CN107454915B - L-岩藻糖的生物催化生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物催化方法，包括纯酶法、混合酶法‑发酵法和纯发酵方法，其用于将L‑岩藻糖醇直接单步转化成L‑岩藻糖，以容易地以大量和高水平纯度获得L‑岩藻糖。本发明还涉及适合的重组微生物和真菌，以及它们在用于单步转化L‑岩藻糖的所述方法中的用途。

Description

L-岩藻糖的生物催化生产方法
技术领域
本发明涉及从L-岩藻糖醇(L-fucitol)生物催化即酶法和/或发酵法生产L-岩藻糖的方法。本发明还公开了适合于从L-岩藻糖醇生物催化生产L-岩藻糖的酶，特别是半乳糖氧化酶。还公开了重组微生物和真菌，它们具有用于从L-岩藻糖醇生产L-岩藻糖的酶所需的可表达为转基因的核酸序列，并且可以在功能上表达它们，还公开了这些微生物或真菌在本发明方法中的用途。
发明背景
岩藻糖以两种对映体形式出现：L-岩藻糖(也称作鼠李糖)和D-岩藻糖(CAS 3615-37-0)。L形式本质上是广泛的。L-岩藻糖是用于研究和开发的基础分子且是聚糖结构的特征成分。岩藻糖基化物质领域中的科学研究表明它们在胚胎发育中具有突出的重要性，并且牵涉生物体的免疫应答等。
特别是在人母乳中发现L-岩藻糖。人母乳在健康儿童发育中起重要作用。其中存在的物质，特别是寡糖类(人乳寡糖类(HMO))是母乳的整体主要成分之一，并且具有核心结构，该结构在还原末端具有乳糖单元，并被N-乙酰氨基乳糖单元以支链或链状方式拉伸。结构变异性尤其由末端位置上的岩藻糖基修饰而扩展。关于健康和发育作用，HMO的生物功能是许多研究的主题，但这需要足够量的化合物的技术纯度。目前，通过从天然来源直接提取或通过化学修饰单糖来提供L-岩藻糖(有关概述参见P.T.Vanhooren等人，J.Chem.Technol.Biotechnol.74,479(1999)及其中所引用的来源)。目前使用最广泛使用的方法是从母乳中的繁琐提取。虽然已经描述了HMO的生物技术生产方法(参见Han等人，Biotechnol.Adv.2012,30,1268-1278)，但相应的HMO通常不能以合理的价格获得。
L-岩藻糖和包含L-岩藻糖的物质是正在进行的研究的主题。L-岩藻糖本身和岩藻糖基化底物是化学和制药工业中的重要起始材料，并且也可用于生产化妆品和营养制品。因此，仍然需要在工业规模上生产L-岩藻糖的创新生产方法。
已提出生物技术方法来获得L-岩藻糖。例如，WO 2012/034996 A1教导了使用具有根据SEQ ID NO：1的特异性16S rRNA的，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(保藏为DSM22227)的分离的微生物来生产L-岩藻糖的方法，用于通过发酵生产L–岩藻糖。然而，仅在经过耗时的发酵后才获得作为未纯化混合物的L-岩藻糖，这就是为获得L-岩藻糖而需要繁琐的进一步纯化步骤的原因。US 8,642,297 B2特别地假定了一种通用发酵方法，该方法预期使用来自芹菜(Apium graveolens)的重组甘露糖醇-1-脱氢酶来生产L-岩藻糖。然而，没有公开具体的操作实施例，也没有公开实例。此外，没有公开可以用于反应的替代酶。WO2005/087941 A1公开了用于提供L-岩藻糖的组合发酵-酶法。为此，通过使用醋酸杆菌属(Acetobacterium)的脱氢酶首先从L-岩藻糖醇产生L-墨角藻糖(L-fuculose)。然后必须在另外的步骤中合成得到L-岩藻糖。
因此，对于在可以在工业上使用的方法中以尽可能少的步骤经济地生产足够纯度的L-岩藻糖仍然存在巨大需要。
发明概述
因此，本发明的目的是提供用于生物技术生产L-岩藻糖的方法，以及适用于该目的的酶，以及重组微生物和真菌，其中L-岩藻糖可以在工业规模上在单一步骤反应中直接从L-岩藻糖醇得到。
本发明通过提供使用L-岩藻糖醇和半乳糖氧化酶和任选的选自过氧化物酶和/或过氧化氢酶(catalase)的另外的酶的方法实现该目的，由此将L-岩藻糖醇转化成L-岩藻糖可以在单一步骤反应中进行，并且在这种情况下可得到高产率。还公开了适合于此目的的酶。最后，公开了可以产生用于所公开合成路线的相关酶的重组微生物或真菌，还公开了其用途。
从以下详细描述和实施例、附图和所附专利权利要求书中，本发明的方面和实施方案将变得显而易见。
附图简述
图1(Fig.1)显示了通过L-岩藻糖醇获得L-岩藻糖的半乳糖反应途径，其中L-岩藻糖醇的氧化步骤通过半乳糖氧化酶进行。
图2(Fig.2)显示了底物浓度对使用半乳糖氧化酶将L-岩藻糖醇随时间转化成L-岩藻糖的影响。
