CN113637652B

CN113637652B - 一种腺苷转移酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN113637652B
Application number: CN202111204638.3A
Authority: CN
Inventors: 王浩; 张天萌; 王芬; 张由恒; 王景; 郭学平
Original assignee: Huaxi Biotechnology Hainan Co ltd; Bloomage Biotech Co Ltd; Shandong Bloomage Hyinc Biopharm Co Ltd
Current assignee: Huaxi Biotechnology Hainan Co ltd; Bloomage Biotech Co Ltd
Priority date: 2021-10-15
Filing date: 2021-10-15
Publication date: 2022-01-04
Anticipated expiration: 2041-10-15
Also published as: CN113637652A

Abstract

本发明提供一种腺苷转移酶突变体及其应用，属于基因工程技术领域，该突变体的氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO.2相比，在氨基酸序列SEQ ID NO.2中第77位组氨酸、第80位组氨酸、第201位精氨酸中任意一个或两个以上位点进行突变。该烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体用于β‑烟酰胺单核苷酸的合成制备，可有效阻断副产物NAD生成，解决目标产物烟酰胺单核苷酸（NMN）的收率低，产物与副产物分离困难、生产成本高的问题。

Description

一种腺苷转移酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地，涉及一种腺苷转移酶突变体及其应用。

背景技术

烟酰胺单核苷酸（Nicotinamide mononucleotide，简称NMN）是维生素B3的吡啶-核苷形式，NMN可充当烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的直接前体物质，其生理功能是通过转化为NAD+来发挥，如激活NAD+底物依赖性酶、调节细胞存活和死亡、维持氧化还原状态等。然而胞外NAD+不易穿过细胞壁，直接摄入外源NAD+难以达到预期效果，因此促使合成前体物质NMN成为研究热点。

目前NMN的合成方式主要为生物酶法和化学法，其中生物体外酶法弥补了化学合成的弊端，凭借转化率高、产率高等优势成为高效、绿色安全的生产方式。生物酶法合成烟酰胺单核苷酸是使用烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶作为催化剂，催化烟酰胺核糖苷转化为烟酰胺单核苷酸。但是烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶是一种双功能酶，存在将烟酰胺核糖苷(NR)转化为烟酰胺单核苷酸(NMN)，然后再将NMN转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的双结构域。因此，在酶法催化制备烟酰胺单核苷酸的过程中，通常会产生大量的副产物NAD。从而造成目标产物烟酰胺单核苷酸的收率低，以及产物与副产物分离困难、生产成本高的问题。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种腺苷转移酶突变体及其应用。

具体来说，本发明涉及如下方面：

1. 一种腺苷转移酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列相比，在第77位组氨酸、第80位组氨酸、第201位精氨酸中任意一个或两个以上位点发生突变。

2. 根据项1所述的腺苷转移酶突变体，其特征在于，所述突变为将SEQ ID NO. 2中第77位组氨酸突变为丙氨酸。

3. 根据项1所述的腺苷转移酶突变体，其特征在于，所述突变为将SEQ ID NO. 2中第80位组氨酸突变为丙氨酸。

4. 根据项1所述的腺苷转移酶突变体，其特征在于，所述突变为将SEQ ID NO. 2中第201位精氨酸突变为丙氨酸。

5. 一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码项1-4中任一项所述的腺苷转移酶突变体。

6. 一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含项5所述的核酸分子。

7. 一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含项6所述的表达载体。

8. 一种制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述方法包括：

使用项1-4中任一项所述的腺苷转移酶突变体或项5所述的核酸分子编码的腺苷转移酶突变体来制备β-烟酰胺单核苷酸。

9. 根据项8所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

将所述腺苷转移酶突变体加入包含烟酰胺核糖苷的反应体系中，在25℃-37℃，pH4.0-6.0条件下反应15min-5h，其中在所述反应体系中，所述腺苷转移酶突变体的浓度为0.05-3 U/mg，烟酰胺核糖苷的浓度为1-30 mM。

10. 根据项9所述的方法，其特征在于，反应结束时，烟酰胺核糖苷向β酰烟酰胺单核苷酸的转化率大于85%。

11. 项1-4中任一项所述的腺苷转移酶突变体或项5所述的核酸分子或项6所述的表达载体或项7所述的宿主细胞在制备β-烟酰胺单核苷酸中的应用。

本发明将NMN转化为NAD结构域的保守活性位点进行定点突变，构建腺苷转移酶突变体，从而达到稳定合成产物NMN，阻遏副产物NAD合成的目的。本发明所涉及的酶突变体37℃反应30 min可完全阻遏副产物NAD的生成且稳定合成产物NMN，NMN摩尔转化率大于85%。

