CN109609478B - α-转氨酶及突变体以及在不对称合成L-草铵膦中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型转氨酶及其高活力突变体在制备L‑草铵膦中的应用，转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID:5所示，其突变体是将SEQ ID:5所示的氨基酸序列的第124、144、237、250、和328位中的一个或者多个进行单位点突变或多位点突变获得的。本发明实现高转化率转氨酶活力突变体基因的高效表达，酶活最高为840U/mg。本发明中所述转氨酶突变体的最适反应温度最高达到67℃，在该温度下催化800mM草铵膦前体酮利用无机胺正丁胺不对称合成L‑草铵膦中，转化率高达100％。该AcTA突变体解决了当前转氨酶制备L‑草铵膦工艺中，酶源少、酶活低、底物耐受性和氨基供体昂贵等技术难题，具有较好应用前景。

Description

α-转氨酶及突变体以及在不对称合成L-草铵膦中的应用

(一)技术领域

本发明涉及一种新型转氨酶及其高活力突变体，及其在不对称合成L-草铵膦中的应用。

(二)背景技术

草铵膦，4-[羟基(甲基)膦酰基]-DL-高丙氨酸(phosphinothricin,PPT)，为广谱、触杀型、灭生性、非残留的除草剂，具有高效、低毒、易降解等特点。PPT是外消旋体混合物，包含两种光学异构体，但只有L-型具有植物毒性。自除草剂草甘膦退出农药市场，制备光学纯L-PPT获得前所未有的市场机遇。

制备光学纯L-PPT主要有化学合成法、手性拆分法和不对称合成法。化学合成法工艺步骤繁多，所需要的合成试剂价格昂贵，导致成本投入高，而且部分试剂对环境和人体都有一定的毒害作用，无法满足当今的绿色环保要求。手性拆分制备光学纯L-PPT过程用到手性试剂，拆分收率最高仅为50％，得到的D-PPT需要消旋后再利用，手性拆分过程复杂。

不对称合成法具有立体选择性严格、反应条件温和，收率高以及容易分离纯化等优点，适用于大规模制备L-PPT。催化此类反应的酶主要包括谷氨酸脱氢酶和转氨酶，底物为草铵膦前体酮(2-羰基-4-(羟基甲基磷酰基)-丁酸，PPO)。脱氢酶催化时，需要使用昂贵的NAD(P)H作为辅助因子，催化成本过高。

转氨酶(transaminase，简称TA，EC 2.6.1.X)，是一种吡哆醛5'-磷酸(PLP)依赖型酶，它催化氨基从合适的供体到羰基受体的可逆转移。根据氨基被转移到不同的氨基受体位置，可以分为α-TA和ω-TA。α-TA催化底物α位置的羰基接受氨基供体的氨基转移反应，ω-TA催化底物ω位置的羰基接受氨基供体的氨基转移的反应。原则上，TA可以催化转化众多结构的酮和胺，因此TA具有更高的应用前景和价值。

目前，已有一些α-TA已制备L-PPT的报道。Schulz等在大肠杆菌K-12中得到的转氨酶在制备L-PPT，固定化后底物浓度为550mM时转化率可以达到76％(Schulz A,TaggeselleP,Tripier D,et al.Stereospecific production of the herbicide phosphinothricin(glufosinate)by transamination:isolation and characterization of aphosphinothricin-specific transaminase from Escherichia coli..Applied&Environmental Microbiology,1990,56(1):1.)。Bartsch等人从土壤中筛选得到天冬氨酸转氨酶并应用于制备L-PPT，当以天冬氨酸为氨基供体，底物浓度为40mM时转化率最高可以达到75％，底物浓度为100mM时转化率为59％(K.Bartsch,Process for the preparationof L-phosphinothricine by enzymatic transamination with aspartate,U.S.Patent(2005)6936444.)。现有的转氨酶工艺存在的问题是酶源少、酶活性低、转化率低、氨基供体昂贵。

在此背景下，本发明提出通过基因挖掘技术筛选新型TA重组酶，并通过蛋白质工程技术进行分子改造，将具有活性和底物耐受性提高的TA突变体催化剂用于不对称合成制备L-PPT，对于改善TA在制备L-PPT过程中底物耐受性差、酶活低、催化成本高具有重要意义。

(三)发明内容

发明目的是提供可应用于制备L-草铵膦具备优良催化活力和底物耐受性、利用廉价氨基供体的新型转氨酶及其突变体，以及该酶和突变体在不对称合成L-草铵膦中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种α-转氨酶，氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

SEQ ID NO：5序列如下：

MSNANRYTGLVDRYRDRLPVSATTRAISLGEGNTPLIKLENIPRIIGKNVEIYVKYEGLNPTGSFKDRGMTMAVTKAVEEGSKAIICASTGNTSAAAAAYAARAGIKAFVLIPEGKIAMGKMAQAMMYGAITMQIRGNFDDGMRLVKEVADQAPVTIVNSINPYRLQGQKTIAYEIVDELGRAPDYHCLPVGNAGNITAHWMGYTEAVANQPADQFEQVVYDAATDAFTGPKPEGLPVMVGYQASGAAPFLRGAPVENPETVATAIRIGNPQSWNHAKAVVRDSQGWFDELTDAEILEAQRMLSMYEGVFVEPASAASIGGAMRDIKAGKIAEGSVIVCTVTGNGLKDPDTAMKQCQDAVMLSIDATMDQVRDSILSNMDQLEHHHHHH

运用生物信息学方法，对已有转氨酶的保守序列和催化关键位点进行体统比较与分析，从酶数据库中筛选获得3条未用于转氨酶活性研究的酶序列，分别为来源于Ashbyagossypii、Azoarcus sp和Acinetobacter sp的AgTA(GenBank编号NP_987025.1)、AsTA(GenBank编号WP_011766092.1)和AcTA(GenBank编号WP_104500271.1)。通过以草铵膦前体酮为底物的转氨酶活力分析，选择活力最高的酶(AcTA)(SEQ ID NO：5)并对其进行定点突变得到一种具有高转氨酶活力突变体。