图3(Fig.3)显示了H2O2对使用半乳糖氧化酶将L-岩藻糖醇随时间转化成L-岩藻糖的影响。
图4(Fig.4)显示L-岩藻糖对使用半乳糖氧化酶将L-岩藻糖醇随时间转化成L-岩藻糖的影响。
详细描述
定义
术语蛋白质、多肽和酶由于本文公开的多肽的恒定的酶功能而可互换使用。
本文所用的术语“生物催化或生物催化作用”是指其中酶用作生物催化剂的化学反应的反应和加速或控制。生物催化作用可以通过添加分离的酶(酶促)或直接在活细胞中(这里是发酵)进行。
本文所用的术语“重组微生物或真菌”是指微生物或真菌，其包含感兴趣的重组的即(部分)人造的生物分子，其中该生物分子可以是核酸序列或多肽序列。此外，与未修饰或野生型菌株相比，所选择的微生物或真菌菌株可在其基因组或包囊的质粒DNA中携带突变，其与感兴趣的生物分子的核酸序列无关。
本文所用的术语“转基因”是指物种的核酸分子，其已经被直接导入另一物种的基因组或通过基因组之外但在另外的物种中可复制的载体导入。由此修饰的生物体在本文中称作重组体(参见上文)。
如本文所使用的术语“子代”是指根据本公开的重组微生物或真菌情况下的这类生物体的子代，其通过包含有性和无性繁殖的天然生殖过程而来源于原始生物体。本领域技术人员已知，在繁殖过程中，突变可以自然地被导入到生物体的基因组中，从而子代与亲本生物体在基因组方面存在差异，但是仍然可以分配至相同的(亚)种类。因此，这种通过自然过程修饰的子代也被本公开的术语“子代”所涵盖。
本文所用的术语“载体”是指用于将核酸分子转入细胞、微生物或真菌中的转运载体。特别地，载体可以是质粒、粘粒或修饰的病毒。此外，术语载体还旨在包括适于将多肽直接导入细胞或微生物的手段。
本文所用的术语“以功能形式表达”是指重组微生物或真菌能够将一种或多种转基因翻译成多肽的能力，所述转基因选自如上文所定义的半乳糖氧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶，所述多肽在适合的反应条件下满足如上述举出的半乳糖氧化酶、过氧化氢酶或过氧化物酶的酶功能。
发明详述
在一个方面，本发明提供了生产L-岩藻糖的方法，包括以下步骤：(a)提供L-岩藻糖醇；(b)提供EC 1.1.3.9酶分类的半乳糖氧化酶和任选的一种或多种另外成分；(c)使用半乳糖氧化酶和任选的另外成分氧化L-岩藻糖醇，并在允许L-岩藻糖醇生物催化氧化成L-岩藻糖的条件下温育所得混合物；(d)任选地：分离合成的L-岩藻糖。
半乳糖氧化酶(EC 1.1.3.9)是铜依赖性氧化酶。实际上通常作为由许多丝状真菌分泌的胞外单体酶在自然界被发现。半乳糖氧化酶催化伯醇类氧化成相应的醛类，同时将分子氧还原成H2O2(参见Paukner,R.等人；Galactose oxidases from Fusariumoxysporum-expression in E.coli and P.pastoris and biochemicalcharacterization；PLoS ONE,2014,9,e100116/1)。半乳糖氧化酶的活性可以通过本领域技术人员已知的方法测定，其中在适合的底物(特别是半乳糖)存在下，对从氧还原(O2)释放的过氧化氢(H2O2)进行定量。或者，O2浓度的降低也是半乳糖氧化酶活性的量度。
在该方面的一个实施方案中，该方法包括：子步骤(b1)提供用于重组表达酶种类EC1.3.3.9的半乳糖氧化酶的重组微生物或真菌，其中所述微生物或真菌包含编码半乳糖氧化酶的转基因，所述半乳糖氧化酶来自肉座菌目(Hypocreales)的真菌，优选选自镰刀菌属(Fusarium)，特别是来自尖镰孢(Fusarium oxysporum)菌种；(b2)在允许合成半乳糖氧化酶的条件下培养重组微生物；(b3)任选地：分离合成的半乳糖氧化酶。根据本公开优选的来自尖镰孢菌的半乳糖氧化酶是包含681个氨基酸的多肽(
Figure BDA0001417488040000051
保存号：AHA90705.1)。编码序列的相应核酸序列(2046个核苷酸，包括终止密码子)可以以保存号KF601698.1在
Figure BDA0001417488040000052
中获得。
本领域技术人员已知，本发明的方法可以使用由相当的催化活性限定的酶分类为1.1.3.9的任何酶，只要该酶催化上述氧化伯醇类为相应醛类同时将分子氧还原成H2O2的功能。同样，本领域技术人员知晓，反应条件根据所用酶的不同而改变。对反应和/或培养条件进行调整易于由本领域技术人员进行。
在该方面的一个实施方案中，所述一种或多种任选的另外成分选自过氧化物酶和/或过氧化氢酶。