附图说明

图1a为重组菌腺苷转移酶纯酶的SDS-PAGE蛋白电泳。其中，泳道M代表分子量为180 kDa的标准蛋白；泳道1代表对照菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-NadR_EC腺苷转移酶的纯化蛋白；泳道2代表突变菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-NadR_ECT77腺苷转移酶的纯化蛋白；泳道3代表突变菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-NadR_ECT80腺苷转移酶的纯化蛋白；泳道4代表突变菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-NadR_ECT201腺苷转移酶的纯化蛋白。

图1b为重组菌腺苷转移酶粗酶液的SDS-PAGE蛋白电泳。其中，泳道M代表分子量为180 kDa的标准蛋白；泳道1代表对照菌E.coli BL21(DE3)/pET28a粗酶液；泳道2代表对照菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-NadR_EC腺苷转移酶的粗酶液；泳道3代表突变菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-NadR_ECT77腺苷转移酶的粗酶液；泳道4代表突变菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-NadR_ECT80腺苷转移酶的粗酶液；泳道5代表突变菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-NadR_ECT157腺苷转移酶的粗酶液。泳道6代表突变菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-NadR_ECT201腺苷转移酶的粗酶液。

图2为对照菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-NadR_EC的腺苷转移酶反应产物的变化趋势图。

图3为重组菌腺苷转移酶催化产物的高效液相色谱图。

为标准品（NMN、NR/ATP、 ADP、NAD）的高效液相色谱图；

为对照菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-NadR_EC腺苷转移酶的反应产物高效液相色谱图；

为突变菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-NadR_ECT77腺苷转移酶的反应产物高效液相色谱图；

为突变菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-NadR_ECT80腺苷转移酶的反应产物高效液相色谱图；

为突变菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-NadR_ECT201腺苷转移酶的反应产物高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。

除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。

采用酶法合成烟酰胺单核苷酸使用烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶作为催化剂，催化烟酰胺核糖苷转化为烟酰胺单核苷酸。但是烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶是一种双功能酶，存在将烟酰胺核糖苷(NR)转化为烟酰胺单核苷酸(NMN)，然后再将NMN转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的双结构域。因此，在酶法催化制备烟酰胺单核苷酸的过程中，通常会产生大量的副产物NAD。从而造成目标产物烟酰胺单核苷酸的收率低，以及产物与副产物分离困难的问题。

为了解决这个问题，本发明考虑将烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶进行定点突变，从而使得得到的突变体既有将烟酰胺核糖苷(NR)转化为烟酰胺单核苷酸(NMN)的活性，又抑制了将NMN转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的的活性。

具体地，本发明提供腺苷转移酶突变体，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列相比，在第77位组氨酸、第80位组氨酸、第201位精氨酸中任意一个或两个以上位点发生突变。

其中，本文中的“突变体”可理解为包含至少一个野生型或天然氨基酸被不同于野生型或天然多肽的氨基酸取代的突变型多肽。突变体可以只包含一个野生型或天然氨基酸取代，称为“点突变”或“单点突变”多肽。另外，突变体可包含两个或更多个野生型或天然氨基酸被不同于野生型或天然多肽的两个或多个氨基酸取代。

取代突变可利用本领域熟知的任何诱变技术制备，包括而不限于定点诱变。其中，定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。

SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列是烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的野生型序列，本发明所述突变体的氨基酸序列在SEQ ID NO. 2的第77位组氨酸、第80位组氨酸、第201位精氨酸中任意一个或两个以上位点发生突变。

在一个具体的实施方式中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列相比，在第77位组氨酸、第80位组氨酸、第201位精氨酸中任意一个位点发生突变。例如可以在SEQ ID NO. 2的第77位组氨酸、第80位组氨酸、或第201位精氨酸其中的一个位点发生突变。

在一个具体的实施方式中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列相比，在第77位组氨酸、第80位组氨酸、第201位精氨酸中任意两个位点发生突变。例如可以在SEQ ID NO. 2的第77位组氨酸和第80位组氨酸两个位点发生突变，可以在SEQ IDNO. 2的第77位组氨酸和第201位精氨酸两个位点发生突变，也可以在SEQ ID NO. 2的第80位组氨酸和第201位精氨酸两个位点发生突变。

在一个具体的实施方式中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列相比，在第77位组氨酸、第80位组氨酸、第201位精氨酸三个位点均发生突变。

在一个优选的实施方式中，本发明所述的腺苷转移酶突变体的氨基酸序列与SEQID NO. 2所示的氨基酸序列相比，将SEQ ID NO. 2中第77位组氨酸突变为丙氨酸。