一种α-转氨酶突变体，由序列如SEQ ID NO：5所示的氨基酸经定点突变而来，所述突变的位点为下列中的一个或多个：(1)第124位、(2)第144位、(3)第237位、(4)第250位、(5)第328位。所述点突变可以是上述位点中的一位、两位、三位、四位或者五位氨基酸突变为谷氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、苏氨酸或亮氨酸。

优选的，所述转氨酶活力突变体由序列如SEQ ID NO：5所示的氨基酸经下列之一或多个位点突变而得：(1)第124位谷氨酰胺突变为亮氨酸(Q124L)，(2)第144位精氨酸突变为谷氨酸(R144E)，(3)第237位脯氨酸突变为苏氨酸(P237T)，(4)第250位苯丙氨酸突变为天冬酰胺(F250N)，(5)第328位丙氨酸突变为酪氨酸(A328Y)。

更为优选的，所述转氨酶活力突变体由SEQ ID NO：5所示的氨基酸经上述五个位点突变而来，获得的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。

SEQ ID NO：7序列如下：

MSNANRYTGLVDRYRDRLPVSATTRAISLGEGNTPLIKLENIPRIIGKNVEIYVKYEGLNPTGSFKDRGMTMAVTKAVEEGSKAIICASTGNTSAAAAAYAARAGIKAFVLIPEGKIAMGKMALAMMYGAITMQIRGNFDDGMELVKEVADQAPVTIVNSINPYRLQGQKTIAYEIVDELGRAPDYHCLPVGNAGNITAHWMGYTEAVANQPADQFEQVVYDAATDAFTGPKPEGLTVMVGYQASGAAPNLRGAPVENPETVATAIRIGNPQSWNHAKAVVRDSQGWFDELTDAEILEAQRMLSMYEGVFVEPASAASIGGAMRDIKYGKIAEGSVIVCTVTGNGLKDPDTAMKQCQDAVMLSIDATMDQVRDSILSNMDQLEHHHHHH

本发明还涉及所述的转氨酶及突变体在催化草铵膦前体酮不对称合成L-草铵膦中的应用。

本发明关键在于新型高活力转氨酶及其突变位点的选择，在已知新型高活力转氨酶及其突变体位点的前提下，本领域普通技术人员可根据SEQ ID NO.5的TA基因(AcTA)，设计定点突变的突变引物，以携带TA的克隆载体为模板进行定点突变构建突变体，以质粒pET28b或能表达该酶的载体为表达载体，将重组质粒转化Escherichia coli BL21(DE3)细胞或能表达该酶的宿主细胞，高通量筛选验证后的阳性单克隆进行发酵培养，即可获得含有本发明突变体的湿菌体。

具体的，所述应用为：以含所述新型高活力转氨酶或其突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经超声破碎后获得的上清液作为催化剂，以草铵膦前体酮PPO为底物，以磷酸吡哆醛为辅酶，以天然氨基酸或无机胺为氨基供体，在pH8.0Tris-HCl缓冲液中，32～77℃、400～600r/min条件下反应，反应结束后，反应液分离纯化，获得L-草铵膦。

所述无机胺包括异丙胺、正丁胺、3-丙醇胺、乙酰胺或苯胺等。

所述转氨酶或突变体编码基因序列如SEQ ID NO.6、或SEQ ID NO.8所示。

反应体系中，底物初始浓度为20～800mM，湿菌体用量为10～100g/L(优选50g/L)，辅酶用量为0～1mM(优选0.2mM)。

优选的，所述反应在57～77℃(优选67℃)下进行。

具体的，所述湿菌体可按如下方法制备：构建含有所述优良催化活力和底物耐受性的TA或突变体基因的重组载体，将所述重组载体转化至E.coli中，获得的重组基因工程菌进行诱导表达，取培养液分离得到湿菌体细胞。具体为：将含TA或突变体基因的工程菌接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃、150r/min培养10h，获得种子液；将种子液以2％(v/v)接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃、150r/min培养OD600至0.6-0.8，再向培养液中加入终浓度为1mM的IPTG，于28℃诱导12h，4℃、8000r/min离心10min，弃去上清液，收集湿菌体；所述LB培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH值自然。

本发明有益效果主要体现在：本发明提供了一种新的转氨酶及其高活力突变体，该突变体对草铵膦前体酮PPO具有较高的催化活力(最高可达840U/mg)，其最适反应温度67℃，以上特性均属于文献报道的最高水平。使用本突变体不对称生产L-PPT，使用的氨基供体可以为廉价的无机胺，并且转化率高达100％，是文献报道的最高水平。该AcTA突变体解决了不对称合成L-草铵膦中，现有酶源少、酶活低、底物耐受性差、氨基供体昂贵的技术难题，具有较好应用前景。

(四)附图说明

图1为AcTA突变体的最适温度示意图；

图2为AcTA突变体的氨基供体筛选示意图；

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：新型转氨酶的筛选

1、酶的筛选与合成

通过对已报道的转氨酶催化口袋和关键残基分析，从酶数据库中挖掘获得三种酶，其来源分别为Ashbya gossypii(GenBank编号NP_987025.1)、Azoarcus sp.(GenBank编号WP_011766092.1)和Acinetobacter sp.(GenBank编号WP_104500271.1)，并命名为AgTA、AsTA和AcTA。依据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，通过基因工程的常规操作以全合成的方法合成了三条选择的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示；编码酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5所示。在核酸序列末端加入6×his-tag标签，两端加入酶切位点Xba I和Xho I，将该基因克隆至pET28b(+)对应的Xba I和Xho I位点，获得重组表达质粒pET28b/AgTA、pET28b/AsTA和pET28b/AcTA。

2、重组工程菌的诱导表达

LB液体培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH值自然；LB固体培养基在LB液体培养基中添加20g/L琼脂；121℃高压灭菌20min；使用前添加终浓度50μg/mL卡那霉素。

