CN111876396B

CN111876396B - 双辅酶依赖型草铵膦脱氢酶突变体及其在催化合成l-草铵膦中的应用

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Publication number: CN111876396B
Application number: CN202010644394.XA
Authority: CN
Inventors: 程峰; 李举谋; 薛亚平; 李清华; 徐建妙; 沈其; 邹树平; 郑裕国
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2020-07-07
Filing date: 2020-07-07
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2040-07-07
Also published as: CN111876396A

Abstract

本发明公开了双辅酶依赖型草铵膦脱氢酶突变体及其在催化合成L‑草铵膦中的应用，该双辅酶依赖型草铵膦脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第91位、第111位、第240位和第261位进行多点突变后获得。本发明不仅改变了草铵膦脱氢酶突变体的辅酶依赖性，由原来NADPH依赖性改为NADH/NADPH双依赖性，而且也对草铵膦脱氢酶催化活性进行了改造，活力有了较大提升，并将突变体进一步组合，获得了高活力菌株，催化制备的L‑草铵膦转化率高、收率高、产物易于分离提纯且显著缩短了反应进程。

Description

双辅酶依赖型草铵膦脱氢酶突变体及其在催化合成L-草铵膦中的应用

技术领域

本发明涉及生物化工技术领域，尤其涉及双辅酶依赖型草铵膦脱氢酶突变体及其在催化合成L-草铵膦中的应用。

背景技术

草铵膦(glufosinate-ammonium)化学名称为4-[羟基(甲基)膦酰基]-DL-高丙氨酸，是世界第二大转基因作物耐受除草剂，由赫斯特公司(几经合并后现归属拜耳公司)开发生产，又称草铵膦铵盐、Basta、Buster等，属膦酸类除草剂，非选择性(灭生性)触杀型除草剂是谷氨酰胺合成酶抑制剂。

众所周知，灭生性除草剂市场巨大。目前，世界三大除草剂分别为百草枯，草甘膦，草铵膦。在市场使用方面，草甘膦独占鳌头，但是由于其长期使用，使得大量杂草产生抗性，而草甘膦也趋于失效；中国农业部已发布公告说明，百草枯由于其剧毒性，已被列入《鹿特丹公约》，百草枯在2014年7月1日停止生产，2016年7月1日禁止使用；全球越来越多国家禁用或限用。而目前草铵膦产量虽小，却具有优异的除草性能和较小的药害副作用，因此，在未来一段时间内拥有巨大的市场潜力。

草铵膦有两种光学异构体，分别为L-草铵膦和D-草铵膦。但只有L-型具有生理活性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。

目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。若草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，可显著降低草铵膦的使用量，这对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力具有重要意义。

手性纯L-草铵膦的主要制备方法主要由三种：手性拆分法，化学合成法和生物催化法。

手性拆分法是通过对外消旋D,L-草铵膦或其衍生物进行手性拆分，实现D型和L型异构体的分离，从而得到光学纯的L-草铵膦。此工艺主要存在以下缺点：需要使用昂贵手性拆分试剂、理论收率只能达到50％、单次拆分率低、工艺比较复杂。

化学合成法是从手性原料出发合成光学纯L-草铵膦。化学不对称合成法工艺步骤多、收率低，手性原料昂贵导致生产成本高，不利于大规模制备L-草铵膦。

生物催化法生产草铵膦则具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高等优点，是生产L-草铵膦的优势方法。主要包括以下三类：

(1)以L-草铵膦的衍生物为底物，通过酶法直接水解获得，主要的优点转化率高，产物ee值较高，但需要昂贵且不易获得的手性原料作为前体，成本加高，不利于工业化生产。例如生物法制备L-草铵膦最简单的方法就是利用蛋白酶直接水解双丙氨膦。双丙氨膦是一种天然的三肽化合物，在蛋白酶的催化下，双丙氨膦脱去2分子L-丙氨酸，生成L-草铵膦。

(2)以外消旋草铵膦的前提为底物，通过酶的选择性拆分获得。主要优点为原料相对易得，催化剂活力高，但其理论收率只能达到50％，会造成原料的浪费。例如一种采用α-胰凝乳蛋白酶拆分双丙氨膦乙酯制备L-草铵膦的方法，该法首先经过3步反应将外消旋的草铵膦合成双丙氨膦二乙酯，接着用碱性mesinterico肽酶将其C端脂基水解。再经α-胰凝乳蛋白酶催化水解肽键。在该步反应中，α-胰凝乳蛋白酶能选择性水解L-双丙氨膦乙酯，生成L-草铵膦乙脂。最后利用磷酸二脂酶水解P端酯基得到L-草铵膦。

(3)以α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，通过酶的不对称合成获得，主要涉及的酶包括转氨酶与草铵膦脱氢酶。早在研究草铵膦在土壤微生物体内的代谢途径时就已经发现，L-草铵膦在转氨酶的作用下，发生转氨作用被分解成一种α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(简称PPO)。SchμLz A等(Stereospeciric production orthe herbicide phosphinothricin(glurosinate)by transamination:isolation andcharacterization or a phosphinothricin-speciric transaminase from Escherichiacoli[J].Applied&Environmental Microbiology,1990,56(1):1-6.)在上世纪90年代就利用从大肠杆菌中克隆的转氨酶，以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，L-谷氨酸作为氨基供体，催化转氨反应生产L-草铵膦。该在转氨酶经固定化并安装至生物反应器，催化制备L-草铵膦，其产物浓度可达76.1g/L，最高产率为50g/(L·h)，L-草铵膦的ee值超过99.9％。但利用转氨酶制备L-草铵膦有两大缺陷，其一是原料PPO不能完全转化为L-PPT，转化率最高只有90％；其二是要使可逆反应向生成L-PPT的方向进行，需要4倍当量以上的L-谷氨酸作为氨基供体，过量的谷氨酸给L-草铵膦的分离带来了很大的麻烦。

