CN109609476B - α-转氨酶和突变体及其在不对称合成L-草铵膦中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型转氨酶及其高活力突变体在不对称合成L‑草铵膦中的应用。所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID:1所示，其突变体是将SEQ ID:1所示的氨基酸序列的第87、108、167、304和357位中的一个或者多个进行单位点突变或多位点突变获得的。本发明实现高转化率转氨酶活力突变体基因的高效表达，酶活最高为818.4U/mg。本发明中所述转氨酶活力突变体的最适反应温度最高达到67℃，在该温度下催化800mM草铵膦前体酮不对称合成L‑草铵膦中，转化率高达100％，是文献报道的最高水平。该NsTA突变体解决了当前转氨酶制备L‑草铵膦工艺中，酶源少、酶活低、底物耐受性和转化率低等技术难题，具有较好应用前景。

Description

α-转氨酶和突变体及其在不对称合成L-草铵膦中的应用

(一)技术领域

本发明涉及一种新的α-转氨酶及其突变体，以及该α-转氨酶和突变体在不对称合成L-草铵膦中的应用。

(二)背景技术

草铵膦，4-[羟基(甲基)膦酰基]-DL-高丙氨酸(phosphinothricin,PPT)，为广谱、触杀型、灭生性、非残留的除草剂，具有高效、低毒、易降解等特点。PPT是外消旋体混合物，包含两种光学异构体，但只有L-型具有植物毒性。自除草剂草甘膦退出农药市场，制备光学纯L-PPT获得前所未有的市场机遇。

制备光学纯L-PPT主要有化学合成法、手性拆分法和不对称合成法。化学合成法工艺步骤繁多，所需要的合成试剂价格昂贵，导致成本投入高，而且部分试剂对环境和人体都有一定的毒害作用，无法满足当今的绿色环保要求。手性拆分制备光学纯L-PPT过程用到手性试剂，拆分收率最高仅为50％，得到的D-PPT需要消旋后再利用，手性拆分过程复杂。

不对称合成法具有立体选择性严格、反应条件温和，收率高以及容易分离纯化等优点，适用于大规模制备L-PPT。催化此类反应的酶主要包括谷氨酸脱氢酶和转氨酶，底物为草铵膦前体酮(2-羰基-4-(羟基甲基磷酰基)-丁酸，PPO)。脱氢酶催化时，需要使用昂贵的NAD(P)H作为辅助因子，催化成本过高。

转氨酶(transaminase，简称TA，EC 2.6.1.X)，是一种吡哆醛5'-磷酸(PLP)依赖型酶，它催化氨基从合适的供体到羰基受体的可逆转移。根据氨基被转移到不同的氨基受体位置，可以分为α-TA和ω-TA。α-TA催化底物α位置的羰基接受氨基供体的氨基转移反应，ω-TA催化底物ω位置的羰基接受氨基供体的氨基转移的反应。原则上，TA可以催化转化众多结构的酮和胺，因此TA具有更高的应用前景和价值。

目前，已有一些α-TA已制备L-PPT的报道。Schulz等在大肠杆菌K-12中得到的转氨酶在制备L-PPT，固定化后底物浓度为550mM时转化率可以达到76％(Schulz A,TaggeselleP,Tripier D,et al.Stereospecific production of the herbicide phosphinothricin(glufosinate)by transamination:isolation and characterization of aphosphinothricin-specific transaminase from Escherichia coli..Applied&Environmental Microbiology,1990,56(1):1.)。Bartsch等人从土壤中筛选得到天冬氨酸转氨酶并应用于制备L-PPT，当以天冬氨酸为氨基供体，底物浓度为40mM时转化率最高可以达到75％，底物浓度为100mM时转化率为59％(K.Bartsch,Process for the preparationof L-phosphinothricine by enzymatic transamination with aspartate,U.S.Patent(2005)6936444.)。现有的转氨酶工艺存在的问题是酶源少、酶活性低、底物耐受性差、产物转化率低。

在此背景下，本发明提出通过基因挖掘技术筛选新型TA重组酶，并通过蛋白质工程技术进行分子改造，将具有活性和底物耐受性提高的TA突变体催化剂用于不对称合成制备L-PPT，对于改善TA在制备L-PPT过程中底物耐受性差、酶活的低具有重要意义。

(三)发明内容

本发明提供了可应用于制备L-草铵膦具备优良催化活力和底物耐受性酶的新型基因。

本发明目的即是提供一种具备优良催化活力和底物耐受性的转氨酶及其突变体，以及该酶和突变体在不对称合成L-草铵膦中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种α-转氨酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

运用生物信息学方法，对已有转氨酶的保守序列和催化关键位点进行体统比较与分析，从酶数据库中筛选获得3条未用于转氨酶活性研究的酶序列，分别为来源于Neisseria meningitidis serogroup B、Beijerinckia indica和Rhizopus microsporus的NsTA(GenBank编号WP_014582472.1)、BiTA(GenBank编号WP_012386560.1)和RmTA(GenBank编号XP_023463024.1)。通过以草铵膦前体酮为底物的转氨酶活力分析，选择活力最高的酶(NSTA)并对其进行定点突变得到一种具有高转氨酶活力突变体。

一种α-转氨酶突变体，由序列如SEQ ID NO：1所示的氨基酸经定点突变而来，所述突变的位点为下列中的一个或多个：(1)第87位、(2)第108位、(3)第167位、(4)第304位、(5)第357位。所述点突变可以是上述位点中的一位、两位、三位、四位或者五位氨基酸突变为丝氨酸、脯氨酸、组氨酸、苏氨酸或丙氨酸。

优选的，所述转氨酶活力突变体由序列如SEQ ID NO：1所示的氨基酸经下列之一或多个位点突变而得：(1)第87位缬氨酸突变为脯氨酸(V87P)，(2)第108位异亮氨酸突变为丙氨酸(I108A)，(3)第167位赖氨酸突变为丝氨酸(K167S)，(4)第304位酪氨酸突变为组氨酸(Y304H)，(5)第357位甘氨酸突变为苏氨酸(G357T)。

更为优选的，所述转氨酶活力突变体由SEQ ID NO：1所示的氨基酸经上述五个位点突变而来，获得的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。

