CN108795916B - 一种赖氨酸脱羧酶突变体、其编码基因及其表达和应用 - Google Patents
一种赖氨酸脱羧酶突变体、其编码基因及其表达和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108795916B CN108795916B CN201810787121.3A CN201810787121A CN108795916B CN 108795916 B CN108795916 B CN 108795916B CN 201810787121 A CN201810787121 A CN 201810787121A CN 108795916 B CN108795916 B CN 108795916B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- leu
- lysine decarboxylase
- ile
- thr
- glu
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/001—Amines; Imines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
- C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
- C12Y401/01018—Lysine decarboxylase (4.1.1.18)
Abstract
本发明公开了一种赖氨酸脱羧酶突变体，它是由氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的赖氨酸脱羧酶通过定点突变得到，为如下(1)和(2)中的任意一种：(1)将氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的赖氨酸脱羧酶的第12位的缬氨酸突变为半胱氨酸，第41位的天冬氨酸突变为半胱氨酸，得到赖氨酸脱羧酶突变体V12C/D41C；(2)将氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的赖氨酸脱羧酶的第89位的亮氨酸突变为半胱氨酸，第442位的亮氨酸突变为半胱氨酸，得到赖氨酸脱羧酶突变体L89C/L442C。本发明提供的赖氨酸脱羧酶突变体其在耐碱及催化性能方面有大幅度提高，更加适合工业化生产需求，满足社会生产的要求。
Description
技术领域
本发明涉及赖氨酸脱羧酶的突变，具体涉及一种赖氨酸脱羧酶突变体、其编码基因及其表达和应用。
背景技术
尼龙(PA)，作为工程塑料中最大最重要的品种，具有很强的生命力，主要在于它改性后实现高性能化，其次是汽车、电器、通讯、电子、机械等产业自身对产品高性能的要求越来越强烈。相关产业的飞速发展，促进了全球市场对尼龙需求量的不断提高。当前，传统尼龙材料都来源于石油产品，难以做到可持续性无疑是一个明显的缺陷。出于对全球环境问题的担忧和持续增加的废弃物处理难度的考虑，生物基尼龙材料是最理想的替代性材料。1,5-戊二胺作为生物基尼龙材料的重要单体，其工业化的生物合成也是必然趋势和一个亟待解决的问题。
赖氨酸脱羧酶(简称LCD)是一种生物体内高度专一性酶，能够催化赖氨酸脱去一个CO2分子，生成1,5-戊二胺的胞内酶。其来源广泛，在芽孢杆菌(Bacillus)、大肠杆菌(E.coli)、毛链霉菌(Streptomyces polosus)、峰房哈夫尼菌(Hafnia alvei)等微生物中都有发现LCD的存在。该酶需要磷酸吡哆醛(PLP)作为其辅酶，帮助其完成脱羧反应。
赖氨酸脱羧酶主要分为组成型酶LdcC和诱导型酶CadA(又称LdcI)，尽管LdcC具有更为广泛的最适pH值，但是其催化活性和稳定性比较差，因此很少用于赖氨酸的脱羧反应。与此相反，CadA由于较高的表达水平及更高的催化活性，通常用于戊二胺的生产。然而，在脱羧酶反应的情况下，一分子的赖氨酸被脱羧就会消耗一个质子，戊二胺的大量积累也伴随着反应体系pH的逐渐增加，这对于CadA的酶活及稳定性来说是不利的。在大肠杆菌本体天然途径中，CadA通常由细胞生长的酸性发酵产物如乙酸等引起的细胞质pH降低而诱导表达的。因此，与其他酶相比，CadA的结构稳定性及活性对于pH的变化十分敏感。虽然目前CadA被广泛用于戊二胺的生产研究，但是克服其原有的不稳定性对于开发戊二胺的工业化生产是必不可少的。
据报道，赖氨酸脱羧酶CadA本身是一个二聚体的结构，在行使功能的时候则是一个十聚体的结构，而当pH逐渐上升的时候，CadA会自动发生一个解聚的过程，变为二聚体的结构，此时，CadA的催化活性急剧下降。
发明内容
发明目的：为了解决现有的赖氨酸脱羧酶在高pH下耐受性能弱的问题，本发明第一方面提供了一种赖氨酸脱羧酶突变体，第二方面提供了赖氨酸脱羧酶突变体的编码基因，第三方面提供了赖氨酸脱羧酶突变体的表达及应用。
技术方案：本发明第一发明提供了一种赖氨酸脱羧酶突变体，它是由氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的赖氨酸脱羧酶通过定点突变得到，定点突变方法为如下(1)和(2)中的任意一种：
(1)将氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的赖氨酸脱羧酶的第12位的缬氨酸突变为半胱氨酸，第41位的天冬氨酸突变为半胱氨酸，得到赖氨酸脱羧酶突变体V12C/D41C；
(2)将氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的赖氨酸脱羧酶的第89位的亮氨酸突变为半胱氨酸，第442位的亮氨酸突变为半胱氨酸，得到赖氨酸脱羧酶突变体L89C/L442C。
通过分析赖氨酸脱羧酶十聚体的三级结构,排除位于脱羧酶单体内的氨基酸以及保守氨基酸外，选择了两对氨基酸，将其突变为二硫键更强的半胱氨酸，以提高二硫共价键的结合力。
优选地，所述赖氨酸脱羧酶突变体为赖氨酸脱羧酶突变体V12C/D41C。
本发明第二方面提供编码赖氨酸脱羧酶突变体的CadA基因，当赖氨酸脱羧酶突变体为赖氨酸脱羧酶突变体V12C/D41C时，CadA基因的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，赖氨酸脱羧酶突变体V12C/D41C的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示；当赖氨酸脱羧酶突变体为赖氨酸脱羧酶突变体L89C/L442C时，CadA基因的核苷酸序列如SEQ ID No:5所示，赖氨酸脱羧酶突变体L89C/L442C的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示。
本发明第三方面提供包含上述CadA基因的重组载体。
优选地，所述载体为pETDuet-1，重组载体的构建方法如下：
(1)构建重组质粒pETDuet-1-CadA
以大肠杆菌(E.coli)MG1655基因组为模板，以cadA基因两端的引物进行PCR扩增，得到的CadA片段克隆至载体pETDuet-1的NdeI和KpnI酶切位点之间，得到重组质粒pETDuet-1-CadA。
所述两端引物如下：
Primer1-F:5’-GGAATTCCATATGAACGTTATTGCAATATTG-3’
Primer1-R:5’-GGGGTACCTTATTTTTTGCTTTCTTCTTTC-3’；
(2)构建定点突变质粒
a、以步骤(1)构建的重组质粒pETDuet-1-CadA为模板，利用两轮PCR(聚合酶链式反应)体外扩增得到定点突变质粒pETDuet-1-CadA-M1(L89C/L442C)，即将第89位亮氨酸/第442位亮氨酸分别突变为半胱氨酸；用于定点突变的引物如下：
L89C primer-F：5’-GCTAATACGTATTCCACTTGCGATGTAAGCCTGAATG-3’
L89C primer-R：5’-CATTCAGGCTTACATCGCAAGTGGAATACGTATTAGC-3’
L442C primer-F：5’-CGTAAAGAGATCAAACGTTGCAGAACGGAATCTGATG-3’
L442C primer-R：5’-CATCAGATTCCGTTCTGCAACGTTTGATCTCTTTACG-3’
向通过PCR扩增得到的定点突变质粒中加入DpnI，异性切除甲基化的DNA链(即模板DNA)。
b、以步骤(1)构建的重组质粒pETDuet-1-CadA为模板，利用两轮PCR(聚合酶链式反应)体外扩增得到定点突变质粒pETDuet-1-CadA-M3(V12C/D41C)，即将第12位缬氨酸/第41位天冬氨酸分别突变为半胱氨酸；用于定点突变的引物如下：
V12C primer-F：5’-TATTGAATCACATGGGGTGCTATTTTAAAGAAGAACCC-3’
V12C primer-R：5’-TTCTTCTTTAAAATAGCACCCCATGTGATTCAATATTG-3’
D41C primer-F：5’-CCCGAACGACCGTGACTGCTTATTAAAACTGATCG-3’
D41C primer-R：5’-CGATCAGTTTTAATAAGCAGTCACGGTCGTTCGGG-3’。
向通过PCR扩增得到的定点突变质粒中加入DpnI，异性切除甲基化的DNA链(即模板DNA)。
本发明第四方面提供包含所述CadA基因的重组菌株。优选地，所述菌株为E.coliBL21(DE3)。
本方面第五方面提供一种表达赖氨酸脱羧酶突变体的方法，包括以下步骤：
