CN112553178B

CN112553178B - 热稳定性和活性增强的烟酰胺核糖激酶突变体及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN112553178B
Application number: CN202011561179.XA
Authority: CN
Inventors: 戴维; 周嘉莹; 余允东; 刘慧�; 徐广见
Original assignee: Zhongshan Junkai Biotechnology Development Co ltd
Current assignee: Zhongshan Bailing Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-12-25
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2023-03-10
Anticipated expiration: 2040-12-25
Also published as: CN112553178A

Abstract

本发明属于生物酶工程技术领域，具体涉及热稳定性和活性增强的烟酰胺核糖激酶突变体及其编码基因和应用。所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列与氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的野生型烟酰胺核糖激酶相比，在SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的15个位点中的任意一个或多个位点进行单点或多点联合突变。本发明所提供的烟酰胺核糖激酶突变体可用于β‑烟酰胺单核苷酸的合成制备。本发明构建的烟酰胺核糖激酶突变体与野生型酶相比，该突变体的热稳定性和单位酶活均得到大大提高，从而可以显著提升酶的反应温度，加快反应速率，降低反应时间和生产成本提高NMN收率，具有大规模工业应用的广泛前景。

Description

热稳定性和活性增强的烟酰胺核糖激酶突变体及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及生物酶工程技术领域，具体涉及热稳定性和活性增强的烟酰胺核糖激酶突变体及其编码基因和应用。

背景技术

烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononuclotide，NMN)，是一种自然存在的生物活性核苷酸，NMN有2种不规则存在形式，α异构体和β异构体。其中，β异构体是NMN的活性形式，分子量为334.221g/mol。NMN是哺乳动物体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamideadenine dinucleotide，NAD⁺，又称辅酶I)合成途径的重要中间体。近年来在Science、Nature、Cell等国际权威学术杂志上的相关研究报道表明，补充NMN可有效地增加和恢复体内辅酶I水平，大幅延缓衰老和防止老年痴呆症等多种神经元退化疾病，并由此从根本上调理和改善衰老的各种症状。因此以NMN为活性成分的功能性保健食品有着很大的开发潜力和市场前景。目前NMN在欧、美、日等发达国家已批准作为保健食品原料，并以NMN为主要成份开发出多种保健品，如美国HERBALmax、基因港GeneHarbor NMN9000、日本MIRAI LABNMN3000胶囊等。

NMN目前的生产方法主要有三种：固态酵母发酵工艺、体外酶催化工艺和化学法合成工艺。其中：(1)固态酵母发酵工艺复杂，产量较低，因此产品价格高昂。(2)化学法合成工艺以烟酰胺核糖为原料，用三氯氧磷进行磷酸化得到。虽然技术容易控制，但产品中杂质过多，分离纯化困难且总体收率很低；同时有机溶剂使用量大，对环境污染不可忽视。(3)酶作为一类与化学合成互补的、高效的生物催化剂已被广泛应用于新药研发、食品、化工等领域。目前主流的NMN生产工艺都是采用安全绿色的体外酶催化工艺。

主流的NMN的生物酶法制备是以烟酰胺核糖(nicotinamide riboside，NR)为起始原料，在烟酰胺核糖激酶(NR kinase，NRK)和ATP的作用下，一步反应得到NMN。对于酶催化反应来说，在酶的最适反应温度范围内，反应速率隨著温度的升高而急剧增加，从而缩短反应时间。然而，目前已报道的合成NMN的酶均为常温反应的酶，热稳定性不高，最适反应温度低于37℃，反应速率低，反应时间较长；同时也不利于酶液的长期保存。

如中国专利CN110373398A公开了一种烟酰胺核糖激酶突变体及其应用，该突变体的氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO.2相比，在氨基酸序列SEQ ID NO.2中第D45位、第D58位、第R161位、第Y164位进行单突变、两两联合突变、三个联合突变或四个联合突变中的一种突变；该新型烟酰胺核糖激酶突变体工业酶用于β-烟酰胺单核苷酸的合成制备，具有酶成本低，转化时间短、工艺操作简单等特点。但对于酶的热稳定性及酶活并没有明显提高。