将实施例1获得的基因工程菌接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃、150r/min培养OD₆₀₀约0.6-0.8，获得种子液；将种子液以体积浓度2％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.6-0.8，再向培养液中加入终浓度为1mM的IPTG，于28℃下诱导表达10h后，4℃、8000r/min离心10min，弃去上清液，用0.85％的生理盐水清洗两遍湿菌体，并收集湿菌体，备用。

3、重组工程菌的酶活的测定

采用超声破碎方法对湿菌体进行超声破碎，取1g湿菌体，用10mL Tris-HCl(pH8.0)缓冲液悬浮，在39W条件下超声破碎5min，制备获得无细胞抽提液(即超声破碎后的混悬液)，离心，收集上清液，取1mL上清液用于反应。反应体系：100mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，加入20mM PPO、60mM L-谷氨酸、0.1mM PLP和1mL酶液，体系共5mL。反应条件：于37℃、150r/min条件下反应30min，沸冰浴5min终止反应，12000r/min离心2min，取200μL上清液进行衍生化反应；采用HPLC检测L-PPT浓度。分析柱为C18柱(250×4.6mm，5μm)(依利特分析仪器有限公司，大连，中国)。采用配备了荧光检测器的LC-U3000液相色谱仪。酶活定义：37℃和pH 8.0下，每分钟生成1μmol L-PPT所需酶量定义为一个酶活单位(U)。由表1可知，重组酶AgTA、AsTA和AcTA的活力分别为4.9、5.6和8.3U/mg。

表1：重组酶的酶活测定

实施例2：AcTA单位点突变体的构建与筛选

1、突变体构建

选择酶活最高的重组菌，根据AcTA亲本(亲本AcTA来源于Acinetobacter sp.，GenBank编号为WP_104500271.1)序列(氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列为SEQID NO.6所示)设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/AcTA为模板，对第87位引入单突变，引物为：

正向引物GGGTAAAATGGCANNKGCCATGATG(下划线为突变碱基)

反向引物CGTACATCATGGCNNKTGCCATTTTAC(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物2μL，反向引物2μL，模板DNA 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，50℃15s，61℃6.5min)30循环；72℃5min。

取5μL的PCR产物，加入100μL冰浴的感受态细胞悬液中，冰上静置30min，将转化产物于42℃热击90s，迅速置于冰上冷却2min，向管中加入600μL的LB液体培养基，37℃，150r/min培养60min，取100μL上述菌液涂板，待菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养12h。

2、高通量筛选阳性转化子

配制反应混合溶液A液终浓度组成为：100mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、0.1mMPLP、20mM PPO、60mML-谷氨酸。配制反应混合溶液B液为：溴百里酚蓝指示剂。

用牙签挑取转化平板的突变株至每孔装有1mL发酵培养基(LB培养基中包括50μg/mL卡那霉素和1mM IPTG)的96孔板中，然后用封口膜封边，于28℃、150r/min培养约10h，取20μL培养所得发酵液于干净的96孔板，加入100μL于37℃保温的A液，于37℃、150r/min反应30min后加入30μL的B液观察颜色变化，以未突变菌株E.coli BL21(DE3)/pET28b/AcTA(SEQID NO.1所示基因转入E.coli BL21(DE3))作为对照，颜色变化最显著的突变株进行后续酶活测定。

3、阳性转化子发酵产酶

同实施例1。

4、酶活测定

同实施例1。

该实施例的结果为：运用高通量筛选，对198株重组转化菌初筛，筛选出5株酶活提高的突变株，再对其进行酶活测定，具体结果见表2。经分析确定，其余194株重组菌酶活保持不变或下降的原因是第124位谷氨酰胺(Q)突变为E、Y、N、T和L外的其他氨基酸。

表2：单点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最显著的突变体AcTA-Q124L记为AcTA1，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/AcTA1。

实施例3：AcTA二位点突变体的构建与筛选

根据实施例2构建的单突变体AcTA1序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/AcTA1为模板，对第144位引入单突变，引物为：

正向引物CGATGGTATGNNKCTGGTGAAAG(下划线为突变碱基)

反向引物CTTCTTTCACCAGNNKCATACCATC(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物2μL，反向引物2μL，模板DNA 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，50℃15s，59℃6.5min)30循环；72℃5min。

PCR产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，利用溴百里酚蓝高通量显色法对突变体进行初筛(同实施例2)。

采用超声破碎方法对湿菌体进行超声破碎，对初筛的阳性突变株进行酶活测定(同实施例1)。

该实施例的结果为：运用高通量筛选方法，对213株重组转化菌初筛，筛选出2株酶活提高的突变株，再对其进行酶活测定，具体结果见表3。经分析确定，其余211株重组菌酶活保持不变或下降的原因是第144位异精氨酸(R)突变为E和T外的其他氨基酸。

表3：双点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的突变体AcTA1-R144E记为AcTA2，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/AcTA2。

实施例4：AcTA三位点突变体的构建与筛选

根据实施例3构建的突变体AcTA2序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/AcTA2为模板，对第237位引入单突变，引物为：

正向引物CCGGAAGGTTTANNKGTTATGGTC(下划线为突变碱基)

反向引物CCGACCATAACNNKTAAACCTTCC(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物2μL，反向引物2μL，模板DNA 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，50℃15s，58℃6.5min)30循环；72℃5min。

PCR产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，利用溴百里酚蓝高通量显色法对突变体进行初筛(同实施例2)。

采用超声破碎方法对高通量初筛获得的阳性突变体进行超声破碎和酶活测定(同实施例1)。

该实施例的结果为：对165株重组转化菌初筛，筛选出4株酶活提高的突变株，再对其进行酶活测定，具体结果见表4。经分析确定，其余161株重组菌酶活保持不变或下降的原因是第237位脯氨酸(P)突变为Y、N、T和L外的其他氨基酸。

表4：三点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的突变体AcTA2-P237T记为AcTA3，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/AcTA3。

实施例5：AcTA四位点突变体的构建与筛选

根据实施例4构建的突变体AcTA3序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/AcTA3为模板，对第304位引入单突变，引物为：