(1)将含编码赖氨酸脱羧酶突变体的CadA基因的重组载体转化至E.coli BL21(DE3)中，得到重组菌株；
(2)将重组菌株活化后接种于LB培养基中，当OD600达到0.6-0.8时，加入IPTG诱导表达赖氨酸脱羧酶突变体。
优选地，步骤(2)中所述IPTG在LB培养基中的终浓度为0.01-1mM，所述诱导条件为18-37℃，10-12h。
优选地，步骤(1)中所述重组载体的出发载体为pETDuet-1；步骤(2)中所述活化为从甘油管中将重组菌株接种于含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，装液量为5mL/50mL；37℃、200rpm培养8-10h；重组菌的OD600达到0.6-0.8的培养条件为在含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中37℃，200rpm培养。
本发明第五方面提供所述赖氨酸脱羧酶突变体在合成1,5-戊二胺中的应用。本发明通过定点突变改造赖氨酸脱羧酶CadA基因，提高了其编码的赖氨酸脱羧酶在高pH或者高戊二胺浓度条件下十聚体的稳定性，使得酶活提高，耐碱性及催化性能增强；通过诱导胞内赖氨酸脱羧酶突变体表达，并利用全细胞或纯化的赖氨酸脱羧酶突变体催化赖氨酸发生脱羧反应，可显著提高1,5-戊二胺的产量。
本发明第六方面提供所述编码赖氨酸脱羧酶突变体的CadA基因在合成1,5-戊二胺中的应用。
有益效果：本发明通过定点突变改造赖氨酸脱羧酶CadA基因，提高了其编码的赖氨酸脱羧酶在高pH或者高戊二胺浓度条件下十聚体的稳定性，使得酶活提高，耐碱性及催化性能增强。其中，重组菌株E.coli BL21(DE3)(pETDuet-1-CadA-M3)(V12C/D41C)所表达的赖氨酸脱羧酶突变体在pH 8的条件下可以保持93％的酶活，在pH 10的条件下依然可以保持26％的酶活；同时其催化效率由突变前的88.9g/Lh提高至336g/Lh，1,5-戊二胺产量由突变前的220g/L提高至398g/L。本发明提供的赖氨酸脱羧酶突变体其在耐碱及催化性能方面有大幅度提高，更加适合工业化生产需求，满足社会生产的要求。
具体实施方式
实施例1重组质粒pETDuet-1-CadA的构建
以大肠杆菌MG1655(购于武汉淼灵生物科技有限公司)基因组为模板，以CadA基因两端的引物进行PCR扩增得到CadA片段(见表1)，然后克隆至载体pETDuet-1(购于武汉淼灵生物科技有限公司)的NdeI和KpnI酶切位点之间(见表2和表3)，得到重组质粒pETDuet-1-CadA。大肠杆菌MG1655中CadA基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，其编码的诱导型赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
其中，两端引物如下：
Primer1-F:5’-GGAATTCCATATGAACGTTATTGCAATATTG-3’
Primer2-R:5’-GGGGTACCTTATTTTTTGCTTTCTTCTTTC-3’；
表1 CadA基因的PCR反应体系及反应条件
表2载体pETDuet-1的酶切体系及酶切条件
表3 CadA片段和pETDuet-1片段的连接
实施例2定点突变质粒的构建
通过分析赖氨酸脱羧酶十聚体的三级结构,排除位于脱羧酶单体内的氨基酸以及保守氨基酸外，选择了三对氨基酸，将其突变为二硫键更强的半胱氨酸，以提高二硫共价键的结合力。
以实施例1制备的质粒pETDuet-1-CadA为模板，利用两轮PCR(聚合酶链式反应)体外扩增得到定点突变质粒pETDuet-1-CadA-M1(M2/M3)：M1(L89C/L442C)即将氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的赖氨酸脱羧酶第89位亮氨酸/第442位亮氨酸分别突变为半胱氨酸，M2(F102C/L547C)即将氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的赖氨酸脱羧酶第102位苯丙氨酸/第547位亮氨酸分别突变为半胱氨酸，M3(V12C/D41C)即将氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的赖氨酸脱羧酶第12位缬氨酸/第41位天冬氨酸分别突变为半胱氨酸。
(1)pETDuet-1-CadA-M1用于定点突变的引物如下：
L89C primer-F：5’-GCTAATACGTATTCCACTTGCGATGTAAGCCTGAATG-3’
L89C primer-R：5’-CATTCAGGCTTACATCGCAAGTGGAATACGTATTAGC-3’
L442C primer-F：5’-CGTAAAGAGATCAAACGTTGCAGAACGGAATCTGATG-3’
L442C primer-R：5’-CATCAGATTCCGTTCTGCAACGTTTGATCTCTTTACG-3’
(2)pETDuet-1-CadA-M2用于定点突变的引物如下：
F102C primer-F：5’-CGTTTACAGATTAGCTGCTTTGAATATGCGCTG-3’
F102C primer-R：5’-CAGCGCATATTCAAAGCAGCTAATCTGTAAACG-3’
L547C primer-F：5’-GATAAGACCAAAGCATGCAGCCTGCTGCGTG-3’
L547C primer-R：5’-CACGCAGCAGGCTGCATGCTTTGGTCTTATC-3’
(3)pETDuet-1-CadA-M3用于定点突变的引物如下：
V12C primer-F：5’-TATTGGGGTTTATTTGCTATTTTAAAGAAGAACCC-3’
V12C primer-R：5’-TTCTTCTTTAAAATAGCACCCCATGTGATTCAATATTG-3’
D41C primer-F：5’-CCCGAACGACCGTGACTGCTTATTAAAACTGATCG-3’
D41C primer-R：5’-CGATCAGTTTTAATAAGCAGTCACGGTCGTTCGGG-3’
以M1(L89C/L442C)突变为例，具体实施步骤如下。
(1)第一轮PCR扩增反应
以pETDuet-1-CadA为模板，用L89C位点的定点突变引物进行第一轮PCR体外扩增，反应体系及条件见表4：
表4 M1(L89C/L442C)第一轮PCR反应体系及反应条件
(2)DpnI消化
第一轮PCR结束后，得到产物质粒pETDuet-1-CadA-L89C的PCR原液。取上述产物10μL，并向其中加入1μL DpnI(购于北京全式金生物技术有限公司)，37℃消化2h，特异性切除甲基化的DNA链。
(3)第二轮PCR扩增反应
以pETDuet-1-CadA-L89C为模板，用L442C位点的定点突变引物进行第二轮PCR体外扩增，反应体系及条件见表5：
表5 M1(L89C/L442C)第二轮PCR反应体系及反应条件
(4)DpnI消化
第二轮PCR结束后，得到产物质粒pETDuet-1-CadA-M1的PCR原液。取上述产物10μL，并向其中加入1μL DpnI(购于北京全式金生物技术有限公司)，37℃消化2h，特异性切除甲基化的DNA链，得到pETDuet-1-CadA-M1。
M2(F102C/L547C)、M3(V12C/D41C)的两轮PCR扩增方法参照M1(L89C/L442C)，分别得到pETDuet-1-CadA-M2和pETDuet-1-CadA-M3。
实施例3突变表达载体的验证扩增
将实施例2得到的切除模板DNA后的PCR原液转化至E.coli Trans1-T1(购于北京全式金生物技术有限公司)感受态细胞中，涂布在含100mg/L氨苄青霉素抗性的LB平板上，将平板倒置于37℃培养箱中培养一夜。挑取数个单菌落，提取质粒测序，确认突变无误后，将正确质粒转化至E.coli BL21(DE3)(购于北京全式金生物技术有限公司)感受态细胞中，构建得到可以产生具有改良活性的赖氨酸脱羧酶突变体的菌株E.coli BL21(DE3)(pETDuet-1-CadA-M1(M2/M3))。
其中，含100mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基配方如下：蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；氯化钠5g/L；琼脂粉25g/L；氨苄青霉素0.1g/L。
其中，DNA转化的方法为：
取20μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞移至新的转化管中，向感受态细胞中加入0.1-10ng(2-5μL)的转化用DNA，轻轻混匀后冰上放置20-30min。42℃水浴中放置45s后，立即与冰上放置3min。加入800μL LB培养基，37℃振荡培养1-2h。5000rpm离心3min，取700μL上清弃掉。将菌体重悬于剩余的100μL培养基中，涂平板。将平板倒置于37℃培养箱中培养一夜，得到重组菌。
实施例4赖氨酸脱羧酶突变体的表达
从甘油管中将重组菌E.coli BL21(DE3)(pETDuet-1-CadA-M1(M2/M3))分别接种于含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，装液量为5mL/50mL，37℃，200rpm培养8-10h。然后将培养8-10h的种子液以1％(V/V)的接种量接入含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，装液量为100mL/500mL，37℃，200rpm培养。当重组菌生长到OD600＝0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导，37℃，200rpm诱导发酵10-12h。