SEQ ID NO：7序列如下：

MPTMGAEMNTRNMRYILLTGLLPMASAFGETALQCAALTDNVTRLACYDRIFAAQLPSSAGQEGQESKAVLNLTETVRSSLDKGEAPIVVEKGGDALPADSAGETADAYTPLSLMYDLDKNDLRGLLGVREHNPMYLMPLWYNNSPNYAPSSPTRGTTVQEKFGQQSRAETKLQVSFKSKIAEDLFKTRADLWFGYTQRSDWQIYNQGRKSAPFRNTDYKPEIFLTQPVKADLPFGGRLRMLGAGFVHQSNGQSRPESRSWNRIYAMAGMEWGKLTVIPRVWVRAFDQSGDKNDNPDIADYMGHGDVKLQYRLNDRQNVYSVLRYNPKTGYGAIEAAYTFPIKGKLKGVVRGFHGYTESLIDYNHKQNGIGIGLMFNDLDGILEHHHHHH

其编码基因为(SEQ ID NO：8)：

ATGCCGACAATGGGGGCGGAGATGAATACACGGAATATGCGCTATATTCTTTTGACAGGACTGTTGCCGATGGCATCCGCTTTTGGAGAGACCGCGCTGCAATGCGCCGCTTTGACGGACAATGTTACGCGTTTGGCGTGTTACGACAGGATTTTTGCGGCACAGCTTCCGTCTTCGGCAGGACAGGAAGGGCAGGAGTCGAAAGCTGTACTCAATCTGACGGAAACCGTCCGCAGCAGCCTGGATAAGGGCGAGGCGCCUATTGTTGTTGAAAAAGGCGGGGATGCGCTTCCTGCCGACAGTGCGGGCGAAACCGCCGACGCGTATACGCCTTTGAGCCTGATGTACGACTTGGACAAAAACGATTTGCGCGGGCTGTTGGGCGTACGCGAACACAATCCGATGTACCTTATGCCGCTCTGGTACAACAATTCGCCCAACTATGCCCCGAGTTCGCCGACGCGCGGTACGACTGTACAGGAAAAATTCGGACAGCAGUCGCGTGCGGAAACCAAATTGCAGGTTTCGTTCAAAAGCAAAATTGCCGAAGATTTGTTTAAAACCCGCGCGGATCTGTGGTTCGGCTACACCCAAAGATCCGATTGGCAGATTTACAACCAAGGCAGGAAATCCGCGCCGTTCCGCAATACGGATTACAAACCTGAAATTTTCCTGACCCAGCCTGTGAAGGCGGATTTGCCGTTCGGCGGCAGGCTGCGTATGCTCGGTGCGGGTTTTGTCCACCAGTCCAACGGACAGAGCCGTCCCGAATCGCGTTCGTGGAACAGGATTTACGCCATGGCAGGCATGGAATGGGGCAAATTGACGGTGATTCCGCGCGTGTGGGTGCGTGCGTTCGATCAGAGCGGCGATAAAAACGACAATCCCGATATTGCCGACTATATGGGGCAUGGCGACGTGAAGCTGCAGTACCGCCTGAACGACAGGCAGAATGTGTATTCCGTATTGCGCTACAACCCCAAAACGGGCTACGGCGCGATTGAAGCCGCCTACACGTTTCCGATTAAGGGCAAACTCAAAGGCGTGGTACGCGGATTCCACGGTTACACGGAGAGCCTGATCGACTACAACCACAAGCAGAACGGTATCGGTATCGGGTTGATGTTCAACGACTTGGACGGCATCTGACTCGAGCACCACCACCACCACCAC

本发明还涉及所述的高转氨酶及其突变体在催化草铵膦前体酮不对称合成L-草铵膦中的应用。

本发明关键在于新型高活力转氨酶及其突变位点的选择，在已知所述新型高活力转氨酶序列及其突变体位点的前提下，本领域普通技术人员可根据SEQ ID NO.1的TA基因(NsTA)，设计定点突变的突变引物，以携带TA的克隆载体为模板进行定点突变构建突变体，以质粒pET28b或能表达该酶的载体为表达载体，将重组质粒转化Escherichia coli BL21(DE3)细胞或能表达该酶的宿主细胞，高通量筛选验证后的阳性单克隆进行发酵培养，即可获得含有本发明突变体的湿菌体。

具体的，所述应用为：以含所述新型高活力转氨酶或突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经超声破碎后获得的上清液作为催化剂，以草铵膦前体酮PPO为底物，以磷酸吡哆醛为辅酶，以天然氨基酸供体，在pH8.0Tris-HCl缓冲液中，32～77℃、400～600r/min条件下反应，反应结束后，反应液分离纯化，获得L-草铵膦。

所述高转氨酶或突变体编码基因序列如SEQ ID NO.2(编码SEQ ID NO.1氨基酸序列)、或SEQ ID NO.8(编码SEQ ID NO.7氨基酸序列)所示。

反应体系中，底物初始浓度为20～800mM，湿菌体用量为10～100g/L(优选50g/L)，辅酶用量为0～1mM(优选0.2mM)。

优选的，所述反应在57～77℃(优选67℃)下进行。

具体的，所述湿菌体可按如下方法制备：构建含有所述优良催化活力和底物耐受性的TA或突变体基因的重组载体，将所述重组载体转化至E.coli中，获得的重组基因工程菌进行诱导表达，取培养液分离得到湿菌体细胞。具体为：将含TA或突变体基因的工程菌接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃、150r/min培养10h，获得种子液；将种子液以2％(v/v)接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃、150r/min培养OD600至0.6-0.8，再向培养液中加入终浓度为1mM的IPTG，于28℃诱导12h，4℃、8000r/min离心10min，弃去上清液，收集湿菌体；所述LB培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH值自然。

本发明有益效果主要体现在：本发明提供了一种新的转氨酶及其高活力突变体，该突变体对草铵膦前体酮PPO具有较高的催化活力(最高可达818.4U/mg)，其最适反应温度67℃，以上特性均属于文献报道的最高水平。使用本突变体不对称生产L-PPT，转化率最高可达100％，是文献报道的最高水平。该NsTA突变体解决了针对不对称合成L-草铵膦中，现有转氨酶酶源少、酶活低、底物耐受性差、转化率低的技术难题，具有较好应用前景。

