CN114752572B - 甲酸脱氢酶突变体及其应用 - Google Patents

甲酸脱氢酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了甲酸脱氢酶突变体及其应用。所述甲酸脱氢酶突变体包括如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列在第54位、第121位和第228位中的至少一个氨基酸处的突变。本发明所提供的甲酸脱氢酶相比于常规野生型的甲酸脱氢酶对NMN有更高的还原酶活，其酶活力达到野生型的80～886倍左右，能够高效还原NMN为NMNH，这种高催化活性使其可以以粗酶的形式使用而不需要纯化，或者仅部分纯化之后就可以使用。因而可以大幅降低生产成本，从而适用于大规模工业化生产，更具有市场竞争力。

Description

甲酸脱氢酶突变体及其应用
技术领域
本申请涉及酶工程技术领域，尤其是涉及甲酸脱氢酶突变体及其应用。
背景技术
还原态烟酰胺单核苷酸(Reduced form of Nicotinamide mononucleotide，NMNH)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)的前体之一。细胞内NAD+水平的下降，会导致细胞老化和老化相关的疾病，而额外补充NMN和NR可以维持NAD+水平。目前有研究发现，NMNH作为烟酰胺单核苷酸酰基转移酶(NMNAT)的调节因子，相比NMN和NR能更有效地增加NAD+水平，并有效控制细胞新陈代谢速度。因此NMNH成为一种潜在的重要NAD+增强剂。
然而，NMNH作为一种非典型的还原性辅酶因子，除了极少数的黄素还原酶以外，绝大多数的天然氧化还原酶对NMNH催化合成活性极低，导致生产成本过高，市场竞争力较小，严重限制了该产品的应用。
发明内容
本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种对NMN有高还原酶活的甲酸脱氢酶突变体及其应用。
本申请的第一方面，提供甲酸脱氢酶突变体，所述突变体包括如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列在第54位、第121位和第228位中的至少一个氨基酸处的突变。
在本发明的一些实施方式中，所述如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列在第54位突变为天冬酰胺；
所述如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列在第121位突变为赖氨酸；
所述如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列在第228位突变为赖氨酸。
在本发明的一些实施方式中，所述甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.2～SEQ ID NO.4任一项所示；
在本发明的一些优选实施方式中，所述甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
本申请的第二方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列为(A1)或(A2)：
(A1)编码上述甲酸脱氢酶突变体的核苷酸序列；
(A2)与(A1)的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
在本发明的一些优选实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.8任一项所示。
本申请的第三方面，提供一种载体，所述载体可表达本发明第一方面所述的甲酸脱氢酶突变体或含有本发明第二方面所述的核酸分子。
在本发明的一些实施方式中，所述载体为pET、pCW、pUC或pPIC9k。
本申请的第四方面，提供一种重组细胞，含有本发明第三方面所述的载体，所述重组细胞非动物或植物新品种。
在本发明的一些实施方式中，所述重组细胞选自大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、链霉菌、枯草芽孢杆菌等本领域熟知的能够用于表达目的蛋白的真核或原核细胞。
本发明的第五个方面，提供本发明第一方面所述的甲酸脱氢酶突变体或本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的载体或本发明第四方面所述的重组细胞在(B1)或(B2)中的应用：