其中，含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基配方如下：蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；氯化钠5g/L；氨苄青霉素0.1g/L。
实施例5突变前后赖氨酸脱羧酶的耐碱性能对比
将实施例1构建的重组质粒pETDuet-1-CadA转化至E.coli BL21(DE3)(购于北京全式金生物技术有限公司)感受态细胞中得到E.coli BL21(DE3)(pETDuet-1-CadA)；并按照实施例4的方法对E.coli BL21(DE3)(pETDuet-1-CadA)、E.coli BL21(DE3)(pETDuet-1-CadA-M1(M2/M3))进行发酵诱导。发酵结束后，离心收集菌体，弃掉上清。将菌体沉淀分别重悬于pH 6.0、pH 8.0的PBS缓冲液以及pH 9.0、pH10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中，超声破碎，离心去除蛋白碎片，得到粗酶液。在同等蛋白量的情况下，加入100g/L的赖氨酸溶液进行脱羧反应。以未突变E.coli BL21(DE3)(pETDuet-1-CadA)(wild-type)在pH6.0的缓冲溶液下的酶活为对照(100％)，计算其余条件下的相对酶活，结果见表6。
其中，赖氨酸脱羧酶的酶活定义如下：1min内转化1mmol底物所需的酶量(V)为一个活力单位，其单位为U。
具体测定方法为：取一定量粗酶液，加入50mM赖氨酸，5min后取样，12000rpm离心1min，取上清，利用SBA生物传感仪进行赖氨酸含量测定。酶活计算方法为：
所用酶量(V)/(赖氨酸消耗量/5min)
相对酶活的计算方法为：[酶活(Un)/对照组酶活(U0)]×100％。其中，Un代表不同条件下的酶活，U0代表未突变CadA(wild-type)在pH6.0的缓冲溶液下的酶活。
表6不同菌株表达的赖氨酸脱羧酶的pH稳定性及最适pH
实施例6突变前后赖氨酸脱羧酶的催化性能对比
将实施例1构建的重组质粒pETDuet-1-CadA转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中得到E.coli BL21(DE3)(pETDuet-1-CadA)；并按照实施例4的方法对E.coli BL21(DE3)(pETDuet-1-CadA)、E.coli BL21(DE3)(pETDuet-1-CadA-M1(M2/M3))进行发酵诱导。发酵结束后，离心收集菌体，弃掉上清。将菌体沉淀分别重悬于pH 6.0的PBS缓冲液中，在同等菌体量的情况下，加入200g/L的赖氨酸溶液,37℃，200rpm条件下进行脱羧反应。待赖氨酸反应完后，再向体系中加入一定量固体赖氨酸，使其终浓度达到150g/L。多次反应后，测定及计算多次反应后赖氨酸脱羧酶及其突变体的催化效率、脱羧反应结束最终戊二胺浓度，结果见表7。
表7不同菌株的催化效率及产物戊二胺的浓度
由表6和表7可知，重组菌E.coli BL21(DE3)(pETDuet-1-CadA-M3)在pH 10的条件下依然可以保持26％的酶活，在pH 8的条件下可以保持93％的酶活。同时，利用重组菌E.coli BL21(DE3)(pETDuet-1-CadA-M3)进行批次反应，戊二胺浓度可积累至398g/L，是突变前的1.5倍。对于突变体M2来说，后经过分析，M2突变的两处位点，其中102位的苯丙氨酸在β折叠的位置，变成半胱氨酸后，其折叠方向会发生改变，因此会导致酶活下降。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种赖氨酸脱羧酶突变体、其编码基因及其表达和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2127
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 1
atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt 60
gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120
gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat 180
aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac 240
gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt 300
agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc 360
actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt 420
cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa 480
agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt 540
tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600
gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660
tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccgg caggcagcac cattctgatt 720
gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780
tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840
cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900
gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960
acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020
ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080
gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140
aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200
ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa gggtaatgct 1260
ggtaagcgtc tgatcaacgg ttccattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320
cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgttt ggcagccgga tcatatcgat 1380
acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440
aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500
gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560
catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620
atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgacttcaa acgtgcgttc 1680
gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740
tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct caaaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800
aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860
tatgctgcgt tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg 1920
gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtatccgc cgggagttcc tctggtaatg 1980
ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt 2040
gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct 2100