正向引物GGCGCTGCGCCANNKTTACGTGG(下划线为突变碱基)

反向引物GCGCACCACGTAANNKTGGCGCAG(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物2μL，反向引物2μL，模板DNA 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，50℃15s，65℃6.5min)30循环；72℃5min。

PCR产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，利用溴百里酚蓝高通量显色法对突变体进行初筛(同实施例2)。

采用超声破碎方法对高通量初筛获得的阳性突变体进行超声破碎和酶活测定(同实施例1)。

该实施例的结果为：对247株重组转化菌初筛，筛选出3株酶活提高的突变株，再对其进行酶活测定，具体结果见表5。经分析确定，其余244株重组菌酶活保持不变或下降的原因是第250位苯丙氨酸(F)突变为E、N和L外的其他氨基酸。

表5：四点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的突变体AcTA3-F250N记为AcTA4，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/AcTA4。

实施例6：AcTA五位点突变体的构建与筛选

根据实施例5构建的突变体AcTA4序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/AcTA4为模板，对第328位引入单突变，引物为：

正向引物GCGTGACATTAAANNKGGTAAAATTG(下划线为突变碱基)

反向引物CTTCTGCAATTTTACCNNKTTTAATGTC(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物2μL，反向引物2μL，模板DNA 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，50℃15s，58℃6.5min)30循环；72℃5min。

PCR产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，利用溴百里酚蓝高通量显色法对突变体进行初筛(同实施例2)。

采用超声破碎方法对高通量初筛获得的阳性突变体进行超声破碎和酶活测定(同实施例1)。

该实施例的结果为：对163株重组转化菌初筛，筛选出4株酶活提高的突变株，再对其进行酶活测定，具体结果见表6。经分析确定，其余159株重组菌酶活保持不变或下降的原因是第328位丙氨酸(A)突变为E、Y、T和L外的其他氨基酸。

表6：五点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的突变体AcTA4-A328Y记为AcTA5，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/AcTA5。

实施例7：重组大肠杆菌发酵产酶

分别将实施例1-6的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/AcTA1、E.coli BL21(DE3)/pET28b/AcTA2、E.coli BL21(DE3)/pET28b/AcTA3、E.coli BL21(DE3)/pET28b/AcTA4、E.coli BL21(DE3)/pET28b/AcTA5接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃、150r/min培养OD₆₀₀约0.6-0.8，获得种子液；将种子液以2％(v/v)接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.6-0.8，再向培养液中加入终浓度为1mM的IPTG，于28℃下诱导表达12h后，4℃、8000r/min离心10min，弃去上清液，用0.85％的生理盐水清洗两遍湿菌体，并收集湿菌体，备用。

实施例8：确定催化酶的最适温度

收集实施例7制备的各重组菌的湿菌体在39W条件下超声破碎5min后，将破碎混合液，在4℃、8000r/min离心10min，弃去沉淀，收集上清液使用nickel-NTA琼脂糖凝胶柱进行纯化，用平衡缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.0)平衡层析柱，再使用洗脱液(50mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，500mM咪唑，pH 8.0)进行洗脱，根据紫外检测器的信号响应，收集相应的洗脱液，即为各自纯酶液。

将上述纯酶液作为转化用酶，测定酶的最适反应温度。具体操作如下：100mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0)中，加入20mM PPO、60mM L-谷氨酸、0.1mM PLP和1mL纯酶液，体系共5mL。分别于不同转化温度：32-77℃测定TA活力(方法同实施例1)，结果见图1。

由图可知，E.coli BL21(DE3)/pET28b/AcTA5的最适反应温度是67℃，比原始酶AcTA提高了10℃，属于文献报道的最高值。

实施例9：氨基供体的选择

将实施例10中的突变株AcTA5纯酶液作为转化用酶，对酶的最适氨基供体进行优化。具体操作如下：100mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中，加入20mM PPO、60mM L-氨基酸、0.1mM PLP和1mL纯酶液，体系共5mL。L-氨基酸具体包括L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-赖氨酸、L-天冬酰胺、L-甘氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、异丙胺、正丁胺、3-丙醇胺、乙酰胺和苯胺。测定TA在不同氨基供体的活力，由图2可知E.coli BL21(DE3)/pET28b/AcTA5的氨基供体非常广泛，包括正丁胺、3-丙醇胺、L-甘氨酸、L-谷氨酸、和L-酪氨酸。其中，最优供体为正丁胺。

实施例10：重组菌全细胞催化草铵膦前体酮PPO不对称合成L-PPT

按实施例7的方法，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/AcTA、E.coli BL21(DE3)/pET28b/AcTA1、E.coli BL21(DE3)/pET28b/AcTA2、E.coli BL21(DE3)/pET28b/AcTA3、E.coli BL21(DE3)/pET28b/AcTA4、E.coli BL21(DE3)/pET28b/AcTA5湿菌体作为生物催化剂，以草铵膦前体酮PPO为底物，不对称合成制备L-PPT。100mL催化体以200mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)为反应介质，200-800mM PPO，3倍摩尔数的正丁胺氨基供体，0.2mMPLP，50g/L湿菌体。该体系于67℃、600r/min反应6h，HPLC定期检测L-PPT浓度，并计算转化率。由表7可知，E.coliBL21(DE3)/pET28b/AcTA5底物浓度800mM，转化4h的转化率高达100％，高于原始酶和其他突变酶的转化率，同时也为文献报道的最高水平。

表7：正丁胺为氨基供体不同底物浓度下的转化率比较

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> α-转氨酶及突变体以及在不对称合成L-草铵膦中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 393