(B1)催化合成NMNH；
(B2)制备催化合成NMNH的产品。
本发明的第六个方面，提供一种产品，包含本发明第一方面所述的甲酸脱氢酶突变体或本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的载体或本发明第四方面所述的重组细胞。
本发明的第七个方面，提供甲酸脱氢酶突变体的制备方法：通过培养本发明第四方面所述的重组细胞，获得培养物，从培养物中分离出甲酸脱氢酶突变体。
在本发明的一些实施方式中，在分离出甲酸脱氢酶突变体的粗酶液后，可以对其进行进一步的纯化以获得更高纯度的甲酸脱氢酶突变体。
本发明的第八个方面，提供一种NMNH的制备方法，包含以下步骤：
提供甲酸和NMN作为底物；
将底物与上述的甲酸脱氢酶突变体接触，催化合成NMNH。
其中，提供甲酸和NMN作为底物是指直接提供甲酸和NMN，在甲酸脱氢酶突变体的催化下，甲酸转移氢质子至NMN上，生成二氧化碳和NMNH。另外，催化合成过程中所需的其它反应助剂或反应条件可以根据反应过程相应的合成步骤中所使用的酶的最适反应温度等条件进行相应的调整。
在本发明的一些实施方式中，NMNH的制备方法包括以下步骤：
(a)向反应器中加入包含底物的溶液，调节溶液的pH至7.0～8.0；
(b)向溶液中加入甲酸脱氢酶，得到反应体系；
(c)控制体系温度约为36～39℃，保持反应体系的pH在7.0～8.0之间，进行催化反应；
(d)得到含NMNH的粗溶液；
(e)将粗溶液过滤、纯化、干燥，得到NMNH。
其中，甲酸脱氢酶突变体以及其它一些反应过程中所需的酶，以酶溶液、酶冻干粉、含酶细胞、固定化酶或固定化酶的细胞等其中至少一种形式参与催化反应。
本发明的有益效果是：
本发明提供了甲酸脱氢酶突变体，编码抗菌肽的核酸分子以及包含上述核酸分子的表达载体或重组细胞。与现有甲酸脱氢酶相比，本发明所提供的甲酸脱氢酶相比于常规野生型的甲酸脱氢酶对NMN有更高的还原酶活，其酶活力达到野生型的80～886倍左右，能够高效还原NMN为NMNH，这种高催化活性使其可以以粗酶的形式使用而不需要纯化，或者仅部分纯化之后就可以使用。因而可以大幅降低生产成本，从而适用于大规模工业化生产，更具有市场竞争力。
附图说明
图1为实施例3中底物NMN的HPLC图。
图2为实施例3中NMNH的HPLC图。
图3为NMNH的核磁共振氢谱图。
图4为图3的局部放大图。
图5为图3的局部放大图。
图6为NMNH的核磁共振碳谱图。
图7为图6的局部放大图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1甲酸脱氢酶突变体的制备
本实施例提供一种甲酸脱氢酶，其制备方法如下：
1.重组质粒和重组菌的制备
本实施例所采用的亲本甲酸脱氢酶来自于Pandoraea commovens，其氨基酸序列如下所示(GenBank：VVE30574.1)：
MAKIVCVLYDDPVTGYPKTYARDDLPKIECYPDGQTLPTPRAIDFQPGALLGSVSGELGLRKYLESNGHELVVTSSKDGDNSVLDRELADAEIVISQPFWPAYMTAERIKRAKKLKMIVTAGIGSDHTDLQAAMEHGITVAEVTYCNSNSVAEHVMMTTLALVRNYLPSYQWVLKGGWNIADCVERSYDLEGMHVGTVAAGRIGLRVLRLMKPFGTHLHYLDRHRLPESVEKELNLTHHTSLESLAKVCDVVTLNCPLHPETEHMINADSLKHFKRGAYLINTARGKLCDRDAVAAALESGQLAGYGGDVWFPQPAPADHPWRSMPHHGMTPHISGTSLSAQTRYAAGTREILECYFENRPIRNEYLIVQNGKLAGVGAHSYSAGNATGGSEEAARFKKSA(SEQ ID No.1)。
编码该甲酸脱氢酶的核苷酸序列如下所示：