在诸多草铵膦的酶法合成路线中，酮酸中间体的酮羰基是潜手性官能团，能够通过酶法合成途径构建手性中心，酮酸路线也因原料价廉易得且可以避免使用剧毒氰化物，而成为适宜L-草铵膦工业化开发生产的路线。

氨基酸脱氢酶(EC 1.4.1.-，AADH)是一类能将氨基酸可逆的脱氨生成对应酮酸的氨基酸脱氢酶，其反应需要核苷类辅酶的参与(NAD(P)+)。根据其底物特异性，可分为谷氨酸脱氢酶、亮氨酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶、缬氨酸脱氢酶等。在谷氨酸脱氢酶中，一部分对草铵膦前体酮(PPO)具有活性的酶称之为草铵膦脱氢酶。

发明内容

本发明提供了一种双辅酶依赖型草铵膦脱氢酶突变体、包含草铵膦脱氢酶突变体的基因工程菌以及突变体和基因工程菌在催化合成L-草铵膦中的应用。本发明不仅改变了草铵膦脱氢酶突变体的辅酶依赖性，由原来NADPH依赖性改为NADH/NADPH双依赖性，既可以利用NADPH作为辅酶，也可以利用NADH作为辅酶，而且也对草铵膦脱氢酶催化活性进行了改造，酶活力有了较大提升，并将突变体进一步组合，获得了高活力菌株，催化制备的L-草铵膦转化率高、收率高、产物易于分离提纯且显著缩短了反应进程。

具体技术方案如下：

本发明提供了一种双辅酶依赖型草铵膦脱氢酶突变体，所述突变体由SEQ IDNO.2所示氨基酸序列的第91位、第111位、第240位和第261位进行多点突变后获得；其中，第91位的甘氨酸突变为丙氨酸，第111位的谷氨酰胺突变为丝氨酸，第240位的天冬酰胺突变为赖氨酸，第261位的天冬氨酸突变为谷氨酰胺。

该双辅酶依赖型草铵膦脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明利用来源于细纹文氏菌(Ventosimonas gracilis)的野生型草铵膦脱氢酶(NCBI登录号为WP_068388615.1，核苷酸序列为如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)，通过定点饱和突变，构建获得草铵膦脱氢酶的基因突变文库，并从中筛选获得酶活、催化性能和立体选择性均高的草铵膦脱氢酶突变体。

本发明提供了所述的双辅酶依赖型草铵膦脱氢酶突变体的编码基因。

作为优选，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明提供的双辅酶依赖型草铵膦脱氢酶突变体可用于催化合成L-草铵膦。

本发明还提供了一种基因工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述目的基因包含所述双辅酶依赖型草铵膦脱氢酶突变体的编码基因。

作为优选，所述目的基因还包含葡萄糖脱氢酶的编码基因。

作为优选，所述葡萄糖脱氢酶的编码基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明还提供了上述基因工程菌在催化合成L-草铵膦中的应用。

具体地，本发明提供了一种催化合成L-草铵膦的方法，为以下两种中的任意一种：

(1)以2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸或其盐为底物，在无机氨基供体和辅酶循环系统存在的条件下，利用催化剂催化底物发生还原胺化反应，制得L-草铵膦；

(2)以D-草铵膦为底物，在无机氨基供体、D-氨基酸氧化酶和和辅酶循环系统存在的条件下，利用催化剂催化底物反应获得L-草铵膦；

在(1)和(2)中，所述辅酶循环系统为葡萄糖脱氢酶循环系统；所述催化剂为所述的双辅酶依赖型草铵膦脱氢酶突变体或其固定化酶，或所述的基因工程菌。

其中，所述D-氨基酸氧化酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQID NO.6所示。

进一步地，所述无机氨基供体为硫酸铵。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明通过定点饱和突变技术，构建获得具双辅酶依赖性的草铵膦脱氢酶突变体的基因文库，并从中筛选获得酶活、催化性能和立体选择性均高的草铵膦脱氢酶突变体；该草铵膦脱氢酶的突变体活性较野生酶有了较大的提升，最终完全催化800mM的2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸生产L-草铵膦仅仅需要5小时(转氨酶通常需要40小时)，且ee值大于99.5％。

(2)本发明提供的L-草铵膦制备方法原料转化率高、收率高、产物易于分离提纯。

(3)本发明方提供的L-草铵膦制备方法与转氨酶等催化工艺相比，工艺相对简单，原料转化率高，转化率可达100％，且获得的产物易于从反应液中分离提纯。

附图说明

图1为实施例4中利用草铵膦脱氢酶与辅酶再生酶双酶耦联催化2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸不对称胺化还原制备L-草铵膦的反应示意图。

图2为一锅法制备L-草铵膦的反应示意图。

图3为实施例5中E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-VgPPTDH-G91A-Q111S-N240K-D261Q-EsGDH的反应进程图。

图4为实施例6中E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-VgPPTDH-G91A-Q111S-N240K-D261Q–EsGDH和氨基酸氧化酶一锅法制备L-草铵膦的反应进程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。

上游基因工程操作所用试剂：本发明实施例中使用的一步克隆试剂盒均购自Vazyme，南京诺唯赞生物科技有限公司；质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒购自Axygen杭州有限公司；E.coli BL21(DE3)、质粒等购自上海生工；DNA marker、FastPfu DNA聚合酶、低分子量标准蛋白、琼脂糖电泳试剂、引物合成与基因测序工作由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。

下游催化工艺所用试剂：2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(简称PPO)，D,L-草铵膦、L-草铵膦标准品购自Sigma-Aldrich公司；NADPH购于邦泰生物工程(深圳)有限公司；其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

下列实施例中高效液相色谱的检测方法如下：

高效液相色谱(HPLC)检测底物浓度，分析方法为：色谱柱型号：QS-C18，5μm，4.6×250mm。流动相：将50mM磷酸二氢胺溶于800mL超纯水中，加入10mL四丁基氢氧化铵(10％)用水稀释并定容至1000mL，用磷酸调pH到3.8，与乙腈以体积比88:12混合。检测波长为232nm，流速：1.0mL/min。柱温：40℃，2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸出峰时间为：9.7分钟。