<212> PRT

<213> Ashbya gossypii

<400> 1

Met Ala Asn Asn Leu Gln Lys Gln Leu Phe Ala Lys Lys Phe Lys Asp

1 5 10 15

Ala Glu Glu Val Leu Arg Thr Met Asp Asp Gln Gly Asn Asp Ala Ala

20 25 30

Pro Asp Thr Glu Ser Asp Asp Leu Gly Glu Leu Pro Ala Phe Gly Cys

35 40 45

Gly Gly Ile Arg Pro Arg Arg His Ala Ser Ser Met Pro Val Gly Asp

50 55 60

Asn Asp Ser Trp Arg Lys Tyr Phe Ala Val Asn Glu Met Phe Ala Ile

65 70 75 80

Pro Glu Arg Asn Phe Lys Phe Asn Thr Tyr Tyr Lys Leu Pro Gln Thr

85 90 95

Thr Asn Ala Ala Ser Ile Pro Val Phe Ile Met His His Gly Ala Gly

100 105 110

Ser Ser Gly Leu Thr Phe Ala Pro Leu Ala Asp Glu Leu Tyr Thr Arg

115 120 125

Leu Glu Gly Lys Cys Gly Ile Phe Ser Phe Asp Ala Arg Gly His Gly

130 135 140

Glu Thr Val Pro Leu Asp Ser Thr Leu Glu Val Pro Tyr Asp Leu Ala

145 150 155 160

Thr Phe Thr Ala Asp Phe Asn Ala Val Ile Lys Thr Leu Gln Gln Arg

165 170 175

Ile Leu Gln His Lys Ile Pro Lys Glu Lys Leu Ser Ile Val Leu Leu

180 185 190

Gly His Ser Leu Gly Gly Ser Ile Cys Thr Thr Ala Phe Asn Ala Met

195 200 205

Glu Ser Ala Leu Arg Ser Lys Val Val Gly Val Ala Ile Phe Asp Ile

210 215 220

Val Glu Glu Ala Ala Ile Ala Ala Leu Asn Asn Met Ser His His Leu

225 230 235 240

Ala Thr Thr Pro Thr Ser Phe Ala Thr Met Arg Glu Ala Ile Glu Tyr

245 250 255

Tyr Ile Glu Lys Gly Leu Ser Asn Leu Arg Ser Ser Ala Glu Val Cys

260 265 270

Val Pro Ala Leu Phe His Lys Thr Ser Arg Gly Lys Ala Val Arg Ile

275 280 285

Thr Asp Leu Ala Ser Phe Gln Lys Tyr Trp His Thr Trp Phe Val Gly

290 295 300

Leu Ser Ser Arg Phe Val His Leu Pro Thr Ser Lys Leu Leu Val Leu

305 310 315 320

Ala Gly Ser Asp Asn Leu Asp Lys Glu Leu Ile Ile Gly Gln Met Gln

325 330 335

Gly Lys Tyr Gln Leu Val Val Phe Gln Glu Ser Gly His Phe Ile Gln

340 345 350

Glu Asp Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ile Thr Leu Ile Glu Phe Trp Arg

355 360 365

Arg Asn Asp Asn Lys Asn Val Val Ile Lys Thr Asn Trp Gly Gln Trp

370 375 380

Asn Leu Glu His His His His His His

385 390

<210> 2

<211> 1179

<212> DNA

<213> Ashbya gossypii

<400> 2

atggcgaaca atctacagaa acaactattt gctaagaagt tcaaagatgc tgaagaggtg 60

cttcggacca tggatgatca aggcaatgac gcagcaccgg acacagagtc agatgattta 120

ggcgaactcc cggcctttgg ttgcgggggt ataaggccta gaaggcatgc tagctctatg 180

cccgtgggag ataacgacag ctggcgcaag tactttgcgg tcaacgaaat gttcgcgata 240

cccgagcgta acttcaaatt caacacatac tacaaacttc cccagacaac taatgctgct 300

tccataccag ttttcattat gcaccatggc gcgggctcgt cggggcttac ctttgcgcct 360

cttgcggacg agctatacac gcgacttgag ggtaaatgtg gaatcttctc ctttgatgcc 420

aggggacatg gggagaccgt tccgctagat tcaactttgg aggtcccata tgatcttgcc 480

acgttcactg cggactttaa cgctgtcatt aagacactac aacagcggat cttgcaacat 540

aaaataccaa aagaaaagct atcaatagtg ctactggggc atagtctcgg gggcagcata 600

tgcacaacag cctttaatgc gatggagagt gcacttcgga gcaaagtggt cggcgtggct 660

atttttgata ttgtagaaga ggctgctatt gcagctttaa ataatatgtc acaccaccta 720

gcgacaacac caacctcctt tgctactatg cgtgaggcta ttgaatacta cattgagaag 780

ggtctttcga atctacgctc tagcgccgaa gtatgtgttc ctgccttgtt ccacaagacc 840

tcgagaggta aagctgtccg aataacagat cttgcaagct ttcagaagta ttggcatacc 900

tggttcgtgg gcctatcgtc tcgttttgtg catttaccaa ctagtaagct gctggtgctt 960

gcaggcagcg acaatctgga caaggaactg atcattggac agatgcaagg gaagtaccaa 1020

ctggtagttt ttcaggaatc tggccatttt attcaggagg atgctccggc gaaagctgcc 1080

attacgctga tcgaattttg gcggagaaat gataacaaga acgttgtaat caagacgaac 1140

tgggggcagt ggaactaaga gcaccaccac caccaccac 1179

<210> 3

<211> 398

<212> PRT

<213> Azoarcus sp.

