CN114921432B - 一种转氨酶突变体及其工程菌与应用 - Google Patents

一种转氨酶突变体及其工程菌与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种转氨酶突变体及其工程菌与应用，所述转氨酶突变体由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第241位氨基酸经单点突变而获得。本发明提供了一种来源于沙门氏菌新的高活力转氨酶突变体，酶活可达79.81U/(mg蛋白)。所述转氨酶突变体能够生物催化2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]‑丁酸制备L‑草铵膦，200mM底物反应3h，底物转化率为83.19％，产物ee>99.9％，相比于原始酶，转化率提高了2.23倍，在生产L‑草铵膦中具有较好的应用前景。

Description

一种转氨酶突变体及其工程菌与应用
(一)技术领域
本发明涉及一种S型转氨酶突变体及其编码基因，以及其在微生物催化底物2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸不对称合成L-草铵膦中的应用。
(二)背景技术
草铵膦是由原德国艾格福公司(后归属拜耳公司)在20世纪80年代开发成功的一种广谱触杀型灭生性除草剂。草铵膦属于膦酸类除草剂，能够抑制植物氮代谢途径中的谷氨酰胺合成酶，从而干扰植物的代谢，使植物死亡。
草铵膦具有杀草谱广、低毒、活性高和环境相容性好等特点，其发挥活性作用的速度比百草枯慢而优于草甘膦，成为与草甘膦和百草枯并存的非选择性除草剂，应用前景广阔。许多杂草对草铵膦敏感，在草甘膦产生抗性的地区可以作为草甘膦的替代品使用。外消旋草铵膦才具有除草活性，且能在土壤微生物的作用下迅速降解。草铵膦的半衰期约为3-7天，对人畜毒性小，对环境破坏力小。若只使用仅含L-构型草铵膦(L-PPT)的产品，不仅使草铵膦的用量降低50％，减少药害，同时也减缓了杂草产生抗药性的进程，延长农药的使用寿命。由此，越来越多的研究转向了L-构型草铵膦的生产。
L-PPT的合成方法主要分为化学法和生物法。化学法合成L-PPT主要分为低温定向合成法、不对称催化加氢合成法、不对称氰基加成法、不对称Michael加成反应。化学法具有原子经济性高的特点，但其反应条件往往比较苛刻，对设备的要求比较高。生物法不对称合成L-PPT因具有立体选择性高、反应条件温和以及环境污染小等优点而备受关注。迄今为止，尽管化学法合成L-PPT的方法很普遍。但是化学合成L-PPT通常步骤冗长，合成路线复杂，产率和对映体选择性比较低。相比与化学法合成L-PPT，生物酶法具有严格的立体选择性、催化体系简单、催化条件温和、产率高及产物易于分离纯化等优点，研究生物酶法生产L-PPT的路线具有十分重要的产业价值和显著的社会效益。
L-PPT的生物合成一般分为两种策略，即动力学拆分和不对称合成，其中酰胺酶、脱乙酰酶、脱氢酶和转氨酶参与其中。由于能够产生纯净的异构体和100％的理论产率，不对称合成L-PPT在工业应用中更具竞争力。
转氨酶(TA)是一类依赖PLP的酶，能够催化氨基供体和氨基受体之间的氨基转移。根据转移氨基的位置，转氨酶大致可分为α-TAs(催化α-碳上的氨基转移)和ω-TAs(反应中转移的氨基距离羧基较远)。Mehta等人根据序列和结构相似性将转氨酶分类，并将其分为6个亚组或类别，I类和II类包括L-天冬氨酸转氨酶和L-丙氨酸转氨酶、III类ω-转氨酶、IV类D-氨基酸转氨酶和支链转氨酶(BCAT)、V类L-丝氨酸转氨酶和VI类糖转氨酶。转氨酶催化反应一般是经过两步实现。首先转氨酶通过转氨作用将氨基供体上的氨基转移到辅酶PLP的羰基上，形成5-磷酸吡哆胺(PMP)和与氨基供体对应的酮；然后PMP上的氨基在同一转氨酶的催化作用下转移到氨基受体上，实现产物胺化合物的生成，而PMP又转变为PLP。转氨酶主要用于手性胺、手性氨基酸、手性氨基醇等的合成，这些手性化合物常作为药品的活性成分或主要中间体被使用，例如，广谱触杀型除草剂草铵膦、治疗糖尿病药物的西他列汀及抗生素青霉素等，在制药工业、农业、化工业都有重要的作用。
