CN117210431A - 一种热稳定性转氨酶突变体及其工程菌与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种热稳定性转氨酶突变体及其工程菌与应用。所述转氨酶突变体由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第23位的组氨酸取代为丙氨酸，第43位的酪氨酸取代为天冬氨酸，第128位的精氨酸取代为丝氨酸，第214位的苯丙氨酸取代为半胱氨酸得到。经测定，本发明提供的ω‑转氨酶突变体的酶活达45U/mg以上。所述ω‑转氨酶突变体能够生物催化2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]‑丁酸不对称合成L‑草铵膦，200mM底物反应3h，底物转化率高达88％以上，产物ee>99.9％，相比于原始酶，转化率提高了1.8倍。此外，本发明采用三酶级联法，进一步提高了转化率，可催化300mM底物PPO转化为L‑草铵膦，300mM底物反应10h，底物转化率为100％，产物ee>99.9％，体现了极佳的L‑草铵膦生产潜力。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种来自嗜热假单胞菌(Pseudomonasthermotolerans)的ω-转氨酶突变体。
背景技术
草铵膦具有杀草谱广、低毒、活性高和环境相容性好等优点，其发挥活性作用的速度比百草枯慢而优于草甘膦，成为与草甘膦和百草枯并存的非选择性除草剂，应用前景广阔。草铵膦又称草丁膦，化学名为4-[羟基(甲基)膦酰基]-DL-高丙氨酸或2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸铵，为白色结晶，有轻微气味。熔点为210℃，760mmHg下沸点为519.1℃。易溶于水，22℃时在水中溶解度为1370g/L，在常见的有机溶剂中溶解度较低。草铵膦具有手性，通常生产的是L型和D型的外消旋体，后续研究发现只用L-草铵膦具有除草作用，而D型则几乎无活性。若制成仅有L-草铵膦纯光学异构体的产品进行使用，可使草铵膦的用量减少一半，提高经济性、降低使用成本减轻环境压力。
草铵膦的合成主要分为化学合成法和生物酶法两大类：化学合成法主要以甲基二氯化磷或亚磷酸酯为起始原料，通过烷基化、重排、氰胺化、铵化、酸解、纯化等一系列的反应最终生成磷酸酯，然后与某些氨基衍生物发生反应制得草铵膦。但是化学合成L-草铵膦通常步骤冗长，合成路线复杂，产率和对映体选择性比较低。而相比于化学合成法生成L-草铵膦，生物酶法生成L-草铵膦具有反应条件温和、收率高、产物易分离纯化且具有严格的立体选择性等优点，因此研究生物酶法生产L-草铵膦具有十分重要的产业价值和显著的社会效益。
转氨酶(Transaminase)是可逆催化氨基转移的一类酶。能够催化手性胺的不对称合成，通过胺基从胺供体转移到酮或醛受体，以PLP为辅因子。根据折叠类型，PLP依赖性酶分为7大类，转氨酶属于折叠类型I和IV。转氨酶主要用于手性胺、手性氨基酸，这些手性化合物常作为药品的活性成分或主要中间体被使用，例如，广谱触杀型除草剂草铵膦、治疗糖尿病药物的西他列汀以及抗生素青霉素等，在制药业、农业、化工业都有重要的作用。转氨酶催化的转氨反应主要分为动力学拆分和不对称合成，以酮酸为底物的不对称合成生产非天然氨基酸具有100％理论产率，对映选择性高，催化活力好的优点。但是目前在利用转氨酶合成L-草铵膦的工艺中存在热力学平衡、产物转化率低、酶活性低、底物耐受性差等问题，不利于转氨酶合成L-草铵膦工艺的工业化生产。且目前报导的用于不对称合成L-草铵膦的转氨酶是基于活力筛选的，稳定性及底物耐受性不是首要考虑因素。
发明内容
本发明提供了一种催化活力高、底物浓度和有机溶剂耐受性高的ω-转氨酶突变体，其通过以下技术方案实现：
一种来源于嗜热假单胞菌(Pseudomonas thermotolerans)的ω-转氨酶突变体，所述ω-转氨酶突变体由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第23位的组氨酸取代为丙氨酸，第43位的酪氨酸取代为天冬氨酸，第128位的精氨酸取代为丝氨酸，第214位的苯丙氨酸取代为半胱氨酸得到。
所述SEQ ID NO.1所示氨基酸序列对应的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
作为优选，所述ω-转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
由于氨基酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在80％以上，均属于本发明保护范围之列。所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