在一个优选的实施方式中，本发明所述的腺苷转移酶突变体的氨基酸序列与SEQID NO. 2所示的氨基酸序列相比，将SEQ ID NO. 2中第80位组氨酸突变为丙氨酸。

在一个优选的实施方式中，本发明所述的腺苷转移酶突变体的氨基酸序列与SEQID NO. 2所示的氨基酸序列相比，将SEQ ID NO. 2中第201位精氨酸突变为丙氨酸。

本发明还提供一种核酸分子，其编码上述的腺苷转移酶突变体。

如本文所使用的，术语“核酸分子”可以包括包含天然和/或非天然存在的核苷酸和碱基的那些，例如包括具有骨架修饰的那些，所述核酸分子指的是核苷酸的聚合物，核苷酸的此类聚合物可以含有天然和/或非天然核苷酸，并且包括但不限于DNA、RNA和PNA。核苷酸序列指的是构成核酸分子的线性序列。

在一些情况下，核酸分子含有cDNA，在一些情况下，可以修饰核酸分子以用于本发明所述的构建体中，如用于密码子优化。在一些情况下，出于克隆到载体的目的，可以将序列设计为含有末端限制性位点序列。

在一些情况下，核酸分子可以从多种来源获得，如通过一种或多种给定细胞内的或从所述一种或多种给定细胞中分离的编码核酸的聚合酶链式反应（PCR）扩增获得。

本发明还提供一种表达载体，其包含上述核酸分子。

如本文所使用的，术语“载体”用于描述可以被工程化以含有可以在宿主细胞中扩增的克隆的一种多核苷酸或多种多核苷酸的核酸分子。载体包括但不限于：单链，双链或部分双链的核酸分子;包含一个或多个游离末端，没有游离末端（例如环状）的核酸分子;包含DNA，RNA或两者的核酸分子;以及本领域已知的其他多核苷酸种类。一种类型的载体是“质粒”，其是指可以插入额外DNA片段的环状双链DNA环，例如通过标准分子克隆技术。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制（例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体）。其他载体（例如，非游离型哺乳动物载体）在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们可操作地连接的那些基因的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。重组表达载体可以包含适于在宿主细胞中表达核酸的形式的本发明的核酸，这意味着重组表达载体包括一种或多种调节元件，其可以基于用于表达的、可以与待表达的核酸序列可操作地连接的宿主细胞来选择。

其中，构建腺苷转移酶突变载体可以采用现有技术常规的方式实现，所述腺苷转移酶突变载体可以选自pET系列表达载体、pCW系列表达载体、pUC系列表达载体或pPIC9K表达载体中的任意一种。其中，pET系列表达载体包括pET28a、pET21b、pETDuet-1等。pCW系列表达载体包括pCWori等，pUC系列表达载体包括pUC18、pUC19等。

在一个具体的实施方式中，所述腺苷转移酶突变载体是pET28a。

本发明还提供一种宿主细胞，其包含权利要求上述表达载体。

如本文所使用的，术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，其易受包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何后代，其由于复制过程发生的突变与亲本细胞不完全相同。

在一个具体的实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母或毕赤酵母中的一种，优选大肠杆菌。

具体地，所述腺苷转移酶突变体可以通过以下步骤得到：构建腺苷转移酶突变载体；将腺苷转移酶突变载体转入宿主细胞中进行生产。

对于生产得到的腺苷转移酶突变体的酶活，采用高效液相色谱测定产物NMN的量来确定。具体地，高效液相色谱可以采用如下的条件：Agilent 1260液相色谱配置OSAKA-SODA C18色谱柱，以A:NaH₂PO₄和B:甲醇为流动相梯度进样，柱流速1 ml/min，柱温25℃，波长260 nm，进样量20 μl。

其中，腺苷转移酶突变体的酶活力单位定义（U）为：在37℃，pH 5.5条件下反应，腺苷转移酶突变体纯酶单位时间内（1 min）生产1 μmol产物所需的酶量。

本发明还提供一种制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，所述方法包括：使用上述腺苷转移酶突变体或上述核酸分子编码的腺苷转移酶突变体来制备β-烟酰胺单核苷酸。其中，腺苷转移酶突变体可以是粗酶液的形式，也可以是将粗酶液纯化后得到的纯酶形式。