(四)附图说明

图1为NsTA突变体的最适温度示意图；

图2为NsTA突变体的氨基供体筛选示意图；

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：新型转氨酶的筛选

1、酶的筛选与合成

通过对已报道的α-转氨酶催化口袋和关键残基分析，从酶数据库中挖掘获得三种酶，其来源分别为Neisseria meningitidis serogroup B(GenBank编号WP_014582472.1)、Beijerinckia indica(GenBank编号WP_012386560.1)和Rhizopus microsporus(GenBank编号XP_023463024.1)，并命名为NsTA、BiTA和RmTA。依据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，通过基因工程的常规操作以全合成的方法合成了三条选择的核苷酸序列，如SEQID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示；编码酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.5所示。在核酸序列末端加入6×his-tag标签，两端加入酶切位点Xba I和Xho I，将该基因克隆至pET28b(+)对应的Xba I和Xho I位点，获得重组表达质粒pET28b/NsTA、pET28b/BiTA和pET28b/RmTA。

2、重组工程菌的诱导表达

LB液体培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH值自然；LB固体培养基在LB液体培养基中添加20g/L琼脂；121℃高压灭菌20min；使用前添加终浓度50μg/mL卡那霉素。

将实施例1获得的基因工程菌接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃、150r/min培养OD₆₀₀约0.6-0.8，获得种子液；将种子液以体积浓度2％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.6-0.8，再向培养液中加入终浓度为1mM的IPTG，于28℃下诱导表达10h后，4℃、8000r/min离心10min，弃去上清液，用0.85％的生理盐水清洗两遍湿菌体，并收集湿菌体，备用。

3、重组工程菌的酶活的测定

采用超声破碎方法对湿菌体进行超声破碎，取1g制备的湿菌体，用10mLTris-HCl(pH 8.0)缓冲液悬浮，在39W条件下超声破碎5min，制备获得无细胞抽提液(即超声破碎后的混悬液)，离心，收集上清液，取1mL上清液用于反应。反应体系：100mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中，加入20mM PPO、60mM L-谷氨酸、0.1mM PLP和1mL酶液，体系共5mL。反应条件：于37℃、150r/min条件下反应30min，沸冰浴5min终止反应，12000r/min离心2min，取200μL上清液进行衍生化反应；采用HPLC检测L-PPT浓度。分析柱为C18柱(250×4.6mm，5μm)(依利特分析仪器有限公司，大连，中国)。采用配备了荧光检测器的LC-U3000液相色谱仪。酶活定义：37℃和pH 8.0下，每分钟生成1μmol L-PPT所需酶量定义为一个酶活单位(U)。由表1可知，重组酶NsTA和BiTA的活力分别为7.2和4.6U/mg，而RmTA没有测到活力。

表1：重组酶的酶活测定

实施例2：NsTA单位点突变体的构建与筛选

1、突变体构建

选择酶活最高的重组菌，根据NsTA亲本(亲本NsTA来源于Neisseriameningitidis serogroup B，GenBank编号为WP_014582472.1)序列(氨基酸序列为SEQ IDNO.1所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示)设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/NsTA为模板，对第87位引入单突变，引物为：

正向引物GGGCGAGGCGNNKATTGTTG(下划线为突变碱基)

反向引物CAACAACAATNNKCGCCTCGC(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物2μL，反向引物2μL，模板DNA 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，50℃15s，60℃6.5min)30循环；72℃5min。

取5μL的PCR产物，加入100μL冰浴的感受态细胞悬液中，冰上静置30min，将转化产物于42℃热击90s，迅速置于冰上冷却2min，向管中加入600μL的LB液体培养基，37℃，150r/min培养60min，取100μL上述菌液涂板，待菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养12h。

2、高通量筛选阳性转化子

配制反应混合溶液A液终浓度组成为：100mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、0.1mMPLP、20mM PPO、60mM L-谷氨酸。配制反应混合溶液B液为：溴百里酚蓝指示剂。

用牙签挑取转化平板的突变株至每孔装有1mL发酵培养基(LB培养基中包括50μg/mL卡那霉素和1mM IPTG)的96孔板中，然后用封口膜封边，于28℃、150r/min培养约10h，取20μL培养所得发酵液于干净的96孔板，加入100μL于37℃保温的A液，于37℃、150r/min反应30min后加入30μL的B液观察颜色变化，以未突变菌株E.coli BL21(DE3)/pET28b/NsTA(SEQID NO.1所示基因转入E.coli BL21(DE3))作为对照，颜色变化最显著的突变株进行后续酶活测定。

3、阳性转化子发酵产酶

同实施例1。

4、酶活测定

同实施例1。

该实施例的结果为：运用高通量筛选，对350重组转化菌初筛，筛选出4株酶活提高的突变株，再对其进行酶活测定，具体结果见表2。经分析确定，其余346重组菌酶活保持不变或下降的原因是第87位缬氨酸(V)突变为P、A、H和T外的其他氨基酸。

表2：单点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最显著的突变体NsTA-V87P记为NsTA1，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/NsTA1。

实施例3：NsTA二位点突变体的构建与筛选

根据实施例2构建的单突变体NsTA1序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/NsTA1为模板，对第108位引入单突变，引物为：

正向引物CGAAACCGCCGACNNKTATACGCC(下划线为突变碱基)

反向引物CTCAAAGGCGTATANNKGTCGGCGG(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物2μL，反向引物2μL，模板DNA 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，50℃15s，62℃6.5min)30循环；72℃5min。

PCR产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，利用溴百里酚蓝高通量显色法对突变体进行初筛(同实施例2)。

采用超声破碎方法对湿菌体进行超声破碎，对初筛的阳性突变株进行酶活测定(同实施例1)。

该实施例的结果为：运用高通量筛选方法，对304重组转化菌初筛，筛选出3株酶活提高的突变株，再对其进行酶活测定，具体结果见表3。经分析确定，其余301组菌酶活保持不变或下降的原因是第108位异亮氨酸(I)突变为A、H和T外的其他氨基酸。