作为进一步优选，所述ω-转氨酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.4所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有80％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的突变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的突变体可以是等位变异体或非等位变异体，如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变编码氨基酸的功能。
一种包含有上述ω-转氨酶突变体的编码基因的重组质粒。
所述重组质粒是将ω-转氨酶突变体的编码基因插入pET28a(+)载体得到。
一种包含有上述ω-转氨酶突变体的编码基因的重组基因工程菌。
所述重组基因工程菌是将重组质粒转化进宿主菌细胞获得的，所述宿主菌包括E.coli BL21(DE3)细胞或能表达该酶的宿主细胞。
作为优选，所述重组基因工程菌还含有氨基酸脱氢酶GluDH和乙醇脱氢酶ADH的编码基因。
上述ω-转氨酶突变体在生物催化2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸不对称合成L-草铵膦中的应用。
一种L-草铵膦制备方法，将包含有ω-转氨酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎后经镍柱纯化得到的纯酶液作为催化剂，以2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸为底物，以磷酸吡哆醛为辅酶，以L-谷氨酸为氨基供体，于pH6.0～10.0缓冲液中构成转化体系，在25～75℃、400～600r/min条件下反应，得到反应液，反应液经分离纯化得到L-草铵膦。
作为优选，催化剂加入量为1-10U/mL，进一步优选为4U/mL；辅酶用量为0.02～25mM，进一步优选为0.1～2mM，更优选为1mM；底物PPO的初始浓度为10～160mM，优选为20～100mM，更优选为20mM；氨基供体加入量为30～100mM，优选为60mM；所述反应介质优选pH8.0的50mM PB缓冲液。
一种L-草铵膦制备方法，将包含有ω-转氨酶突变体编码基因、氨基酸脱氢酶GluDH和乙醇脱氢酶ADH的编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸为底物，L-谷氨酸氨基供体，异丙醇为辅底物，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为氧化还原辅因子，加入磷酸吡哆醛，于pH6.0～8.0的缓冲液为反应介质构成反应体系，在35～55℃反应8～24h，得到反应液，反应液分离纯化得到L-草铵膦。
本发明乙醇脱氢酶ADH可以为本领域已知的任何具有催化辅因子NAD+发生氧化反应，生成NADH的脱氢酶，实现氧化还原辅因子循环，该反应需要辅底物的存在。
本发明所述ω-转氨酶突变体、谷氨酸脱氢酶、乙醇脱氢酶的加入形式可以为纯化的酶，超声破碎的粗酶液，湿菌体，固定化的菌体，固定化的酶，完整的发酵液或其任意组合。
作为优选，反应条件为50℃反应10h。
作为优选，反应pH值优选为7.0～8.0，更优选pH值为8.0。优选pH值为6.5～8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，pH值为8.0～9.5的Tris-盐酸缓冲液，更优选为pH值为8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。
作为优选，所述氨基供体还包括硫酸铵或甲酸铵中的一种。
所述反应体系中，催化剂加入终浓度以湿菌体重量计为5～50g/L，优选为10～15g/L；底物加入终浓度为50～300mM，优选为50mM；所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸加入终浓度为0.05～1.0mM，优选为0.1mM；所述磷酸吡哆醛加入终浓度为0.05～1.0mM，优选0.1mM；所述氨基供体L-谷氨酸加入终浓度为5～100mM，优选10mM。所述氨基供体硫酸铵或甲酸铵加入终浓度为20～300mM，优选75mM。所述异丙醇加入终浓度为25～300mM，优选65mM。
本发明相较于现有技术具有以下有益效果：
本发明提供了一种新的ω-转氨酶突变体，酶活可达45.53U/mg。该突变体对草铵膦前体酮酸PPO具有较高的催化活力，可催化底物PPO转化为L-草铵膦，200mM底物反应3h，底物转化率为88.58％，产物ee>99.9％，相比较于野生型，ω-转氨酶突变体对PPO的特异性活性提高了1.8倍，其最适反应温度为55℃，最适pH为8.0，为耐高温嗜热稳定性较好的菌株。此外，在本发明中，还采用了三酶级联法，GluDH及ADH的引入提高了转化效率，可催化底物PPO转化为L-草铵膦，300mM底物反应10h，底物转化率为100％，产物ee>99.9％，在生产L-草铵膦中具有较好的应用前景。