产物的手性分析及浓度分析通过柱前衍生化高效液相色谱进行，具体的分析方法为：

(1)色谱条件：色谱柱型号：QS-C18，5μm，4.6×250mm。流动相：50mM乙酸铵溶液：甲醇＝10:1。荧光检测波长：λex＝340nm，λem＝455nm。流速：1mL/min。柱温：30℃，L-草铵膦出峰时间为8.5min，D-草铵膦出峰时间为10.2min。

(2)衍生化试剂：分别称取0.1g邻苯二甲醛与0.12g N-乙酰-L-半胱氨酸，用10mL乙醇助溶，再加入40mL 0.1moL/L硼酸缓冲液(pH 9.8)，振荡使其充分溶解，4℃冰箱保存备用(不超过4天)。

(3)衍生化反应与测定：取100μL样品加入400μL衍生化试剂，在振荡器上500rpm，30℃震荡5min，再加入400μL超纯水混匀，进样10μL进行HPLC分析。

实施例1表达载体和工程菌的构建

(1)重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)//pETDuet-1-VgPPTDH

通过在NCBI数据库中挑选了1株来源于Ventosimonas gracilis的草铵膦脱氢酶，NCBI登录号为WP_068388615.1，并进行基因合成，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

根据SEQ ID NO.1所示核苷酸序列设计引物，并分别在引物中引入了Sac I和NotI限制性酶切位点：

上游引物：5’-GAGCTCATGACTGTATCTGTTGACTCCTT-3’；

下游引物：5’-GCGGCCGCTTAAACCACGCCTTGCTCCA-3’；

以pETDuet-1质粒为表达载体，构建重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-VgPPTDH：在上述引物的引发下，以目的基因核酸序列为模板，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得草铵膦脱氢酶的基因序列，测序后利用Sac I和NotI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，并利用T4 DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的载体pETDuet-1进行连接，构建表达载体/pETDuet-1-VgPPTDH。

感受态细胞的制备：从-80℃冰箱中获得甘油管保藏的E.coli BL21(DE3)菌株，在无抗LB平板上划线，37℃培养10h，获取单菌落；挑取LB平板的单菌落，接种至含5mL的LB培养基的试管中，37℃、180rpm培养9h；从试管中取200μL菌液，接种到50mL的LB培养基中，37℃、180rpm培养OD₆₀₀至0.4-0.6；将菌液在冰上预冷，取菌液至灭菌的离心管中，冰上放置10min，4℃、5000rpm离心10min；将上清液倒出，注意防止染菌，用预冷的0.1mol/L的CaCl₂水溶液重悬沉淀细胞，并在冰上放置30min；4℃、5000rpm离心10min，弃上清，用预冷的含15％甘油的0.1mol/L的CaCl₂水溶液重悬沉淀细胞，取100μL重悬细胞分装至灭菌的1.5mL离心管中，保藏于-80℃冰箱，需要时取出。

重组大肠杆菌的获得：首先将储藏于-80℃的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞在0℃冰浴10min，然后在超净台内加入5μL的质粒pETDuet-1-VgPPTDH，0℃冰浴30min，42℃水浴中热击90s，0℃冰浴2min，加入600μL的LB培养基，在37℃、200rpm摇床培养1h；涂布于含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB平板，37℃下培养8-12h，随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定，筛选获得含有表达重组质粒的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-VgPPTDH。

(2)重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET24a-pRtDAAO

将D-氨基酸氧化酶基因(NCBI登录号：ALM22233.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)，根据SEQ ID NO.5所示D-氨基酸氧化酶基因核苷酸序列设计引物，并分别在引物中引入了Sac I和NotI限制性酶切位点：

上游引物：5’-GAGCTCATGCACAGCCAGAAGCGTGT-3’；

下游引物：5’-GCGGCCGCTTACAGTTTGCTTTCACGCGCC-3’；

以pET-24a(+)质粒为表达载体，构建E.coli BL21(DE3)/pET-24a-pRtDAAO：在上述引物的引发下，以氨基酸氧化酶基因序列为模板，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得带有酶切位点的D-氨基酸氧化酶的基因序列，测序后利用Sac I和NotI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，并利用T4 DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的载体pET-24a(+)进行连接，构建E.coli BL21(DE3)/pET-24a-pRtDAAO。

D-氨基酸氧化酶工程菌的获得：首先将储藏于-80℃的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞在0℃冰浴10min，然后在超净台内加入5μL的pET24a-pRtDAAO质粒，0℃冰浴30min，42℃水浴中热击90s，0℃冰浴2min，加入600μL的LB培养基，在37℃、200rpm摇床培养1h；涂布于含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB平板，37℃下培养8-12h，随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定，获得含有表达重组质粒的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET24a-pRtDAAO。

实施例2葡萄糖脱氢酶和草铵膦脱氢酶重组构建，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-VgPPTDH-EsGDH。

为了进一步降低工业化生产成本，构建葡萄糖-葡萄糖脱氢酶辅酶循环系统，采用一步克隆法将葡萄糖脱氢酶(NCBI登录号：KM817194.1，氨基酸序列SEQ ID NO.7所示)，克隆到表达载体pETDuet-1的第二个多克隆位点上，葡萄糖脱氢酶为NADPH/NADH双辅酶特异性的脱氢酶。

带有同源序列的葡萄糖脱氢酶基因的获得：将表达载体pETDuet-1的NdeI和PacI酶切位点前面和后面的各20bp左右序列作为同源序列，以E.coli BL21(DE3)/pET28b-EsGDH(根据NCBI登录号，进行基因合成)为模板，设计引物1、引物2并将同源臂分别添加到基因特异性正/反向扩增引物序列的5’端，以此对带有同源臂的葡萄糖脱氢酶基因利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，将消化模板后的PCR产物用DNA回收纯化试剂盒进行纯化回收，并分别测出核酸浓度，得到带有同源序列的葡萄糖脱氢酶基因序列。