根据本发明的任意方面，教导了通过使用半乳糖氧化酶和任选另外的过氧化物酶和/或过氧化氢酶从L-岩藻糖醇开始生物催化回收L-岩藻糖。本发明所有方面的这些生物催化反应完全可以通过酶促、酶促和发酵或仅通过发酵来进行。这方面的酶促表示使用分离和任选纯化的和另外修饰的酶。这方面的发酵是指在允许酶以功能形式表达的适合反应条件下一种或多种目标酶在重组宿主生物体中表达。
鉴于使用半乳糖氧化酶将L-岩藻糖醇转化成L-岩藻糖的反应是氧依赖性反应的事实，根据本发明所有方面和实施方案，反应剂始终充分与氧接触。这种氧气输入可以通过本领域技术人员众所周知的方法进行，例如通过对培养物或反应批量通气或充气进行通风换气。
正如已经举出的，优选的是，一种或多种任选的另外成分是否是或选自过氧化物酶和/或过氧化氢酶。过氧化氢酶催化整个方程的反应：2H2O2→O2+2H2O，因此在半乳糖氧化酶与L-岩藻糖醇的反应中形成副产物H2O2。过氧化物酶例如辣根过氧化物酶是催化过氧化物还原的酶。催化反应的总体方程也是：2H2O2→O2+2H2O。过氧化物酶的底物特异性可以显著改变。辣根过氧化物酶是具有广谱供体和受体的该酶类的代表性实例。为了在本发明中使用，在合适反应条件下可以催化H2O2分解成氧和水的任何过氧化氢酶或过氧化物酶都是适合的。
已经发现，过氧化物酶和/或过氧化氢酶的添加有利地影响L-岩藻糖醇向L-岩藻糖的转化，这是因为特别地因半乳糖氧化酶活性形成的H2O2被这些额外的H2O2解毒酶的活性除去，由此可以增加L-岩藻糖的收率。在一个实施方案中，除了半乳糖氧化酶之外还使用过氧化氢酶或过氧化物酶。在一个优选的实施方案中，除了半乳糖氧化酶之外，还使用过氧化氢酶和过氧化物酶。图3示例了后一实施方案的有利结果。
在一个实施方案中，过氧化物酶选自酶种类EC1.11.1.7、特别是来自辣根(Armoracia rusticana)的过氧化物酶。辣根过氧化物酶可以商业购买(SIGMA-ALDRICH，例如产品编号：P8250)，或可以重组生产。GenBank中的保存号是用于核酸序列mRNA的X57564.1，或用于多肽序列的CAA40796.1，用于来自Armoracia rusticana的酶。
在本发明第一方面的另一个实施方案中，过氧化氢酶选自酶种类EC1.11.1.6、特别是来自牛(欧洲牛(Bos Taurus))的过氧化氢酶。
在一个实施方案中，过氧化氢酶是适合于直接酶促转化的酶种类EC1.11.1.6(来源，例如SIGMA ALDRICH，产品编号：C30)的牛肝过氧化氢酶。对于重组表达，示例性牛肝过氧化氢酶的核酸序列可以作为NCBI参比序列NM_001035386.2(mRNA)公开获得，并且相应的翻译的多肽序列可以作为NCBI参比序列NP_001030463.1公开获得。
同样，对于本公开的酶的发酵生成的所有方面，提出了与上述定义的数据库序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性的半乳糖氧化酶和/或过氧化物酶和/或过氧化氢酶序列，其中所述核酸或多肽序列可以是密码子优化的或可以包含靶点突变，只要翻译的多肽仍然执行野生型参比序列的功能即可。用于使核酸序列和由此酶的多肽序列适配的这类修饰是本领域技术人员众所周知的，并且尤其用于使序列适应于选择用于表达的重组宿主生物的密码子应用，以优化酶的稳定性或功能并且提高对于所选宿主生物体的酶产物的产量或降低其细胞毒性。
此外，本公开的核酸或多肽序列可以携带标记序列(“标记”)，其允许纯化或检测经标记为融合分子翻译的多肽序列。这类标记及其序列以及用于修饰靶序列的方法是本领域技术人员众所周知的，并且包括序列例如链霉抗生物素标记、多组氨酸标记、谷胱甘肽S-转移酶标记、麦芽糖结合蛋白标记、闪式标记(flash tag)、介导重组多肽分泌到培养上清液中的标记等。
在本发明的一个实施方案中，根据第一方面在步骤(c)中开始温育时的混合物中半乳糖氧化酶的浓度在0.005-6.25g/L的范围、优选在0.005-3.2g/L、更优选为0.005-0.5g/L且特别优选为0.005-0.05g/L。本领域技术人员已知所用半乳糖氧化酶的浓度取决于所使用的特定的酶以及其酶比活性。酶活性可以以两种可能的单位表示：(1)单位(1酶单位)＝1μmol底物min-1，或以katal计的SI单位(kat)＝1mol底物s-1。对于本领域技术人员而言，大致计算酶反应速率以及酶活性通过米-门二氏方程式已知，由此可以在适合的测定中容易地确定感兴趣的酶的酶活性。
在本发明的另一个实施方案中，根据第一方面在步骤(c)中开始温育时的混合物中过氧化物酶的浓度在0-0.5g/L的范围、优选在0-0.3g/L、更优选为0-0.15g/L。
在本发明的另一个实施方案中，根据第一方面在步骤(c)中开始温育时的混合物中过氧化氢酶的浓度在0-0.4g/L的范围、优选在0-0.2g/L、更优选为0-0.1g/L。