序列描述
SEQ ID NO.1为来源于嗜热假单胞菌Pseudomonas thermotolerans的ω-转氨酶ω-TA的氨基酸序列。
SEQ ID NO.2为来源于嗜热假单胞菌Pseudomonas thermotolerans的ω-转氨酶ω-TA的核苷酸序列。
SEQ ID NO.3为来源于嗜热假单胞菌Pseudomonas thermotolerans的ω-转氨酶ω-TA突变后的氨基酸序列。
SEQ ID NO.4为来源于嗜热假单胞菌Pseudomonas thermotolerans的ω-转氨酶ω-TA突变后的核苷酸序列。
SEQ ID NO.5为来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌Geobacillus stearothermophilus的谷氨酸脱氢酶GluDH的氨基酸序列。
SEQ ID NO.6为来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌Geobacillus stearothermophilus的谷氨酸脱氢酶GluDH的核苷酸序列。
SEQ ID NO.7为来源于红球菌Rhodococcus ruber的乙醇脱氢酶ADH的氨基酸序列。
SEQ ID NO.8为来源于红球菌Rhodococcus ruber的乙醇脱氢酶ADH的核苷酸序列。
附图说明
图1为实施例2中ω-转氨酶及突变体易错PCR产物的凝胶电泳图：泳道M为DNA分子量Marker，泳道1为ω-转氨酶PtTA，泳道2为ω-转氨酶突变体PtTA-H23A-Y43D-R128S-F214C。
图2为实施例4、5镍柱纯化前后野生型ω-转氨酶及突变体的SDS-PAGE图：泳道M为蛋白质分子量Marker，泳道1为纯化前的ω-转氨酶PtTA，泳道2为纯化后ω-转氨酶PtTA，泳道3为纯化前的ω-转氨酶突变体PtTA-H23A-Y43D-R128S-F214C，泳道4为纯化后ω-转氨酶突变体PtTA-H23A-Y43D-R128S-F214C。
图3为ω-转氨酶突变体的最适温度示意图。
图4为ω-转氨酶突变体的温度稳定性示意图。
图5为ω-转氨酶突变体的最适pH示意图。
图6为ω-转氨酶突变体的pH稳定性示意图。
图7为ω-转氨酶突变体的底物转化率示意图。
图8为不同浓度氨基供体对ω-转氨酶突变体的转化率影响示意图。
图9为转氨酶催化PPO生成L-草铵膦的反应式。
图10构建完成的pET-28a-PtTA-H23A-Y43D-R128S-F214C-GluDH-ADH质粒图谱。
图11三酶级联体系全细胞不对称合成L-草铵膦的反应进程。
具体实施方式
下面结合说明书附图以及具体实施例对本发明做进一步描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明实施例所用LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为蒸馏水，pH值7.0。LB平板组成是在LB液体培养基中添加20g/L的琼脂。
实施例1：ω-转氨酶基因PtTA的来源和基因克隆
PtTA(Genbank accession：WP_017938159.1)的扩增以Pseudomonasthermotolerans的基因组为模板进行PCR，扩增引物如表1所示，PCR程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min 30s，共35个循环，最后72℃延伸10min。通过PCR扩增得到ω-转氨酶PtTA(氨基酸序列为SEQ ID No.1所示，核苷酸序列SEQ ID No.2所示)。将扩增的PtTA导入载体pET28a(保留载体本身的His-Tag基因)的NcoI与XhoI之间，构建表达载体pET28a-PtTA；再将表达载体pET28a-PtTA转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(Invitrogen)中(42℃，90s)，涂布于含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB平板，37℃下培养12～14h，随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定，测序结果准确无误。筛选获得含有表达重组质粒pET28a-PtTA的野生型重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-PtTA。
表1、引物
实施例2：ω-转氨酶PtTA基因突变体库的构建
1、随机突变引物设计
据实施例1获得的ω-转氨酶PtTA基因(SEQ ID NO.2所示)，通过随机突变技术来进一步提高ω-转氨酶活性。根据PtTA基因序列，设计随机突变引物。设计的引物如表2所示。
表2、引物
2、重组基因工程突变菌株
首先以重组载体pET28a-PtTA为模板，利用表1引物，采用QuikChange诱变试剂盒(购自Vazyme，中国南京)，利用易错PCR技术进行随机突变，得到重组质粒PtTA-H23A-Y43D-R128S-F214C。
易错PCR反应体系如下(总体积50μL)：10×DNAPolymerase Buffer 5μL，10mMdNTP mixture(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)1μL，浓度均为50μM的正向引物、反向引物各0.5μL，模板DNA 1μL，DNA Polymerase 0.5μL，5mM Mn2+4μL，ddH2O 36.5μL。
用BioRad的PCR仪，PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火15s，72℃延伸1min 30s，共32个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物进行DNA琼脂糖凝胶电泳阳性验证(如图2)，条带单一，大小符合理论值，将PCR产物在37℃，200r/min下进行Dpn I酶消化模板1h，用DNA回收纯化试剂盒(购自Axygen公司)对产物进行纯化，具体步骤参照纯化试剂盒说明书。
取5μL纯化后的PCR产物，加入到100μL冰浴的E.coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中，冰上静置10min，将转化产物于42℃热击90s，迅速置于冰上冷却5min，向管中加入600μL的LB液体培养基，37℃，200r/min培养60min，取100μL上述菌液均匀涂布于含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，待菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养12h，挑取单菌落、验证为阳性克隆后，接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB试管培养基，37℃，200r/min培养12h，获得重组基因工程突变菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-PtTA-H23A-Y43D-R128S-F214C。
实施例3：ω-转氨酶的诱导表达
将实施例1中的出发菌株E.coli BL21(DE3)-pET28a/PtTA和实施例2中的突变菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-PtTA-H23A-Y43D-R128S-F214C分别接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃、200rpm下培养8～10h，培养液再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃、150rpm下培养至菌体OD600达0.6～0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导ω-转氨酶蛋白表达，28℃下诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集湿菌体，即获得含有表达重组质粒的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a/PtTA及其突变体的湿菌体，该菌体可直接作为生物催化剂或者用于蛋白纯化。
实施例4：ω-转氨酶的超声破碎
分别取实施例3方法制备的各个湿菌体1g悬浮在10mL的50mM PB缓冲液(pH 8.0)中，超声破碎细胞。破碎条件：超声35W，超声2s，间歇2s，有效时间为10min，破碎过程置于冰浴中完成。4℃，8000rpm离心10min，获得上清液，即为ω-转氨酶PtTA及其突变体的粗酶液，SDS-PAGE图见图2的泳道1和泳道3。
实施例5：ω-转氨酶的蛋白纯化
采用蛋白层析仪系统(Biologic LP)，选用Ni-NTA亲和柱(40×12.6mm，Bio-Rad，USA)分离纯化实施例4制备的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-PtTA及其突变体的粗酶液作为上样液，纯化步骤如下:
(1)缓冲液配置：
缓冲液A(Binding buffer)：20mM Na2HPO4-NaH2PO4，300mM NaCl，pH8.0，增加洗脱柱对核酸的结合活性；
缓冲液B(Elution buffer)：20mM Na2HPO4-NaH2PO4，300mM NaCl，500mM咪唑，pH8.0，把DNA从柱子上洗脱下来；