表3：双点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的突变体NsTA1-I108A记为NsTA2，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/NsTA2。

实施例4：NsTA三位点突变体的构建与筛选

根据实施例3构建的突变体NsTA2序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/NsTA2为模板，对第167位引入单突变，引物为：

正向引物CGGACAGCAGNNKCGTGCGG(下划线为突变碱基)

反向引物GGTTTCCGCACGNNKCTGCTGTC(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物2μL，反向引物2μL，模板DNA 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，50℃15s，62℃6.5min)30循环；72℃5min。

PCR产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，利用溴百里酚蓝高通量显色法对突变体进行初筛(同实施例2)。

采用超声破碎方法对高通量初筛获得的阳性突变体进行超声破碎和酶活测定(同实施例1)。

该实施例的结果为：对285株重组转化菌初筛，筛选出4株酶活提高的突变株，再对其进行酶活测定，具体结果见表4。经分析确定，其余281重组菌酶活保持不变或下降的原因是第167位赖氨酸(K)突变为P、A、S和H外的其他氨基酸。

表4：三点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的突变体NsTA2-K167S记为NsTA3，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/NsTA3。

实施例5：NsTA四位点突变体的构建与筛选

根据实施例4构建的突变体NsTA3序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/NsTA3为模板，对第304位引入单突变，引物为：

正向引物CCGACTATATGGGGNNKGGCGACGTG(下划线为突变碱基)

反向引物CAGCTTCACGTCGCCNNKCCCCATATAG(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物2μL，反向引物2μL，模板DNA 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，50℃15s，63℃6.5min)30循环；72℃5min。

PCR产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，利用溴百里酚蓝高通量显色法对突变体进行初筛(同实施例2)。

采用超声破碎方法对高通量初筛获得的阳性突变体进行超声破碎和酶活测定(同实施例1)。

该实施例的结果为：对343株重组转化菌初筛，筛选出2株酶活提高的突变株，再对其进行酶活测定，具体结果见表5。经分析确定，其余341重组菌酶活保持不变或下降的原因是第304位酪氨酸(Y)突变为A和H外的其他氨基酸。

表5：四点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的突变体NsTA3-Y304H记为NsTA4，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/NsTA4。

实施例6：NsTA五位点突变体的构建与筛选

根据实施例5构建的突变体NsTA4序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/NsTA4为模板，对第357位引入单突变，引物为：

正向引物CCACGGTTACNNKGAGAGCC(下划线为突变碱基)

反向引物GATCAGGCTCTCNNKGTAACCG(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物2μL，反向引物2μL，模板DNA 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，50℃15s，63℃6.5min)30循环；72℃5min。

PCR产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，利用溴百里酚蓝高通量显色法对突变体进行初筛(同实施例2)。

采用超声破碎方法对高通量初筛获得的阳性突变体进行超声破碎和酶活测定(同实施例1)。

该实施例的结果为：对133株重组转化菌初筛，筛选出4株酶活提高的突变株，再对其进行酶活测定，具体结果见表6。经分析确定，其余129株重组菌酶活保持不变或下降的原因是第357位甘氨酸(G)突变为P、S、H和T外的其他氨基酸。

表6：五点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的突变体NsTA4-G357T记为NsTA5，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/NsTA5。

实施例7：重组大肠杆菌发酵产酶

分别将实施例1-6的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/NsTA、E.coli BL21(DE3)/pET28b/NsTA1、E.coli BL21(DE3)/pET28b/NsTA2、E.coli BL21(DE3)/pET28b/NsTA3、E.coli BL21(DE3)/pET28b/NsTA4、E.coli BL21(DE3)/pET28b/NsTA5接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃、150r/min培养OD₆₀₀约0.6-0.8，获得种子液；将种子液以2％(v/v)接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.6-0.8，再向培养液中加入终浓度为1mM的IPTG，于28℃下诱导表达12h后，4℃、8000r/min离心10min，弃去上清液，用0.85％的生理盐水清洗两遍湿菌体，并收集湿菌体，备用。

实施例8：确定催化酶的最适温度

收集实施例7制备的各重组菌的湿菌体在39W条件下超声破碎5min后，将破碎混合液，在4℃、8000r/min离心10min，弃去沉淀，收集上清液使用nickel-NTA琼脂糖凝胶柱进行纯化，用平衡缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.0)平衡层析柱，再使用洗脱液(50mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，500mM咪唑，pH 8.0)进行洗脱，根据紫外检测器的信号响应，收集相应的洗脱液，即为各自纯酶液。

将上述纯酶液作为转化用酶，测定酶的最适反应温度。具体操作如下：100mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0)中，加入20mM PPO、60mM L-谷氨酸、0.1mM PLP和1mL纯酶液，体系共5mL。分别于不同转化温度：32-77℃测定TA活力(方法同实施例1)，结果见图1。

由图可知，E.coli BL21(DE3)/pET28b/NsTA5的最适反应温度是67℃，比原始酶NsTA提高了10℃，属于文献报道的最高值。

实施例9：氨基供体的选择

将实施例8中的突变株NsTA5纯酶液作为转化用酶，对酶的最适氨基供体进行优化。具体操作如下：100mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中，加入20mM PPO、60mM L-氨基酸、0.1mM PLP和1mL纯酶液，体系共5mL。L-氨基酸具体包括L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-赖氨酸、L-天冬酰胺、L-甘氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、异丙胺、正丁胺、3-丙醇胺、乙酰胺和苯胺。测定TA在不同氨基供体的活力，由图2可知，E.coli BL21(DE3)/pET28b/NsTA5的氨基供体非常广泛，包括L-甘氨酸、L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-赖氨酸和L-天冬酰胺。其中，最优供体为L-甘氨酸。

