前記の微生物の1つにおいて使用するためのGLF、MDH及びFDHをコードする配列番号1、2及び3によるヌクレオチド配列の使用も含まれる。
同じように本発明は少なくとも1つ又は複数の前記のヌクレオチド配列を有する遺伝子構造を含む。
少なくとも1つ又は複数の前記のヌクレオチド配列又は1つ又はそれ以上の前記の遺伝子構造を有するベクターは同様に本発明に含まれている。
本発明は、記載された微生物における前記のヌクレオチド配列、遺伝子構造及びベクターもしくはこれらのヌクレオチド配列、遺伝子構造及びベクターを有する微生物の使用も含む。
図面は、本発明による方法の結果並びに本方法について役割を果たす最も重要な代謝経路の略示的な図解を例示的に示す。
配列番号1はジモモナス=モビリスからのGLFをコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号2はリューコノストック=プソイドメゼンテロイデスからのMDHをコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号3はマイコバクテリウム=バッカエN10からのFDHをコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号2はリューコノストック=プソイドメゼンテロイデスからのMDHをコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号3はマイコバクテリウム=バッカエN10からのFDHをコードするヌクレオチド配列を示す。
以下に本発明は例示的に記載される。
I)リューコノストック=プソイドメゼンテロイデスATCC 12291からのマンニトール−2−デヒドロゲナーゼ:酵素の精製及びキャラクタリゼーション;大腸菌中のmdh−遺伝子のクローニング及び機能発現
a)細菌株及びプラスミド
MDHを単離するためのソースとしてリューコノストック=プソイドメゼンテロイデス ATCC 12291を使用した。大腸菌JM 109(DE 3)(Promega)を、リューコノストック=プソイドメゼンテロイデスATCC 12291からのゲノムDNAを単離するための部分プラスミドバンクの生産のための宿主生物として利用した。プラスミドバンクの一部を、リューコノストック=プソイドメゼンテロイデスATCC 12291からのゲノムDNAの4.0−4.5kb Eco RIフラグメントのライゲーションによりpUC18中で生産した。
a)細菌株及びプラスミド
MDHを単離するためのソースとしてリューコノストック=プソイドメゼンテロイデス ATCC 12291を使用した。大腸菌JM 109(DE 3)(Promega)を、リューコノストック=プソイドメゼンテロイデスATCC 12291からのゲノムDNAを単離するための部分プラスミドバンクの生産のための宿主生物として利用した。プラスミドバンクの一部を、リューコノストック=プソイドメゼンテロイデスATCC 12291からのゲノムDNAの4.0−4.5kb Eco RIフラグメントのライゲーションによりpUC18中で生産した。
b)培養条件
リューコノストック=プソイドメゼンテロイデス ATCC 12291を培養するために、次の培地を使用した:
Trypton 10g/l、酵母抽出物10g/l、K2HPO4 10g/l、D−フルクトース20g/l、D−グルコース10g/l、ビタミン/ミネラル−溶液10ml/l、蒸留水中;オルト−リン酸を使用してpH−値を7.5に調節。
リューコノストック=プソイドメゼンテロイデス ATCC 12291を培養するために、次の培地を使用した:
Trypton 10g/l、酵母抽出物10g/l、K2HPO4 10g/l、D−フルクトース20g/l、D−グルコース10g/l、ビタミン/ミネラル−溶液10ml/l、蒸留水中;オルト−リン酸を使用してpH−値を7.5に調節。
ゲノムリューコノストックDNAのプラスミドバンクのサブクローニング及び調製のために、大腸菌JM109(DE 3)を、アンピシリン(100μg/ml)又はカルベニシリン(50μg/ml)を添加してLuria-Bertani培地中で170rpmで37℃で培養した。