在本发明的另一个实施方案中，根据第一方面在步骤(c)中开始温育时的混合物中L-岩藻糖醇的浓度在1-500g/L的范围、优选范围为5-250g/L、特别优选为20-125g/L。
在本发明的任意方面的一个实施方案中，重组微生物或真菌选自：大肠杆菌菌种(Escherichia coli spp.)，优选大肠杆菌BL21、大肠杆菌MG1655或大肠杆菌W3110及其子代；芽孢杆菌属菌种(Bacillus spp.)，优选地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subitilis)或解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)及其子代；酵母纲(Saccharomycetes)，优选酵母目(Saccharomycetales)，更优选酵母科(Saccharomycetaceae)，更优选Komagataella，优选汉逊酵母属(Hansenula)或毕赤酵母属菌种(Pichiaspp.)，特别优选巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)及其子代；克鲁维酵母属菌种(Kluyveromyces spp.)，优选乳酸克鲁维酵母(K.lactis)及其子代；曲霉属菌种(Aspergillus spp.)，优选米曲霉(A.oryzae)、构巢曲霉(A.nidulans)或黑曲霉(A.niger)及其子代，或木霉属菌种(Trichoderma spp.)，优选里氏木霉(T.reesei)或哈茨木霉(T.harzianum)及其子代，或子囊菌门(phylum Ascomycota)真菌，优选嗜热毁丝霉(Myceliopthora thermophila)或其子代。
根据本发明的另一个方面，提供重组微生物或真菌，其中所述微生物或真菌包含编码来自镰刀菌属真菌的半乳糖氧化酶的转基因，并且还包含选自如上述定义的过氧化物酶和/或过氧化氢酶的转基因，其中所述重组微生物或真菌选自大肠杆菌菌种，优选大肠杆菌BL21、大肠杆菌MG1655或大肠杆菌W3110及其子代；芽孢杆菌属菌种，优选地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌及其子代；酵母纲，优选酵母目，更优选酵母科，更优选Komagataella，优选汉逊酵母属或毕赤酵母属菌种，特别优选巴斯德毕赤酵母及其子代；克鲁维酵母属菌种，优选乳酸克鲁维酵母及其子代；曲霉属菌种，优选米曲霉、构巢曲霉或黑曲霉及其子代，或木霉属菌种，优选里氏木霉或哈茨木霉及其子代，或子囊菌门的真菌，优选嗜热毁丝霉或其子代，且其中所述重组微生物或真菌可以表达功能形式的转基因。
本领域技术人员众所周知的是，在酶的上下文中，术语“适合的(反应)条件”意味着必须提供必需的底物、缓冲条件、特别是盐浓度、任选的辅因子、尤其包含辅基、辅酶和金属离子以及pH和温度条件，它们是相应酶活性不可缺少的或有助于相应酶活性。在使用半乳糖氧化酶——氧依赖性酶——的情况下，其包含例如对培养物或反应批量通气或充气进行通风换气。由于本发明的所有酶和由它们催化的反应均被充分表征，因此，适合的反应条件的确定在本领域技术人员的能力范围内。
在一个实施方案中，除了编码半乳糖氧化酶的转基因之外，编码过氧化氢酶的另外的转基因存在于重组微生物或真菌中。
在另一个实施方案中，除了编码半乳糖氧化酶的转基因之外，编码过氧化物酶的另外的转基因存在于重组微生物或真菌中。
在另一个实施方案中，除了编码半乳糖氧化酶的转基因之外，编码过氧化物酶的另外转基因和编码过氧化氢酶的转基因都存在于重组微生物或真菌中。
提供相应的转基因、将其并入重组微生物或真菌以及选择允许相应转基因的转录和翻译的合适的培养和反应条件是本领域技术人员众所周知的。
在一个实施方案中，重组微生物或真菌可以通过向培养介质中加入L-岩藻糖醇以通过发酵从L-岩藻糖醇直接生产L-岩藻糖而使用，即重组微生物或真菌直接使用或实施上述方法。该实施方案允许在分批发酵中直接生产L-岩藻糖，任选地随后进行进一步纯化步骤。
在一个实施方案中，用于半乳糖氧化酶以及过氧化物酶和/或过氧化氢酶的转基因可以具有允许翻译的多肽分泌到培养上清液中的标记。这允许从培养上清液中便利地分离酶，或者在加入L-岩藻糖醇之后直接实施L-岩藻糖醇转化成L-fucitose，并调节反应条件，使得分泌的酶能够实现它们的酶功能。
在另一个实施方案中，将编码半乳糖氧化酶、过氧化物酶和/或过氧化氢酶的转基因不是在一种、而是在不同的重组微生物或真菌中提供，并且在适合的培养条件下表达并任选地进行纯化。然后可以使用由此获得的酶、在加入L-岩藻糖醇后在体外或体内进行本文所述的方法，从而通过提供适合的反应条件从L-岩藻糖醇得到L-岩藻糖。
在另一个方面，本发明提供了重组微生物或真菌用于重组表达如上所定义的方法中的半乳糖氧化酶的用途，其中所述微生物或真菌包含编码如上述所定义的来自镰刀菌属真菌的半乳糖氧化酶的转基因，其中所述重组微生物或真菌选自：大肠杆菌菌种，优选大肠杆菌BL21、大肠杆菌MG1655或大肠杆菌W3110及其子代；芽孢杆菌属菌种，优选地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌及其子代；酵母纲，优选酵母目，更优选酵母科，更优选Komagataella，优选汉逊酵母属或毕赤酵母属菌种，特别优选巴斯德毕赤酵母及其子代；克鲁维酵母属菌种，优选乳酸克鲁维酵母及其子代；曲霉属菌种，优选米曲霉、构巢曲霉或黑曲霉及其子代，或木霉属菌种，优选里氏木霉或哈茨木霉及其子代，或子囊菌门的真菌，优选嗜热毁丝霉或其子代，且其中所述重组微生物或真菌可以表达功能形式的转基因。
在另一个方面，本发明提供了半乳糖氧化酶和至少一种选自过氧化物酶和/或过氧化氢酶的另外的酶的用途，其中半乳糖氧化酶和过氧化物酶和/或过氧化氢酶优选地通过包括以下步骤的方法得到：
(a)提供重组微生物或真菌，其用于半乳糖氧化酶和过氧化物酶和/或过氧化氢酶的重组表达，其中所述微生物包含编码来自镰刀菌属真菌的半乳糖氧化酶的转基因，并且包含另一种编码过氧化物酶和/或过氧化氢酶的转基因，且其中所述重组微生物或真菌选自：大肠杆菌菌种，优选大肠杆菌BL21、大肠杆菌MG1655或大肠杆菌W3110及其子代；芽孢杆菌属菌种，优选地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌及其子代；酵母纲，优选酵母目，更优选酵母科，更优选Komagataella，优选汉逊酵母属或毕赤酵母属菌种，特别优选巴斯德毕赤酵母及其子代；克鲁维酵母属菌种，优选乳酸克鲁维酵母及其子代；曲霉属菌种，优选米曲霉、构巢曲霉或黑曲霉及其子代，或木霉属菌种，优选里氏木霉或哈茨木霉及其子代，或子囊菌门的真菌，优选嗜热毁丝霉或其子代；或
(b1)提供第一种重组微生物或真菌，其用于半乳糖氧化酶的重组表达，其中所述微生物或真菌包含编码来自镰刀菌属真菌的半乳糖氧化酶的转基因；和
(b2)提供第二种重组微生物或真菌，其用于过氧化物酶的重组表达，其中所述微生物或真菌包含编码过氧化物酶的转基因；和/或
(b3)提供第三种重组微生物或真菌，其用于过氧化氢酶的重组表达，其中所述微生物或真菌包含编码过氧化氢酶的转基因；
(c)在允许合成所述半乳糖氧化酶和所述过氧化物酶和/或所述过氧化氢酶的适合条件下培养所述重组微生物；
(d)任选地：分离合成的半乳糖氧化酶和所述过氧化物酶和/或所述过氧化氢酶，用于在根据本发明第一方面的方法中生物催化转化L-岩藻糖醇为L-岩藻糖。
因此，对于过氧化物酶和/或过氧化氢酶，上述陈述相应地在每种情况性均适用。
本发明的该方面尤其有用，以便提供、生产和任选地分别在一种或多种重组生物体中分离所有期望的单一酶，其用于实施将L-岩藻糖醇生物催化转化成L-岩藻糖，从而随后在体外以受控方式实施将L-岩藻糖醇酶促转化成L-岩藻糖。
实施例
现在通过不被视为限制性的实施例更详细地示例本发明。
实施例1：在过氧化物酶和过氧化氢酶存在下用半乳糖氧化酶通过生物催化氧化 L-岩藻糖醇来生产L-岩藻糖
向圆底三颈烧瓶(50mL)中加入L-岩藻糖醇溶液(包含600mg L-岩藻糖醇的6.0mL水溶液，CAS 13074-06-1，Santa Cruz Biotechnology)，然后加入1.2mL K2HPO4/KH2PO4(1000mM,pH＝7.0)和0.095mL过氧化氢酶(来自牛肝，SIGMA，21 300U/mg，34mg/mL)，加入0.120mL过氧化物酶(来自辣根，173U/mg固体，SIGMA)和2.218mL半乳糖氧化酶(38.4mg/mL，2708U/mL)。所得溶液在室温用O2吹扫，直到所有的L-岩藻糖醇都被转化成L-岩藻糖。通过HPLC监测反应。分离终产物并通过1H-和13C-NMR分析。将结果概括在表1中。
[表1]
Figure BDA0001417488040000121
实施例2：过氧化物酶和过氧化氢酶对L-岩藻糖醇的生物催化氧化的影响