ATGGCCAAGATTGTTTGTGTACTGTACGACGACCCCGTTACCGGCTACCCGAAGACCTACGCCCGCGACGATCTGCCGAAGATCGAGTGCTACCCCGATGGCCAGACGCTGCCTACGCCGCGCGCCATCGACTTCCAGCCGGGCGCATTGCTCGGTAGCGTGTCTGGCGAACTGGGCCTGCGCAAGTACCTCGAATCGAACGGCCACGAACTCGTCGTGACGTCGAGCAAAGACGGCGACAACAGCGTGCTCGACCGCGAACTGGCCGACGCCGAAATCGTGATTTCGCAACCGTTCTGGCCCGCGTACATGACGGCCGAGCGCATCAAGCGTGCGAAGAAGCTGAAGATGATCGTGACCGCTGGCATCGGCTCGGATCACACCGATCTGCAAGCCGCCATGGAACACGGCATCACCGTCGCGGAAGTGACGTACTGCAACAGCAACAGCGTGGCGGAACACGTGATGATGACGACGCTGGCATTGGTGCGTAACTACCTGCCGTCGTATCAATGGGTGCTCAAGGGCGGCTGGAACATCGCCGACTGCGTCGAGCGTTCGTACGATCTGGAAGGCATGCATGTGGGTACGGTGGCGGCGGGGCGCATCGGCCTGCGCGTGCTGCGTCTGATGAAGCCGTTCGGCACGCATCTGCACTACCTCGATCGTCACCGTCTGCCGGAATCGGTCGAGAAGGAACTCAACCTCACGCACCACACGAGCCTGGAGAGCCTCGCCAAGGTGTGCGACGTGGTGACGCTGAACTGCCCGCTGCACCCGGAAACGGAGCACATGATCAACGCCGACAGCCTGAAGCACTTCAAGCGCGGCGCCTACCTGATCAACACGGCGCGCGGCAAGCTGTGCGACCGTGACGCCGTTGCGGCGGCGCTCGAAAGTGGCCAGCTCGCGGGCTACGGTGGCGATGTCTGGTTCCCGCAACCGGCACCGGCCGATCACCCGTGGCGCAGCATGCCGCACCACGGCATGACCCCACACATCTCGGGCACGAGCCTGTCGGCGCAGACGCGTTACGCCGCCGGTACGCGTGAAATTCTGGAGTGCTACTTCGAGAACCGTCCGATCCGCAACGAGTACCTGATCGTGCAGAACGGCAAGCTCGCCGGTGTGGGCGCGCACTCGTACAGCGCAGGCAATGCCACGGGCGGTTCGGAAGAAGCCGCTCGCTTCAAGAAGTCGGCCTGA(SEQ ID No.5)。
亲本甲酸脱氢酶(PcFDH)的基因由南京金斯瑞公司合成并重组到表达载体pET-22b(含酶切位点BamH I、HindⅢ)上。用限制性内切酶BamH I和Hind III(Invitrogen公司)对含亲本PcFDH基因的表达载体pET-22b进行双酶切，同时，用限制性内切酶BamH I和HindIII对pET-28a(+)载体(Invitrogen公司)进行双酶切，使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4连接酶将上述两个酶切产物连接，将连接产物转化入E.coli DH5α感受态细胞中，提取质粒，酶切鉴定，PCR鉴定后送测序确定表达载体构建成功，命名为pET28a-PcFDH。重组质粒转化至E.coli BL21，获得重组表达基因工程菌E.coli BL21-PcFDH。
定点突变的引物采用Primer premier 5.0设计，引物设计的原则为：正反向扩增引物5′端包含15～21bp反向互补区域，各引物非互补区域长度至少为15bp，所需引入的突变包含在互补区域内。突变引物如下：
V54N-F：5′-TGCTCGGTAGCAACTCTGGCGAACTG-3′(SEQ ID No.9)；
V54N-R：5′-CAGTTCGCCAGAGTTGCTACCGAGCA-3′(SEQ ID No.10)；
A121K-F：5′-TGATCGTGACCAAGGGCATCGGCTCG-3′(SEQ ID No.11)；
A121K-R：5′-CGAGCCGATGCCCTTGGTCACGATCA-3′(SEQ ID No.12)；
E228K-F：5′-TCACCGTCTGCCGAAGTCGGTCGAGA-3′(SEQ ID No.13)；
E228K-R：5′-TCTCGACCGACTTCGGCAGACGGTGA-3′(SEQ ID No.14)。
定点突变以实施例1中的pET28a-PcFDH重组质粒为模板，利用PrimerStar Mix(ABM公司)进行全质粒扩增，扩增产物经过DpnⅠ酶(ABM公司)消化去除PCR反应体系中的模板，然后在重组酶催化下将5′端和3′端进行同源重组，完成质粒的环化。定点突变体系如表1所示。
表1定点突变体系
重组质粒pET28a-PcFDH 1μl
上游引物F 1μl
下游引物R 1μl
PrimerStar Mix 25μl
ddH2O 补充至50μl