gatggccgct ataccgttaa ggtattg 2127
<210> 2
<211> 709
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 2
Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu
1 5 10 15
Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln
20 25 30
Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn
35 40 45
Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu
50 55 60
Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr
65 70 75 80
Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp
100 105 110
Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile
115 120 125
Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys
130 135 140
Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys
145 150 155 160
Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met
165 170 175
Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp
180 185 190
His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe
195 200 205
Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn
210 215 220
Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile
225 230 235 240
Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp
245 250 255
Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu
260 265 270
Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg
275 280 285
Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys
305 310 315 320
Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr
325 330 335
Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly
340 345 350
Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu
355 360 365
Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val
370 375 380
Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser
385 390 395 400
Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met
405 410 415
Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala
420 425 430
Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly
435 440 445
Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys
450 455 460
Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp
465 470 475 480
Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro
485 490 495
Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser
500 505 510
Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr
515 520 525
Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr
530 535 540
Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe
545 550 555 560
Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu
565 570 575
Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn
580 585 590
Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg
595 600 605
Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe
610 615 620
Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met
625 630 635 640
Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val
645 650 655
Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val
660 665 670
Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly
675 680 685
Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr
690 695 700
Thr Val Lys Val Leu
705
<210> 3
<211> 2127
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 3
atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg gggtgctatt ttaaagaaga acccatccgt 60
gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120
tgcttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat 180
aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac 240
gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt 300
agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc 360
actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt 420
cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa 480
agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt 540
tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600
gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660
tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccgg caggcagcac cattctgatt 720
gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780
tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840
cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900
gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960
acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020
ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080
gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140
aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200
ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa gggtaatgct 1260
ggtaagcgtc tgatcaacgg ttccattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320
cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgttt ggcagccgga tcatatcgat 1380
acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440
aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500
gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560
catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620
atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgacttcaa acgtgcgttc 1680
gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740
tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct caaaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800
aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860
tatgctgcgt tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg 1920
gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtatccgc cgggagttcc tctggtaatg 1980
ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt 2040
gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct 2100
gatggccgct ataccgttaa ggtattg 2127
<210> 4
<211> 709
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 4
Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Cys Tyr Phe Lys Glu
1 5 10 15
Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln
20 25 30
Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Cys Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn
35 40 45
Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu
50 55 60
Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr
65 70 75 80
Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp
100 105 110
Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile
115 120 125
Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys
130 135 140
Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys
145 150 155 160
Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met
165 170 175
Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp
180 185 190
His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe
195 200 205
Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn
210 215 220
Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile
225 230 235 240
Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp
245 250 255
Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu
260 265 270
Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg
275 280 285
Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys
305 310 315 320
Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr
325 330 335
Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly
340 345 350
Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu
355 360 365
Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val
370 375 380
Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser
385 390 395 400
Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met
405 410 415
Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala
420 425 430
Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly
435 440 445
Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys
450 455 460
Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp
465 470 475 480
Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro
485 490 495
Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser
500 505 510
Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr
515 520 525
Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr
530 535 540
Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe
545 550 555 560
Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu
565 570 575
Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn
580 585 590
Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg
595 600 605
Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe
610 615 620
Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met
625 630 635 640
Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val
645 650 655
Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val
660 665 670
Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly
675 680 685
Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr
690 695 700
Thr Val Lys Val Leu
705
<210> 5
<211> 2127
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 5
atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt 60
gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120
gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat 180
aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac 240
gcgttcgcta atacgtattc cacttgcgat gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt 300
agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc 360
actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt 420
cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa 480
agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt 540
tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600
gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660
tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccgg caggcagcac cattctgatt 720
gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780
tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840
cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900
gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960
acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020
ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080
gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140
aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200
ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa gggtaatgct 1260
ggtaagcgtc tgatcaacgg ttccattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320
cgttgcagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgttt ggcagccgga tcatatcgat 1380
acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440
aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500
gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560
catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620
atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgacttcaa acgtgcgttc 1680
gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740
tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct caaaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800
aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860
tatgctgcgt tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg 1920
gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtatccgc cgggagttcc tctggtaatg 1980
ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt 2040
gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct 2100
gatggccgct ataccgttaa ggtattg 2127
<210> 6
<211> 709
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 6
Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu
1 5 10 15
Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln
20 25 30
Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn
35 40 45
Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu
50 55 60
Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr
65 70 75 80
Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Cys Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp
100 105 110
Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile
115 120 125
Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys
130 135 140
Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys
145 150 155 160
Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met
165 170 175
Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp
180 185 190
His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe
195 200 205
Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn
210 215 220
Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile
225 230 235 240
Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp
245 250 255
Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu
260 265 270
Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg
275 280 285
Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys
305 310 315 320
Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr
325 330 335
Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly
340 345 350
Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu
355 360 365
Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val
370 375 380
Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser
385 390 395 400
Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met
405 410 415
Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala
420 425 430
Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Cys Arg Thr Glu Ser Asp Gly
435 440 445
Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys
450 455 460
Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp
465 470 475 480
Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro
485 490 495
Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser
500 505 510
Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr
515 520 525
Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr
530 535 540
Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe
545 550 555 560
Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu
565 570 575
Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn
580 585 590
Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg
595 600 605
Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe
610 615 620
Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met
625 630 635 640
Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val
645 650 655
Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val
660 665 670
Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly
675 680 685
Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr
690 695 700
Thr Val Lys Val Leu
705
Claims (9)
1.一种赖氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，它是由氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的赖氨酸脱羧酶通过定点突变得到，定点突变方法为如下(1)和(2)中的任意一种：
(1)将氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的赖氨酸脱羧酶的第12位的缬氨酸突变为半胱氨酸，第41位的天冬氨酸突变为半胱氨酸，得到赖氨酸脱羧酶突变体V12C/D41C；
(2)将氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的赖氨酸脱羧酶的第89位的亮氨酸突变为半胱氨酸，第442位的亮氨酸突变为半胱氨酸，得到赖氨酸脱羧酶突变体L89C/L442C。
2.根据权利要求1所述的赖氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，其为赖氨酸脱羧酶突变体V12C/D41C。
3.编码权利要求1所述赖氨酸脱羧酶突变体的CadA基因，其特征在于，当赖氨酸脱羧酶突变体为赖氨酸脱羧酶突变体V12C/D41C时，CadA基因的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；当赖氨酸脱羧酶突变体为赖氨酸脱羧酶突变体L89C/L442C时，CadA基因的核苷酸序列如SEQ ID No:5所示。
4.包含权利要求3所述CadA基因的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，起始载体为pETDuet-1。
6.包含权利要求3所述CadA基因的重组菌株。
7.一种表达赖氨酸脱羧酶突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将权利要求4或5所述的重组载体转化至E.coli BL21(DE3)中，得到重组菌株；
(2)将重组菌株活化后接种于LB培养基中，当OD600达到0.6-0.8时，加入IPTG诱导表达赖氨酸脱羧酶突变体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述IPTG在LB培养基中的终浓度为0.01-1mM，所述诱导条件为18-37℃，10-12h。
9.权利要求1或2所述的赖氨酸脱羧酶突变体在合成1,5-戊二胺中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810787121.3A CN108795916B (zh) | 2018-07-16 | 2018-07-16 | 一种赖氨酸脱羧酶突变体、其编码基因及其表达和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810787121.3A CN108795916B (zh) | 2018-07-16 | 2018-07-16 | 一种赖氨酸脱羧酶突变体、其编码基因及其表达和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108795916A CN108795916A (zh) | 2018-11-13 |
| CN108795916B true CN108795916B (zh) | 2020-02-21 |
Family
ID=64077333
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810787121.3A Active CN108795916B (zh) | 2018-07-16 | 2018-07-16 | 一种赖氨酸脱羧酶突变体、其编码基因及其表达和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108795916B (zh) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109880859A (zh) * | 2019-04-01 | 2019-06-14 | 南京工业大学 | 一种固定化赖氨酸脱羧酶生产戊二胺的方法 |
| CN111187785B (zh) * | 2020-02-12 | 2021-07-16 | 浙江中医药大学 | 一种短小蛇根草色氨酸脱羧酶基因OpTDC2的克隆表达及应用 |
| CN111411119A (zh) * | 2020-03-13 | 2020-07-14 | 南京凯诺生物科技有限公司 | 一种耦合产戊二胺和丁二酸的重组大肠杆菌的构建及其应用 |
| CN112746067B (zh) * | 2021-01-26 | 2023-10-31 | 洛阳华荣生物技术有限公司 | 用于制备d-鸟氨酸的赖氨酸脱羧酶突变体 |
| CN112899261B (zh) * | 2021-03-25 | 2022-03-29 | 美邦美和生物科技有限公司 | 赖氨酸脱羧酶突变体、其编码基因及应用 |
| CN115125229B (zh) * | 2021-03-25 | 2023-11-14 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种用于合成戊二胺的赖氨酸脱羧酶突变体 |
| CN113604444B (zh) * | 2021-07-27 | 2023-07-14 | 华东理工大学 | 一种催化活性提高的羧酸还原酶突变体及其编码基因、基因工程菌以及应用 |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006078039A1 (en) * | 2005-01-18 | 2006-07-27 | Ajinomoto Co., Inc. | L-amino acid producing microorganism and a method for producing l-amino acid |
| WO2009076226A1 (en) * | 2007-12-07 | 2009-06-18 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | Mutants of lysine decarboxylase, vaccines for periodontitis, and methods of use |