以1.0mL量级进行以下实验：半乳糖氧化酶(GO)：向0.250mL L-岩藻糖醇溶液(100mg/mL)加入0.635mL水，然后加入0.050mL K2HPO4/KH2PO4缓冲溶液pH 7.0、0.065mL半乳糖氧化酶(2705U/mL在100mM K3PO4缓冲液中的溶液,pH 6.0)；GO+过氧化氢酶：向0.250mL L-岩藻糖醇溶液(100mg/mL)加入0.631mL水，然后加入0.050mL K2HPO4/KH2PO4缓冲液pH 7.0、0.004mL过氧化氢酶水溶液(724 200U/mL)、0.065mL半乳糖氧化酶(2705U/mL在100mM K3PO4缓冲液中的溶液,pH 6.0)。GO+过氧化物酶：向0.250mL L-岩藻糖醇溶液(100mg/mL)加入0.630mL水，然后加入0.050mL K2HPO4/KH2PO4缓冲液pH 7.0、0.005mL过氧化物酶水溶液(7500U/mL)、0.065mL半乳糖氧化酶(2705U/mL在100mM K3PO4缓冲液中的溶液,pH 6.0)；GO+过氧化物酶+过氧化氢酶：向0.250mL L-岩藻糖醇溶液(100mg/mL)加入0.626mL水，然后加入0.050mL K2HPO4/KH2PO4缓冲液pH 7.0、0.005mL过氧化物酶水溶液(7500U/mL)、0.004mL过氧化氢酶水溶液(724 200U/mL)、0.065mL半乳糖氧化酶(2705U/mL在100mM K3PO4缓冲液中的溶液,pH 6.0)。用氧气吹扫全部反应体系，搅拌60min。通过HPLC监测反应过程。将各个反应的结果概括在图3中。
实施例3：L-岩藻糖醇浓度对L-岩藻糖醇的生物催化氧化的影响
以1.0mL量级进行以下实验：
25g/LL-岩藻糖醇：向0.100mL L-岩藻糖醇溶液(100mg/mL)中加入0.231mL水，然后加入0.040mL K2HPO4/KH2PO4缓冲溶液pH 7.0、0.005mL过氧化物酶水溶液(7500U/mL)、0.004mL过氧化氢酶水溶液(724 200U/mL)、0.065mL半乳糖氧化酶(2705U/mL在100mM K3PO4缓冲液中的溶液,pH 6.0)。50g/LL-岩藻糖醇：将0.020g L-岩藻糖醇加入到0.281mL水中，然后加入0.040mL K2HPO4/KH2PO4缓冲溶液pH 7.0、0.004mL过氧化物酶水溶液(7500U/mL)、0.0032mL过氧化氢酶水溶液(724 200U/mL)、0.052mL半乳糖氧化酶(2705U/mL在100mMK3PO4缓冲液中的溶液,pH 6.0)。100g/LL-岩藻糖醇：将0.040g L-岩藻糖醇加入到0.202mL水中，然后加入0.040mL K2HPO4/KH2PO4缓冲溶液pH 7.0、0.0080mL过氧化物酶水溶液(7500U/mL)、0.0064mL过氧化氢酶水溶液(724 200U/mL)、0.104mL半乳糖氧化酶(2705U/mL在100mM K3PO4缓冲液中的溶液,pH 6.0)。200g/LL-岩藻糖醇：将0.080g L-岩藻糖醇加入到0.044mL水中，然后加入0.040mL K2HPO4/KH2PO4缓冲溶液pH 7.0、0.0160mL过氧化物酶水溶液(7500U/mL)、0.0127mL过氧化氢酶水溶液(724 200U/mL)、0.207mL半乳糖氧化酶(2705U/mL在100mM K3PO4缓冲液中的溶液pH 6.0)。用氧气吹扫全部反应体系，搅拌60min。通过HPLC监测反应过程。将结果概括在图2中。
图4显示了进一步的对照实验，其中还研究了L-岩藻糖对L-岩藻糖醇转化率的影响。
实施例4：半乳糖氧化酶的发酵生产和回收
用适合的其中镰刀菌属菌种的野生型半乳糖氧化酶基因已被克隆的载体转化巴斯德毕赤酵母。作为载体，任何可用的毕赤酵母属相容载体被证明是有用的。另外，使用了不同的标记，以帮助纯化所获得的酶和/或使其分泌到培养上清液中。选择甲醇诱导型启动子作为启动子。这表明毕赤酵母属在发酵罐等级上适合作为宿主生物体，以诱导大量半乳糖氧化酶的表达。任选地从培养上清液中分离或回收所获得的半乳糖氧化酶，并任选地进行纯化。回收的半乳糖氧化酶具有约3000U/g的活性。在使用丝状真菌作为重组真菌的情况下，半乳糖氧化酶的分泌也直接进入培养上清液。
进行了使用包含大肠杆菌和各种众所周知的真菌菌株的另外的表达菌株的另外实例，并相应地适应性改变了使用的载体、控制元件、培养基和培养条件。这些改变是本领域技术人员众所周知的。所有这些表达得到足量、足够纯度和足够活性的半乳糖氧化酶，以便催化L-岩藻糖的生物催化生产。已经证实酵母和真菌菌株是特别优选的菌株。

Claims (37)

1.用于生产L-岩藻糖的方法，包括下列步骤：
(a)提供L-岩藻糖醇，
(b)提供酶种类EC 1.1.3.9的半乳糖氧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶，