PCR扩增程序：95℃预变性300s，98℃变性10s，66℃退火15s，72℃延伸300s，反应30个循环后，再72℃延伸5min，最后4℃保温。PCR反应结束后，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。然向每个PCR管中加入1μl Dpn I轻轻混匀后置37℃金属浴2h，之后将消化好的扩增产物进行重组反应。重组反应体系如表2所示。
表2重组反应体系
200ng线性质粒 5μl
5×Ligation Free Cloning(ABM公司) 4μl
ddH2O 补充至20μl
将环化的扩增产物转入E.coli DH5α感受态细胞中，并涂布在含卡那霉素的平板上，置于37℃培养箱中过夜培养。次日从平板中挑选含有不同突变质粒的E.coli DH5α菌株，用5mL含有相应抗性的液体LB培养后抽提质粒，送金斯瑞公司进行测序。最后将测序结果与野生型基因核苷酸序列进行比对，确定突变是否成功。
获得的PcFDH突变体依据其突变位点分别命名为V54N、V54N/A121K、V54N/A121K/E228K，V54N的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；V54N/A121K的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示；V54N/A121K/E228K的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示。
其中，SEQ ID No.1所示的氨基酸序列第54位缬氨酸突变为天冬酰胺后的V54N的氨基酸序列如下所示：
MAKIVCVLYDDPVTGYPKTYARDDLPKIECYPDGQTLPTPRAIDFQPGALLGSNSGELGLRKYLESNGHELVVTSSKDGDNSVLDRELADAEIVISQPFWPAYMTAERIKRAKKLKMIVTAGIGSDHTDLQAAMEHGITVAEVTYCNSNSVAEHVMMTTLALVRNYLPSYQWVLKGGWNIADCVERSYDLEGMHVGTVAAGRIGLRVLRLMKPFGTHLHYLDRHRLPESVEKELNLTHHTSLESLAKVCDVVTLNCPLHPETEHMINADSLKHFKRGAYLINTARGKLCDRDAVAAALESGQLAGYGGDVWFPQPAPADHPWRSMPHHGMTPHISGTSLSAQTRYAAGTREILECYFENRPIRNEYLIVQNGKLAGVGAHSYSAGNATGGSEEAARFKKSA(SEQ ID No.2)；
核苷酸序列如下所示：
ATGGCCAAGATTGTTTGTGTACTGTACGACGACCCCGTTACCGGCTACCCGAAGACCTACGCCCGCGACGATCTGCCGAAGATCGAGTGCTACCCCGATGGCCAGACGCTGCCTACGCCGCGCGCCATCGACTTCCAGCCGGGCGCATTGCTCGGTAGCAACTCTGGCGAACTGGGCCTGCGCAAGTACCTCGAATCGAACGGCCACGAACTCGTCGTGACGTCGAGCAAAGACGGCGACAACAGCGTGCTCGACCGCGAACTGGCCGACGCCGAAATCGTGATTTCGCAACCGTTCTGGCCCGCGTACATGACGGCCGAGCGCATCAAGCGTGCGAAGAAGCTGAAGATGATCGTGACCGCTGGCATCGGCTCGGATCACACCGATCTGCAAGCCGCCATGGAACACGGCATCACCGTCGCGGAAGTGACGTACTGCAACAGCAACAGCGTGGCGGAACACGTGATGATGACGACGCTGGCATTGGTGCGTAACTACCTGCCGTCGTATCAATGGGTGCTCAAGGGCGGCTGGAACATCGCCGACTGCGTCGAGCGTTCGTACGATCTGGAAGGCATGCATGTGGGTACGGTGGCGGCGGGGCGCATCGGCCTGCGCGTGCTGCGTCTGATGAAGCCGTTCGGCACGCATCTGCACTACCTCGATCGTCACCGTCTGCCGGAATCGGTCGAGAAGGAACTCAACCTCACGCACCACACGAGCCTGGAGAGCCTCGCCAAGGTGTGCGACGTGGTGACGCTGAACTGCCCGCTGCACCCGGAAACGGAGCACATGATCAACGCCGACAGCCTGAAGCACTTCAAGCGCGGCGCCTACCTGATCAACACGGCGCGCGGCAAGCTGTGCGACCGTGACGCCGTTGCGGCGGCGCTCGAAAGTGGCCAGCTCGCGGGCTACGGTGGCGATGTCTGGTTCCCGCAACCGGCACCGGCCGATCACCCGTGGCGCAGCATGCCGCACCACGGCATGACCCCACACATCTCGGGCACGAGCCTGTCGGCGCAGACGCGTTACGCCGCCGGTACGCGTGAAATTCTGGAGTGCTACTTCGAGAACCGTCCGATCCGCAACGAGTACCTGATCGTGCAGAACGGCAAGCTCGCCGGTGTGGGCGCGCACTCGTACAGCGCAGGCAATGCCACGGGCGGTTCGGAAGAAGCCGCTCGCTTCAAGAAGTCGGCCTGA(SEQ ID No.6)。
SEQ ID No.1所示的氨基酸序列第54位缬氨酸突变为天冬酰胺、第121位丙氨酸突变为赖氨酸后的V54N/A121K的氨基酸序列如下所示：
MAKIVCVLYDDPVTGYPKTYARDDLPKIECYPDGQTLPTPRAIDFQPGALLGSNSGELGLRKYLESNGHELVVTSSKDGDNSVLDRELADAEIVISQPFWPAYMTAERIKRAKKLKMIVTKGIGSDHTDLQAAMEHGITVAEVTYCNSNSVAEHVMMTTLALVRNYLPSYQWVLKGGWNIADCVERSYDLEGMHVGTVAAGRIGLRVLRLMKPFGTHLHYLDRHRLPESVEKELNLTHHTSLESLAKVCDVVTLNCPLHPETEHMINADSLKHFKRGAYLINTARGKLCDRDAVAAALESGQLAGYGGDVWFPQPAPADHPWRSMPHHGMTPHISGTSLSAQTRYAAGTREILECYFENRPIRNEYLIVQNGKLAGVGAHSYSAGNATGGSEEAARFKKSA(SEQ ID No.3)；
核苷酸序列如下所示：
ATGGCCAAGATTGTTTGTGTACTGTACGACGACCCCGTTACCGGCTACCCGAAGACCTACGCCCGCGACGATCTGCCGAAGATCGAGTGCTACCCCGATGGCCAGACGCTGCCTACGCCGCGCGCCATCGACTTCCAGCCGGGCGCATTGCTCGGTAGCAACTCTGGCGAACTGGGCCTGCGCAAGTACCTCGAATCGAACGGCCACGAACTCGTCGTGACGTCGAGCAAAGACGGCGACAACAGCGTGCTCGACCGCGAACTGGCCGACGCCGAAATCGTGATTTCGCAACCGTTCTGGCCCGCGTACATGACGGCCGAGCGCATCAAGCGTGCGAAGAAGCTGAAGATGATCGTGACCAAGGGCATCGGCTCGGATCACACCGATCTGCAAGCCGCCATGGAACACGGCATCACCGTCGCGGAAGTGACGTACTGCAACAGCAACAGCGTGGCGGAACACGTGATGATGACGACGCTGGCATTGGTGCGTAACTACCTGCCGTCGTATCAATGGGTGCTCAAGGGCGGCTGGAACATCGCCGACTGCGTCGAGCGTTCGTACGATCTGGAAGGCATGCATGTGGGTACGGTGGCGGCGGGGCGCATCGGCCTGCGCGTGCTGCGTCTGATGAAGCCGTTCGGCACGCATCTGCACTACCTCGATCGTCACCGTCTGCCGGAATCGGTCGAGAAGGAACTCAACCTCACGCACCACACGAGCCTGGAGAGCCTCGCCAAGGTGTGCGACGTGGTGACGCTGAACTGCCCGCTGCACCCGGAAACGGAGCACATGATCAACGCCGACAGCCTGAAGCACTTCAAGCGCGGCGCCTACCTGATCAACACGGCGCGCGGCAAGCTGTGCGACCGTGACGCCGTTGCGGCGGCGCTCGAAAGTGGCCAGCTCGCGGGCTACGGTGGCGATGTCTGGTTCCCGCAACCGGCACCGGCCGATCACCCGTGGCGCAGCATGCCGCACCACGGCATGACCCCACACATCTCGGGCACGAGCCTGTCGGCGCAGACGCGTTACGCCGCCGGTACGCGTGAAATTCTGGAGTGCTACTTCGAGAACCGTCCGATCCGCAACGAGTACCTGATCGTGCAGAACGGCAAGCTCGCCGGTGTGGGCGCGCACTCGTACAGCGCAGGCAATGCCACGGGCGGTTCGGAAGAAGCCGCTCGCTTCAAGAAGTCGGCCTGA(SEQ ID No.7)。
SEQ ID No.1所示的氨基酸序列第54位缬氨酸突变为天冬酰胺、第121位丙氨酸突变为赖氨酸、第228位谷氨酸突变为赖氨酸后的V54N/A121K/E228K的氨基酸序列如下所示：
MAKIVCVLYDDPVTGYPKTYARDDLPKIECYPDGQTLPTPRAIDFQPGALLGSNSGELGLRKYLESNGHELVVTSSKDGDNSVLDRELADAEIVISQPFWPAYMTAERIKRAKKLKMIVTKGIGSDHTDLQAAMEHGITVAEVTYCNSNSVAEHVMMTTLALVRNYLPSYQWVLKGGWNIADCVERSYDLEGMHVGTVAAGRIGLRVLRLMKPFGTHLHYLDRHRLPKSVEKELNLTHHTSLESLAKVCDVVTLNCPLHPETEHMINADSLKHFKRGAYLINTARGKLCDRDAVAAALESGQLAGYGGDVWFPQPAPADHPWRSMPHHGMTPHISGTSLSAQTRYAAGTREILECYFENRPIRNEYLIVQNGKLAGVGAHSYSAGNATGGSEEAARFKKSA(SEQ ID No.4)；
核苷酸序列如下所示：
ATGGCCAAGATTGTTTGTGTACTGTACGACGACCCCGTTACCGGCTACCCGAAGACCTACGCCCGCGACGATCTGCCGAAGATCGAGTGCTACCCCGATGGCCAGACGCTGCCTACGCCGCGCGCCATCGACTTCCAGCCGGGCGCATTGCTCGGTAGCAACTCTGGCGAACTGGGCCTGCGCAAGTACCTCGAATCGAACGGCCACGAACTCGTCGTGACGTCGAGCAAAGACGGCGACAACAGCGTGCTCGACCGCGAACTGGCCGACGCCGAAATCGTGATTTCGCAACCGTTCTGGCCCGCGTACATGACGGCCGAGCGCATCAAGCGTGCGAAGAAGCTGAAGATGATCGTGACCAAGGGCATCGGCTCGGATCACACCGATCTGCAAGCCGCCATGGAACACGGCATCACCGTCGCGGAAGTGACGTACTGCAACAGCAACAGCGTGGCGGAACACGTGATGATGACGACGCTGGCATTGGTGCGTAACTACCTGCCGTCGTATCAATGGGTGCTCAAGGGCGGCTGGAACATCGCCGACTGCGTCGAGCGTTCGTACGATCTGGAAGGCATGCATGTGGGTACGGTGGCGGCGGGGCGCATCGGCCTGCGCGTGCTGCGTCTGATGAAGCCGTTCGGCACGCATCTGCACTACCTCGATCGTCACCGTCTGCCGAAGTCGGTCGAGAAGGAACTCAACCTCACGCACCACACGAGCCTGGAGAGCCTCGCCAAGGTGTGCGACGTGGTGACGCTGAACTGCCCGCTGCACCCGGAAACGGAGCACATGATCAACGCCGACAGCCTGAAGCACTTCAAGCGCGGCGCCTACCTGATCAACACGGCGCGCGGCAAGCTGTGCGACCGTGACGCCGTTGCGGCGGCGCTCGAAAGTGGCCAGCTCGCGGGCTACGGTGGCGATGTCTGGTTCCCGCAACCGGCACCGGCCGATCACCCGTGGCGCAGCATGCCGCACCACGGCATGACCCCACACATCTCGGGCACGAGCCTGTCGGCGCAGACGCGTTACGCCGCCGGTACGCGTGAAATTCTGGAGTGCTACTTCGAGAACCGTCCGATCCGCAACGAGTACCTGATCGTGCAGAACGGCAAGCTCGCCGGTGTGGGCGCGCACTCGTACAGCGCAGGCAATGCCACGGGCGGTTCGGAAGAAGCCGCTCGCTTCAAGAAGTCGGCCTGA(SEQ ID No.8)。
2.酶的制备
将上述实施例中测序正确的突变重组质粒转化E.coli BL21菌株，获得含有不同突变位点的PcFDH突变体重组基因工程菌株：E.coli BL21-V54N、E.coli BL21-V54N/A121K、E.coli BL21-V54N/A121K/E228K。再将含有野生型PcFDH基因及其突变体基因的不同的基因工程菌分别接种到含有卡那霉素的5mL LB液体培养基(LB(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母提取物5)的50mL的摇管中，在摇床上37℃恒温培养8h，转速200rpm。再将培养菌液按2％接种量接入含有100mL诱导培养基TB中(TB(g/l)：酵母粉25，胰蛋白胨15，氯化钠10，葡萄糖2，乳糖3)的500mL摇瓶中，于200rpm，37℃培养2h，待OD600达到0.2左右时转16℃诱导24h离心收集菌体。超声破菌，离心取上清液为粗酶液，置于4℃冰箱，可用于后续酶活性测定和生物催化制备NMNH。
实施例2酶活测定
配制终浓度为60mM NMN、150mM甲酸、100mM Tris缓冲液的反应液，调节pH至8.0。取4份反应溶液(每份900μl)，分别加入100μl蛋白浓度相同的亲本PcFDH以及3种突变体PcFDH的上清粗酶液，在30℃反应10min，然后加入100μl 25％三氯乙酸终止反应，通过HPLC测定反应溶液中的NMNH含量，并计算每种酶的具体活性，1分钟内转化1nmol NMN为NMNH的酶活定义为1U。比较突变体PcFDH的酶活，结果如表3所示。
表3相对酶活检测结果
从上述结果可以看出，本申请实施例所提供的单一位点的突变体相对于野生型PcFDH的酶活已有明显的提高，达到野生型的80倍左右；同时，双位点的突变体的酶活比单一突变体的酶活有一定的提高，约为野生型的151倍；最终，三位点的突变体的酶活比双点位突变体的酶活同样有较为明显的提高，约为野生型的886倍。可见，本申请实施例提供的PcFDH突变体的这种高催化活性使其可以以粗酶的形式使用而不需要纯化，或者仅部分纯化之后就可以使用。因而可以大幅降低生产成本，从而适用于大规模工业化生产，更具有市场竞争力。
实施例3 NMNH的制备
向反应器中加入含有100mM NMN、200mM甲酸、200mM Tris-HCl缓冲液的底物溶液，调节pH至7.0～8.0。然后加入催化酶，添加量分别为：20ml/L(粗酶液/底物溶液)的突变体V54N/A121K/E228K的上清粗酶液，搅拌均匀后，在恒温水浴摇床中进行反应。摇床转速设置为50rpm，反应温度控制在30℃，pH保持在7.0～8.0。反应4小时后，得到含粗品的溶液，通过HPLC检测反应前底物溶液和反应后反应液(图1-图2)，经过滤、纯化、干燥，得到终产物，氢谱(图3-图5)、碳谱(图6-图7)检验证实其为NMNH。
另外，结果显示，粗品溶液中NMNH的浓度为69.8mM。
上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳希吉亚生物技术有限公司
<120> 甲酸脱氢酶突变体及其应用
<130>
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 401
<212> PRT
<213> Pandoraea commovens
<400> 1
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Pro Lys Thr Tyr Ala Arg Asp Asp Leu Pro Lys Ile Glu Cys Tyr Pro
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50 55 60
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Lys Lys Leu Lys Met Ile Val Thr Ala Gly Ile Gly Ser Asp His Thr
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Ala Leu Val Arg Asn Tyr Leu Pro Ser Tyr Gln Trp Val Leu Lys Gly
165 170 175
Gly Trp Asn Ile Ala Asp Cys Val Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Glu Gly
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Arg Leu Met Lys Pro Phe Gly Thr His Leu His Tyr Leu Asp Arg His