缓冲液C(Washing buffer)：20mM Na2HPO4-NaH2PO4，300mM NaCl，20mM咪唑，pH8.0，洗掉柱子里除核酸物质以外的杂质；缓冲液于冰浴中预冷。
(2)装柱平衡：将Ni-NTA柱安装在蛋白层析仪系统(Biologic LP)，先用超纯水冲洗整个系统，再用缓冲液A冲洗Ni-NTA柱，流速为2mL/min，直至蛋白层析仪标线平稳不变；
(3)上样：将粗酶液以2mL/min的流速泵入步骤(2)的Ni-NTA柱，上样量为10mL，注意不要进入气泡；
(4)杂蛋白洗脱：步骤(3)上样结束后，用缓冲液C以2mL/min的流速洗脱10个柱体积，除去未结合完全的蛋白；
(5)洗脱目的蛋白：步骤(4)洗脱结束后，用缓冲液B以2mL/min的速度洗脱10个柱体积，洗脱目的蛋白，根据蛋白层析仪紫外检测器的信号响应检测OD280的值，当OD280到达0.25并上升时开始收集洗脱液，OD280降为0.25时停止收集；
(6)透析：步骤(5)收集的洗脱液于透析袋(MD44，MW：8000)在pH 8.0，4℃，PBS缓冲液中透析24h，每6h换一次缓冲液，截留液即为纯酶液，-80℃低温保存。
对获得的目的蛋白进行SDS-PAGE，结果如图2中泳道2和泳道4所示，ω-转氨酶PtTA及其突变体蛋白在大肠杆菌中表达，单一条带，该带有6×his-tag的转氨酶理论分子量为46.0kDa。
实施例6：ω-转氨酶及其突变体酶活测定
(1)酶活检测标准条件：20mM PPO，100mM L-Glu，1mM PLP，适量实施例5方法制备的各个纯酶液(稀释至适当浓度)，pH 8.0，50mM的PB缓冲液为反应介质构成1mL反应体系，于30℃、600rpm反应10min，加入5μL 6M的HCl终止反应。
(2)衍生化试剂：使用0.1M硼酸盐缓冲液(pH 9.8)将含有0.1g邻苯二甲醛和0.12gN-乙酰基-L-半胱氨酸的10mL无水乙醇溶液定容至50mL。
(3)酶活检测：将步骤(1)反应液经12000rpm，4℃离心1min，取100μL上清液用900μL超纯水稀释后，取200μL稀释液与衍生化试剂按体积比1：2混合，并在30℃下衍生化反应5min，然后经0.22μm膜过滤后，滤液采用HPLC检测分析底物PPO和产物L-PPT的浓度，分别计算PPO的转化率和L-PPT的产率。
酶活单位(U)定义：在上述标准条件下，每分钟生成1μmol L-PPT所需的酶量定义为1个酶活单位U。比酶活定义为每毫克酶蛋白所具有的活力单位数，为U/(mgprotein)。
ω-转氨酶酶活如表3所示，结果表明突变体Mut-H23A-Y43D-R128S-F214C的酶活相比出发菌株提高1.5倍。
表3、ω-转氨酶酶活测定
底物PPO液相检测条件：使用Ultimate 3000高效液相色谱系统(ThermoFisher,Dionex,USA)，色谱柱C18(4.6×250mm，5μm，100A)柱，流动相：50mM磷酸二氢铵溶液(磷酸二氢铵溶液：称取5.75g磷酸二氢铵溶于800mL超纯水中，加入1.0g四丁基氢氧化铵，用磷酸调pH到3.8，定容至1L)与乙腈的体积比为88:12。流速为1mL/min，紫外检测波长为232nm，进样量10μL，柱温箱40℃，PPO保留时间为9.7min。
产物L-PPT液相检测条件：采用使用Ultimate 3000高效液相色谱系统(ThermoFisher,Dionex,USA)，配备荧光检测器(UltiMate FLD-3100)，色谱柱C18柱(4.6×250mm，5μm，China)；流动相：甲醇：0.05M乙酸铵(pH 5.7)，体积比为10：90；流速1.0mL/min；检测波长Ex＝340nm、Em＝450nm；进样量10μL；柱温35℃。L-PPT的保留时间为13.6min。
L-PPT非对映体过量e.e.值计算公式如下所示：
式中，CL-PPT和CD-PPT分别表示产物L-PPT和D-PPT的摩尔浓度。
实施例7：确定催化ω-转氨酶突变体的最适温度
将实施例5方法制备的E.coli BL21(DE3)/pET28a-PtTA-H23A-Y43D-R128S-F214C纯酶液作为催化剂，反应体系(1mL)组成：终浓度20mM的底物PPO，100mM L-Glu，1mM PLP，适量的纯酶液(稀释至适当浓度)，反应介质为pH 8.0、PB缓冲液。置于不同温度(30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃)下反应，加入5μL 6M的HCl终止反应，其它操作同实施例6所述方法进行酶活测试，以ω-转氨酶突变体酶活最高时定义为100％，ω-转氨酶突变体最适温度结果见图3。ω-转氨酶突变体E.coli BL21(DE3)/pET28a-PtTA-H23A-Y43D-R128S-F214C在30℃-55℃时活性逐渐升高，55℃～70℃时活性逐渐降低，55℃时获得最大活性。
实施例8：ω-转氨酶突变体的温度稳定性
将实施例5中的纯酶液E.coli BL21(DE3)/pET28a-PtTA-H23A-Y43D-R128S-F214C作为催化剂，测定酶的温度稳定性，具体操作如下：将纯酶液分别于不同温度40～65℃(40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃)的PB缓冲液中下进行孵育6h，测定残余酶活，残余酶活定义为：测定与初始酶活的百分比。结果显示，突变体在40℃下孵育6h，残余酶活92％；在最适温度55℃下孵育6h，残余酶活84.4％。表明E.coli BL21(DE3)/pET28a-PtTA-H23A-Y43D-R128S-F214C酶具有良好的温度稳定性。
实施例9：确定催化ω-转氨酶突变体的最适pH
将实施例5方法制备的E.coli BL21(DE3)/pET28a-PtTA-H23A-Y43D-R128S-F214C纯酶液作为催化剂，反应体系(1mL)组成：终浓度20mM的底物PPO，100mM的L-Glu，1mM PLP，适量的纯酶液(稀释至适当浓度)，反应介质为不同pH的缓冲液，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(磷酸缓冲液，PB buffer，pH6.0-8.0)，Tris-盐酸缓冲液(Tris-HCl buffer，pH 7.0-9.0)，硼酸钠-氢氧化钠缓冲液(Na2B4O7-NaOH buffer，pH 9.0-10.0)。置于40℃、600rpm的恒温金属浴中反应10min，用5μL 6M HCl终止反应。其它操作按实施例6所述方法进行酶活测试，以ω-转氨酶突变体酶活最高时定义为100％，ω-转氨酶突变体最适pH结果见图5所示。ω-转氨酶突变体E.coli BL21(DE3)/pET28a-PtTA-H23A-Y43D-R128S-F214C在pH 6.0～8.0时上升，pH 8.0～10.0时开始下降，pH 8.0时酶活最好。
实施例10：ω-转氨酶突变体的pH稳定性
将实施例5中的纯酶液E.coli BL21(DE3)/pET28a-PtTA-H23A-Y43D-R128S-F214C作为催化剂，测定酶的pH稳定性，具体操作如下：适量酶液在不同pH的缓冲液，冰上孵育24h。具体操作如下：1mL的pH 7.0～9.0缓冲液中，加入20mM PPO、100mM L-Glu、1mM PLP和适量的纯酶液(稀释至适当浓度)。同实施例6方法测定不同pH下的酶活，结果见图6。ω-转氨酶突变体E.coli BL21(DE3)/pET28a-PtTA-H23A-Y43D-R128S-F214C在最适pH 8.0下孵育24h后，酶活保存88％，说明酶的pH稳定性较好。
实施例11：ω-转氨酶突变体催化制备L-草铵膦
以实施例5方法制备的E.coli BL21(DE3)/pET28a-PtTA-H23A-Y43D-R128S-F214C的湿菌体为催化剂，以PPO为底物，不对称合成L-草铵膦，反应体系(10mL)组成：200mM PPO，700mM L-Glu，1mM PLP，湿菌体20g/L，反应介质为pH 8.0，50mM的PB缓冲液，在40℃、600rpm下反应，分别于0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h和3h取200μL转化液，将转化液按实施例6所述HPLC检测底物PPO的浓度。结果如图7所示，反应2h时ω-转氨酶突变体的转化率为88.58％，而野生型ω-转氨酶的转化率只有49.21％。
实施例12：ω-转氨酶突变体在不同氨基供体浓度条件下制备L-草铵膦
以实施例5方法制备的E.coli BL21(DE3)/pET28a-PtTA-H23A-Y43D-R128S-F214C的湿菌体为催化剂，以PPO为底物，不对称合成L-草铵膦，反应体系(10mL)组成：200mM PPO，1mM PLP，湿菌体20g/L，分别加入不同浓度的L-Glu(200mM、400mM、600mM、800mM和1M)，反应介质为pH 8.0、50mM的PB缓冲液，在40℃、600rpm下反应，分别于0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h和3h取200μL转化液，同实施例6方法检测底物PPO的浓度。结果如图8所示，随着L-Glu用量的增加，L-PPT的产量也随之增加，L-Glu与底物PPO的最佳配比为5:1。
实施例13：重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-PtTA-H23A-Y43D-R128S-F214C-GluDH-ADH的构建