(c)采用所述半乳糖氧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶氧化L-岩藻糖醇，并且在允许L-岩藻糖醇生物催化氧化成L-岩藻糖的条件下，对得到的混合物进行温育，
(d)任选地：分离合成的L-岩藻糖。
2.如权利要求1的方法，其中步骤(b)包含下列子步骤：
(b1)提供重组微生物，其用于酶种类EC 1.1.3.9的半乳糖氧化酶的重组表达，其中所述微生物包含编码半乳糖氧化酶的转基因，所述半乳糖氧化酶来自肉座菌目的真菌，
(b2)在允许合成半乳糖氧化酶的条件下培养所述重组微生物，
(b3)任选地：分离合成的半乳糖氧化酶。
3.如权利要求2的方法，中所述重组微生物选自：大肠杆菌菌种，芽孢杆菌属菌种，其中所述重组微生物表达编码半乳糖氧化酶的转基因和任选的、编码过氧化物酶和/或过氧化氢酶的转基因。
4.如权利要求3的方法，其中所述重组微生物选自大肠杆菌BL21、大肠杆菌MG1655或大肠杆菌W3110，或地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌，其中所述重组微生物表达编码半乳糖氧化酶的转基因和任选的、编码过氧化物酶和/或过氧化氢酶的转基因。
5.如权利要求1的方法，其中步骤(b)包含下列子步骤：
(b1)提供重组微生物，其用于酶种类EC 1.1.3.9的半乳糖氧化酶的重组表达，其中所述微生物包含编码半乳糖氧化酶的转基因，其中所述半乳糖氧化酶来自镰刀菌属的真菌，
(b2)在允许合成半乳糖氧化酶的条件下培养所述重组微生物，
(b3)任选地：分离合成的半乳糖氧化酶。
6.如权利要求5的方法，其中所述转基因编码半乳糖氧化酶，所述半乳糖氧化酶来自尖孢镰菌。
7.如权利要求5的方法，中所述重组微生物选自：大肠杆菌菌种，芽孢杆菌属菌种，其中所述重组微生物表达编码半乳糖氧化酶的转基因和任选的、编码过氧化物酶和/或过氧化氢酶的转基因。
8.如权利要求7的方法，其中所述重组微生物选自大肠杆菌BL21、大肠杆菌MG1655或大肠杆菌W3110，或地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌，其中所述重组微生物表达编码半乳糖氧化酶的转基因和任选的、编码过氧化物酶和/或过氧化氢酶的转基因。
9.如权利要求1至8任一项的方法，其中所述过氧化物酶选自酶种类EC 1.11.1.7的过氧化物酶。
10.如权利要求1至8任一项的方法，其中所述过氧化氢酶选自酶种类EC 1.11.1.6的过氧化氢酶。
11.如权利要求1至8任一项的方法，其中在步骤(c)中的温育开始时L-岩藻糖醇在混合物中的浓度为1-500g/L。
12.如权利要求1至8任一项的方法，其中在步骤(c)中的温育开始时半乳糖氧化酶在混合物中的浓度为0.005-6.25g/L。
13.如权利要求1至8任一项的方法，其中在步骤(c)中的温育开始时过氧化物酶在混合物中的浓度为0-0.5g/L。
14.如权利要求1至8任一项的方法，其中在步骤(c)中的温育开始时过氧化氢酶在混合物中的浓度为0-0.4g/L。
15.如权利要求3中所定义的重组微生物在权利要求1-4和9-14任一项的方法中的用途。
16.如权利要求7中所定义的重组微生物在权利要求1和5-14任一项的方法中的用途。
17.重组微生物用于重组表达在权利要求1、5-14任一项的方法中的半乳糖氧化酶的用途，其中所述微生物包含编码来自镰刀菌属真菌的半乳糖氧化酶的转基因，如权利要求5中所定义，其中所述重组微生物如权利要求7中所定义。
18.半乳糖氧化酶和其他酶用于生物催化转化L-岩藻糖醇为L-岩藻糖的用途，其中所述其他酶为过氧化物酶和过氧化氢酶，其中所述半乳糖氧化酶和所述过氧化物酶和/或所述过氧化氢酶通过包括下列步骤的方法获得：
(a)提供重组微生物，其用于重组表达半乳糖氧化酶和过氧化物酶和/或过氧化氢酶，其中所述微生物包含编码来自镰刀菌属真菌的半乳糖氧化酶的转基因，并且包含另外的编码过氧化物酶和/或过氧化氢酶的转基因，且其中所述重组微生物如权利要求7中所定义，或
(b1)提供第一种重组微生物，其用于半乳糖氧化酶的重组表达，其中所述微生物包含编码来自镰刀菌属真菌的半乳糖氧化酶的转基因；和
(b2)提供第二种重组微生物，其用于过氧化物酶的重组表达，其中所述微生物包含编码如权利要求9中所定义的过氧化物酶的转基因；和/或
(b3)提供第三种重组微生物，其用于过氧化氢酶的重组表达，其中所述微生物包含编码如权利要求10中所定义的过氧化氢酶的转基因；
(c)在允许合成所述半乳糖氧化酶和所述过氧化物酶和/或所述过氧化氢酶的适合条件下培养所述重组微生物，