实施例10：重组菌全细胞催化草铵膦前体酮PPO不对称合成L-PPT

按实施例7的方法，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/NsTA、E.coli BL21(DE3)/pET28b/NsTA1、E.coli BL21(DE3)/pET28b/NsTA2、E.coli BL21(DE3)/pET28b/NsTA3、E.coli BL21(DE3)/pET28b/NsTA4、E.coli BL21(DE3)/pET28b/NsTA5湿菌体作为生物催化剂，以草铵膦前体酮PPO为底物，不对称合成制备L-PPT。100mL催化体以200mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)为反应介质，200-600mM PPO，3倍摩尔数的L-甘氨酸氨基供体，0.2mMPLP，50g/L湿菌体。该体系于67℃、600r/min反应6h，HPLC定期检测L-PPT浓度，并计算转化率。由表7可知，E.coliBL21(DE3)/pET28b/NsTA5在底物浓度800mM，转化4h的转化率高达100％，高于原始酶和其他突变酶的转化率，同时也为文献报道的最高水平。

表7：甘氨酸为氨基供体不同底物浓度下的转化率比较

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> α-转氨酶和突变体及其在不对称合成L-草铵膦中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 390

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis serogroup B

<400> 1

Met Pro Thr Met Gly Ala Glu Met Asn Thr Arg Asn Met Arg Tyr Ile

1 5 10 15

Leu Leu Thr Gly Leu Leu Pro Met Ala Ser Ala Phe Gly Glu Thr Ala

20 25 30

Leu Gln Cys Ala Ala Leu Thr Asp Asn Val Thr Arg Leu Ala Cys Tyr

35 40 45

Asp Arg Ile Phe Ala Ala Gln Leu Pro Ser Ser Ala Gly Gln Glu Gly

50 55 60

Gln Glu Ser Lys Ala Val Leu Asn Leu Thr Glu Thr Val Arg Ser Ser

65 70 75 80

Leu Asp Lys Gly Glu Ala Val Ile Val Val Glu Lys Gly Gly Asp Ala

85 90 95

Leu Pro Ala Asp Ser Ala Gly Glu Thr Ala Asp Ile Tyr Thr Pro Leu

100 105 110

Ser Leu Met Tyr Asp Leu Asp Lys Asn Asp Leu Arg Gly Leu Leu Gly

115 120 125

Val Arg Glu His Asn Pro Met Tyr Leu Met Pro Leu Trp Tyr Asn Asn

130 135 140

Ser Pro Asn Tyr Ala Pro Ser Ser Pro Thr Arg Gly Thr Thr Val Gln

145 150 155 160

Glu Lys Phe Gly Gln Gln Lys Arg Ala Glu Thr Lys Leu Gln Val Ser

165 170 175

Phe Lys Ser Lys Ile Ala Glu Asp Leu Phe Lys Thr Arg Ala Asp Leu

180 185 190

Trp Phe Gly Tyr Thr Gln Arg Ser Asp Trp Gln Ile Tyr Asn Gln Gly

195 200 205

Arg Lys Ser Ala Pro Phe Arg Asn Thr Asp Tyr Lys Pro Glu Ile Phe

210 215 220

Leu Thr Gln Pro Val Lys Ala Asp Leu Pro Phe Gly Gly Arg Leu Arg

225 230 235 240

Met Leu Gly Ala Gly Phe Val His Gln Ser Asn Gly Gln Ser Arg Pro

245 250 255

Glu Ser Arg Ser Trp Asn Arg Ile Tyr Ala Met Ala Gly Met Glu Trp

260 265 270

Gly Lys Leu Thr Val Ile Pro Arg Val Trp Val Arg Ala Phe Asp Gln

275 280 285

Ser Gly Asp Lys Asn Asp Asn Pro Asp Ile Ala Asp Tyr Met Gly Tyr

290 295 300

Gly Asp Val Lys Leu Gln Tyr Arg Leu Asn Asp Arg Gln Asn Val Tyr

305 310 315 320

Ser Val Leu Arg Tyr Asn Pro Lys Thr Gly Tyr Gly Ala Ile Glu Ala

325 330 335

Ala Tyr Thr Phe Pro Ile Lys Gly Lys Leu Lys Gly Val Val Arg Gly

340 345 350

Phe His Gly Tyr Gly Glu Ser Leu Ile Asp Tyr Asn His Lys Gln Asn

355 360 365

Gly Ile Gly Ile Gly Leu Met Phe Asn Asp Leu Asp Gly Ile Leu Glu

370 375 380

His His His His His His

385 390

<210> 2

<211> 1173

<212> DNA

<213> Neisseria meningitidis serogroup B

<400> 2

atgccgacaa tgggggcgga gatgaataca cggaatatgc gctatattct tttgacagga 60

ctgttgccga tggcatccgc ttttggagag accgcgctgc aatgcgccgc tttgacggac 120

aatgttacgc gtttggcgtg ttacgacagg atttttgcgg cacagcttcc gtcttcggca 180

ggacaggaag ggcaggagtc gaaagctgta ctcaatctga cggaaaccgt ccgcagcagc 240

ctggataagg gcgaggcggt cattgttgtt gaaaaaggcg gggatgcgct tcctgccgac 300

agtgcgggcg aaaccgccga catctatacg cctttgagcc tgatgtacga cttggacaaa 360

aacgatttgc gcgggctgtt gggcgtacgc gaacacaatc cgatgtacct tatgccgctc 420

tggtacaaca attcgcccaa ctatgccccg agttcgccga cgcgcggtac gactgtacag 480

gaaaaattcg gacagcagaa acgtgcggaa accaaattgc aggtttcgtt caaaagcaaa 540

attgccgaag atttgtttaa aacccgcgcg gatctgtggt tcggctacac ccaaagatcc 600

gattggcaga tttacaacca aggcaggaaa tccgcgccgt tccgcaatac ggattacaaa 660

cctgaaattt tcctgaccca gcctgtgaag gcggatttgc cgttcggcgg caggctgcgt 720

atgctcggtg cgggttttgt ccaccagtcc aacggacaga gccgtcccga atcgcgttcg 780

tggaacagga tttacgccat ggcaggcatg gaatggggca aattgacggt gattccgcgc 840

gtgtgggtgc gtgcgttcga tcagagcggc gataaaaacg acaatcccga tattgccgac 900

tatatggggt atggcgacgt gaagctgcag taccgcctga acgacaggca gaatgtgtat 960

tccgtattgc gctacaaccc caaaacgggc tacggcgcga ttgaagccgc ctacacgttt 1020

ccgattaagg gcaaactcaa aggcgtggta cgcggattcc acggttacgg cgagagcctg 1080

atcgactaca accacaagca gaacggtatc ggtatcgggt tgatgttcaa cgacttggac 1140

ggcatctgac tcgagcacca ccaccaccac cac 1173

<210> 3

<211> 389

<212> PRT

<213> Beijerinckia indica

<400> 3

Met Ala Asp Lys Trp Glu Phe Pro Gly Gly Lys Leu Glu Glu Gly Glu

1 5 10 15

Thr Pro Glu Ala Cys Leu Arg Arg Glu Met His Glu Glu Phe Gly Ile

20 25 30

Glu Val Ala Val Gly Pro Leu Val Gly Arg Ser Arg His Ala Tyr Pro

35 40 45

His Gly Glu Ile Asp Leu Val Ala Tyr Arg Val Thr His Ile Ala Gly

50 55 60

Asp Phe Gln Leu His Asp His Glu Glu Ile Arg Trp Val Cys Pro Ala

65 70 75 80

Glu Met Thr Ser Tyr Asp Phe Ser Ala Ala Asp Ile Pro Ile Ala Gly

85 90 95

Ile Leu Ala Arg Gln Asp Gly Gly Val His Ala Asp Asp Ser Pro Ser

100 105 110

Glu His Phe Leu Pro Ile Gly Gly Leu Pro Leu Arg Ile Leu Glu Arg

115 120 125

Gly Ser Arg Ala Gly Arg Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Thr Gly Asp

130 135 140

Asn Ala His Thr Trp Asp Leu Leu Ala Pro Thr Leu Ala Gly Thr Phe

145 150 155 160

Arg Val Leu Ala Leu Asp Gln Arg Gly His Gly Lys Ser Gly Trp Ala

165 170 175

Val Pro Pro Ala Tyr Arg Cys Glu Asp Tyr Leu Gln Asp Leu Ser Ser

180 185 190

Val Ile Asp Ser Leu Gly Leu Glu Gly Leu Ile Leu Leu Gly His Ser

195 200 205

Met Gly Ala Leu His Ala Ser Leu Tyr Ala Ala Gln Asn Pro Gly Arg

210 215 220

Val Ala Ala Leu Ile His Val Asp Ile Glu Pro Phe Pro Pro Asp Trp

225 230 235 240

Asn Arg Lys Tyr Leu Leu Gly Leu Tyr Gln Asn Leu Pro Asp Ser Tyr

245 250 255

Ala Gln Pro Gly Asp Tyr Val Ala Glu Ile Ala Arg Asn Ala Pro Tyr

260 265 270

Ala Arg Pro Glu Thr Leu Gln Gly Leu Ala Ala Arg Ser Leu Val Leu

275 280 285

Arg Ser Gly Arg Trp Phe Arg Thr Tyr Asp Arg Glu Ile Leu Ala Arg

290 295 300

Phe Asp Arg Tyr Asp Leu Arg Asp His Leu Glu Lys Ile Arg Cys Pro

305 310 315 320

Ala Leu Val Ile Arg Gly Ala Glu Ser Arg Val Leu Gly Arg Glu Ala

325 330 335

Ala Glu Gln Met Val Arg Ala Leu Pro Ala Gly Glu Leu Ala Glu Ile

340 345 350

Pro Arg Ala Ala His Pro Ala His Leu Asp Asn Pro Glu Ala Phe Arg

355 360 365

Asp Ala Val Thr Gly Phe Leu Ala Arg His Gly Phe Leu Leu Glu His

370 375 380

His His His His His

385

<210> 4

<211> 1170

<212> DNA

<213> Beijerinckia indica

<400> 4

atggttggct tagggaaaac cattttcgat ttgtcacatt ttcatcgcca gtgggaaaac 60

ctctggaata atgatgttca gcgcgacgat gtcgatgaat cgttcgaccg cttgtgggaa 120

atcgaggact tcggctcaaa tcccggcaat cttcgcatgc tcatccatgt gccggaggac 180

ctgccgccga atccggccct ggtcgttgtt ttgcacggat gttcgcaaac cgccgctggc 240

tatgatcatg gcacgggttg gtcgcgtctg gccgatcagc aagggttcgt gctcgtctat 300

cccgagcagc ggcgcgccaa taatcccaaa agttgcttct cctggttcga cccaggcgat 360

atgcagcgcg atatgggcga gcccctgtcg atccgacaga tgatcgagaa ggcggtcgtc 420

gatcataaaa tcgaccggtc acggattttc atcaacggac tttcggccgg cggcgcgatg 480

accaatatca tgctcgcgac ctatccagag gtgttcgcgg cgggcgccat cattgccggg 540

ctgccctatg gcgcggctac caatatgcat gaggccctgc gcgccatgtt cgagggcgcg 600

gaacgcgacg ccgaggtctg gggcgatctc gttcgcacgg cttcggaaca taagggggca 660

tggccgcgga tatcgatctg gcacggaacc tcggatcgga cggtgaaatt ttcgaacgcg 720

gcggaaatcc ttaaacaatg gcataatctg catgggcttg agaccggcaa gccgcgctat 780

ggtcgcattg acggctatac ctatcgcggc tggcacgcgg cttcgggggc cgtcctggtc 840

gaggattatc agcttgatgg catggcgcat ggcgtgccgc ttgatgtgca aggggaaaat 900

agccgggaaa ccagtggctc cttcctgctc gatgtcggca tttcctccac atcgcatatt 960

gcccggtttt tcggtttgat ggggtctgag acgctgcgcc atcgtgtcgt gcagcctccc 1020

atctggcaaa tagccggtgg gccactcgat gcccgtctcc cccctgtcga cagggccgtg 1080

gccgtcgcca agcccggtaa agtcgtcagc gtcatcggca agacggccac ggtgctgaaa 1140

ttttagctcg agcaccacca ccaccaccac 1170

<210> 5

<211> 388

<212> PRT

<213> Rhizopus microsporus

<400> 5

Arg Leu Ile Ile Arg Asn Asp Tyr Asp Ala Val Ser Glu Trp Val Ala

1 5 10 15

His Tyr Ile Lys Glu Arg Ile Asn Gln Phe Gly Pro Thr Lys Ser Arg

20 25 30

Pro Phe Val Leu Gly Leu Pro Thr Gly Ser Ser Pro Leu Ser Thr Tyr

35 40 45

Lys Arg Leu Val Glu Phe Tyr Lys Glu Gly Lys Leu Ser Phe Lys His

50 55 60

Val Val Thr Phe Asn Met Asp Glu Tyr Val Gly Ile Pro Arg Ser His

65 70 75 80

Lys Gln Ser Tyr Tyr Ser Phe Met Trp Thr Asn Leu Phe Gln His Ile

85 90 95

Asp Ile Pro Leu Glu Asn Ile Asn Phe Leu Asn Gly Asn Ala Pro Asp

100 105 110

Leu Glu Ala Glu Cys Ala Arg Tyr Glu Ala Glu Ile Ala Lys Tyr Gly

115 120 125

Gly Ile Glu Leu Phe Ile Gly Gly Ile Gly Pro Asp Gly His Ile Ala

130 135 140

Phe Asn Glu Pro Gly Ser Ser Leu Thr Ser Arg Thr Arg Val Lys Thr

145 150 155 160

Leu Ala Tyr Glu Thr Ile Ile Ala Asn Ala Arg Phe Phe Glu Gly Asp

165 170 175

Ile Thr Lys Val Pro Lys Leu Ala Leu Thr Val Gly Val Ala Thr Val

180 185 190

Met Asp Ala Arg Glu Val Cys Ile Ile Ile Thr Gly Ala His Arg Ser

195 200 205

Ile Ala Leu Ala Lys Cys Val Glu Glu Gly Ile Asn His Met Trp Thr

210 215 220

Val Ser Ala Ile Gln Met His Pro Lys Gly Leu Ile Val Cys Asp Glu

225 230 235 240

Asp Ala Thr Leu Glu Leu His Val Lys Thr Val Lys Tyr Phe Lys Ser

245 250 255

Ile Glu His Val His Gln Ser Leu Ile Gly Gln Glu Asn Leu Gly Leu

260 265 270

Gln Gly Glu Leu Leu Ser Pro Lys Lys Ile Gln Arg Ser Val Arg Leu

275 280 285

Thr Arg Glu Met Met Val Arg Lys Leu Leu Asn Gly Glu Leu Ser Pro

290 295 300

Asn Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Leu Glu Leu Pro Lys Ile Tyr

305 310 315 320

Pro Ser Ser Ser Lys Lys Arg Arg Ile Asp Ser Ser Ser Ser Asn Asn

325 330 335

Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Ser Ile Ala Gly Ser Ser Ser

340 345 350

Ser Ser Thr Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn

355 360 365

Asn Asn Asn Asn Ser Met Ile Gln Ala Ser Asp Ser Leu Glu His His

370 375 380

His His His His

385

<210> 6

<211> 1170

<212> DNA

<213> Rhizopus microsporus

<400> 6

atgagactta ttatcagaaa tgattatgat gctgtatccg agtgggttgc tcactatatc 60

aaagaacgta tcaatcaatt tggacctact aaatcaagac cattcgtttt gggtttacct 120

acaggatctt caccactgag tacatataaa cgtctagtcg aattctataa agaaggaaaa 180

ctctctttca agcacgttgt tacctttaat atggacgaat acgtgggtat accacgttca 240

cataaacagt cttattactc attcatgtgg acaaacctat ttcaacatat cgatattcca 300

ctagagaaca tcaacttttt aaacggtaat gctcctgatt tagaagctga atgcgcaaga 360

tatgaagcag agatagcaaa gtatggtggt attgagttat tcattggtgg tattggtcct 420

gatggtcata ttgcgtttaa cgagcccggt tcttcattaa cctctcggac ccgtgtcaag 480

acattggctt atgaaaccat tattgccaat gcaaggtttt ttgaaggcga tattacaaaa 540

gtgccaaaac tagcattaac tgtgggtgta gctactgtca tggatgctcg tgaagtctgt 600

atcatcatca ctggtgcaca cagaagtatt gcgctggcaa aatgcgtaga agagggtatc 660

aaccatatgt ggacagtatc agccatacaa atgcacccaa agggtcttat tgtgtgtgat 720

gaagatgcta cattagaatt acatgtgaag acggttaaat acttcaaatc aattgagcat 780

gttcatcaat cacttattgg gcaagagaat ttaggcttac agggcgagtt attgtcacca 840

aagaaaatac agcgttctgt tagactgaca agagaaatga tggtaagaaa gctattgaac 900

ggtgagctat ctcccaatga tgaagaagag gaagatgaag aattagaatt accaaaaatc 960

tatccttcaa gttcaaaaaa gagacgcatc gatagtagta gtagtaataa taataataac 1020

aataacaata acaacaactc tattgctggt agcagtagta gcagtactag tagtagaagc 1080

agcagtagta gcaataataa taataataat aataataata gcatgatcca agcttctgat 1140

tcataactcg agcaccacca ccaccaccac 1170

<210> 7

<211> 390

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Pro Thr Met Gly Ala Glu Met Asn Thr Arg Asn Met Arg Tyr Ile

1 5 10 15

Leu Leu Thr Gly Leu Leu Pro Met Ala Ser Ala Phe Gly Glu Thr Ala

20 25 30

Leu Gln Cys Ala Ala Leu Thr Asp Asn Val Thr Arg Leu Ala Cys Tyr

35 40 45

Asp Arg Ile Phe Ala Ala Gln Leu Pro Ser Ser Ala Gly Gln Glu Gly

50 55 60

Gln Glu Ser Lys Ala Val Leu Asn Leu Thr Glu Thr Val Arg Ser Ser

65 70 75 80

Leu Asp Lys Gly Glu Ala Pro Ile Val Val Glu Lys Gly Gly Asp Ala

85 90 95

Leu Pro Ala Asp Ser Ala Gly Glu Thr Ala Asp Ala Tyr Thr Pro Leu

100 105 110

Ser Leu Met Tyr Asp Leu Asp Lys Asn Asp Leu Arg Gly Leu Leu Gly

115 120 125

Val Arg Glu His Asn Pro Met Tyr Leu Met Pro Leu Trp Tyr Asn Asn

130 135 140

Ser Pro Asn Tyr Ala Pro Ser Ser Pro Thr Arg Gly Thr Thr Val Gln

145 150 155 160

Glu Lys Phe Gly Gln Gln Ser Arg Ala Glu Thr Lys Leu Gln Val Ser

165 170 175

Phe Lys Ser Lys Ile Ala Glu Asp Leu Phe Lys Thr Arg Ala Asp Leu

180 185 190

Trp Phe Gly Tyr Thr Gln Arg Ser Asp Trp Gln Ile Tyr Asn Gln Gly

195 200 205

Arg Lys Ser Ala Pro Phe Arg Asn Thr Asp Tyr Lys Pro Glu Ile Phe

210 215 220

Leu Thr Gln Pro Val Lys Ala Asp Leu Pro Phe Gly Gly Arg Leu Arg

225 230 235 240

Met Leu Gly Ala Gly Phe Val His Gln Ser Asn Gly Gln Ser Arg Pro

245 250 255

Glu Ser Arg Ser Trp Asn Arg Ile Tyr Ala Met Ala Gly Met Glu Trp

260 265 270

Gly Lys Leu Thr Val Ile Pro Arg Val Trp Val Arg Ala Phe Asp Gln

275 280 285

Ser Gly Asp Lys Asn Asp Asn Pro Asp Ile Ala Asp Tyr Met Gly His

290 295 300

Gly Asp Val Lys Leu Gln Tyr Arg Leu Asn Asp Arg Gln Asn Val Tyr

305 310 315 320

Ser Val Leu Arg Tyr Asn Pro Lys Thr Gly Tyr Gly Ala Ile Glu Ala

325 330 335

Ala Tyr Thr Phe Pro Ile Lys Gly Lys Leu Lys Gly Val Val Arg Gly

340 345 350

Phe His Gly Tyr Thr Glu Ser Leu Ile Asp Tyr Asn His Lys Gln Asn

355 360 365

Gly Ile Gly Ile Gly Leu Met Phe Asn Asp Leu Asp Gly Ile Leu Glu

370 375 380

His His His His His His

385 390

<210> 8

<211> 1170

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgccgacaa tgggggcgga gatgaataca cggaatatgc gctatattct tttgacagga 60

ctgttgccga tggcatccgc ttttggagag accgcgctgc aatgcgccgc tttgacggac 120

aatgttacgc gtttggcgtg ttacgacagg atttttgcgg cacagcttcc gtcttcggca 180

ggacaggaag ggcaggagtc gaaagctgta ctcaatctga cggaaaccgt ccgcagcagc 240

ctggataagg gcgaggcgcc attgttgttg aaaaaggcgg ggatgcgctt cctgccgaca 300

gtgcgggcga aaccgccgac gcgtatacgc ctttgagcct gatgtacgac ttggacaaaa 360

acgatttgcg cgggctgttg ggcgtacgcg aacacaatcc gatgtacctt atgccgctct 420

ggtacaacaa ttcgcccaac tatgccccga gttcgccgac gcgcggtacg actgtacagg 480

aaaaattcgg acagcagcgc gtgcggaaac caaattgcag gtttcgttca aaagcaaaat 540

tgccgaagat ttgtttaaaa cccgcgcgga tctgtggttc ggctacaccc aaagatccga 600

ttggcagatt tacaaccaag gcaggaaatc cgcgccgttc cgcaatacgg attacaaacc 660

tgaaattttc ctgacccagc ctgtgaaggc ggatttgccg ttcggcggca ggctgcgtat 720

gctcggtgcg ggttttgtcc accagtccaa cggacagagc cgtcccgaat cgcgttcgtg 780

gaacaggatt tacgccatgg caggcatgga atggggcaaa ttgacggtga ttccgcgcgt 840

gtgggtgcgt gcgttcgatc agagcggcga taaaaacgac aatcccgata ttgccgacta 900

tatggggcag gcgacgtgaa gctgcagtac cgcctgaacg acaggcagaa tgtgtattcc 960

gtattgcgct acaaccccaa aacgggctac ggcgcgattg aagccgccta cacgtttccg 1020

attaagggca aactcaaagg cgtggtacgc ggattccacg gttacacgga gagcctgatc 1080

gactacaacc acaagcagaa cggtatcggt atcgggttga tgttcaacga cttggacggc 1140

atctgactcg agcaccacca ccaccaccac 1170

Claims (6)

1.一种α-转氨酶突变体，其特征在于所述α-转氨酶突变体由序列如SEQ ID NO：1所示的氨基酸经下列之一的单点或多点突变而得：（1）第87位缬氨酸突变为脯氨酸，（2）第87位缬氨酸突变为脯氨酸+第108位异亮氨酸突变为丙氨酸，（3）第87位缬氨酸突变为脯氨酸+第108位异亮氨酸突变为丙氨酸+第167位赖氨酸突变为丝氨酸，（4）第87位缬氨酸突变为脯氨酸+第108位异亮氨酸突变为丙氨酸+第167位赖氨酸突变为丝氨酸+第304位酪氨酸突变为组氨酸，（5）第87位缬氨酸突变为脯氨酸+第108位异亮氨酸突变为丙氨酸+第167位赖氨酸突变为丝氨酸+第304位酪氨酸突变为组氨酸+第357位甘氨酸突变为苏氨酸。

2.如权利要求1所述的α-转氨酶突变体，其特征在于所述α-转氨酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。

3.权利要求1或2所述的α-转氨酶突变体在催化草铵膦前体酮不对称合成L-草铵膦中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用为：以含所述α-转氨酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经超声破碎后获得的上清液作为催化剂，以草铵膦前体酮PPO为底物，以磷酸吡哆醛为辅酶，以天然氨基酸为氨基供体，在pH8.0 Tris-HCl缓冲液中，32~77℃、400~600 r/min条件下反应，反应结束后，反应液分离纯化，获得L-草铵膦。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述α-转氨酶突变体编码基因序列如SEQ IDNO.8所示。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于反应体系中，底物初始浓度为20~800 mM，湿菌体用量为10~100 g/L，辅酶用量为0~1 mM。

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