c)リューコノストック=プソイドメゼンテロイデスATCC 12291からのMDHの活性の決定
本発明において酵素活性を、還元反応
D−フルクトース + NADH + H+ → D−マンニトール + NAD+
についてのNADH−濃度の減少を介して測光法により決定する。MDHの活性を測定するためのバッチはpH 6.5で100mMリン酸カリウム−緩衝液中のNADH 200μM及びD−フルクトース200mMを含有していた。粗抽出物及び部分的に精製された酵素単離物の比活性はタンパク質1mg当たりの単位(U/mg)として与えられ、その際に1Uは1分当たりの1μmol基質減少として定義される。
本発明において酵素活性を、還元反応
D−フルクトース + NADH + H+ → D−マンニトール + NAD+
についてのNADH−濃度の減少を介して測光法により決定する。MDHの活性を測定するためのバッチはpH 6.5で100mMリン酸カリウム−緩衝液中のNADH 200μM及びD−フルクトース200mMを含有していた。粗抽出物及び部分的に精製された酵素単離物の比活性はタンパク質1mg当たりの単位(U/mg)として与えられ、その際に1Uは1分当たりの1μmol基質減少として定義される。
d)タンパク質濃度の決定
全てのタンパク質濃度決定をBradfordの方法に従って実施した。
全てのタンパク質濃度決定をBradfordの方法に従って実施した。
e)ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いるタンパク質の分離
粗抽出物及び部分的に精製された酵素単離物の純度分析を、並びにウェスタンブロット上で準備的に調製を、不連続な12% SDS−ポリアクリルアミドゲル中でLaemmliの方法に従って電気泳動により実施した。
粗抽出物及び部分的に精製された酵素単離物の純度分析を、並びにウェスタンブロット上で準備的に調製を、不連続な12% SDS−ポリアクリルアミドゲル中でLaemmliの方法に従って電気泳動により実施した。
f)リューコノストック=プソイドメゼンテロイデスATCC 12291からのマンニトール−2−デヒドロゲナーゼの単離
マンニトール−2−デヒドロゲナーゼを単離するために、細胞崩壊後に次の処理工程を実施した:硫酸アンモニウム−沈殿、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アニオン交換体クロマトグラフィーI、アニオン交換体クロマトグラフィーII、サイズ排除クロマトグラフィー、並びに等電点クロマトグラフィー pH 5〜4。
マンニトール−2−デヒドロゲナーゼを単離するために、細胞崩壊後に次の処理工程を実施した:硫酸アンモニウム−沈殿、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アニオン交換体クロマトグラフィーI、アニオン交換体クロマトグラフィーII、サイズ排除クロマトグラフィー、並びに等電点クロマトグラフィー pH 5〜4。
MDHの比活性はpH=5.35でD−マンニトールへのD−フルクトースの還元について450U/mgであった。
g)分子遺伝学的方法
リューコノストック=プソイドメゼンテロイデスATCC 12291からのゲノムDNAの単離、アガロースゲルからのDNA−フラグメントの単離、ジゴキシゲニン修飾dUTPでのDNA−プローブの標識付け及び免疫学的検出及びDNA−DNA−ハイブリダイゼーション(サザンブロット)を実施した。
リューコノストック=プソイドメゼンテロイデスATCC 12291からのゲノムDNAの単離、アガロースゲルからのDNA−フラグメントの単離、ジゴキシゲニン修飾dUTPでのDNA−プローブの標識付け及び免疫学的検出及びDNA−DNA−ハイブリダイゼーション(サザンブロット)を実施した。
エドマン分解及び引き続いてHPLC−分析を用いる43kDa−酵素サブユニットのアミノ末端配列分析法により、八量体の(oktamere)アミノ酸配列MEALVLTGがもたらされた。リューコノストック=プソイドメゼンテロイデスについてのコドン使用頻度−統計学を使用して2048倍に縮重されたオリゴヌクレオチド−プローブを、リューコノストック=プソイドメゼンテロイデスATCC 12291のゲノムDNAのマンニトール−2−デヒドロゲナーゼ−遺伝子検出のために誘導した(図2参照)。24bp−DNA−プローブに、ジゴキシゲニン−11−dUTP−尾部を3'−末端上に設け、L.プソイドメゼンテロイデスATCC 12291のゲノムDNAの部分プラスミドバンクのイムノスクリーニングに利用した。この経路で4.2kb−DNA−フラグメントを単離した(図3)。適しているプライマーを用いてmdh−遺伝子をこのフラグメントから増幅し、ベクターpET24a(+)中へライゲーションし、大腸菌BL21(DE3)中で形質転換及び発現させた。大腸菌BL21(DE3)pET24a(+)Lmdhの細胞抽出物は誘導後にSDS−ポリアクリル電気泳動において43kDaでの強力な過剰発現バンド及びタンパク質70U/mgのマンニトール−2−デヒドロゲナーゼの比活性を示したの対して、対照(プラスミドなしの細胞、空のプラスミドを有する細胞)は活性を示さなかった。
L.プソイドメゼンテロイデスATCC 12291からのmdh−遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号2に示されている。
II)組換え大腸菌−株を用いるD−マンニトールへのD−フルクトースのバイオトランスフォーメーション
組換え大腸菌−株中で、酵素であるギ酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.2.1.2)及びマンニトール−2−デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.67)を、細胞中で酸化−還元サイクルを確立するために過剰発現させた。この酸化−還元サイクルにおいて、水素を、ギ酸から細胞内NAD+を経てD−フルクトースに伝達し、その際にD−フルクトースはD−マンニトールへ還元される(図1参照)。付加的に基質であるフルクトースの使用可能性を改善するために、細胞中でグルコース促進体を発現させた。
組換え大腸菌−株中で、酵素であるギ酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.2.1.2)及びマンニトール−2−デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.67)を、細胞中で酸化−還元サイクルを確立するために過剰発現させた。この酸化−還元サイクルにおいて、水素を、ギ酸から細胞内NAD+を経てD−フルクトースに伝達し、その際にD−フルクトースはD−マンニトールへ還元される(図1参照)。付加的に基質であるフルクトースの使用可能性を改善するために、細胞中でグルコース促進体を発現させた。
(a)株及びベクター
株:大腸菌BL21(DE3)Star(Invitrogen)を使用した。ベクターとして、マイコバクテリウム=バッカエからのギ酸デヒドロゲナーゼ、リューコノストック=プソイドメゼンテロイデスからのマンニトール−2−デヒドロゲナーゼのORFをコードするpET−24a(+)fdh/mdh及びジモモナス=モビリスからのグルコース促進体をコードするpZY507glfを使用した。
株:大腸菌BL21(DE3)Star(Invitrogen)を使用した。ベクターとして、マイコバクテリウム=バッカエからのギ酸デヒドロゲナーゼ、リューコノストック=プソイドメゼンテロイデスからのマンニトール−2−デヒドロゲナーゼのORFをコードするpET−24a(+)fdh/mdh及びジモモナス=モビリスからのグルコース促進体をコードするpZY507glfを使用した。
バイオトランスフォーメーションのためには、化学的にコンピテントな大腸菌BL21(DE3)StarをpET−24a(+)fdh/mdh及びpZY507glfで同時形質転換し、クロラムフェニコール25μg/ml及びカナマイシン30μg/mlを有するLB−寒天平板上で淘汰した。対照として大腸菌BL21(DE 3)StarをpET−24a(+)fdh/mdh又はpZY507glfのいずれかで単独で形質転換した。形質転換体の淘汰は、クロラムフェニコール25μg/ml(pZY507glf)又はカナマイシン50μg/ml(pET−24a(+)fdh/mdh)のいずれかを有するLB−寒天平板上で行った。p pET−24a(+)fdh/mdhで形質転換された大腸菌BL21(DE 3)StarについてのLB−寒天平板は付加的に、マンニトール−2−デヒドロゲナーゼ及びギ酸デヒドロゲナーゼの基本発現(Basalexpression)を減少させるための1%(v/v)D−グルコースを含有していた。
(b)バイオトランスフォーメーション
大腸菌中のFDH、MDH及びGLFの過剰発現後に、成長しない細胞をバイオトランスフォーメーションにおいて使用する。大腸菌BL21(DE 3)Star pET−24a(+)fdh/mdh/pZY507glfの誘導された細胞各1.0gを、pH 7.0の100mMリン酸カリウム−緩衝液で洗浄し、pH 6.7の100mMリン酸カリウム−緩衝液中のD−フルクトース500mM及びギ酸ナトリウム500mMを有する反応溶液50ml中に再懸濁させた。バッチを、じゃま板のない100ml−フラスコ中で100〜120rpm及び30℃で24h振とうした。反応開始後0、1、2、3、4、5、6、8、17及び23hの時点に、ギ酸、D−フルクトース及びD−マンニトールの濃度の測定のために上澄みの1〜2ml−試料を採取した。試料を5000gで1min遠心分離し、上澄みを0.2μm−ろ過し、HPLCによる測定まで−20℃で貯蔵した。対照として、大腸菌BL21(DE 3)Star pET−24a(+)fdh/mdh/pZY507glfの誘導されなかった細胞1.0gを、同じようにしてバイオトランスフォーメーションにおいて使用した。
大腸菌中のFDH、MDH及びGLFの過剰発現後に、成長しない細胞をバイオトランスフォーメーションにおいて使用する。大腸菌BL21(DE 3)Star pET−24a(+)fdh/mdh/pZY507glfの誘導された細胞各1.0gを、pH 7.0の100mMリン酸カリウム−緩衝液で洗浄し、pH 6.7の100mMリン酸カリウム−緩衝液中のD−フルクトース500mM及びギ酸ナトリウム500mMを有する反応溶液50ml中に再懸濁させた。バッチを、じゃま板のない100ml−フラスコ中で100〜120rpm及び30℃で24h振とうした。反応開始後0、1、2、3、4、5、6、8、17及び23hの時点に、ギ酸、D−フルクトース及びD−マンニトールの濃度の測定のために上澄みの1〜2ml−試料を採取した。試料を5000gで1min遠心分離し、上澄みを0.2μm−ろ過し、HPLCによる測定まで−20℃で貯蔵した。対照として、大腸菌BL21(DE 3)Star pET−24a(+)fdh/mdh/pZY507glfの誘導されなかった細胞1.0gを、同じようにしてバイオトランスフォーメーションにおいて使用した。
反応上澄み中及び細胞不含の粗抽出物中のギ酸、D−フルクトース及びD−マンニトールの濃度決定を、HPLC−装置(Merck/Hitachi)を用いて実施した。
第1表は、形質転換された微生物を用いて達成されることができた結果を例示的に示す。
大腸菌中のギ酸デヒドロゲナーゼ及びマンニトール−2−デヒドロゲナーゼ及びグルコース促進体の並行した過剰発現が、D−フルクトース及びギ酸を有する反応媒体中でのこれらの細胞によるD−マンニトールの極めて高い産生をもたらすことを示すことができた。23h後に244mMまでのマンニトールは、17h後に15mMを有するに過ぎないGLFなしの方法及び17h後に20mMを有するFDHなしの方法と相対している。すなわち約12〜15倍の改善が達成されることができた。
Claims (30)
- マンニトール−2−デヒドロゲナーゼ(MDH)を発現する生物を使用しながらD−マンニトールを製造する方法において、MDHの糖−基質及び/又は糖−基質前駆物質を、非リン酸化糖−輸送系を経て生物中へ輸送することを特徴とする、MDHを発現する生物の使用下でのD−マンニトールの製造方法。