所述方法可以包括如下步骤：

将所述腺苷转移酶突变体加入包含烟酰胺核糖苷的反应体系中，在25℃-37℃，pH4.0-6.0条件下反应15min-5h，其中在所述反应体系中，所述腺苷转移酶突变体的浓度为0.05-3 U/mg，烟酰胺核糖苷的浓度为1-30 mM。其中，所述腺苷转移酶突变体的浓度为0.05-3 U/mg，例如可以为0.05 U/mg、1 U/mg、1.5 U/mg、2 U/mg、2.5 U/mg、3 U/mg。烟酰胺核糖苷的浓度为1-30 mM，例如可以为1 mM、2 mM、5 mM、8 mM、10 mM、12 mM、15 mM、18 mM、20 mM、22 mM、25 mM、28 mM、30 mM。反应温度为25℃-37℃，例如可以为25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃。反应pH为 4.0-6.0，例如可以为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0。反应时间为15min-5h，例如可以为15min、30min、1h、2h、3h、4h、5h。

其中所得到的产物β-烟酰胺单核苷酸可以通过高效液相色谱进行检测。

进一步地，使用本发明的腺苷转移酶突变体制备β-烟酰胺单核苷酸在反应结束时，烟酰胺核糖苷向β-烟酰胺单核苷酸的转化率大于85%。

本发明还提供了上述腺苷转移酶突变体或核酸分子或表达载体或宿主细胞在制备β-烟酰胺单核苷酸中的应用。

实施例

实施例1：含腺苷转移酶基因（NadR）原核表达系统的构建

以大肠杆菌基因组为模板，扩增腺苷转移酶NadR基因片段，其核苷酸序列如SEQID NO. 1所示。首先用EcoRI和XhoI双酶切表达载体pET28a和NadR基因片段，酶切连接后得到重组表达载体pET28a-NadR_EC，然后将重组载体转入E.coli BL21（DE3）宿主菌中，得到表达菌株E.coli BL21（DE3）/pET28a-NadR_EC作为后续定向突变和发酵的原代菌株。

实施例2：野生型腺苷转移酶基因（NadR）的重组表达

上述构建的表达菌株E.coli BL21（DE3）/pET28a-NadR_EC接种于5 ml终浓度50 μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200 rpm振荡培养过夜后，按1%（V/V）比例接种于120 ml终浓度50 μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200 rpm振荡培养。培养至OD6000.8-1.0时，加入终浓度为0.2 mM的诱导剂IPTG（异丙基-异丙基m硫代半乳糖苷，IPTG），25℃诱导过夜。菌体在4℃、8000 rpm条件下离心收集，然后悬浮于20 mM pH 8.0磷酸钠缓冲液中，超声破碎（200 W，2 s/4 s，20 min）后4℃、12000 rpm离心20 min，取上清进行镍柱亲和层析纯化，经咪唑洗脱后即得纯酶液，并使用试剂盒（BCA蛋白浓度测定试剂盒 BL521A500T，biosharp）检测纯酶蛋白浓度。野生型腺苷转移酶基因（NadR）纯酶液进行SDS-PAGE蛋白电泳分析，结果如附图1a所示，泳道1为E.coli BL21（DE3）/pET28a-NadR_EC的纯化蛋白，在腺苷转移酶基因理论蛋白分子量45.6 kDa附近有一条对应的蛋白条带。

体外酶法催化：

10×底物母液：75 mM ATP，50 mM MgCl₂·6H2O，30 mM NR，200 mM Tris-HCl，pH至5.5定容至50 mL。反应体系为1 mL：200 μL上述酶液加入到800 μL 1×上述底物液中，37℃反应按时间取点进行高效液相色谱检测，其中10×底物液为反应液母液，1×底物液为10×底物母液稀释10倍，5×底物液为10×底物母液稀释2倍。其中，液相色谱检测的具体条件为：Agilent 1260液相色谱配置OSAKA-SODA C18色谱柱，以A:NaH₂PO₄和B:甲醇为流动相梯度进样，柱流速1 ml/min，柱温25℃，波长260 nm，进样量20 μL。

结果如图2所示，随着反应时间的增加，产物NMN呈现下降趋势，副产物NAD逐渐积累增加，由此可见双功能酶NadR可进一步转化产物NMN生成副产物NAD，所以阻断副产物生成将有利于产物NMN的稳定积累。

实施例3：突变体的构建和筛选

突变体的构建：对不同生物体来源的腺苷转移酶NadR蛋白进行多序列比对，分析预测出可能有益的保守位点H77、H80、P118、R123、W157、E179、R201、W219等；通过与流感嗜血杆菌NadR与配体NAD的蛋白结晶结构比对后，最终选择在SEQ ID NO. 2的H77、H80、R201位点进行突变。