带有草铵膦脱氢酶的线性化载体基因的获得：以pETDuet-1-VgPPTDH为模板，NdeI和PacI酶切位点前面和后面各20bp左右序列作为引物，设计引物3、引物4，利用高保真PfuDNA聚合酶进行扩增，将消化模板后的PCR产物用DNA回收纯化试剂盒进行纯化回收，并分别测出核酸浓度，得到带有草铵膦脱氢酶的线性化载体。

引物1：5’-TATAAGAAGGAGATATACATATGGGTTATAATTCTCTGAAA-3’；

引物2：5’-GTGGCAGCAGCCTAGGTTAATCAACCACGGCCAGCCTGA-3’；

引物3：5’-TTAACCTAGGCTGCTGCCACCGC-3’；

引物4：5’-ATGTATATCTCCTTCTTATACTTA-3’。

单片段同源重组反应：

最适克隆载体使用量＝{0.02*克隆载体碱基对数}ng(0.03pmol)

最适插入片段使用量＝{0.04*插入片段碱基对数}ng(0.06pmol)

反应体系(表1)：

表1 反应体系：

组分	重组反应	阴性对照-1	阴性对照-2	阳性对照
					线性化载体	XμL	XμL	0μL	1μL
N个插入片段	Y<sub>1</sub>+Y<sub>2</sub>...+Y<sub>n</sub>μL	0μL	Y<sub>1</sub>+Y<sub>2</sub>...+Y<sub>n</sub>μL	1μL
					2*CLonExpressMIX	5μL	0μL	0μL	5μL
ddH<sub>2</sub>O	to 10μL	to 10μL	to 10μL	to 10μL

注：X表示加入线性化载体的量，Y表示插入片段的量。

将配置好的反应体系使用移液器轻轻吸打混匀，短暂离心后将反应液收集到管底。反应体系放在50℃的水浴中，静置5min，然后立即放在冰上冷却。将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中(42℃，90s)，涂布于含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB平板，37℃下培养12-16h，随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定，分别筛选获得含有草铵膦脱氢酶和葡萄糖脱氢酶基因的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-VgPPTDH-EsGDH。

实施例3草铵膦脱氢酶-葡萄糖脱氢酶重组菌、氨基酸氧化酶的诱导表达

含草铵膦脱氢酶-葡萄糖脱氢酶的湿菌体：分别将实施例2获得的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-VgPPTDH-EsGDH接种至含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以1％(v/v)接种量接种至新鲜的含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD₆₀₀达0.6-0.8，加入终浓度为24μg/mL的IPTG，22℃下诱导培养16h后，4℃、8000rpm离心20min，弃去上清液，收集沉淀，用pH7.5、20mM磷酸盐缓冲液(PB)洗涤两次，即获得含草铵膦脱氢酶-葡萄糖脱氢酶的重组菌株E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-VgPPTDH-EsGDH的湿菌体；将湿菌体加入pH 7.5、100mM的PBS中重悬，在冰水混合物上超声破碎10min，超声破碎条件：功率为400W，破碎1s，暂停5s，获得粗酶液。

含D-氨基酸氧化酶的湿菌体：将含有D-氨基酸氧化酶基因的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET24a-pRtDAAO接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm下培养12h，再以1％(v/v)接种量接种至新鲜的含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD₆₀₀达0.6-0.8，加入终浓度为24μg/mL的IPTG，28℃下诱导培养14h后，4℃、8000rpm离心20min，弃去上清液，收集沉淀，用pH 7.5、20mM磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次，获得湿菌体；将湿菌体加入pH 7.5、100mM的PBS中重悬，在冰水混合物上超声破碎10min，超声破碎条件：功率为400W，破碎1s，暂停5s，获得粗酶液。

实施例4草铵膦脱氢酶基因突变文库的构建及其高通量筛选

通过对VgPPTDH进行同源建模与分子对接，选取91、111、115、238、240、241、261位点进行定点饱和突变。引物设计如表2所示

表2 引物设计

一、高通量筛选方法的建立

配制50mL工作液：邻苯二甲醛0.013g，N乙酰-L-半胱氨酸0.032g，用pH＝9.8硼酸缓冲液溶解定容到50mL，作为高通量工作液。用pH＝9.8硼酸缓冲液配置1mM外消旋草铵膦溶液50μL与50μL工作液震荡反应30s，再加入100μL ddH₂O。

二、高通量筛选

以pETDuet-1-VgPPTDH-EsGDH为出发质粒，构建定点饱和突变文库，将获得的突变体文库转入大肠杆菌E.coLi BL21(DE3)的感受态细胞中，转化条件：将PCR产物加入到感受态细胞中，冰浴30min，热击温度42℃，热击90s，在含有50μg/mL氨苄霉素的LB抗性平板上挑取单克隆，用灭菌的牙签挑取单菌落到灭好菌的96深孔板中，每孔有1mL含有50μg/mL氨苄抗性的LB培养基，在37℃、200rpm摇床上培养8h后，每孔吸取500μL的菌液，转移到另一每孔有500μL的含有终浓度为50μg/mL氨苄和终浓度为24μg/mL IPTG诱导剂的LB培养基的96深孔板中，然后放在22℃、200rpm的摇床上培养16h后，离心，收取菌体于96孔板底。

1、初筛：

配置反应液：终浓度20mM底物PPO(2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸)，50mM的硫酸铵和24mM的葡萄糖，以pH 7.5的磷酸缓冲液为反应介质构成反应液。96深孔板每孔加入500μL的反应液，同时用移液枪反复吹打，将96孔板收集的菌体重悬，然后将96深孔板放入40℃、200rpm的摇床上反应4小时后，离心取上清，测荧光值，λex＝340nm，λem＝455nm，筛选荧光值高于原始菌株的菌株。