然而目前关于烟酰胺核糖激酶的研究仍然较少，限制了生物酶催化一步反应法制备NMN工业化生产中的应用。通过定向突变方法提高烟酰胺核糖激酶的热稳定性及酶活性，将十分有助于实现工业上减少酶量，降低生产成本。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种热稳定性和活性增强的烟酰胺核糖激酶突变体及其编码基因和应用，以解决现有NRK热稳定性不高、反应速率低、反应时间较长，难以实现工业化生产的问题。

为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：

来源于Homo sapiens的野生型烟酰胺核糖激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明针对野生型NRK，通过大分子建模技术以及通过定点突变来降低蛋白整体结构的自由能来增加蛋白稳定性，通过蛋白结构自由能计算预测出了15个位点，可能与提高稳定性有关。更为具体的为，31位丝氨酸突变为半胱氨酸，49位赖氨酸突变为谷氨酸，59位谷氨酸突变为天冬氨酸，62位天冬酰胺突变为天冬氨酸，64位谷氨酸突变为天冬氨酸，69位丙氨酸突变为苏氨酸，71位丝氨酸突变为谷酰胺，76位丝氨酸突变为天冬酰胺，109位天冬氨酸突变为天冬酰胺，110位苏氨酸天冬氨酸，139位丝氨酸突变为脯氨酸，159位谷酰胺突变为谷氨酸，176位天冬氨酸突变为谷氨酸，179位亮氨酸突变为天冬酰胺，186位异亮氨酸突变为谷酰胺。

突变型NRK的基因序列通过常州基宇生物技术有限公司全基因合成所得，在编码区两端分别添加NdeI和HindIII限制性内切酶位点。目的基因片段通过限制性内切酶NdeI和HindIII酶切后，与经过同样双酶切的pET28a(+)载体进行连接、转化和筛选，筛选得到的阳性质粒NrK-pET28a(+)转入BL21(DE3)宿主菌中，从而构建突变型NrK的体外异源表达体系。最终得到的突变型NRK的热稳定性和酶活均相比于野生型NRK得到了提高。

因此，一方面，本发明请求保护一种烟酰胺核糖激酶突变体，其氨基酸序列与氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的野生型烟酰胺核糖激酶相比，在SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的第31位、第49位、第59位、第62位、第64位、第69位、第71位、第76位、第109位、第110位、第139位、第159位、第176位、第179位和第186位中的任意一个或多个位点进行单点或多点联合突变。

具体地，所述的烟酰胺核糖激酶突变体在SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的基础上，包含其第31位丝氨酸突变为半胱氨酸、第49位赖氨酸突变为谷氨酸、第59位谷氨酸突变为天冬氨酸、第62位天冬酰胺突变为天冬氨酸、第64位谷氨酸突变为天冬氨酸、第69位丙氨酸突变为苏氨酸、第71位丝氨酸突变为谷酰胺、第76位丝氨酸突变为天冬酰胺、第109位天冬氨酸突变为天冬酰胺、第110位苏氨酸天冬氨酸、第139位丝氨酸突变为脯氨酸、第159位谷酰胺突变为谷氨酸、第176位天冬氨酸突变为谷氨酸、第179位亮氨酸突变为天冬酰胺和第186位异亮氨酸突变为谷酰胺中的任意一个或多个突变位点。

更具体地，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

另一方面，本发明还请求保护与上述烟酰胺核糖激酶突变体具有75.4％及以上氨基酸序列相似性的烟酰胺核糖激酶。

另一方面，本发明还请求保护上述烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

又一方面，本发明还请求保护含有上述编码基因的载体。

具体地，所述的载体可以为各种表达载体，包括但不限于pET表达载体、pCW表达载体、pUC表达载体或pPIC9k表达载体中的任意一种表达载体。

优选地，所述的载体为pET表达载体。

又一方面，本发明还请求保护含有上述编码基因的宿主细胞。

具体地，所述的宿主细胞可以为任一种合适的宿主细胞，包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌或毕赤酵母。

优选地，所述的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

又一方面，本发明还请求保护上述烟酰胺核糖激酶突变体、编码基因、载体、宿主细胞在制备β-烟酰胺单核苷酸中的应用。

再一方面，本发明还提供了一种制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，包括以下步骤：

S1.配置反应体系，包含：0.1-5g/L烟酰胺核糖激酶突变体，50mMpH6.5磷酸钠缓冲液，10mM ATP，10-100g/L烟酰胺核糖，50mM六偏磷酸钠，50mM七水硫酸镁；控制反应体系温度在42℃，进行搅拌反应；

S2.反应3h后进行HPLC检测；经过纯化后得β-烟酰胺单核苷酸。

反应产物经HPLC检测，反应转化率＞99％。β-烟酰胺单核苷酸的生成率可达到95％。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明构建的烟酰胺核糖激酶突变体与野生型酶相比，热稳定性得到显著的提高，45℃加热20分钟后残留酶活由野生型的14.05％增加到突变体的76.24％；同时，突变体的单位酶活相对于野生型提高了2.77倍，从而可以显著提升酶的反应温度，加快反应速率，降低反应时间和生产成本，提高NMN收率，能够满足采用生物酶法制备NMN的大规模工业化生产的需求，具有广泛的应用前景。

(2)本发明构建的烟酰胺核糖激酶突变体的稳定性增加，可以有效延长酶的保存时间，降低酶的使用成本。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础等译，第三版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。

实施例一突变体的构建及培养

突变位点的选择：以Homo sapiens来源的烟酰胺核糖激酶NRK为起始模版，采用大分子建模技术以及自由能计算预测出可能有效的突变位点为S31C，K49E，E59D，N62D，E64D，A69T，S71Q，S76N，D109N，T110D，S139P，Q159E，D176E，L179N，I186Q。随后将含有15个突变位点的基因进行全合成。

实施例二原核表达体系的构建

突变体NRK(命名为NRK15)基因片段由常州基宇生物技术有限公司合成，并重组到PUC57载体上。经限制性内切酶NdeI和HindIII(购自New England Biolabs公司，NEB)在37℃双酶切4h后，1％琼脂糖凝胶电泳分离并进行切胶回收(胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司)。随后与同样经过双酶切的表达载体pET28a(+)(Novagen公司)，在T4 DNA连接酶(购自Takara公司)作用下16℃连接过夜。连接液转化DH5a感受态细胞，并进行菌落PCR筛选和测序验证，从而得到阳性重组质粒NRK15-pET28a(+)。

将阳性重组质粒NRK15-pET28a(+)转化表达宿主菌BL21(DE3)(购自天根生化科技(北京)有限公司)，得到原核表达菌株NRK15-pET28a(+)/BL21(DE3)。

用于ATP再生的多聚磷酸激酶(PPK2，来源于E.coli)由常州基宇生物技术有限公司合成，后续重组表达质粒的构建同NRK15-pET28a(+)质粒的构建，转入BL21(DE3)中后得到表达菌株。

实施例三酶的摇瓶发酵制备酶冻干粉

上述构建的表达菌株NRK15-pET28a(+)/BL21(DE3)，在加有终浓度为30μg/mL硫酸卡那霉素的5mL LB液体培养基【10g/L胰蛋白胨(OXIOD)，5g/L酵母粉(OXIOD)，10g/L氯化钠(国药试剂)】中于37℃、200rpm振荡培养过夜后，按1％(V/V)比例接种于含有终浓度为30μg/mL硫酸卡那霉素的400mL LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养。待OD₆₀₀在0.8-1.0之间时，加入终浓度为0.1mM的诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，并在25℃诱导过夜。菌体在4℃、8000rpm条件下离心收集，然后悬浮于50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，超声破碎(200W，3s/5s，30min)，4℃、12000rpm离心20min，取上清进行镍柱亲和层析纯化，经咪唑洗脱、除盐后冷冻干燥，即得酶冻干粉。

实施例四突变体酶单位酶活和热稳定性检测

酶活测定：在50mM pH7.0的磷酸钠缓冲液中依次加入终浓度分别为10g/L的NR、15g/L的ATP、10mM的七水硫酸镁，于37℃水浴锅中磁力搅拌温育5min后加入待测的酶液(或酶冻干粉)，反应20min后取样进行HPLC检测。

热稳定性测定：将野生型酶粉和突变体酶粉溶于50mM pH7.0的磷酸钠缓冲液后，置于45℃水浴锅中温育20min，离心取上清进行残留的酶活测定。

实验结果如下表所示，突变体热稳定性得到了显著提升，残留酶活从野生型的14.05％提高到突变体的76.24％；单位酶活也得到意外提升，比野生型酶提高了2.77倍。

表1野生型NRK酶和突变型NRK15的热稳定性及酶活

*1U定义为单位时间内(1min)生产1μmol产物NMN所需的酶量。

上述烟酰胺核糖激酶突变体NRK15的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。相应地，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

SEQ ID NO:1(NRK15编码基因的核苷酸序列)：

ATGAAAACCTTTATCATCGGTATTAGCGGCGTTACCAATAGCGGTAAAACAACCCTGGCAAAAAATCTGCAGAAACATCTGCCGAATTGTTGTGTTATTAGCCAGGATGATTTTTTTAAACCGGAAAGCGAAATTGAAACCGATGAAAATGGTTTTCTGCAGTATGATGTTCTGGATGCACTGGATATGGATAAAATGATGAGCACCATTCAGTGTTGGATGGAAAATGCACGTCATAGCGTTGTTAGCACCGATCAGGAAAGCGCAGAAGAAATTCCGATTCTGATTATTGAAGGTTTTCTGCTGTTTAATTATAAACCGCTGAATGATATTTGGAATCGTAGCTATTTTCTGACCATTCCGTATGAAGAATGTAAACGTCGTCGTAGCACCCGTGTTTATCAGCCGCCGGACCCTCCGGGTTATTTTGATGGTCATGTTTGGCCGATGTATCTGAAATATCGTCAGGAAATGGAAGATATTACCTGGGAAGTTGTTTATCTGGATGGTACCAAAAGCGAAGAAGAACTGTTTAATCAGGTTTATGAAGATCTGCAGCAGGAACTGGCAAAACAGAAATGTCTGCAGGTTACCGCATAA

SEQ ID NO:2(NRK15氨基酸序列)：

MKTFIIGISGVTNSGKTTLAKNLQKHLPNCCVISQDDFFKPESEIETDENGFLQYDVLDALDMDKMMSTIQCWMENARHSVVSTDQESAEEIPILIIEGFLLFNYKPLNDIWNRSYFLTIPYEECKRRRSTRVYQPPDPPGYFDGHVWPMYLKYRQEMEDITWEVVYLDGTKSEEELFNQVYEDLQQELAKQKCLQVTA

实施例五突变体的生物催化

将160mg底物NR溶解于1.6mL 50mM pH6.5磷酸钠缓冲液中，待底物完全溶解后加入50mM六偏磷酸钠、5mM ATP、50mM七水硫酸镁、烟酰胺核糖激酶突变体NRK15和PPK2酶量分别是0.5g/L和0.5g/L，在42℃恒温磁力搅拌器下搅拌反应，反应3h后进行HPLC检测；经过纯化后得β-烟酰胺单核苷酸。底物转化率大于99％，β-烟酰胺单核苷酸的生成率可达到95％。

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 中山俊凯生物技术开发有限公司

<120> 热稳定性和活性增强的烟酰胺核糖激酶突变体及其编码基因和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaaaacct ttatcatcgg tattagcggc gttaccaata gcggtaaaac aaccctggca 60

aaaaatctgc agaaacatct gccgaattgt tgtgttatta gccaggatga tttttttaaa 120

ccggaaagcg aaattgaaac cgatgaaaat ggttttctgc agtatgatgt tctggatgca 180

ctggatatgg ataaaatgat gagcaccatt cagtgttgga tggaaaatgc acgtcatagc 240

gttgttagca ccgatcagga aagcgcagaa gaaattccga ttctgattat tgaaggtttt 300

ctgctgttta attataaacc gctgaatgat atttggaatc gtagctattt tctgaccatt 360

ccgtatgaag aatgtaaacg tcgtcgtagc acccgtgttt atcagccgcc ggaccctccg 420

ggttattttg atggtcatgt ttggccgatg tatctgaaat atcgtcagga aatggaagat 480

attacctggg aagttgttta tctggatggt accaaaagcg aagaagaact gtttaatcag 540

gtttatgaag atctgcagca ggaactggca aaacagaaat gtctgcaggt taccgcataa 600

<210> 2

<211> 199

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Lys Thr Phe Ile Ile Gly Ile Ser Gly Val Thr Asn Ser Gly Lys

1 5 10 15

Thr Thr Leu Ala Lys Asn Leu Gln Lys His Leu Pro Asn Cys Cys Val

20 25 30

Ile Ser Gln Asp Asp Phe Phe Lys Pro Glu Ser Glu Ile Glu Thr Asp

35 40 45

Glu Asn Gly Phe Leu Gln Tyr Asp Val Leu Asp Ala Leu Asp Met Asp

50 55 60

Lys Met Met Ser Thr Ile Gln Cys Trp Met Glu Asn Ala Arg His Ser

65 70 75 80

Val Val Ser Thr Asp Gln Glu Ser Ala Glu Glu Ile Pro Ile Leu Ile

85 90 95

Ile Glu Gly Phe Leu Leu Phe Asn Tyr Lys Pro Leu Asn Asp Ile Trp

100 105 110

Asn Arg Ser Tyr Phe Leu Thr Ile Pro Tyr Glu Glu Cys Lys Arg Arg

115 120 125

Arg Ser Thr Arg Val Tyr Gln Pro Pro Asp Pro Pro Gly Tyr Phe Asp

130 135 140

Gly His Val Trp Pro Met Tyr Leu Lys Tyr Arg Gln Glu Met Glu Asp

145 150 155 160

Ile Thr Trp Glu Val Val Tyr Leu Asp Gly Thr Lys Ser Glu Glu Glu

165 170 175

Leu Phe Asn Gln Val Tyr Glu Asp Leu Gln Gln Glu Leu Ala Lys Gln

180 185 190

Lys Cys Leu Gln Val Thr Ala

195

<210> 4

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgaaaacct tcatcattgg tattagcggt gtgacgaaca gcggtaaaac gaccctggcg 60

aaaaacctgc aaaaacatct gccgaattgt agcgtgattt ctcaggatga ctttttcaaa 120

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ctgaatatgg aaaaaatgat gagtgcgatt tcctgctgga tggaaagtgc ccgccattca 240

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ctgctgttca actacaaacc gctggacacc atttggaatc gcagctattt tctgacgatc 360

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<210> 4

<211> 199

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Lys Thr Phe Ile Ile Gly Ile Ser Gly Val Thr Asn Ser Gly Lys

1 5 10 15

Thr Thr Leu Ala Lys Asn Leu Gln Lys His Leu Pro Asn Cys Ser Val

20 25 30

Ile Ser Gln Asp Asp Phe Phe Lys Pro Glu Ser Glu Ile Glu Thr Asp

35 40 45

Lys Asn Gly Phe Leu Gln Tyr Asp Val Leu Glu Ala Leu Asn Met Glu

50 55 60

Lys Met Met Ser Ala Ile Ser Cys Trp Met Glu Ser Ala Arg His Ser

65 70 75 80

Val Val Ser Thr Asp Gln Glu Ser Ala Glu Glu Ile Pro Ile Leu Ile

85 90 95

Ile Glu Gly Phe Leu Leu Phe Asn Tyr Lys Pro Leu Asp Thr Ile Trp

100 105 110

Asn Arg Ser Tyr Phe Leu Thr Ile Pro Tyr Glu Glu Cys Lys Arg Arg

115 120 125

Arg Ser Thr Arg Val Tyr Gln Pro Pro Asp Ser Pro Gly Tyr Phe Asp

130 135 140

Gly His Val Trp Pro Met Tyr Leu Lys Tyr Arg Gln Glu Met Gln Asp

145 150 155 160

Ile Thr Trp Glu Val Val Tyr Leu Asp Gly Thr Lys Ser Glu Glu Asp

165 170 175

Leu Phe Leu Gln Val Tyr Glu Asp Leu Ile Gln Glu Leu Ala Lys Gln

180 185 190

Lys Cys Leu Gln Val Thr Ala

195

Claims

1.一种烟酰胺核糖激酶突变体，其特征在于，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.权利要求1所述的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因，其特征在于，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.含有权利要求2所述的编码基因的载体。

4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述的载体为pET 表达载体、pCW表达载体、pUC表达载体或pPIC9k表达载体。

5.含有权利要求2所述的编码基因的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌或毕赤酵母。

6.权利要求1所述的烟酰胺核糖激酶突变体、权利要求2所述的编码基因、权利要求3或4所述的载体、或权利要求5所述的宿主细胞在制备β-烟酰胺单核苷酸中的应用。

7.一种制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

S1.配置反应体系，包含：0.1-5g/L权利要求1所述的烟酰胺核糖激酶突变体，50mMpH6.5磷酸钠缓冲液，10mM ATP，10-100g/L烟酰胺核糖，50mM六偏磷酸钠，50mM七水硫酸镁；控制反应体系温度在42℃，进行搅拌反应；

S2.反应3h后进行HPLC检测；经过纯化后得β-烟酰胺单核苷酸。