具体地，以实施例1中pET28a-NadR_EC重组质粒为模板，对H77、H80、R201这三个位点分别进行定点突变构建突变质粒。定点突变通过PCR方法实现，其中PCR扩增体系如下，总体系50 μL：100 μM上游引物1.0 μL，100 μM下游引物1.0 μL，模板1.0 μL，prime star酶25 μL，ddH2O 22 μL。PCR扩增条件如下：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃ 延伸7 min，循环30次；72℃延伸5 min。PCR产物用DpnⅠ酶37℃消化1 h后，转化E.coli BL21 (DE3)宿主菌，DNA测序比对，重组序列正确后即分别得到突变菌株E.coli BL21(DE3)/ pET28a-NadR_ECT77（突变体③）、E.coli BL21(DE3)/pET28a-NadR_ECT80（突变体

）、 E.coli BL21(DE3)/pET28a-NadR_ECT201（突变体

）。其中，第H77位突变正向引物： AAGTTCTACCCACTGGCGACCGGACATATC（SEQ ID NO. 3），反向引物：CAGTGGGTAGAACTTACCGAAT ACGACACCGAT（SEQ ID NO. 4）；第H80位突变正向引物：CTGCATACCGGAGCGATCTACCTTATCCA （SEQ ID NO. 5），反向引物：TCCGGTATGCAGTGGGTAGAACTTACCGAA（SEQ ID NO. 6）；第R201位突变正向引物：GTCGATCCGAAAGCGACCTTTATGAGTATC（SEQ ID NO. 7），反向引物： TTTCGGATCGACCAGCACCGTCTC（SEQ ID NO. 8）。其中，突变引物中下划线部分核苷酸为突变位点核苷酸。

突变体的培养：将上述突变菌株接种于5 ml终浓度50 μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200 rpm振荡培养过夜后，按1%（V/V）比例接种于120 ml终浓度50 μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200 rpm振荡培养。培养至OD600 0.8-1.0时，加入终浓度为0.2 mM的诱导剂IPTG（异丙基-异丙基m硫代半乳糖苷，IPTG），25℃诱导过夜。

腺苷转移酶突变体的纯化：上述菌体在4℃、8000 rpm条件下离心收集，然后悬浮于20 mM pH 8.0磷酸钠缓冲液中，超声破碎（200 W，2 s/4 s，20 min）然后4℃ 12000 rpm离心20 min，取上清进行镍柱亲和层析纯化，经咪唑洗脱后即得纯酶液，并使用试剂盒（BCA蛋白浓度测定试剂盒 BL521A 500T，biosharp）检测纯酶蛋白浓度。腺苷转移酶突变体NadR_ECT77、NadR_ECT80、NadR_ECT201的纯酶液进行SDS-PAGE蛋白电泳分析，如附图1b所示，对应的泳道3、4、6在腺苷转移酶理论蛋白分子量45.6 kDa附近均有一条对应的蛋白条带。

突变体筛选：10×底物液：75 mM ATP，50 mM MgCL₂·6H₂O，30 mM NR，200 mMTris-HCl，pH至5.5定容至50 mL。同时将突变体③④⑤和对照无突变菌②各自的纯酶液稀释到同一蛋白浓度0.09 mg/ml备用。反应体系为1 mL：500 μL上述纯酶液加到500 uL 5×上述底物液中，37℃反应30 min后进行液相检测。结果如图3所示，上述突变体④对比对照菌②（无突变）无副产物NAD生成，只有突变体③和⑤仍能产生少量副产物NAD。上述三株突变体的产物NMN均可稳定合成，以产物NMN表征突变体单位酶活如表1所示。

表1

其中，腺苷转移酶突变体的酶活力单位定义（U）为：在37℃，pH 5.5反应条件下反应，单位时间内（1 min）腺苷转移酶突变体纯酶生产1 μmol产物所需的酶量。

酶活（U/mg）

实施例4：生物催化制备NMN

反应体系底物液中依次加入7.5 mM ATP，5 mM MgCl₂·6H₂O，3 mM NR，20 mMTris-HCl，pH至5.5定容至50 mL。反应体系为1 mL：200 μL突变菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-NadR_ECT80酶液加入到800 μL上述底物液中，37℃反应30 min，反应结束后立即置于沸水浴中2 min，使酶失活终止反应，稀释10倍后高效液相色谱检测，最终底物NR摩尔转化率可达到85%，且基本无副产物NAD生成。

对比例1：

对腺苷转移酶NadR进行三维结构模拟，还预测出可能有益的突变位点为W157。以实施例1中pET28a-NadR_EC重组质粒为模板，对这个位点进行定点突变构建突变质粒，其中，第W157位突变正向引物：TGGGATGTGGCGAGCAACGGC（SEQ ID NO. 9），反向引物：CACATCCCAGCCGTGCGGATA（SEQ ID NO. 10）；其中，突变引物中下划线部分核苷酸为突变位点核苷酸。将获得的突变质粒转化E.coli BL21(DE3)宿主菌后，得到突变菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-NadR_ECT157。