210 215 220
Arg Leu Pro Glu Ser Val Glu Lys Glu Leu Asn Leu Thr His His Thr
225 230 235 240
Ser Leu Glu Ser Leu Ala Lys Val Cys Asp Val Val Thr Leu Asn Cys
245 250 255
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260 265 270
His Phe Lys Arg Gly Ala Tyr Leu Ile Asn Thr Ala Arg Gly Lys Leu
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290 295 300
Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro Ala Pro Ala Asp His
305 310 315 320
Pro Trp Arg Ser Met Pro His His Gly Met Thr Pro His Ile Ser Gly
325 330 335
Thr Ser Leu Ser Ala Gln Thr Arg Tyr Ala Ala Gly Thr Arg Glu Ile
340 345 350
Leu Glu Cys Tyr Phe Glu Asn Arg Pro Ile Arg Asn Glu Tyr Leu Ile
355 360 365
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Ala
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<400> 10
cagttcgcca gagttgctac cgagca 26
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgatcgtgac caagggcatc ggctcg 26
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cgagccgatg cccttggtca cgatca 26
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tcaccgtctg ccgaagtcgg tcgaga 26
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tctcgaccga cttcggcaga cggtga 26

Claims (10)

1.甲酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.2～SEQ ID NO.4任一项所示。
2.根据权利要求1所述的甲酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列为编码权利要求1～2任一项所述的甲酸脱氢酶突变体的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.6～SEQ ID NO.8任一项所示。
5.一种载体，其特征在于，所述载体可表达权利要求1～2任一项所述的甲酸脱氢酶突变体或含有权利要求3～4任一项所述的核酸分子。
6.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包含权利要求5所述的载体。
7.权利要求1～2任一项所述的甲酸脱氢酶突变体或权利要求3～4任一项所述的核酸分子或权利要求5所述的载体或权利要求6所述的重组细胞在（B1）或（B2）中的应用：
（B1）催化合成NMNH；
（B2）制备催化合成NMNH的产品。
8.一种产品，其特征在于，所述产品包含权利要求1～2任一项所述的甲酸脱氢酶突变体或权利要求3～4任一项所述的核酸分子或权利要求5所述的载体或权利要求6所述的重组细胞。
9.一种甲酸脱氢酶突变体的制备方法，通过培养权利要求6所述的重组细胞获得甲酸脱氢酶突变体。
10.NMNH的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供NMN和甲酸作为底物；
将所述底物与权利要求1～2任一项所述的甲酸脱氢酶突变体接触，催化合成所述NMNH。
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