(d)任选地：分离合成的半乳糖氧化酶和所述过氧化物酶和/或所述过氧化氢酶。
19.如权利要求17至18任一项的用途，其中所述重组微生物如权利要求8所定义。
20.如权利要求1的方法，其中步骤(b)包含下列子步骤：
(b1)提供重组真菌，其用于酶种类EC 1.1.3.9的半乳糖氧化酶的重组表达，其中所述真菌包含编码半乳糖氧化酶的转基因，所述半乳糖氧化酶来自肉座菌目的真菌，
(b2)在允许合成半乳糖氧化酶的条件下培养所述重组真菌，
(b3)任选地：分离合成的半乳糖氧化酶。
21.如权利要求20的方法，其中所述重组真菌选自：酵母纲，曲霉属菌种，或木霉属菌种，或子囊菌门的真菌，其中所述重组真菌表达编码半乳糖氧化酶的转基因和任选的、编码过氧化物酶和/或过氧化氢酶的转基因。
22.如权利要求21的方法，其中所述重组真菌选自巴斯德毕赤酵母，乳酸克鲁维酵母，或米曲霉、构巢曲霉或黑曲霉，或里氏木霉或哈茨木霉，或嗜热毁丝霉，其中所述重组真菌表达编码半乳糖氧化酶的转基因和任选的、编码过氧化物酶和/或过氧化氢酶的转基因。
23.如权利要求1的方法，其中步骤(b)包含下列子步骤：
(b1)提供重组真菌，其用于酶种类EC 1.1.3.9的半乳糖氧化酶的重组表达，其中所述真菌包含编码半乳糖氧化酶的转基因，其中所述半乳糖氧化酶来自镰刀菌属的真菌，
(b2)在允许合成半乳糖氧化酶的条件下培养所述重组真菌，
(b3)任选地：分离合成的半乳糖氧化酶。
24.如权利要求23的方法，其中所述转基因编码半乳糖氧化酶，所述半乳糖氧化酶来自尖孢镰菌。
25.如权利要求23的方法，其中所述重组真菌选自：酵母纲，曲霉属菌种，或木霉属菌种，或子囊菌门的真菌，其中所述重组真菌表达编码半乳糖氧化酶的转基因和任选的、编码过氧化物酶和/或过氧化氢酶的转基因。
26.如权利要求25的方法，其中所述重组真菌选自巴斯德毕赤酵母，乳酸克鲁维酵母，或米曲霉、构巢曲霉或黑曲霉，或里氏木霉或哈茨木霉，或嗜热毁丝霉，其中所述重组真菌表达编码半乳糖氧化酶的转基因和任选的、编码过氧化物酶和/或过氧化氢酶的转基因。
27.如权利要求20至26任一项的方法，其中所述过氧化物酶选自酶种类EC 1.11.1.7的过氧化物酶。
28.如权利要求20至26任一项的方法，其中所述过氧化氢酶选自酶种类EC 1.11.1.6的过氧化氢酶。
29.如权利要求20至26任一项的方法，其中在步骤(c)中的温育开始时L-岩藻糖醇在混合物中的浓度为1-500g/L。
30.如权利要求20至26任一项的方法，其中在步骤(c)中的温育开始时半乳糖氧化酶在混合物中的浓度为0.005-6.25g/L。
31.如权利要求20至26任一项的方法，其中在步骤(c)中的温育开始时过氧化物酶在混合物中的浓度为0-0.5g/L。
32.如权利要求20至26任一项的方法，其中在步骤(c)中的温育开始时过氧化氢酶在混合物中的浓度为0-0.4g/L。
33.如权利要求21中所定义的重组真菌在权利要求1、20-22和27-32任一项的方法中的用途。
34.如权利要求25中所定义的重组真菌在权利要求1、23-32任一项的方法中的用途。
35.重组真菌用于重组表达在权利要求1、23-32任一项的方法中的半乳糖氧化酶的用途，其中所述真菌包含编码来自镰刀菌属真菌的半乳糖氧化酶的转基因，如权利要求23中所定义，其中所述重组真菌如权利要求25中所定义。
36.半乳糖氧化酶和其他酶用于生物催化转化L-岩藻糖醇为L-岩藻糖的用途，其中所述其他酶为过氧化物酶和过氧化氢酶，其中所述半乳糖氧化酶和所述过氧化物酶和/或所述过氧化氢酶通过包括下列步骤的方法获得：
(a)提供重组真菌，其用于重组表达半乳糖氧化酶和过氧化物酶和/或过氧化氢酶，其中所述真菌包含编码来自镰刀菌属真菌的半乳糖氧化酶的转基因，并且包含另外的编码过氧化物酶和/或过氧化氢酶的转基因，且其中所述重组真菌如权利要求25中所定义，或
(b1)提供第一种重组真菌，其用于半乳糖氧化酶的重组表达，其中所述真菌包含编码来自镰刀菌属真菌的半乳糖氧化酶的转基因；和
(b2)提供第二种重组真菌，其用于过氧化物酶的重组表达，其中所述真菌包含编码如权利要求27中所定义的过氧化物酶的转基因；和/或
(b3)提供第三种重组真菌，其用于过氧化氢酶的重组表达，其中所述真菌包含编码如权利要求28中所定义的过氧化氢酶的转基因；
(c)在允许合成所述半乳糖氧化酶和所述过氧化物酶和/或所述过氧化氢酶的适合条件下培养所述重组真菌，
(d)任选地：分离合成的半乳糖氧化酶和所述过氧化物酶和/或所述过氧化氢酶。
37.如权利要求35至36任一项的用途，其中所述重组真菌如权利要求26所定义。
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