<400> 3

Met Asn Lys Ile Val Phe Gln Gly Arg Trp Ser His Arg Leu Arg Ser

1 5 10 15

Leu Ala Thr Ala Gly Ala Val Ala Val Arg Val Ala Thr Arg Arg Leu

20 25 30

Leu Gly Arg Arg Arg Val Glu Ser Trp Ser Phe Leu Phe Glu Tyr Gly

35 40 45

Thr Leu Tyr Ile Arg Ala Gln Phe Asn His Ala Phe Arg Leu Lys Ala

50 55 60

Asp Ile Ser Ala Ser Arg Ala Tyr Phe Asp Ser Phe Tyr Ser Val Phe

65 70 75 80

Asp Thr Tyr Pro Asp Val Glu Val Arg Ala Ser Gly Val Gly Glu Pro

85 90 95

Arg Gly His Trp Phe Ile Pro Ala Val Arg His Ser Asp Ala Thr Leu

100 105 110

Leu His Phe His Gly Gly Gly Tyr Thr Phe His Ala Gly Val Ser Arg

115 120 125

His Phe Ala Arg Ile Leu Ala His Ser Leu Gly Val Val Val Phe Ala

130 135 140

Pro Asp Tyr Arg Leu Thr Pro Glu His Pro His Pro Ala Gln Leu Glu

145 150 155 160

Asp Gly Leu Ala Ala Tyr Arg Tyr Leu Leu Glu Arg Gly Val Ala Pro

165 170 175

Arg Arg Leu Val Leu Cys Gly Asp Ser Ala Gly Gly His Leu Ala Leu

180 185 190

Met Thr Leu Ser His Leu Ala Arg Ala Gly Leu Pro Thr Pro Leu Leu

195 200 205

Thr Leu Gly Ile Ser Pro Trp Thr Asp Ile Gly Arg Arg Gly Ala Ser

210 215 220

Gln Phe Gly Asn Asp Pro Tyr Asp Leu Val Gln Gly Tyr Met Thr Leu

225 230 235 240

Gln Phe Ala Glu Trp Leu Lys Gly Gly Gln Asp Val Ser Asp Ala Glu

245 250 255

Leu Ser Pro Ile His Gln Asp Tyr Arg Gly Leu Gly Pro Ile Tyr Leu

260 265 270

Gln Ala Gly Gly Arg Glu Ile Leu Val Asp Met Ile Arg Asp Phe Ala

275 280 285

Ala Thr Val Ala Glu Gln Gly Gly Pro Val Arg Leu Asp Val Trp Pro

290 295 300

Asp Met Asn His Glu Phe His Gly Tyr Gly Asp Gln Leu Ala Glu Ser

305 310 315 320

Arg Ala Ala Leu Asp Arg Leu Arg Ala Ala Ile Ala Trp Ala Ala Gln

325 330 335

Pro Thr Arg Pro Phe Ala Ala Asp Ala Leu Thr Glu Cys Asp Thr Leu

340 345 350

Ser Leu Ala Ala Arg Asp Ala Gln Arg Pro Pro Arg His Gly Thr Gly

355 360 365

Gly Arg Glu Gln Gly Ala Gly Arg Arg Gly Val Ala Ala Arg Pro Ala

370 375 380

Ser Ser Val Pro Asn Ser Leu Glu His His His His His His

385 390 395

<210> 4

<211> 1194

<212> DNA

<213> Azoarcus sp.

<400> 4

atgaacaaga tcgtcttcca gggccgctgg tcccaccgac tccgcagtct cgccaccgcg 60

ggggcggttg ccgtgcgggt cgccacccgc cggctgcttg ggcgccggcg ggtcgaatcg 120

tggtctttcc tgttcgagta cggcacgctc tacatccggg cccagttcaa ccacgcgttt 180

cgcctcaagg cggacatttc ggcgagccgg gcgtatttcg acagcttcta ttcggtgttc 240

gacacctacc ccgatgtcga agtgcgcgcc agcggcgtgg gcgaaccacg cgggcactgg 300

ttcattcccg ccgtccggca cagcgatgcg accctgctgc actttcacgg cggcggttac 360

accttccatg ccggcgtatc ccgtcacttc gcccgcatcc tggcgcatag cctcggcgtt 420

gtggtgttcg cgccggatta ccggctgacg ccggaacacc cgcatcccgc ccaactggaa 480

gacggcctcg ccgcctatcg ctacctgctg gagcgcggcg tggcgccgcg gcgcctcgtg 540

ctgtgcgggg attcggcggg cgggcatctg gcgttgatga cgctgtcgca tctcgcccgc 600

gcgggcctgc ccacaccctt gctgacactc gggatcagcc cctggacgga catcggtcgg 660

cgcggtgcca gccagttcgg caacgatccc tacgacctgg tgcagggcta catgacgctg 720

cagttcgcgg agtggctgaa aggcggacag gacgtgagcg acgccgaact gtcgcccatt 780

catcaggact accgcggtct cggcccgatc tacctgcaag cgggcgggcg cgagatcctg 840

gtcgacatga tccgcgactt cgccgccacc gtggcggagc agggcggccc ggtgcggctt 900

gacgtgtggc cggacatgaa ccacgaattc cacggttacg gcgaccaact ggcggaaagc 960

cgggccgcgc tggaccgctt gcgcgcggcg atcgcctggg ccgcgcagcc cacccggcct 1020

ttcgcagccg acgcgctgac ggaatgcgac acgctgtcgc tcgccgcgcg cgacgcgcag 1080

cgcccgccgc gtcatggcac gggggggcgc gagcagggag ccgggcggcg cggtgtcgcc 1140

gcgcggccgg ctagctccgt accgaactcc tgagagcacc accaccacca ccac 1194

<210> 5

<211> 389

<212> PRT

<213> Acinetobacter sp.