2、复筛：

将初筛获得的菌株培养获得的菌体作为催化剂，以2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸为底物。反应体系选择为30mL，催化剂用量以湿菌体重量计25g/L，底物终浓度300mM，葡萄糖终浓度360mM，硫酸铵终浓度500mM，40℃、控制pH为7.5，600转/分钟反应3h取反应液100μL，加5μL盐酸终止反应，以超纯水补足至1mL，即反应液稀释10倍，稀释后的样品先经过衍生化处理，取200μL稀释后的反应液加400μL衍生化试剂30℃衍生化5min，再加400μL超纯水补足至1mL，12000转/分钟离心1分钟，取上清，过0.22μM微滤膜，作为液相样品，HPLC检测2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸、L-草铵膦、D-草铵膦及ee值。以产物L-草铵膦和值为指标，筛选优势突变体，复筛实验结果示于表3。

表3 液相复筛结果

对筛选结果进行分析，G91A、Q111S活力提高是因为催化活性的改变，N240K、D261Q突变体活力提高是因为辅酶依赖性的改变，由NADPH依赖性改为NADH/NADPH双依赖性的。

实施例5 E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-VgPPTDH-G91A-Q111S-N240K-D261Q-EsGDH不对称胺化还原2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸制备L-草铵膦

根据实施例3的方法，通过发酵获得草铵膦脱氢酶突变体-葡萄糖脱氢酶重组工程菌湿菌体，E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-VgPPTDH-G91A-Q111S-N240K-D261Q–EsGDH添加量为7.5g，加入终浓度800mM的2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸，终浓度1M的葡萄糖，终浓度800mM的(NH₄)₂SO₄氨基供体构成反应体系300mL，在40℃、磁力搅拌转速为600rpm下进行反应，流加氨水使反应液pH维持在7.5。

通过液相方法检测反应过程中产物L-草铵膦的浓度和ee值，反应进程曲线如图3所示。该图显示，产物浓度随时间的推移而逐渐升高，5h内反应完成，底物转化率大于99％，产物ee值始终保持在99.5％以上。

实施例6 D-氨基酸氧化酶工程菌、草铵膦脱氢酶突变体-葡萄糖脱氢酶重组工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-VgPPTDH-G91A-Q111S-N240K-D261Q-EsGDH以D-草铵膦为底物，采用一锅法制备L-草铵膦

根据实施例3的方法，通过发酵获得D-氨基酸氧化酶湿菌体15g、草铵膦脱氢酶-葡萄糖脱氢酶重组工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-VgPPTDH-G91A-Q111S-N240K-D261Q-EsGDH 7.5g，过氧化氢酶(3000units/mg)3g，加入终浓度350mM的D-草铵膦，终浓度420mM的葡萄糖，终浓度350mM的硫酸铵构成反应体系300mL，在40℃、磁力搅拌转速为600rpm下进行反应，流加氨水使反应液pH维持在7.5。

通过液相方法检测反应过程中产物L-草铵膦的生成和ee值的变化，反应进程曲线如图4所示。该图显示，产物浓度随时间的推移而逐渐升高，8h内反应完成，底物转化率大于99％，产物ee值始终保持在99.5％以上。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 双辅酶依赖型草铵膦脱氢酶突变体及其在催化合成L-草铵膦中的应用

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1338

<212> DNA

<213> 细纹文氏菌(Ventosimonas gracilis)

<400> 1

atgactgtat ctgttgactc cttccttgcc cgtatcaaac aacgcgaccc gcatcaaact 60

gaatttcatc aagctgtcga agaggtactg cgcagcctgt ggccctttct gcaagacaac 120

ccgcattacg ccaaggccgg cattttagag cgtttggtcg agccggaacg cgccattcaa 180

tttcgcgtgc cttgggtgga tgaccaaggc gtggtacagg tcaatcgcgg ctttcgtgta 240

cagatgaaca gcgccatcgg cccgtataag gggggattgc gctttcatcc ttcggtcaat 300

ttaagcgtgc ttaagttctt ggcttttgaa caggtgttta aaaattcgct gacttccctg 360

cccatgggcg gcggcaaagg cggtgcggat tttaacccca agggcaagag tgacggcgaa 420

gtgatgcgct tttgccaatc ctttatgagc gagctgtacc gtcatattgg cgcaaacctt 480

gacgtacccg ccggggatat tggcgtgggc gggcgcgaga ttggctattt gttcggccaa 540

tataaacgtc ttgccaatga gtttgcctcg gtgcttaccg gcaaagggct tgcctacggc 600

ggtagcctga tccgcccgga ggcgaccggc tacggctgcg tgtactttgc cgaagagatg 660

ctaaagcgca agcaactcgg ctttgaagga aaaaaggtgt gcatttccgg ttcaggcaat 720

gtctcacaat acgccgcgca aaaagtgatg gaattaggtg gacgggtaat ttccctgtcc 780

gactcacaag gcacgctggt gattgaagca gggcttgatc aggaacagtg gcactacctg 840

atggatttaa aaaaccgccg ccgcgggcgt atccgcgaaa tggctgaaca ctttgccctg 900

ccctttcttg aagggcagac accttggcat ctgccctgtg acattgccct gccctgtgcc 960

acgcaaaacg aattgtcctc tgaagatgca cgtactttgc tgaaaaacgg ctgcatttgc 1020

gtggccgaag gcgccaatat gccggccact ctggaggcgg tggaagtctt tatcgaagcc 1080

ggtacgctct acgctccggg caaggcggcc aacgccggcg gcgttgccac cagcggtctg 1140

gagatgagcc aaaacgccat gcgcctgcac tggagcggcg gcgaggtgga cgaaaaactg 1200

cacaacatca tgcaaaacat ccaccaggcc tgcgtgcgct acggcgagga aaacgggcgc 1260

atcaactacg tcaaaggtgc caatatcgcc ggtttcgtta aagtcgccga tgccatgctg 1320

gagcaaggcg tggtttaa 1338

<210> 2

<211> 445

<212> PRT

<213> 细纹文氏菌(Ventosimonas gracilis)

<400> 2

Met Thr Val Ser Val Asp Ser Phe Leu Ala Arg Ile Lys Gln Arg Asp

1 5 10 15

Pro His Gln Thr Glu Phe His Gln Ala Val Glu Glu Val Leu Arg Ser

20 25 30

Leu Trp Pro Phe Leu Gln Asp Asn Pro His Tyr Ala Lys Ala Gly Ile

35 40 45

Leu Glu Arg Leu Val Glu Pro Glu Arg Ala Ile Gln Phe Arg Val Pro

50 55 60

Trp Val Asp Asp Gln Gly Val Val Gln Val Asn Arg Gly Phe Arg Val

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His

85 90 95

Pro Ser Val Asn Leu Ser Val Leu Lys Phe Leu Ala Phe Glu Gln Val

100 105 110

Phe Lys Asn Ser Leu Thr Ser Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly

115 120 125

Ala Asp Phe Asn Pro Lys Gly Lys Ser Asp Gly Glu Val Met Arg Phe

130 135 140

Cys Gln Ser Phe Met Ser Glu Leu Tyr Arg His Ile Gly Ala Asn Leu

145 150 155 160

Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Gly Arg Glu Ile Gly Tyr

165 170 175

Leu Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Leu Ala Asn Glu Phe Ala Ser Val Leu

180 185 190

Thr Gly Lys Gly Leu Ala Tyr Gly Gly Ser Leu Ile Arg Pro Glu Ala

195 200 205

Thr Gly Tyr Gly Cys Val Tyr Phe Ala Glu Glu Met Leu Lys Arg Lys

210 215 220

Gln Leu Gly Phe Glu Gly Lys Lys Val Cys Ile Ser Gly Ser Gly Asn

225 230 235 240

Val Ser Gln Tyr Ala Ala Gln Lys Val Met Glu Leu Gly Gly Arg Val

245 250 255

Ile Ser Leu Ser Asp Ser Gln Gly Thr Leu Val Ile Glu Ala Gly Leu

260 265 270

Asp Gln Glu Gln Trp His Tyr Leu Met Asp Leu Lys Asn Arg Arg Arg

275 280 285

Gly Arg Ile Arg Glu Met Ala Glu His Phe Ala Leu Pro Phe Leu Glu

290 295 300

Gly Gln Thr Pro Trp His Leu Pro Cys Asp Ile Ala Leu Pro Cys Ala

305 310 315 320

Thr Gln Asn Glu Leu Ser Ser Glu Asp Ala Arg Thr Leu Leu Lys Asn

325 330 335

Gly Cys Ile Cys Val Ala Glu Gly Ala Asn Met Pro Ala Thr Leu Glu

340 345 350

Ala Val Glu Val Phe Ile Glu Ala Gly Thr Leu Tyr Ala Pro Gly Lys

355 360 365

Ala Ala Asn Ala Gly Gly Val Ala Thr Ser Gly Leu Glu Met Ser Gln

370 375 380

Asn Ala Met Arg Leu His Trp Ser Gly Gly Glu Val Asp Glu Lys Leu

385 390 395 400

His Asn Ile Met Gln Asn Ile His Gln Ala Cys Val Arg Tyr Gly Glu

405 410 415

Glu Asn Gly Arg Ile Asn Tyr Val Lys Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe

420 425 430

Val Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Glu Gln Gly Val Val

435 440 445

<210> 3

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Thr Val Ser Val Asp Ser Phe Leu Ala Arg Ile Lys Gln Arg Asp

1 5 10 15

Pro His Gln Thr Glu Phe His Gln Ala Val Glu Glu Val Leu Arg Ser

20 25 30

Leu Trp Pro Phe Leu Gln Asp Asn Pro His Tyr Ala Lys Ala Gly Ile

35 40 45

Leu Glu Arg Leu Val Glu Pro Glu Arg Ala Ile Gln Phe Arg Val Pro

50 55 60

Trp Val Asp Asp Gln Gly Val Val Gln Val Asn Arg Gly Phe Arg Val

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Ala Gly Leu Arg Phe His

85 90 95

Pro Ser Val Asn Leu Ser Val Leu Lys Phe Leu Ala Phe Glu Ser Val

100 105 110

Phe Lys Asn Ser Leu Thr Ser Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly

115 120 125

Ala Asp Phe Asn Pro Lys Gly Lys Ser Asp Gly Glu Val Met Arg Phe

130 135 140

Cys Gln Ser Phe Met Ser Glu Leu Tyr Arg His Ile Gly Ala Asn Leu

145 150 155 160

Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Gly Arg Glu Ile Gly Tyr

165 170 175

Leu Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Leu Ala Asn Glu Phe Ala Ser Val Leu

180 185 190

Thr Gly Lys Gly Leu Ala Tyr Gly Gly Ser Leu Ile Arg Pro Glu Ala

195 200 205

Thr Gly Tyr Gly Cys Val Tyr Phe Ala Glu Glu Met Leu Lys Arg Lys

210 215 220

Gln Leu Gly Phe Glu Gly Lys Lys Val Cys Ile Ser Gly Ser Gly Lys

225 230 235 240

Val Ser Gln Tyr Ala Ala Gln Lys Val Met Glu Leu Gly Gly Arg Val

245 250 255

Ile Ser Leu Ser Gln Ser Gln Gly Thr Leu Val Ile Glu Ala Gly Leu

260 265 270

Asp Gln Glu Gln Trp His Tyr Leu Met Asp Leu Lys Asn Arg Arg Arg

275 280 285

Gly Arg Ile Arg Glu Met Ala Glu His Phe Ala Leu Pro Phe Leu Glu

290 295 300

Gly Gln Thr Pro Trp His Leu Pro Cys Asp Ile Ala Leu Pro Cys Ala

305 310 315 320

Thr Gln Asn Glu Leu Ser Ser Glu Asp Ala Arg Thr Leu Leu Lys Asn

325 330 335

Gly Cys Ile Cys Val Ala Glu Gly Ala Asn Met Pro Ala Thr Leu Glu

340 345 350

Ala Val Glu Val Phe Ile Glu Ala Gly Thr Leu Tyr Ala Pro Gly Lys

355 360 365

Ala Ala Asn Ala Gly Gly Val Ala Thr Ser Gly Leu Glu Met Ser Gln

370 375 380

Asn Ala Met Arg Leu His Trp Ser Gly Gly Glu Val Asp Glu Lys Leu

385 390 395 400

His Asn Ile Met Gln Asn Ile His Gln Ala Cys Val Arg Tyr Gly Glu

405 410 415

Glu Asn Gly Arg Ile Asn Tyr Val Lys Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe

420 425 430

Val Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Glu Gln Gly Val Val

435 440 445

<210> 4

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgactgtat ctgttgactc cttccttgcc cgtatcaaac aacgcgaccc gcatcaaact 60

gaatttcatc aagctgtcga agaggtactg cgcagcctgt ggccctttct gcaagacaac 120

ccgcattacg ccaaggccgg cattttagag cgtttggtcg agccggaacg cgccattcaa 180

tttcgcgtgc cttgggtgga tgaccaaggc gtggtacagg tcaatcgcgg ctttcgtgta 240

cagatgaaca gcgccatcgg cccgtataag gcgggattgc gctttcatcc ttcggtcaat 300

ttaagcgtgc ttaagttctt ggcttttgaa tcggtgttta aaaattcgct gacttccctg 360

cccatgggcg gcggcaaagg cggtgcggat tttaacccca agggcaagag tgacggcgaa 420

gtgatgcgct tttgccaatc ctttatgagc gagctgtacc gtcatattgg cgcaaacctt 480

gacgtacccg ccggggatat tggcgtgggc gggcgcgaga ttggctattt gttcggccaa 540

tataaacgtc ttgccaatga gtttgcctcg gtgcttaccg gcaaagggct tgcctacggc 600

ggtagcctga tccgcccgga ggcgaccggc tacggctgcg tgtactttgc cgaagagatg 660

ctaaagcgca agcaactcgg ctttgaagga aaaaaggtgt gcatttccgg ttcaggcaaa 720

gtctcacaat acgccgcgca aaaagtgatg gaattaggtg gacgggtaat ttccctgtcc 780

cagtcacaag gcacgctggt gattgaagca gggcttgatc aggaacagtg gcactacctg 840

atggatttaa aaaaccgccg ccgcgggcgt atccgcgaaa tggctgaaca ctttgccctg 900

ccctttcttg aagggcagac accttggcat ctgccctgtg acattgccct gccctgtgcc 960

acgcaaaacg aattgtcctc tgaagatgca cgtactttgc tgaaaaacgg ctgcatttgc 1020

gtggccgaag gcgccaatat gccggccact ctggaggcgg tggaagtctt tatcgaagcc 1080

ggtacgctct acgctccggg caaggcggcc aacgccggcg gcgttgccac cagcggtctg 1140

gagatgagcc aaaacgccat gcgcctgcac tggagcggcg gcgaggtgga cgaaaaactg 1200

cacaacatca tgcaaaacat ccaccaggcc tgcgtgcgct acggcgagga aaacgggcgc 1260

atcaactacg tcaaaggtgc caatatcgcc ggtttcgtta aagtcgccga tgccatgctg 1320

gagcaaggcg tggtttaa 1338

<210> 5

<211> 1107

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgcacagcc agaagcgtgt ggttgtgctg ggtagcggcg ttatcggtct gagcagcgcg 60

ctgattctgg cgcgtaaagg ctacagcgtt cacatcgtgg cgcgtgacct gccggaggat 120

gtgagcagcc agacctttgc gagcccgtgg gcgggtgcga actggacccc gtttatgagc 180

ctgaccgatg gtccgcgtca agcgaagtgg gaggaactga ccttcaagaa atgggttgag 240

ctggtgccga ccggtcaggt tatgtggctg aagggcaccc gtcgttttgc gcaaaacgaa 300

gacggtctgc tgggccactg gtacaaagat atcaccccga actatcgtcc gctgccgagc 360

agcgagtgcc cgccgaacag cattggtgtt acctatgaca ccctgagcgt gcacgcgccg 420

aagtactgcc agtatctggc gcgtggtctg cagaaactgg gcgcgacctt cgaacgtcgt 480

accgttacca gcgtggagca ggcgtttgaa ggtgtggatc tggttgtgaa cgcgaccggt 540

ctgggtgcga agagcatcgc gggtattgac gatcaggcgg cggaaccgat ccgtggccaa 600

accgttctgg tgaagagcgc gtgcaaacgt tgcaccatgg acagcagcga tccgagcagc 660

ccggcgtaca tcattccgcg tccgggtggc gaggttattt gcggtggcac ctatggtgtg 720

ggcgactggg atctgagcgt taacccggaa accgtgcaac gtatcctgaa acactgcctg 780

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ctgccgctgg accgtagcaa gagcccgctg agcctgggta aaggcaccac ccgtgcggcg 960

aaggagaaag aagttaccct ggtgcacgcg tacggtttca gcagcgcggg ctatcagcaa 1020

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ggcgcggcgc gtgaaagcaa actgtaa 1107

<210> 6

<211> 368

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met His Ser Gln Lys Arg Val Val Val Leu Gly Ser Gly Val Ile Gly

1 5 10 15

Leu Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Ser Val His Ile

20 25 30

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50 55 60

Pro Arg Gln Ala Lys Trp Glu Glu Leu Thr Phe Lys Lys Trp Val Glu

65 70 75 80

Leu Val Pro Thr Gly Gln Val Met Trp Leu Lys Gly Thr Arg Arg Phe

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100 105 110

Pro Asn Tyr Arg Pro Leu Pro Ser Ser Glu Cys Pro Pro Asn Ser Ile

115 120 125

Gly Val Thr Tyr Asp Thr Leu Ser Val His Ala Pro Lys Tyr Cys Gln

130 135 140

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145 150 155 160

Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Ala Phe Glu Gly Val Asp Leu Val Val