| EP2806026A1 (en) * | 2012-01-18 | 2014-11-26 | Mitsui Chemicals, Inc. | Production method for 1,5-pentamethylenediamine, production method for mutant lysine decarboxylase and 1,5-pentamethylene diisocyanate, and production method for polyisocyanate composition |
| CN104498519A (zh) * | 2014-12-19 | 2015-04-08 | 南京工业大学 | 一种表达重组载体及其应用 |
| CN103789292B (zh) * | 2013-12-26 | 2015-10-21 | 南京工业大学 | 一种赖氨酸脱羧酶、制备方法及其应用 |
| CN107074915A (zh) * | 2015-01-30 | 2017-08-18 | 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 | 参与赖氨酸脱羧作用的产酸克雷伯氏菌多肽的表达及其方法和应用 |
| CN107164352A (zh) * | 2017-05-16 | 2017-09-15 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 新的赖氨酸脱羧酶突变体及其应用 |
| CN108138160A (zh) * | 2015-08-06 | 2018-06-08 | 首尔大学校产学协力团 | 赖氨酸脱羧酶的突变型开发方法及其应用 |
| WO2018120026A1 (en) * | 2016-12-30 | 2018-07-05 | Cathay R&D Center Co., Ltd. | Modified lysine decarboxylase enzymes |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105316270B (zh) * | 2014-06-27 | 2019-01-29 | 宁夏伊品生物科技股份有限公司 | 一种催化生产1,5-戊二胺的工程菌及其应用 |
-
2018
- 2018-07-16 CN CN201810787121.3A patent/CN108795916B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006078039A1 (en) * | 2005-01-18 | 2006-07-27 | Ajinomoto Co., Inc. | L-amino acid producing microorganism and a method for producing l-amino acid |
| WO2009076226A1 (en) * | 2007-12-07 | 2009-06-18 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | Mutants of lysine decarboxylase, vaccines for periodontitis, and methods of use |
| EP2806026A1 (en) * | 2012-01-18 | 2014-11-26 | Mitsui Chemicals, Inc. | Production method for 1,5-pentamethylenediamine, production method for mutant lysine decarboxylase and 1,5-pentamethylene diisocyanate, and production method for polyisocyanate composition |
| CN103789292B (zh) * | 2013-12-26 | 2015-10-21 | 南京工业大学 | 一种赖氨酸脱羧酶、制备方法及其应用 |
| CN104498519A (zh) * | 2014-12-19 | 2015-04-08 | 南京工业大学 | 一种表达重组载体及其应用 |
| CN107074915A (zh) * | 2015-01-30 | 2017-08-18 | 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 | 参与赖氨酸脱羧作用的产酸克雷伯氏菌多肽的表达及其方法和应用 |
| CN108138160A (zh) * | 2015-08-06 | 2018-06-08 | 首尔大学校产学协力团 | 赖氨酸脱羧酶的突变型开发方法及其应用 |
| WO2018120026A1 (en) * | 2016-12-30 | 2018-07-05 | Cathay R&D Center Co., Ltd. | Modified lysine decarboxylase enzymes |
| CN107164352A (zh) * | 2017-05-16 | 2017-09-15 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 新的赖氨酸脱羧酶突变体及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 登录号：EFJ68548，lysine decarboxylase, inducible [Escherichia coli MS 175-1];Weinstock,G.等;《GenBank数据库》;20130606;参见序列信息 * |
| 通过DNA改组技术定向进化赖氨酸脱羧酶基因cadA和ldc;张凯等;《生物加工过程》;20150930;第13卷(第5期);第20-25页，参见全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108795916A (zh) | 2018-11-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108795916B (zh) | 一种赖氨酸脱羧酶突变体、其编码基因及其表达和应用 | |
| CN111269900B (zh) | 一种l-氨基酸脱氨酶突变体的制备及其应用 | |
| CN112391372B (zh) | 一种谷氨酸脱羧酶突变体、基因工程菌及其应用 | |
| CN112877307B (zh) | 一种氨基酸脱氢酶突变体及其应用 | |
| CN113621600B (zh) | 一种高活性腈水合酶突变体及其应用 | |
| WO2004056990A1 (ja) | 新規なニトリルヒドラターゼ | |
| US7399624B2 (en) | Cephalosporin C acylases | |
| CN113151230A (zh) | 一种甲醛裂合酶的突变体蛋白及其应用 | |
| CN108865962B (zh) | 一种可高效可溶性表达4-α-糖基转移酶的大肠杆菌工程菌 | |
| You et al. | Characterization of a prodigiosin synthetase PigC from Serratia marcescens jx-1 and its application in prodigiosin analogue synthesis | |
| CN111748535B (zh) | 一种丙氨酸脱氢酶突变体及其在发酵生产l-丙氨酸中的应用 | |
| CN113817693B (zh) | 一种短链羰基还原酶PpYSDR突变体、编码基因、重组表达载体、基因工程菌及应用 | |
| WO2018165881A1 (zh) | 一种头孢菌素c酰化酶突变体及其应用 | |
| CN113151135A (zh) | 一种食品安全级枯草芽孢杆菌及其在生产几丁二糖脱乙酰酶中的应用 | |
| CN112824527A (zh) | 人工设计的赖氨酰内切酶及编码序列和发酵方法 | |
| US11760988B2 (en) | L-aspartate alpha-decarboxylase mutant and application thereof | |
| CN112831532B (zh) | 一种酶促合成d-亮氨酸的方法 | |
| CN111172143B (zh) | D-木糖酸脱水酶及其应用 | |
| CN109251923B (zh) | 丝氨酸消旋酶突变体 | |
| CN114672525A (zh) | N-乙酰基-5-甲氧基色胺的生物合成方法及其应用 | |
| CN115011569B (zh) | 一种老黄酶NemR-PS突变体及其在制备(S)-香茅醇中的应用 | |
| CN114752572B (zh) | 甲酸脱氢酶突变体及其应用 | |
| KR20120079676A (ko) | 올레산 수화효소 및 그 효소 함유 재조합 미생물을 이용한 10-하이드록시스테아르 산 제조방법 | |
| CN117402846B (zh) | L-丙氨酸脱氢酶突变体及其制备方法和应用 | |
| CN108866017B (zh) | 一种酶法制备β-羟基-β-甲基丁酸的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |