CN111057697B

CN111057697B - 耐高温TIM barrel蛋白突变体及其应用

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Publication number: CN111057697B
Application number: CN201911378513.5A
Authority: CN
Inventors: 柳志强; 贾东旭; 郑裕国; 孙晨奕; 金利群; 彭晨; 陈德水; 廖承军; 程新平; 李勉; 毛宝兴
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2019-12-27
Filing date: 2019-12-27
Publication date: 2023-03-31
Anticipated expiration: 2039-12-27
Also published as: CN111057697A

Abstract

本发明涉及一种具备D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶功能的耐高温TIM barrel蛋白突变体，及其在催化D‑果糖异构化制备D‑阿洛酮糖中的应用。所述TIM Barrel蛋白突变体，由序列如SEQ ID NO.1所示氨基酸经定点突变而得，所述点突变位点为下列中的一个或多个：(1)第241位、(2)第182位、(3)第201位、(4)第105位、(5)第30位。本发明有益效果主要体现在：本发明提供了一种全新的TIM Barrel蛋白酶突变体，该突变体具有超高酶活、较高最适反应温度和底物转化率，解决了现有酶催化制备D‑psicose效率低下的技术难题。使用本突变体生产D‑psicose，产物得率最高可达53.68％，优于原始酶和其他突变酶的转化效果，具有较好工业应用前景。

Description

耐高温TIM barrel蛋白突变体及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种耐高温TIM barrel蛋白突变体，及其在微生物催化D-果糖异构化制备D-阿洛酮糖中的应用。

(二)背景技术

D-阿洛酮糖(D-psicose)是D-果糖的C-3差向异构体，属于稀有糖家族，因其高甜度低能量，是一种理想的蔗糖替代物。D-psicose通过竞争吸收和排泄转运糖蛋白，可以抑制D-果糖和D-葡萄糖的吸收，进而减少体内脂肪累积，降低糖尿病风险。长期和短期的D-psicose膳食补充，对II型糖尿病患者和胰岛β-细胞功能缺陷患者细胞均有明显的益处。D-psicose在自然界中含量稀少，仅在部分植物(如小麦和鼠刺属植物)中有发现，直接提取导致资源浪费和环境破坏。采用化学合成法，催化反应复杂，纯化过程繁琐，化学污染严重。因此，需要采用更加高效的合成方式制备D-psicose。

生物转化是一种利用微生物产生的一种或几种特殊的胞外或胞内酶作为生物催化剂，将底物转化为产物的过程。生物转化具有反应条件温和、原料利用率高的特点，同时转化过程具有优良的化学选择性、区域选择性和立体选择性，能够保证目标化合物的高效合成。目前，利用异构酶或含有该酶的细胞为生物催化剂进行异构化反应制备多种糖类化合物，已成为制糖工业重要的经济增长点。

D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose3-epimerase，简称DPE)属于酮糖3-差向异构酶家族，用于催化D-果糖异构化生成D-psicose。当前的D-psicose生产技术主要集中在日本稀有糖研究中心、首尔国立大学等机构，所用的DPE主要来源于Agrobacteriumtumefaciens ATCC33970、Clostridium cellulolyticum H10和Rhodobacter sphaeroidesSK011等野生菌(Kim T et al.，PLoS ONE,2016,11(7):e0160044.)。上述DPE均不属于耐热性酶，只能在50～60℃的异构化温度下进行催化反应，D-果糖转化率介于25～35％之间。

有报道指出，DPE介入的D-果糖异构化过程是一个热力学平衡反应，随着异构化温度的升高，会促进异构化反应向D-psicose方向进行。如果能在高温如70℃或更高的异构化温度下催化，促使平衡正向进行，提高D-果糖转化率，获得高浓度产物，将大幅度减小生产、提取等成本。目前，在用于合成的D-psicose的DPE酶源较少，能够满足高温催化制备高浓度D-psicose的酶更是罕见。在耐高温酶制剂没有成功投放于市场的背景下，研发新型耐高温DPE对于满足人民群众日益增长的摄糖需求具有重要意义。

据估计，从蛋白质结构分类(SCOP)数据库中，约有10％的已知酶具有TIM-barrel结构域。TIM-barrel蛋白(简称TBP)具有高度的序列变异性和功能多样性，主要包括转移酶、裂解酶和异构酶等多类蛋白。通过生物信息学，依据蛋白质结构的分类，寻找具有异构化D-果糖为D-阿洛酮糖功能的TBP，成为扩宽生物转化合成D-psicose的可能途径，为解决工业化用酶短缺问题提供了新思路。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种具备D-阿洛酮糖3-差向异构酶功能的耐高温TIM barrel蛋白突变体，及其在催化D-果糖异构化制备D-阿洛酮糖中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种耐高温TIM barrel蛋白突变体，由序列如SEQ ID NO.1所示氨基酸经定点突变而来，所述突变的位点为下列中的一个或多个：(1)第241位、(2)第182位、(3)第201位、(4)第105位、(5)第30位。

具体的，所述耐高温TIM barrel蛋白突变体由序列如SEQ ID NO.1所示氨基酸经下列之一或多个位点突变而得：(1)第241位缬氨酸V突变为赖氨酸K、蛋氨酸M、苯丙氨酸F、脯氨酸P或丝氨酸S；(2)第182位亮氨酸L突变为色氨酸W、酪氨酸Y、谷氨酰胺Q或半胱氨酸C；(3)第201位丙氨酸A突变为H、赖氨酸K或苯丙氨酸F；(4)第105位甘氨酸G突变为亮氨酸L、天冬氨酸D或谷氨酰胺Q；(5)第30位苯丙氨酸F突变为脯氨酸P、缬氨酸V或谷氨酸E。

进一步，所述耐高温TIM barrel蛋白突变体由序列如SEQ ID NO.1所示氨基酸经下列之一或多个位点突变而得：(1)第241位缬氨酸V突变为苯丙氨酸F；(2)第182位亮氨酸L突变为色氨酸W；(3)第201位丙氨酸A突变为苯丙氨酸F；(4)第105位甘氨酸G突变为天冬氨酸D；(5)第30位苯丙氨酸F突变为脯氨酸P。

更为优选的，所述耐高温TIM barrel蛋白突变体序列如SEQ ID NO.7所示(其编码基因如SEQ ID NO.8所示)。

本发明还涉及所述的耐高温TIM barrel蛋白突变体在催化D-果糖异构化制备D-阿洛酮糖中的应用中。

具体的，所述应用为：以含所述耐高温TIM barrel蛋白突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经超声破碎后获得的上清液作为催化剂，以D-果糖为底物，在Co²⁺(如CoCl₂)存在下，在pH7.0～8.0的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液中，80～100℃温度下反应，反应结束后，反应液分离纯化，获得D-阿洛酮糖。

所述耐高温TIM barrel蛋白突变体编码基因序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明有益效果主要体现在：本发明提供了一种全新的TIM Barrel蛋白酶突变体，该突变体具有超高酶活、较高最适反应温度和底物转化率，解决了现有酶催化制备D-psicose效率低下的技术难题。使用本发明突变体生产D-psicose，产物得率最高可达53.68％，最适反应温度可达90℃，优于原始酶和其他突变酶的转化效果，具有较好工业应用前景。

(四)附图说明

图1为重组酶的最适温度示意图；

图2为金属离子对重组酶活力的影响示意图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：新型DPE的筛选与活力测定

1、酶的来源与重组菌的构建

解析异构酶的关键催化区域，比对新型未被研究的酶序列，从NCBI数据库中获得三株TIM barrel蛋白(TIM barrel protien，简称TBP)，分别来源于Neobitarellamassiliensis(GenBank编号WP_105203324.1)、Microvirga sp.CDVBN77(GenBank编号WP_150946712.1)、Bacillus bataviensis(GenBank编号WP_144563625.1)，并命名为NmTBP、MsTBP和BbTBP。根据氨基酸序列，依据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，通过基因工程的常规操作以全合成的方法合成了三条选择的核苷酸序列，分别如SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.6所示；编码酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.5所示。在核酸序列末端加入6×His-tag标签，两端加入酶切位点Xba I和Xho I，将该基因克隆至pET28b(+)对应的Xba I和Xho I位点，获得重组表达质粒pET28b/NmTBP、pET28b/MsTBP和pET28b/BbTBP。

2、重组菌的转化与诱导表达

将获得的重组表达质粒pET28b/NmTBP、pET28b/MsTBP和pET28b/BbTBP转化至Escherichia coli BL21(DE3)受体菌中，涂布于含终浓度为100μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃下培养过夜，第2天于平板上长出的菌落中随机挑取克隆并抽提质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得含TBP基因的基因工程菌。

LB液体培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH值自然；LB固体培养基在LB液体培养基中添加15g/L琼脂；121℃高压灭菌20min；使用前添加终浓度100μg/mL卡那霉素。

将基因工程菌接种至含终浓度100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃、150r/min培养至OD₆₀₀约0.6～0.8，获得种子液；将种子液以体积浓度2％(v/v)接种量接种至新鲜的含有终浓度100μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.4～0.6，再向培养液中加入终浓度1mM的IPTG，于25℃下诱导表达12h后，4℃、6000r/min离心10min，弃去上清液，用0.85％的生理盐水清洗两遍湿菌体，并收集湿菌体，备用。

3、底物特异性研究

各取1g上述重组菌湿菌体，用50mL的50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲(pH 7.5)液悬浮，在39W条件下超声破碎，有效时间15min，制备获得超声破碎后的混悬液，离心，收集上清液，取1mL上清液用于反应。反应体系：50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液(pH 7.5)、1mM CoCl₂.6H₂O、0.5mM MnCl₂、0.5mM FeCl₃、0.5mM MgCl₂和50g/L的各种底物(见表1)、100μL上述上清液，共1mL体系。反应条件：于40℃条件下反应10min，沸水煮沸10min终止反应。12000r/min离心10min，取上清液。

采用高效液相色谱法测定各个底物的活力。利用Ca²⁺-Carbohydrate column(Waters Sugar-Pak 1，沃特世公司，美国)分析柱检测各糖的转化情况，将每min内糖底物异构化生成1μmol糖产物所需酶量定义为一个酶活单位(U)。将NmTBP对D-葡萄糖测定的酶活设定为100％，结果见。由表1结果可知，只有NmTBP对D-果糖具有较高酶活，说明该酶具备催化D-果糖至D-阿洛酮糖的异构化反应的潜力。

表1：各酶的底物特异性研究

4、重组菌酶活的精准确定

利用超声破碎湿菌体方法获得上清液(操作同“底物特异性的研究”)。反应体系：50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液(pH 7.5)、1mM CoCl₂.6H₂O和50g/L的D-果糖及100μL上述上清液，共1mL体系。反应条件：60℃条件下反应10min，沸水煮沸10min终止反应。采用HPLC检测D-psicose浓度。酶活定义：60℃和pH 7.5下，每分钟将D-果糖异构化生成1μmol D-阿洛酮糖所需酶量定义为一个酶活单位(U)，结果见表2。由表2结果可知，NmTBP对D-果糖的酶活精准测定为10.12U/mL。

表2：重组酶的酶活测定

实施例2：NmTBP单位点突变体的构建与筛选

1、突变体构建

根据NmTBP亲本序列(氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示)设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/NmTBP为模板，对第241位引入单突变，引物为：

正向引物241V：TATGATGGCAACNNNGTGATGGAACC(下划线为突变碱基)

反向引物241V：GGTTCCATNNNCACGTTGCCATCATA(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物241V 2μL(5pmol/μL)，反向引物241V 2μL(5pmol/μL)，模板DNA 1μL(20ng/μL，)，Phanta MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃ 3min；(95℃ 15s，56℃ 15s，72℃ 6.5min)30循环；72℃5min。

2、突变体转化表达

取5μL的PCR产物，加入100μL冰浴的E.coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中，冰上静置30min，将转化产物于42℃热击90s，迅速置于冰上冷却5min，向管中加入600μL的LB液体培养基，37℃，150r/min培养60min，取100μL上述菌液涂板，待菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养12h。

3、高通量筛选阳性转化子

反应混合液组成：50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液(pH 7.5)、1mM CoCl₂·6H₂O和5g/L的D-果糖，加入去离子水至总反应体系配成1L备用。在96孔聚苯乙烯微孔培养板中每孔加入100μL含有终浓度100μg/mL卡那霉素的LB培养液，接种不同的转化菌落，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.4～0.6，再向培养液中加入终浓度为1mM的IPTG，于25℃下诱导表达10h后，4℃、6000r/min离心10min，弃去上清液。取100μL上述反应混合液加入含有菌体的的96孔板中，振荡器振荡混匀后在60℃、600r/min反应10min，冰浴10min停止反应。取2.5μL反应液以半胱氨酸-咔唑显色法筛选突变体，反应体包括反应液5μL的1.5％(w/v)半胱氨酸盐酸盐，150μL的70％(w/w)浓硫酸、5μL的0.12％(w/v)咔唑乙醇，60℃下保温10min后观察颜色变化。以重组菌菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/NmTBP的反应为对照，取颜色比E.coli BL21(DE3)/pET28b/NmTBP的反应深的突变株进行酶活精准测定。

4、阳性转化子酶活的精准测定

操作同实施例1的“重组菌酶活的精准测定”。

该实施例的结果为：对612株重组转化菌初筛，筛选出5株酶活提高的突变株，再对其进行酶活精准测定，具体结果见表3。经分析确定，其余607株重组菌酶活保持不变或下降的原因是第241位缬氨酸(V)突变为K、M、F、P和S外的其他氨基酸。

表3：单点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的NmTBP-V241F突变体记为NmTBP-1，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/NmTBP-1。

实施例3：NmTBP双位点突变体的构建与筛选

根据实施例2构建的单突变体NmTBP-1序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/NmTBP-1为模板，对第182位引入单突变，引物为：

正向引物182L：CGTGAAAGTGATGNNNGATACCT(下划线为突变碱基)

反向引物182L：AGGTATCNNNCATCACTTTCACG(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物182L 2μL(5pmol/μL)，反向引物182L 2μL(5pmol/μL)，模板DNA 1μL(20ng/μL，)，Phanta MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃ 3min；(95℃ 15s，54℃ 15s，72℃ 6.5min)30循环；72℃5min。

PCR产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑单克隆于含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。利用半胱氨酸咔唑法显色法对突变体进行初筛(操作同实施例2的“高通量筛选阳性转化子”)，阳性克隆进行酶活精准测定(操作同实施例1的“重组酶酶活的精准测定”)。

该实施例的结果为：对350株重组转化菌初筛，筛选出4株酶活提高的突变株，再对其进行酶活精准测定，具体结果见表4。经分析确定，其余346株重组菌酶活保持不变或下降的原因是第182位亮氨酸(L)突变为W、Y、Q和C外的其他氨基酸。

表4：双点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的NmTBP-V241F-L182W突变体记为NmTBP-2，获得重组菌E.coliBL21(DE3)/pET28b/NmTBP-2。

实施例4：NmTBP三位点突变体的构建与筛选

根据实施例3构建的突变体NmTBP-2序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/NmTBP-2为模板，对第201位引入单突变，引物为：

正向引物201A：AAGCGATTCTGACCNNNGGCGATG(下划线为突变碱基)

反向引物201A：CATCGCCNNNGGTCAGAATCGCTT(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物201A 2μL(5pmol/μL)，反向引物201A 2μL(5pmol/μL)，模板DNA 1μL(20ng/μL，)，Phanta MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃ 15s，63℃ 15s，72℃ 6.5min)30循环；72℃5min。

PCR产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑单克隆于含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃℃培养过夜。利用半胱氨酸咔唑法显色法对突变体进行初筛(操作同实施例2的“高通量筛选阳性转化子”)，阳性克隆进行酶活精准测定(操作同实施例1的“重组酶酶活的精准测定”)。

该实施例的结果为：对571株重组转化菌初筛，筛选出3株酶活提高的突变株，再对其进行酶活测定，具体结果见表5。经分析确定，其余568株重组菌酶活保持不变或下降的原因是第201位丙氨酸(A)突变为H、K和F外的其他氨基酸。

表5：三点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的NmTBP-V241F-L182W-A201F突变体记为NmTBP-3，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/NmTBP-3。

实施例5：NmTBP四位点突变体的构建与筛选

根据实施例4构建的突变体NmTBP-3序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/NmTBP-3为模板，对第105位引入单突变，引物为：

正向引物105G：ATTCATTTTGTGNNNGGCGGCCTGTATA(下划线为突变碱基)

反向引物105G：TATACAGGCCGCCNNNCACAAAATGAAT(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物105G 2μL(5pmol/μL)，反向引物105G 2μL(5pmol/μL)，模板DNA 1μL(20ng/μL)，Phanta MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃ 3min；(95℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 6.5min)30循环；72℃5min。

该实施例的结果为：对691株重组转化菌初筛，筛选出3株酶活提高的突变株，再对其进行酶活测定，具体结果见表6。经分析确定，其余688株重组菌酶活保持不变或下降的原因是第105位甘氨酸(G)突变为L、D和Q外的其他氨基酸。

表6：四位点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的NmTBP-V241F-L182W-A201F-G105D突变体记为NmTBP-4，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/NmTBP-4。

实施例6：NmTBP五位点突变体的构建与筛选

根据实施例5构建的突变体NmTBP-4序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/NmTBP-4为模板，对第30位引入单突变，引物为：

正向引物30F：GTGCGTGATCTGGGCNNNGATA(下划线为突变碱基)

反向引物30F：TATCNNNGCCCAGATCACGCAC(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物30F 2μL(5pmol/μL)，反向引物30F 2μL(5pmol/μL)，模板DNA 1μL(20ng/μL，)，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃ 15s，53℃ 15s，72℃ 6.5min)30循环；72℃5min。

该实施例的结果为：对498株重组转化菌初筛，筛选出3株酶活提高的突变株，再对其进行酶活测定，具体结果见表7。经分析确定，其余495株重组菌酶活保持不变或下降的原因是第30位苯丙氨酸(F)突变为P、V和E外的其他氨基酸。

表7：五点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的NmTBP-V241F-L182W-A201F-G105D-F30P突变体记为NmTBP-5，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/NmTBP-5。

实施例7：重组大肠杆菌发酵产酶与纯化

分别将重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/NmTBP、E.coli BL21(DE3)/pET28b/NmTBP-1、E.coli BL21(DE3)/pET28b/NmTBP-2、E.coli BL21(DE3)/pET28b/NmTBP-3、E.coli BL21(DE3)/pET28b/NmTBP-4、E.coli BL21(DE3)/pET28b/NmTBP-5接种至含终浓度100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃、150r/min培养OD₆₀₀约0.6～0.8，获得种子液；将种子液以2％(v/v)接种量接种至新鲜的含有终浓度100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.4～0.6，再向培养液中加入终浓度为1mM的IPTG，于25℃下诱导表达12h后，4℃、6000r/min离心10min，弃去上清液，用0.85％的生理盐水清洗两遍湿菌体，并收集湿菌体。

采用超声破碎方法对湿菌体进行超声破碎，收集上清液。

使用nickel-NTA琼脂糖凝胶柱进行纯化，用平衡缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.0)平衡层析柱，再使用洗脱液(50mM磷酸盐缓冲液，300mMNaCl，500mM咪唑，pH 8.0)进行洗脱，根据紫外检测器的信号响应，收集相应的洗脱液，即为各自纯酶液。

实施例8：纯化NmTBP及其突变体的最适反应温度

将实施例7中的纯酶液作为转化用酶，测定酶的最适反应温度。反应体系为：50g/L的D-果糖、1mM CoCl₂·6H₂O、100μL上述实施例获得的纯酶液，再加入50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液(pH 7.5)至总体系1mL。分别于不同转化温度：60、65、70、75、80、85、90、95、100℃测定重组TBP催化D-果糖异构化为D-psicose的活力(操作方法同实施例1的“重组菌酶活的精准测定”)。由图1中可知，NmTBP-5的最适反应温度为90℃，比原始酶NmTBP提高20℃。

实施例9：金属离子对TBP最优突变体酶活的影响

将实施例7中的纯酶液作为转化用酶，测定金属离子对重组酶酶活的影响。1mL反应体系包括：50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液(pH 7.5)、50g/L D-果糖、100μL纯酶液和1mM不同金属离子。其中，金属离子的选择如下：Co²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Al³⁺、Ba²⁺、Fe²⁺、Pb²⁺和Ca²⁺，于60℃进行酶活测定。以不加金属离子作为对照。由图2可知，不同于传统DPE以Co²⁺为最优金属离子，本发明的酶以Mg²⁺为最优金属离子，使用该金属离子可为后续的分离提取、工业污水净化带来便利。

实施例10：原始酶与突变酶突变重组菌全细胞制备D-psicose

按实施例7的发酵方法，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/NmTBP、E.coliBL21(DE3)/pET28b/NmTBP-1、E.coli BL21(DE3)/pET28b/NmTBP-2、E.coli BL21(DE3)/pET28b/NmTBP-3、E.coli BL21(DE3)/pET28b/NmTBP-4、E.coli BL21(DE3)/pET28b/NmTBP-5。分别以上述湿菌体作为生物催化剂，以D-果糖为底物，生物转化制备D-psicose。催化体系包括：不同浓度的D-果糖、1mM CoCl₂·6H₂O、15g/L湿菌体，再加入适量50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液(pH 7.5)至总体系100mL。反应体系于70℃、150r/min条件下反应8h。每隔1h取样、离心，用0.22μm膜过滤后进行HPLC检测D-psicose浓度。由表8可知，E.coli BL21(DE3)/pET28b/NmTBP-5的产物得率最终达到53.68％，高于原始酶E.coli BL21(DE3)/pET28b/NmTBP和其他突变酶的得率。

表8：各重组菌得率的比较

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 耐高温TIM barrel蛋白酶突变体及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 296

<212> PRT

<213> Neobitarella massiliensis

<400> 1

Met Lys Tyr Gly Ile Tyr Tyr Ala Phe Trp Glu Lys Gln Trp Gly Gly

1 5 10 15

Glu Phe Arg Pro Tyr Val Lys Lys Val Arg Asp Leu Gly Phe Asp Ile

20 25 30

Leu Glu Ile Ser Cys Ala Thr Leu Pro Gln Thr Pro Asp Ser Glu Met

35 40 45

Val Glu Leu Gly Gln Leu Ala Lys Glu Ala Gly Ile Thr Leu Thr Ala

50 55 60

Gly Tyr Gly Pro Ala Pro Cys Tyr Asp Leu Ser Ser Pro Asp Pro Ser

65 70 75 80

Val Val Gln Asn Gly Leu His Phe Tyr Arg Gln Val Phe Ala Lys Met

85 90 95

Ala Leu Ala Asp Ile His Phe Val Gly Gly Gly Leu Tyr Ser His Trp

100 105 110

Pro Val Asp Phe Ser Lys Pro Ile Asp Lys Gln Ala Asp Trp Gln Arg

115 120 125

Ser Val Asn Gly Val Arg Gln Leu Ala Asp Met Ala Ala Gly Phe Asp

130 135 140

Ile Thr Leu Gly Met Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Gly Tyr Leu Leu

145 150 155 160

Thr Cys Ala Ala Glu Gly Val Ala Tyr Val Lys Glu Val Asp Arg Pro

165 170 175

Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp

180 185 190

Ser Phe Thr Glu Ala Ile Leu Thr Ala Gly Asp Ala Leu Gly His Phe

195 200 205

His Ile Gly Glu Cys Asn Arg Lys Leu Pro Gly Gln Gly Arg Ile Pro

210 215 220

Trp Glu Glu Ile Gly Ser Ala Leu Arg Gln Ile Gly Tyr Asp Gly Asn

225 230 235 240

Val Val Met Glu Pro Phe Ile Leu Ser Gly Gly Gln Val Gly Gln Asp

245 250 255

Ile Lys Val Trp Arg Asp Ile Ser Ala Gly Lys Ser Pro Ala Gln Ile

260 265 270

Asp Arg Glu Thr Ala Glu Ser Val Ala Tyr Val Arg Arg Val Phe Glu

275 280 285

Gly Arg His His His His His His

290 295

<210> 2

<211> 888

<212> DNA

<213> Neobitarella massiliensis

<400> 2

atgaaatatg gtatttacta tgctttttgg gaaaagcaat ggggcggaga gttccgtcct 60

tacgttaaaa aggtccgcga tttagggttt gacatcttgg aaatatcttg tgccactctt 120

ccccagaccc cagattccga gatggtagaa ctcggtcaac tagcaaaaga ggcgggcatt 180

acactgacgg ctggatatgg gccggcccct tgctacgact tatcatcgcc cgatccaagt 240

gtggttcaga atggtttgca tttctatcga caagtctttg caaagatggc gcttgctgac 300

atccacttcg taggcggagg gctctacagc cattggccgg tggatttttc taaacctata 360

gacaagcagg ccgattggca acggtccgtt aacggtgtca gacagctagc agacatggcg 420

gctggcttcg atattactct gggaatggaa gtattaaata ggtttgaggg gtatttgctt 480

acctgtgccg cagaaggtgt ggcgtacgtt aaagaggtcg accgtcccaa cgtaaaggtg 540

atgctcgata cattccacat gaatatcgaa gaggactcat ttacggaagc tatactaact 600

gccggcgatg cactgggaca tttccacatt ggggagtgca accgcaaatt accaggtcaa 660

ggccgaatcc cgtgggaaga gataggatcg gcgttgcggc agattgggta tgacggtaat 720

gttgtcatgg aaccttttat ccttagtggc ggacaagtag ggcaggatat aaaggtgtgg 780

agagacatta gcgctggtaa atctcccgcc caaatcgata gggagaccgc agaatccgtt 840

gcgtacgtcc gtcgcgtatt cgagggccga catcaccatc accatcac 888

<210> 3

<211> 299

<212> PRT

<213> Microvirga sp.

<400> 3

Met Asn Ser Ile Gly Leu Ile Ser Met Gln Tyr Ala Arg Pro Phe Thr

1 5 10 15

Ala Glu His Phe Arg Leu Phe Arg Thr Met Arg Glu Leu Gly Phe Asp

20 25 30

Phe Val Glu Leu Leu Val Pro Glu Pro Gly Glu Leu Asp Leu Glu Asp

35 40 45

Thr Arg Arg Ala Leu Glu Asp Ala Gly Leu Ser Val Val Leu Ala Ala

50 55 60

Arg Val Asn Leu Glu Arg Asn Leu Ser Ser Asp Asp Ala Lys Trp Arg

65 70 75 80

Gln Ala Gly Val Asp Tyr Leu Arg Tyr Ala Val Asp Val Ala Asp Ser

85 90 95

Leu Gly Ala Ala Ile Val Gly Gly Pro Leu Thr Gly Asn Pro Leu Val

100 105 110

Phe Ala Gly Arg Pro Pro Gln Pro Ile Ser Glu Ala Glu Arg Leu Ala

115 120 125

Arg Lys Glu Arg Cys Val Thr Gly Leu Arg Thr Ala Gly Asp His Ala

130 135 140

Gly Ala Cys Gly Val Thr Leu Ala Val Glu Pro Leu Asn Arg Phe Glu

145 150 155 160

Ser Asp Val Leu Cys Thr Thr Gln Gln Ala Val Glu Leu Leu Asp Ala

165 170 175

Val Asp His Pro Ala Val Gln Met Met Leu Asp Thr Phe His Met His

180 185 190

Met Glu Glu Ala Ser Ile Pro Glu Ala Ile Arg Leu Gly Gly Lys Arg

195 200 205

Val Ala His Phe Gln Ala Asn Glu Asn His Arg Gly Phe Pro Gly Thr

210 215 220

Gly Ser Thr Asp Trp Val Ala Val Gly Arg Ala Leu His Asp Ile Ala

225 230 235 240

Tyr Ala Gly Pro Ile Ser Leu Glu Pro Phe Arg Arg Asn Asp Asp Arg

245 250 255

Phe Gly Val Pro Phe Ala Gln Trp Arg Pro Pro His Glu Asp Glu Ser

260 265 270

Glu Arg Leu Ala Ala Ser Ala Ala Phe Ile Lys Ser His Leu Leu Leu

275 280 285

Thr Glu Phe Arg Arg His His His His His His

290 295

<210> 4

<211> 897

<212> DNA

<213> Microvirga sp.

<400> 4

atgaattcta ttggtttaat ctccatgcaa tatgctcgtc cttttactgc cgaacatttc 60

cgcttgtttc gaaccatgcg ggagcttggc ttcgattttg ttgaactcct agtccccgag 120

ccaggagaac tggacttaga ggatacaaga agggcattgg aagacgcggg gctttcagta 180

gtgctcgctg cccgtgttaa cctagagcgc aatctgtcga gtgatgacgc aaaatggcga 240

caggcgggtg tcgattactt acggtatgct gtagacgtgg ccgatagctt gggcgcagcg 300

atagttggag ggccgcttac gggtaaccct ctcgtcttcg ctggcagacc cccacaaccg 360

atttctgaag ccgagaggct agcacgtaag gaacgctgtg taactggact gcgaaccgcg 420

ggggaccacg ctggtgcctg cggcgtgaca ttagcagttg agcctttgaa tcggtttgaa 480

tccgatgtcc tttgtacgac tcagcaagcg gtagagctcc tagacgctgt ggatcatccc 540

gccgttcaga tgatgctgga caccttccac atgcatatgg aagaggcatc aatcccagaa 600

gcgataagat taggagggaa aagggtcgct cactttcaag ccaacgagaa tcatcgtggt 660

ttcccgggca caggatcgac ggattgggta gcagtggggc gcgcgttgca cgacattgct 720

tacgccggtc ctatcagtct tgaacccttt cgacggaacg atgacagatt cggcgttcca 780

tttgcacagt ggaggccgcc tcatgaggat gaaagcgagc gtctcgcggc ttctgccgca 840

ttcataaagt cccacctact gttaactgaa tttcgccgac atcaccatca ccatcac 897

<210> 5

<211> 288

<212> PRT

<213> Bacillus bataviensis

<400> 5

Met Lys Phe Gly Ala Ser Thr Phe Ile Trp Val Ser Pro Phe Ser Asn

1 5 10 15

Gln Thr Leu Asn Leu Ile Asp Lys Val Lys Asn Ile Gly Phe Asp Tyr

20 25 30

Leu Glu Ile Cys Ile Glu Asp Pro Glu Thr Ile Asp Val Ala Ala Ile

35 40 45

Arg Asn His Leu Asn Lys Thr Gly Val Gln Ala Leu Val Cys Gly Ala

50 55 60

Phe Gly Pro Asn Arg Asp Ile Ser Ser Glu Asp Ala Ala Ile Arg Glu

65 70 75 80

Gln Gly Ile Glu Tyr Ile Lys Thr Cys Ile Asp Ile Ala Ala Glu Leu

85 90 95

Gly Ser Pro Leu Val Ser Gly Pro Met Tyr Ser Ala Thr Gly Lys Thr

100 105 110

Arg Leu Leu Thr Pro Asp Glu Lys Lys Gln Gln Trp Asn Trp Ala Ala

115 120 125

Glu Asn Met Lys Ile Val Ala Asp Tyr Ala Ser Glu Lys Ser Ile Arg

130 135 140

Leu Ala Val Glu Ile Leu Asn Arg Phe Glu Thr Asp Phe Ile Asn Thr

145 150 155 160

Val Gln Gln Gly Leu Asp Phe Leu Glu Leu Val Asp Cys Asp Asn Val

165 170 175

Gly Phe Leu Leu Asp Thr Phe His Met Asn Leu Glu Glu Lys Asp Ile

180 185 190

Ala Glu Ala Ile Lys Leu Ala Gly Ser Lys Ile Phe Asn Phe His Ser

195 200 205

Cys Glu Asn Asp Arg Gly Thr Pro Gly Thr Gly His Ile Pro Trp Asn

210 215 220

Glu Val Phe Gln Ala Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Asp Gly Pro Val Val