<400> 5

Met Ser Asn Ala Asn Arg Tyr Thr Gly Leu Val Asp Arg Tyr Arg Asp

1 5 10 15

Arg Leu Pro Val Ser Ala Thr Thr Arg Ala Ile Ser Leu Gly Glu Gly

20 25 30

Asn Thr Pro Leu Ile Lys Leu Glu Asn Ile Pro Arg Ile Ile Gly Lys

35 40 45

Asn Val Glu Ile Tyr Val Lys Tyr Glu Gly Leu Asn Pro Thr Gly Ser

50 55 60

Phe Lys Asp Arg Gly Met Thr Met Ala Val Thr Lys Ala Val Glu Glu

65 70 75 80

Gly Ser Lys Ala Ile Ile Cys Ala Ser Thr Gly Asn Thr Ser Ala Ala

85 90 95

Ala Ala Ala Tyr Ala Ala Arg Ala Gly Ile Lys Ala Phe Val Leu Ile

100 105 110

Pro Glu Gly Lys Ile Ala Met Gly Lys Met Ala Gln Ala Met Met Tyr

115 120 125

Gly Ala Ile Thr Met Gln Ile Arg Gly Asn Phe Asp Asp Gly Met Arg

130 135 140

Leu Val Lys Glu Val Ala Asp Gln Ala Pro Val Thr Ile Val Asn Ser

145 150 155 160

Ile Asn Pro Tyr Arg Leu Gln Gly Gln Lys Thr Ile Ala Tyr Glu Ile

165 170 175

Val Asp Glu Leu Gly Arg Ala Pro Asp Tyr His Cys Leu Pro Val Gly

180 185 190

Asn Ala Gly Asn Ile Thr Ala His Trp Met Gly Tyr Thr Glu Ala Val

195 200 205

Ala Asn Gln Pro Ala Asp Gln Phe Glu Gln Val Val Tyr Asp Ala Ala

210 215 220

Thr Asp Ala Phe Thr Gly Pro Lys Pro Glu Gly Leu Pro Val Met Val

225 230 235 240

Gly Tyr Gln Ala Ser Gly Ala Ala Pro Phe Leu Arg Gly Ala Pro Val

245 250 255

Glu Asn Pro Glu Thr Val Ala Thr Ala Ile Arg Ile Gly Asn Pro Gln

260 265 270

Ser Trp Asn His Ala Lys Ala Val Val Arg Asp Ser Gln Gly Trp Phe

275 280 285

Asp Glu Leu Thr Asp Ala Glu Ile Leu Glu Ala Gln Arg Met Leu Ser

290 295 300

Met Tyr Glu Gly Val Phe Val Glu Pro Ala Ser Ala Ala Ser Ile Gly

305 310 315 320

Gly Ala Met Arg Asp Ile Lys Ala Gly Lys Ile Ala Glu Gly Ser Val

325 330 335

Ile Val Cys Thr Val Thr Gly Asn Gly Leu Lys Asp Pro Asp Thr Ala

340 345 350

Met Lys Gln Cys Gln Asp Ala Val Met Leu Ser Ile Asp Ala Thr Met

355 360 365

Asp Gln Val Arg Asp Ser Ile Leu Ser Asn Met Asp Gln Leu Glu His

370 375 380

His His His His His

385

<210> 6

<211> 1167

<212> DNA

<213> Acinetobacter sp.