- 糖−輸送系として真核生物からのグルコース促進体(GLF)を含有する生物を使用する、請求項1記載の方法。
- 糖−輸送系としてジモモナス=モビリスからのグルコース促進体(GLF)を含有する生物を使用する、請求項1又は2記載の方法。
- GLFをコードする配列番号1を有する生物を使用する、請求項2又は3記載の方法。
- 糖としてグルコース及び/又はフルクトースを使用する、請求項1から4までのいずれか1項記載の方法。
- MDHをコードする配列を有する生物を使用する、請求項1から5までのいずれか1項記載の方法。
- 乳酸菌科の微生物から、特にリューコノストック=プソイドメゼンテロイデスからの、MDHをコードする配列を有する生物を使用する、請求項6記載の方法。
- MDHをコードする配列番号2を有する生物を使用する、請求項6又は7記載の方法。
- ギ酸デヒドロゲナーゼ(FDH)をコードする配列を有する生物を使用する、請求項1から8までのいずれか1項記載の方法。
- マイコバクテリウム=バッカエからのFDHをコードする配列を有する生物を使用する、請求項9記載の方法。
- FDHをコードする配列番号3を有する生物を使用する、請求項9又は10記載の方法。
- 生物として微生物を使用する、請求項1から11までのいずれか1項記載の方法。
- バシラス属、シュードモナス属、ラクトバシラス属、リューコノストック属、腸内細菌科又はメチロトローフ酵母及び菌類の微生物を使用する、請求項1から12までのいずれか1項記載の方法。
- D−マンニトールを微生物により製造するための、配列番号2による酵素であるMDH及び配列番号3による酵素であるFDHを発現し、かつMDHの糖−基質及び/又は糖−基質前駆物質を微生物中へ輸送する非リン酸化糖−輸送系を有する、微生物。
- 糖−輸送系が真核生物からのグルコース促進体(GLF)である、請求項14記載の微生物。
- 糖−輸送系がジモモナス=モビリスからのグルコース促進体(GLF)である、請求項14又は15記載の微生物。
- 生物がGLFをコードする配列番号1を有する、請求項16記載の微生物。
- グルコース、フルクトース又はこれらの混合物をD−マンニトールに変換する、請求項14から17までのいずれか1項記載の微生物。
- 乳酸菌科の微生物から、特にリューコノストック=プソイドメゼンテロイデスからの、MDHをコードする配列を有する、請求項14から18までのいずれか1項記載の微生物。
- マイコバクテリウム=バッカエからのFDHをコードする配列を有する、請求項14から19までのいずれか1項記載の微生物。
- バシラス属、ラクトバシラス属、リューコノストック属、腸内細菌科又はメチロトローフ酵母及び菌類、並びに食品工業においても使用される全ての微生物に由来する、請求項14から20までのいずれか1項記載の微生物。
- D−マンニトールを製造するための、請求項14から21までのいずれか1項記載の微生物の使用。
- 請求項14から21までのいずれか1項記載の微生物において使用するためのGLFをコードする配列番号1によるヌクレオチド配列。
- 請求項14から21までのいずれか1項記載の微生物において使用するためのMDHをコードする配列番号2によるヌクレオチド配列。
- 請求項14から21までのいずれか1項記載の微生物において使用するためのFDHをコードする配列番号3によるヌクレオチド配列。
- 請求項23から25までのいずれか1項記載の少なくとも1つ又はそれ以上のヌクレオチド配列を有する遺伝子構造。
- 請求項23から25までのいずれか1項記載の少なくとも1つ又はそれ以上のヌクレオチド配列又は請求項26記載の1つ又はそれ以上の遺伝子構造を有するベクター。
- 請求項14から21までのいずれか1項記載の微生物を形質転換するための、請求項23から25までのいずれか1項記載のヌクレオチド配列の使用。
- 請求項26記載の少なくとも1つの遺伝子構造を有する、請求項14から21までのいずれか1項記載の微生物。
- 請求項27記載の少なくとも1つのベクターを有する、請求項14から21までのいずれか1項記載の微生物。
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