扩增实验室保藏的来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)的注释为谷氨酸脱氢酶GluDH(GenBank编号:CP016552.1)的序列(氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示)与来源于红球菌Rhodococcus ruber的注释为乙醇脱氢酶ADH(GenBank编号:WP_159419335.1)的序列(氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示)，同时插入质粒pET-28a-PtTA-H23A-Y43D-R128S-F214C中，得到pET-28a-PtTA-H23A-Y43D-R128S-F214C-GluDH-ADH；测序验证无误后将pET-28a-PtTA-H23A-Y43D-R128S-F214C-GluDH-ADH转入表达宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中构建重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-PtTA-H23A-Y43D-R128S-F214C-GluDH-ADH，用于共表达PtTA,GluDH和ADH。共表达质粒构建引物如表4所示。
表4、引物
实施例14：三酶级联体系全细胞不对称合成L-草铵膦的反应进程
以实施例13方法制备的E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-PtTA-H23A-Y43D-R128S-F214C-GluDH-ADH共表达湿菌体为催化剂，以PPO为底物，不对称合成L-草铵膦，反应体系10mL：300mM PPO，0.1mM PLP，0.1mM NAD+，450mM(NH4)2SO4，390mM异丙醇，20mM L-Glu，反应介质为pH 8.0、50mM的PB缓冲液在50℃、600rpm下反应，反应24h，分别于2h、4h、6h、8h、10h、12h和24h取200μL转化液，同实施例6方法检测底物PPO的浓度。结果见图11所示，在优化的反应体系下，底物浓度提升至300mM，反应在10h时，终产率达到100％，将300mM PPO完全转化为L-草铵膦。
由以上实验结果可知，本发明得到的含有ω-转氨酶基因的重组大肠杆菌具有较高的酶活力可以作为高效的全细胞催化剂，利用PPO为底物，进行生物催化不对称合成高光学纯的农药L-草铵膦。
Claims (10)
1.一种来源于嗜热假单胞菌(Pseudomonas thermotolerans)的ω-转氨酶突变体，其特征在于，所述ω-转氨酶突变体由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第23位的组氨酸取代为丙氨酸，第43位的酪氨酸取代为天冬氨酸，第128位的精氨酸取代为丝氨酸，第214位的苯丙氨酸取代为半胱氨酸得到。
2.根据权利要求1所述的ω-转氨酶突变体，其特征在于，所述ω-转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求2所述的ω-转氨酶突变体，其特征在于，所述ω-转氨酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.一种包含有权利要求1所述的ω-转氨酶突变体的编码基因的重组质粒。
5.一种包含有权利要求1所述的ω-转氨酶突变体的编码基因的重组基因工程菌。
6.根据权利要求5所述的重组基因工程菌，其特征在于，所述重组基因工程菌还含有氨基酸脱氢酶GluDH和乙醇脱氢酶ADH的编码基因。
7.一种权利要求1所述ω-转氨酶突变体在微生物催化2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸不对称合成L-草铵膦中的应用。
8.一种L-草铵膦制备方法，其特征在于，以权利要求5所述的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎后经镍柱纯化得到的纯酶液作为催化剂，2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸为底物，磷酸吡哆醛为辅酶，L-谷氨酸为氨基供体，于pH6.0～10.0缓冲液中构成转化体系，在25～75℃、400～600r/min条件下反应，得到反应液，反应液经分离纯化得到L-草铵膦。
9.一种L-草铵膦制备方法，其特征在于，以权利要求6所述的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸为底物，L-谷氨酸氨基供体，异丙醇为辅底物，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为氧化还原辅因子，加入磷酸吡哆醛，于pH6.5～8.0的缓冲液为反应介质构成反应体系，在35～55℃反应8～24h，得到反应液，反应液经分离纯化得到L-草铵膦。
10.根据权利要求9所述的L-草铵膦制备方法，其特征在于，所述氨基供体还包括硫酸铵或甲酸铵中的一种。
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