225 230 235 240

Ile Glu Ser Phe Thr Thr Glu Ile Lys Glu Ile Ala Arg Ala Val Ser

245 250 255

Gln Trp Arg Pro Leu Ala Pro Ser Gln Asp Ser Leu Gly Glu Glu Gly

260 265 270

Leu Gln Phe Leu Lys Lys Ala Val Leu Val His His His His His His

275 280 285

<210> 6

<211> 864

<212> DNA

<213> Bacillus bataviensis

<400> 6

atgaaatttg gtgcttctac tttcatttgg gtttcccctt tttcaaatca aaccttaaac 60

ttgatcgata aggtcaaaaa tataggcttc gactatcttg aaatttgtat cgaggatccc 120

gaaacaatag acgtagccgc aattcgtaac catctcaata agacgggagt gcaggcgcta 180

gtttgcgggg cttttggtcc aaaccgcgat atctcgagtg aggacgccgc aatacgagaa 240

caaggcattg agtacatcaa aacttgtata gatattgcgg ctgaactggg aagcccgtta 300

gtctctgggc ctatgtattc cgccaccggt aagacacggt tgcttacgcc cgacgagaaa 360

aagcagcaat ggaattgggc agcggaaaac atgaaaatcg tagctgatta cgcctcagag 420

aagtcgataa gactcgcagt ggaaattcta aataggttcg agactgactt tatcaacacc 480

gttcagcaag gcctggattt cttagaattg gtcgactgcg ataatgtagg atttcttctc 540

gacacattcc acatgaacct agaggaaaaa gatatagcgg aggctattaa gctggccggg 600

agtaaaatct ttaatttcca tagctgtgaa aacgaccgtg gtacgccagg cactggacac 660

ataccgtgga atgaggtgtt tcaggcatta aaggaaattt cttatgatgg gcctgttgtc 720

atcgagtcct tcaccacaga aataaaagag attgcgcgcg ctgtatcaca atggcgaccc 780

ttggccccat cgcaggacag tcttggtgaa gagggcctcc aatttctaaa gaaagcagtg 840

ctggttcatc accatcacca tcac 864

<210> 7

<211> 296

<212> PRT

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 7

Met Lys Tyr Gly Ile Tyr Tyr Ala Phe Trp Glu Lys Gln Trp Gly Gly

1 5 10 15

Glu Phe Arg Pro Tyr Val Lys Lys Val Arg Asp Leu Gly Pro Asp Ile

20 25 30

Leu Glu Ile Ser Cys Ala Thr Leu Pro Gln Thr Pro Asp Ser Glu Met

35 40 45

Val Glu Leu Gly Gln Leu Ala Lys Glu Ala Gly Ile Thr Leu Thr Ala

50 55 60

Gly Tyr Gly Pro Ala Pro Cys Tyr Asp Leu Ser Ser Pro Asp Pro Ser

65 70 75 80

Val Val Gln Asn Gly Leu His Phe Tyr Arg Gln Val Phe Ala Lys Met

85 90 95

Ala Leu Ala Asp Ile His Phe Val Asp Gly Gly Leu Tyr Ser His Trp

100 105 110

Pro Val Asp Phe Ser Lys Pro Ile Asp Lys Gln Ala Asp Trp Gln Arg

115 120 125

Ser Val Asn Gly Val Arg Gln Leu Ala Asp Met Ala Ala Gly Phe Asp

130 135 140

Ile Thr Leu Gly Met Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Gly Tyr Leu Leu

145 150 155 160

Thr Cys Ala Ala Glu Gly Val Ala Tyr Val Lys Glu Val Asp Arg Pro

165 170 175

Asn Val Lys Val Met Trp Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp

180 185 190

Ser Phe Thr Glu Ala Ile Leu Thr Phe Gly Asp Ala Leu Gly His Phe

195 200 205

His Ile Gly Glu Cys Asn Arg Lys Leu Pro Gly Gln Gly Arg Ile Pro

210 215 220

Trp Glu Glu Ile Gly Ser Ala Leu Arg Gln Ile Gly Tyr Asp Gly Asn

225 230 235 240

Phe Val Met Glu Pro Phe Ile Leu Ser Gly Gly Gln Val Gly Gln Asp

245 250 255

Ile Lys Val Trp Arg Asp Ile Ser Ala Gly Lys Ser Pro Ala Gln Ile

260 265 270

Asp Arg Glu Thr Ala Glu Ser Val Ala Tyr Val Arg Arg Val Phe Glu

275 280 285

Gly Arg His His His His His His

290 295

<210> 8

<211> 888

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 8

atgaaatatg gcatttatta tgcgttttgg gaaaaacagt ggggcggcga atttcgtccg 60

tatgtgaaaa aagtgcgtga tctgggcccg gatattctgg aaattagctg cgcgaccctg 120

ccgcagaccc cggatagcga aatggtggaa ctgggccagc tggcgaaaga agcgggcatt 180

accctgaccg cgggctatgg cccggcgccg tgctatgatc tgagcagccc ggatccgagc 240

gtggtgcaga acggcctgca tttttatcgt caggtgtttg cgaaaatggc gctggcggat 300

attcattttg tggatggcgg cctgtatagc cattggccgg tggattttag caaaccgatt 360

gataaacagg cggattggca gcgtagcgtg aacggcgtgc gtcagctggc ggatatggcg 420

gcgggctttg atattaccct gggcatggaa gtgctgaacc gttttgaagg ctatctgctg 480

acctgcgcgg cggaaggcgt ggcgtatgtg aaagaagtgg atcgtccgaa cgtgaaagtg 540

atgtgggata cctttcatat gaacattgaa gaagatagct ttaccgaagc gattctgacc 600

tttggcgatg cgctgggcca ttttcatatt ggcgaatgca accgtaaact gccgggccag 660

ggccgtattc cgtgggaaga aattggcagc gcgctgcgtc agattggcta tgatggcaac 720

tttgtgatgg aaccgtttat tctgagcggc ggccaggtgg gccaggatat taaagtgtgg 780

cgtgatatta gcgcgggcaa aagcccggcg cagattgatc gtgaaaccgc ggaaagcgtg 840

gcgtatgtgc gtcgtgtgtt tgaaggccgt catcatcatc atcatcat 888

Claims

1.一种耐高温TIM barrel蛋白突变体，其特征在于所述耐高温TIM barrel蛋白突变体序列如SEQ ID NO. 7所示。

2.权利要求1所述的耐高温TIM barrel蛋白突变体在催化D-果糖异构化制备D-阿洛酮糖中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：以含所述耐高温TIM barrel蛋白突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经超声破碎后获得的上清液作为催化剂，以D-果糖为底物，在Co²⁺存在下，在pH7.0~8.0 的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液中，80~100℃温度下反应，反应结束后，反应液分离纯化，获得D-阿洛酮糖。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述耐高温TIM barrel蛋白突变体编码基因序列如SEQ ID NO. 8所示。