将上述突变菌株接种于5 ml终浓度50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200 rpm振荡培养过夜后，按1%（V/V）比例接种于120 ml终浓度50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200 rpm振荡培养。培养至OD600 0.8-1.0时，加入终浓度为0.2 mM的诱导剂IPTG（异丙基-异丙基m硫代半乳糖苷，IPTG），25℃诱导过夜。菌体在4℃、8000 rpm条件下离心收集，然后悬浮于20 mM pH 8.0磷酸钠缓冲液中，超声破碎（200 W，2 s/4 s，20 min）后4℃、12000 rpm离心20 min，取上清进行SDS-PAGE蛋白电泳分析，如附图1b所示，泳道5为E.coli BL21(DE3)/pET28a-NadR_ECT157突变菌株，该泳道在腺苷转移酶理论蛋白分子量45.6 kDa附近没有对应的蛋白条带，与H77、H80、R201突变菌株泳道的蛋白条带形成对比，W157保守位点的突变可能影响了蛋白空间结构使其无法正常表达蛋白。同时，参照实施例3的酶活检测方法进行高效液相色谱检测，结果显示，突变菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-NadR_ECT157已无法稳定合成产物NMN。

序列表

SEQ ID NO. 1

ATGTCGTCATTTGATTACCTGAAAACTGCCATCAAGCAACAGGGCTGCACGCTACAGCAGGTAGCTGATGCCAGCGGTATGACCAAAGGGTATTTAAGCCAGTTACTGAATGCCAAAATCAAAAGCCCCAGCGCGCAAAAGCTGGAGGCGTTGCACCGTTTTTTGGGGCTTGAGTTTCCCCGGCAGAAGAAAACGATCGGTGTCGTATTCGGTAAGTTCTACCCACTGCATACCGGACATATCTACCTTATCCAGCGCGCCTGTAGCCAGGTTGACGAGCTGCATATCATTATGGGTTTTGACGATACCCGTGACCGCGCGTTGTTCGAAGACAGTGCCATGTCGCAGCAGCCGACCGTGCCGGATCGTCTGCGTTGGTTATTGCAAACTTTTAAATATCAGAAAAATATTCGCATTCATGCTTTCAACGAAGAGGGCATGGAGCCGTATCCGCACGGCTGGGATGTGTGGAGCAACGGCATCAAAAAGTTTATGGCTGAAAAAGGGATCCAGCCGGATCTGATCTACACCTCGGAAGAAGCCGATGCGCCACAGTATATGGAACATCTGGGGATCGAGACGGTGCTGGTCGATCCGAAACGTACCTTTATGAGTATCAGCGGTGCGCAGATCCGCGAAAACCCGTTCCGCTACTGGGAATATATTCCTACCGAAGTGAAGCCGTTTTTTGTGCGTACCGTGGCGATCCTTGGCGGCGAGTCGAGCGGTAAATCCACCCTGGTAAACAAACTTGCCAATATCTTCAACACCACCAGTGCGTGGGAATATGGCCGCGATTATGTCTTTTCACACCTCGGCGGTGATGAGATCGCATTGCAGTATTCTGACTACGATAAAATCGCGCTGGGCCACGCTCAATACATTGATTTTGCGGTGAAATATGCCAATAAAGTGGCATTTATCGATACCGATTTTGTCACCACTCAGGCGTTCTGCAAAAAGTACGAAGGGCGGGAACATCCGTTCGTGCAGGCGCTGATTGATGAATACCGTTTCGATCTGGTGATCCTGCTGGAGAACAACACGCCGTGGGTGGCGGATGGTTTACGCAGCCTCGGCAGTTCGGTGGATCGCAAAGAGTTCCAGAACTTGCTGGTGGAGATGCTCGAAGAGAACAATATCGAATTTGTGCGGGTTGAAGAGGAAGATTACGACAGTCGTTTCCTGCGCTGCGTGGAACTGGTGCGGGAGATGATGGGGGAGCAGAGATAA

SEQ ID NO. 2

MSSFDYLKTA IKQQGCTLQQ VADASGMTKG YLSQLLNAKI KSPSAQKLEA LHRFLGLEFPRQKKTIGVVF GKFYPLHTGH IYLIQRACSQ VDELHIIMGF DDTRDRALFE DSAMSQQPTV PDRLRWLLQTFKYQKNIRIH AFNEEGMEPY PHGWDVWSNG IKKFMAEKGI QPDLIYTSEE ADAPQYMEHL GIETVLVDPKRTFMSISGAQ IRENPFRYWE YIPTEVKPFF VRTVAILGGE SSGKSTLVNK LANIFNTTSA WEYGRDYVFSHLGGDEIALQ YSDYDKIALG HAQYIDFAVK YANKVAFIDT DFVTTQAFCK KYEGREHPFV QALIDEYRFDLVILLENNTP WVADGLRSLG SSVDRKEFQN LLVEMLEENN IEFVRVEEED YDSRFLRCVE LVREMMGEQR

SEQ ID NO. 3

AAGTTCTACCCACTGGCGACCGGACATATC

SEQ ID NO. 4

CAGTGGGTAGAACTTACCGAATACGACACCGAT

SEQ ID NO. 5

CTGCATACCGGAGCGATCTACCTTATCCA

SEQ ID NO. 6

TCCGGTATGCAGTGGGTAGAACTTACCGAA

SEQ ID NO. 7

GTCGATCCGAAAGCGACCTTTATGAGTATC

SEQ ID NO. 8

TTTCGGATCGACCAGCACCGTCTC

SEQ ID NO. 9

TGGGATGTGGCGAGCAACGGC

SEQ ID NO. 10

CACATCCCAGCCGTGCGGATA

SEQUENCE LISTING

<110> 华熙生物科技股份有限公司

山东华熙海御生物医药有限公司

华熙生物科技（海南）有限公司

<120> 一种腺苷转移酶突变体及其应用

<130> TPE01696

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 人工合成的序列

<400> 1

atgtcgtcat ttgattacct gaaaactgcc atcaagcaac agggctgcac gctacagcag 60

gtagctgatg ccagcggtat gaccaaaggg tatttaagcc agttactgaa tgccaaaatc 120

aaaagcccca gcgcgcaaaa gctggaggcg ttgcaccgtt ttttggggct tgagtttccc 180

cggcagaaga aaacgatcgg tgtcgtattc ggtaagttct acccactgca taccggacat 240

atctacctta tccagcgcgc ctgtagccag gttgacgagc tgcatatcat tatgggtttt 300

gacgataccc gtgaccgcgc gttgttcgaa gacagtgcca tgtcgcagca gccgaccgtg 360

ccggatcgtc tgcgttggtt attgcaaact tttaaatatc agaaaaatat tcgcattcat 420

gctttcaacg aagagggcat ggagccgtat ccgcacggct gggatgtgtg gagcaacggc 480

atcaaaaagt ttatggctga aaaagggatc cagccggatc tgatctacac ctcggaagaa 540

gccgatgcgc cacagtatat ggaacatctg gggatcgaga cggtgctggt cgatccgaaa 600

cgtaccttta tgagtatcag cggtgcgcag atccgcgaaa acccgttccg ctactgggaa 660

tatattccta ccgaagtgaa gccgtttttt gtgcgtaccg tggcgatcct tggcggcgag 720

tcgagcggta aatccaccct ggtaaacaaa cttgccaata tcttcaacac caccagtgcg 780

tgggaatatg gccgcgatta tgtcttttca cacctcggcg gtgatgagat cgcattgcag 840

tattctgact acgataaaat cgcgctgggc cacgctcaat acattgattt tgcggtgaaa 900

tatgccaata aagtggcatt tatcgatacc gattttgtca ccactcaggc gttctgcaaa 960

aagtacgaag ggcgggaaca tccgttcgtg caggcgctga ttgatgaata ccgtttcgat 1020

ctggtgatcc tgctggagaa caacacgccg tgggtggcgg atggtttacg cagcctcggc 1080

agttcggtgg atcgcaaaga gttccagaac ttgctggtgg agatgctcga agagaacaat 1140

atcgaatttg tgcgggttga agaggaagat tacgacagtc gtttcctgcg ctgcgtggaa 1200

ctggtgcggg agatgatggg ggagcagaga taa 1233

<210> 2

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 人工合成的序列

<400> 2

Met Ser Ser Phe Asp Tyr Leu Lys Thr Ala Ile Lys Gln Gln Gly Cys

1 5 10 15

Thr Leu Gln Gln Val Ala Asp Ala Ser Gly Met Thr Lys Gly Tyr Leu

20 25 30

Ser Gln Leu Leu Asn Ala Lys Ile Lys Ser Pro Ser Ala Gln Lys Leu

35 40 45

Glu Ala Leu His Arg Phe Leu Gly Leu Glu Phe Pro Arg Gln Lys Lys

50 55 60

Thr Ile Gly Val Val Phe Gly Lys Phe Tyr Pro Leu His Thr Gly His

65 70 75 80

Ile Tyr Leu Ile Gln Arg Ala Cys Ser Gln Val Asp Glu Leu His Ile

85 90 95

Ile Met Gly Phe Asp Asp Thr Arg Asp Arg Ala Leu Phe Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Met Ser Gln Gln Pro Thr Val Pro Asp Arg Leu Arg Trp Leu Leu

115 120 125

Gln Thr Phe Lys Tyr Gln Lys Asn Ile Arg Ile His Ala Phe Asn Glu

130 135 140

Glu Gly Met Glu Pro Tyr Pro His Gly Trp Asp Val Trp Ser Asn Gly

145 150 155 160

Ile Lys Lys Phe Met Ala Glu Lys Gly Ile Gln Pro Asp Leu Ile Tyr

165 170 175

Thr Ser Glu Glu Ala Asp Ala Pro Gln Tyr Met Glu His Leu Gly Ile

180 185 190

Glu Thr Val Leu Val Asp Pro Lys Arg Thr Phe Met Ser Ile Ser Gly

195 200 205

Ala Gln Ile Arg Glu Asn Pro Phe Arg Tyr Trp Glu Tyr Ile Pro Thr

210 215 220

Glu Val Lys Pro Phe Phe Val Arg Thr Val Ala Ile Leu Gly Gly Glu

225 230 235 240

Ser Ser Gly Lys Ser Thr Leu Val Asn Lys Leu Ala Asn Ile Phe Asn

245 250 255

Thr Thr Ser Ala Trp Glu Tyr Gly Arg Asp Tyr Val Phe Ser His Leu

260 265 270

Gly Gly Asp Glu Ile Ala Leu Gln Tyr Ser Asp Tyr Asp Lys Ile Ala

275 280 285

Leu Gly His Ala Gln Tyr Ile Asp Phe Ala Val Lys Tyr Ala Asn Lys

290 295 300

Val Ala Phe Ile Asp Thr Asp Phe Val Thr Thr Gln Ala Phe Cys Lys

305 310 315 320

Lys Tyr Glu Gly Arg Glu His Pro Phe Val Gln Ala Leu Ile Asp Glu

325 330 335

Tyr Arg Phe Asp Leu Val Ile Leu Leu Glu Asn Asn Thr Pro Trp Val

340 345 350

Ala Asp Gly Leu Arg Ser Leu Gly Ser Ser Val Asp Arg Lys Glu Phe

355 360 365

Gln Asn Leu Leu Val Glu Met Leu Glu Glu Asn Asn Ile Glu Phe Val

370 375 380

Arg Val Glu Glu Glu Asp Tyr Asp Ser Arg Phe Leu Arg Cys Val Glu

385 390 395 400

Leu Val Arg Glu Met Met Gly Glu Gln Arg

405 410

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 人工合成的序列

<400> 3

aagttctacc cactggcgac cggacatatc 30

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 人工合成的序列

<400> 4

cagtgggtag aacttaccga atacgacacc gat 33

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 人工合成的序列

<400> 5

ctgcataccg gagcgatcta ccttatcca 29

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 人工合成的序列

<400> 6

tccggtatgc agtgggtaga acttaccgaa 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 人工合成的序列

<400> 7

gtcgatccga aagcgacctt tatgagtatc 30

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 人工合成的序列

<400> 8

tttcggatcg accagcaccg tctc 24

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 人工合成的序列

<400> 9

tgggatgtgg cgagcaacgg c 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 人工合成的序列

<400> 10

cacatcccag ccgtgcggat a 21

Claims

1.一种腺苷转移酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列相比，将第77位组氨酸、第80位组氨酸、第201位精氨酸中任意一个或两个以上位点突变为丙氨酸。

2.根据权利要求1所述的腺苷转移酶突变体，其特征在于，所述突变为将SEQ ID NO. 2中第77位组氨酸突变为丙氨酸。

3.根据权利要求1所述的腺苷转移酶突变体，其特征在于，所述突变为将SEQ ID NO. 2中第80位组氨酸突变为丙氨酸。

4.根据权利要求1所述的腺苷转移酶突变体，其特征在于，所述突变为将SEQ ID NO. 2中第201位精氨酸突变为丙氨酸。

5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-4中任一项所述的腺苷转移酶突变体。

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求5所述的核酸分子。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求6所述的表达载体，所述宿主细胞非动物和植物品种。

8.一种制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述方法包括：

使用权利要求1-4中任一项所述的腺苷转移酶突变体或权利要求5所述的核酸分子编码的腺苷转移酶突变体来制备β-烟酰胺单核苷酸。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

10.权利要求1-4中任一项所述的腺苷转移酶突变体或权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的表达载体或权利要求7所述的宿主细胞在制备β-烟酰胺单核苷酸中的应用。