<400> 6

atgtcgaatg ccaatcgtta tactggttta gttgaccgtt atcgtgaccg tttaccagtg 60

tctgcaacta cacgtgcaat ctctctcggt gaagggaata ccccgctaat caagcttgag 120

aacattccac gtattattgg caagaacgtt gaaatttatg tgaagtatga aggcttaaac 180

ccgacaggtt catttaaaga ccgtggtatg accatggccg taaccaaagc ggttgaagaa 240

ggttcaaaag ccattatctg tgcctccacc ggtaacactt ctgcagcggc agcagcctat 300

gcagcgcgtg ctggtatcaa agcgtttgtc ttaattcctg aaggcaaaat tgccatgggt 360

aaaatggcac aggccatgat gtacggtgcc atcaccatgc agattcgcgg taactttgac 420

gatggtatgc gtctggtgaa agaagtggcc gatcaggctc ctgtaaccat cgtaaactcg 480

atcaacccgt accgtctgca aggtcaaaag accattgcct acgaaatcgt ggatgaactc 540

ggccgtgccc cagactacca ctgcctgcca gttggtaacg cgggcaatat tactgcacac 600

tggatgggtt ataccgaagc tgtggctaac cagcctgcag accagtttga acaagtggtg 660

tatgatgcgg caacggatgc ctttactggt ccaaaaccgg aaggtttacc agttatggtc 720

ggttatcaag cctctggcgc tgcgccattc ttacgtggtg cgccagttga aaacccggaa 780

actgtagcca ctgcaatccg tattggtaac ccgcaaagct ggaaccatgc caaagctgta 840

gttcgtgatt cacaaggctg gttcgatgaa ctgaccgatg cagaaattct ggaagctcag 900

cgcatgctgt ccatgtacga aggcgtgttt gttgagcctg catctgcagc atccattggc 960

ggcgcgatgc gtgacattaa agccggtaaa attgcagaag gttcggtgat tgtatgtact 1020

gttactggta acggtctgaa agatccagac actgcaatga aacaatgcca ggatgcggtg 1080

atgctgtcaa ttgacgccac tatggatcag gttcgtgatt ctatcctttc aaacatggat 1140

caatgagagc accaccacca ccaccac 1167

<210> 7

<211> 389

<212> PRT

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 7

Met Ser Asn Ala Asn Arg Tyr Thr Gly Leu Val Asp Arg Tyr Arg Asp

1 5 10 15

Arg Leu Pro Val Ser Ala Thr Thr Arg Ala Ile Ser Leu Gly Glu Gly

20 25 30

Asn Thr Pro Leu Ile Lys Leu Glu Asn Ile Pro Arg Ile Ile Gly Lys

35 40 45

Asn Val Glu Ile Tyr Val Lys Tyr Glu Gly Leu Asn Pro Thr Gly Ser

50 55 60

Phe Lys Asp Arg Gly Met Thr Met Ala Val Thr Lys Ala Val Glu Glu

65 70 75 80

Gly Ser Lys Ala Ile Ile Cys Ala Ser Thr Gly Asn Thr Ser Ala Ala

85 90 95

Ala Ala Ala Tyr Ala Ala Arg Ala Gly Ile Lys Ala Phe Val Leu Ile

100 105 110

Pro Glu Gly Lys Ile Ala Met Gly Lys Met Ala Leu Ala Met Met Tyr

115 120 125

Gly Ala Ile Thr Met Gln Ile Arg Gly Asn Phe Asp Asp Gly Met Glu

130 135 140

Leu Val Lys Glu Val Ala Asp Gln Ala Pro Val Thr Ile Val Asn Ser

145 150 155 160

Ile Asn Pro Tyr Arg Leu Gln Gly Gln Lys Thr Ile Ala Tyr Glu Ile

165 170 175

Val Asp Glu Leu Gly Arg Ala Pro Asp Tyr His Cys Leu Pro Val Gly

180 185 190

Asn Ala Gly Asn Ile Thr Ala His Trp Met Gly Tyr Thr Glu Ala Val

195 200 205

Ala Asn Gln Pro Ala Asp Gln Phe Glu Gln Val Val Tyr Asp Ala Ala

210 215 220

Thr Asp Ala Phe Thr Gly Pro Lys Pro Glu Gly Leu Thr Val Met Val

225 230 235 240

Gly Tyr Gln Ala Ser Gly Ala Ala Pro Asn Leu Arg Gly Ala Pro Val

245 250 255

Glu Asn Pro Glu Thr Val Ala Thr Ala Ile Arg Ile Gly Asn Pro Gln

260 265 270

Ser Trp Asn His Ala Lys Ala Val Val Arg Asp Ser Gln Gly Trp Phe

275 280 285

Asp Glu Leu Thr Asp Ala Glu Ile Leu Glu Ala Gln Arg Met Leu Ser

290 295 300

Met Tyr Glu Gly Val Phe Val Glu Pro Ala Ser Ala Ala Ser Ile Gly

305 310 315 320

Gly Ala Met Arg Asp Ile Lys Tyr Gly Lys Ile Ala Glu Gly Ser Val

325 330 335

Ile Val Cys Thr Val Thr Gly Asn Gly Leu Lys Asp Pro Asp Thr Ala

340 345 350

Met Lys Gln Cys Gln Asp Ala Val Met Leu Ser Ile Asp Ala Thr Met

355 360 365

Asp Gln Val Arg Asp Ser Ile Leu Ser Asn Met Asp Gln Leu Glu His

370 375 380

His His His His His

385

<210> 8

<211> 1167

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 8

atgtcgaatg ccaatcgtta tactggttta gttgaccgtt atcgtgaccg tttaccagtg 60

tctgcaacta cacgtgcaat ctctctcggt gaagggaata ccccgctaat caagcttgag 120

aacattccac gtattattgg caagaacgtt gaaatttatg tgaagtatga aggcttaaac 180

ccgacaggtt catttaaaga ccgtggtatg accatggccg taaccaaagc ggttgaagaa 240

ggttcaaaag ccattatctg tgcctccacc ggtaacactt ctgcagcggc agcagcctat 300

gcagcgcgtg ctggtatcaa agcgtttgtc ttaattcctg aaggcaaaat tgccatgggt 360

aaaatggcat tggccatgat gtacggtgcc atcaccatgc agattcgcgg taactttgac 420

gatggtatgg agctggtgaa agaagtggcc gatcaggctc ctgtaaccat cgtaaactcg 480

atcaacccgt accgtctgca aggtcaaaag accattgcct acgaaatcgt ggatgaactc 540

ggccgtgccc cagactacca ctgcctgcca gttggtaacg cgggcaatat tactgcacac 600

tggatgggtt ataccgaagc tgtggctaac cagcctgcag accagtttga acaagtggtg 660

tatgatgcgg caacggatgc ctttactggt ccaaaaccgg aaggtttaac ggttatggtc 720

ggttatcaag cctctggcgc tgcgccaaat ttacgtggtg cgccagttga aaacccggaa 780

actgtagcca ctgcaatccg tattggtaac ccgcaaagct ggaaccatgc caaagctgta 840

gttcgtgatt cacaaggctg gttcgatgaa ctgaccgatg cagaaattct ggaagctcag 900

cgcatgctgt ccatgtacga aggcgtgttt gttgagcctg catctgcagc atccattggc 960

ggcgcgatgc gtgacattaa atatggtaaa attgcagaag gttcggtgat tgtatgtact 1020

gttactggta acggtctgaa agatccagac actgcaatga aacaatgcca ggatgcggtg 1080

atgctgtcaa ttgacgccac tatggatcag gttcgtgatt ctatcctttc aaacatggat 1140

caatgagagc accaccacca ccaccac 1167

Claims (6)

1.一种α-转氨酶突变体，其特征在于所述α-转氨酶突变体由序列如SEQ ID NO：5所示的氨基酸经下列之一的单点或多点突变而得：（1）第124位谷氨酰胺突变为亮氨酸，（2）第124位谷氨酰胺突变为亮氨酸+第144位精氨酸突变为谷氨酸，（3）第124位谷氨酰胺突变为亮氨酸+第144位精氨酸突变为谷氨酸+第237位脯氨酸突变为苏氨酸，（4）第124位谷氨酰胺突变为亮氨酸+第144位精氨酸突变为谷氨酸+第237位脯氨酸突变为苏氨酸+第250位苯丙氨酸突变为天冬酰胺，（5）第124位谷氨酰胺突变为亮氨酸+第144位精氨酸突变为谷氨酸+第237位脯氨酸突变为苏氨酸+第250位苯丙氨酸突变为天冬酰胺+第328位丙氨酸突变为酪氨酸。

2.如权利要求1所述的α-转氨酶突变体，其特征在于所述α-转氨酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。

3.权利要求1或2所述的α-转氨酶突变体在催化草铵膦前体酮不对称合成L-草铵膦中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用为：以含所述α-转氨酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经超声破碎后获得的上清液作为催化剂，以草铵膦前体酮PPO为底物，以磷酸吡哆醛为辅酶，以天然氨基酸或无机胺为氨基供体，在pH8.0 Tris-HCl缓冲液中，32~77℃、400~600 r/min条件下反应，反应结束后，反应液分离纯化，获得L-草铵膦。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述α-转氨酶突变体编码基因序列如SEQ IDNO.8所示。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于反应体系中，底物初始浓度为20~800 mM，湿菌体用量为10~100 g/L，辅酶用量为0~1 mM。

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