165 170 175

Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ala Lys Ser Ile Ala Gly Ile Asp Asp Gln

180 185 190

Ala Ala Glu Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys Ser Ala Cys

195 200 205

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Gly Asp Trp Asp Leu Ser Val Asn Pro Glu Thr Val Gln Arg Ile Leu

245 250 255

Lys His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Ser Ile Ser Ser Asp Gly Thr Ile

260 265 270

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275 280 285

Arg Gly Gly Pro Arg Val Glu Ala Glu Arg Leu Val Leu Pro Leu Asp

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Arg Ser Lys Ser Pro Leu Ser Leu Gly Lys Gly Thr Thr Arg Ala Ala

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Lys Glu Lys Glu Val Thr Leu Val His Ala Tyr Gly Phe Ser Ser Ala

325 330 335

Gly Tyr Gln Gln Ser Trp Gly Ala Ala Glu Asp Val Ala Leu Leu Val

340 345 350

Glu Glu Ala Phe Gln Arg Tyr His Gly Ala Ala Arg Glu Ser Lys Leu

355 360 365

<210> 7

<211> 262

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Gly Tyr Asn Ser Leu Lys Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Gly Ile Gly Glu Ala Ile Ile Arg Arg Tyr Ala Glu Glu Gly

20 25 30

Met Arg Val Val Ile Asn Tyr Arg Ser His Pro Glu Glu Ala Lys Lys

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Ile Ala Glu Asp Ile Lys Gln Ala Gly Gly Glu Ala Leu Thr Val Gln

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Gly Asp Val Ser Lys Glu Glu Asp Met Ile Asn Leu Val Lys Gln Thr

65 70 75 80

Val Asp His Phe Gly Gln Leu Asp Val Phe Val Asn Asn Ala Gly Val

85 90 95

Glu Met Pro Ser Pro Ser His Glu Met Ser Leu Glu Asp Trp Gln Lys

100 105 110

Val Ile Asp Val Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ala Arg Glu Ala

115 120 125

Leu Lys Tyr Phe Val Glu His Asn Val Lys Gly Asn Ile Ile Asn Met

130 135 140

Ser Ser Val His Glu Ile Ile Pro Trp Pro Thr Phe Val His Tyr Ala

145 150 155 160

Ala Ser Lys Gly Gly Val Lys Leu Met Thr Gln Thr Leu Ala Met Glu

165 170 175

Tyr Ala Pro Lys Gly Ile Arg Ile Asn Ala Ile Gly Pro Gly Ala Ile

180 185 190

Asn Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Glu Asp Pro Lys Gln Arg Ala

195 200 205

Asp Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Asn Ile Gly Lys Pro Glu Glu

210 215 220

Ile Ser Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Asp Glu Ala Ser Tyr Val

225 230 235 240

Thr Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Leu Tyr Pro Ser

245 250 255

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260

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gagctcatga ctgtatctgt tgactcctt 29

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcggccgctt aaaccacgcc ttgctcca 28

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gagctcatgc acagccagaa gcgtgt 26

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

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<400> 11

gcggccgctt acagtttgct ttcacgcgcc 30

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tataagaagg agatatacat atgggttata attctctgaa a 41

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gtggcagcag cctaggttaa tcaaccacgg ccagcctga 39

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ttaacctagg ctgctgccac cgc 23

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atgtatatct ccttcttata ctta 24

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(11)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 16

ccgtataagn nkggattgcg ctt 23

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(14)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 17

aagcgcaatc cmnncttata cgg 23

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(14)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 18

ttggcttttg aannkgtgtt taaaaat 27

<210> 19

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 19

atttttaaac acmnnttcaa aagccaa 27

<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(14)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 20

caggtgttta aannktcgct gacttcc 27

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 21

ggaagtcagc gamnntttaa acacctg 27

<210> 22

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(14)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 22

tgcatttccg gtnnkggcaa tgtctca 27

<210> 23

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 23

tgagacattg ccmnnaccgg aaatgca 27

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(14)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 24

tccggttcag gcnnkgtctc acaatac 27

<210> 25

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 25

gtattgtgag acmnngcctg aaccgga 27

<210> 26

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(14)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 26

ggttcaggca atnnktcaca atacgcc 27

<210> 27

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 27

ggcgtattgt gamnnattgc ctgaacc 27

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(14)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 28

atttccctgt ccnnktcaca aggca 25

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(13)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 29

tgccttgtga mnnggacagg gaaat 25

Claims

1.一种双辅酶依赖型草铵膦脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第91位、第111位、第240位和第261位进行多点突变后获得；

其中，第91位的甘氨酸突变为丙氨酸，第111位的谷氨酰胺突变为丝氨酸，第240位的天冬酰胺突变为赖氨酸，第261位的天冬氨酸突变为谷氨酰胺。

2.如权利要求1所述的双辅酶依赖型草铵膦脱氢酶突变体的编码基因。

3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

4.如权利要求1所述的双辅酶依赖型草铵膦脱氢酶突变体在催化合成L-草铵膦中的应用。

5.一种基因工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，其特征在于，所述目的基因包含如权利要求2或3任一项所述的双辅酶依赖型草铵膦脱氢酶突变体的编码基因。

6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述目的基因还包含葡萄糖脱氢酶的编码基因。

7.如权利要求5或6任一项所述的基因工程菌在催化合成L-草铵膦中的应用。

8.一种催化合成L-草铵膦的方法，其特征在于，为以下两种中的任意一种：

在(1)和(2)中，所述辅酶循环系统为葡萄糖脱氢酶循环系统；所述催化剂为如权利要求1所述的双辅酶依赖型草铵膦脱氢酶突变体或其固定化酶，或如权利要求5或6任一项所述的基因工程菌。

9.如权利要求8所述的催化合成L-草铵膦的方法，其特征在于，所述无机氨基供体为硫酸铵。