Schulz A等利用从E.coli K-12中分离到的γ-氨基丁酸转氨酶，以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰胺)-丁酸(PPO)为底物，L-谷氨酸作为氨基供体，利用γ-氨基丁酸转氨酶生产L-草铵膦，产物最高浓度可达76.1g/L(Stereospecificproduction of the herbicidephosphinothricin(glufosinate)by transamination:isolation and characterizationof a phosphinothricin-specific transaminasefrom Escherichia coli[J].Appliedand Environmental Microbiology，1990，56(1):1-6.)。将转氨酶固定在环氧载体上，连续催化20g/L的PPO，L-PPT的最高产率可达90％，L-PPT的ee值超过99.9％。Bartsch K等筛选取得了能够特异性转化2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的草酰乙酸转氨酶。当底物浓度为552mmol/L，高温(80℃)下保温4h，在该草酰乙酸转氨酶的催化下，反应转化率达到了75％，L-天冬氨酸完全转化(Klaus Bartsch.Process for the preparation of L-phosphinothricine by enzymatic transamination with aspartate[P].：US6936444,2005-08-30.)。
虽然已有许多转氨酶应用于不对称合成手性胺中，转氨酶对于L-草铵膦的合成极具应用价值，但是目前在利用转氨酶合成L-草铵膦的工艺中存在热力学平衡、产物转化率低、酶活性低、底物耐受性差等问题，不利于转氨酶合成L-草铵膦工艺的工业化生产。
因此在该背景下，本发明提出通过基因挖掘技术筛选新型转氨酶重组酶，并通过蛋白质工程技术进行分子改造，将优势突变体催化剂应用于不对称合成L-草铵膦，对改善转氨酶酶活性低、提高L-草铵膦的产率以及降低生产成本具有重要意义。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种具有优良催化活力和底物耐受性的新型转氨酶突变体及其编码基因与在不对称合成L-草铵膦中的应用，解决现有转氨酶合成L-草铵膦过程中酶活性低、产物转化率低以及底物耐受性差等问题。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种来源于沙门氏菌(Salmonella enterica)的转氨酶突变体，所述转氨酶突变体由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第241位氨基酸经单点突变而获得。SEQ IDNO.1所示氨基酸序列对应的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.1：
MNTNNALMQRRHNAVPRGVGQIHPIFAERAENCRVWDVEGREYLDFAGGIAVLNTGHLHPGIVSAVEAQLKKLSHTCFQVLAYEPYLALCERMNQKVPGDFAKKTLLVTTGSEAVENAVKIARAATKRSGAIAFSGAYHGRTHYTLSLTGKVHPYSAGMGLMPGHVYRALYPCPLHNISDDDAIASIERIFKNDAAPEDIAAIIIEPVQGEGGFYAASPAFMQRLRALCDQHGIMLIADEVQSGAGRTGTLFAMEQMGVAADITTFAKSIAGGFPLAGVTGRADVMDAIAPGGLGGTYAGNPIACAAALAVLDIFEQENLLQKANTLGNTLRDGLMEIAETHREIGDVRGLGAMIAIELFENGDPGKPNAALTADIVTRAREKGLILLSCGPYYNILRILVPLTIEASQIRQGLEIIAQCFDEAKQA。
SEQ ID NO.2：
ATGAACACCAACAACGCTCTGATGCAGCGTCGTCACAACGCTGTTCCGCGTGGTGTTGGTCAGATCCACCCGATCTTCGCTGAACGTGCTGAAAACTGCCGTGTTTGGGACGTTGAAGGTCGTGAATACCTGGACTTCGCTGGTGGTATCGCTGTTCTGAACACCGGTCACCTGCACCCGGGTATCGTTTCTGCTGTTGAAGCTCAGCTGAAAAAACTGTCTCACACCTGCTTCCAGGTTCTGGCTTACGAACCGTACCTGGCTCTGTGCGAACGTATGAACCAGAAAGTTCCGGGTGACTTCGCTAAAAAAACCCTGCTGGTTACCACCGGTTCTGAAGCTGTTGAAAACGCTGTTAAAATCGCTCGTGCTGCTACCAAACGTTCTGGTGCTATCGCTTTCTCTGGTGCTTACCACGGTCGTACCCACTACACCCTGTCTCTGACCGGTAAAGTTCACCCGTACTCTGCTGGTATGGGTCTGATGCCGGGTCACGTTTACCGTGCTCTGTACCCGTGCCCGCTGCACAACATCTCTGACGACGACGCTATCGCTTCTATCGAACGTATCTTCAAAAACGACGCTGCTCCGGAAGACATCGCTGCTATCATCATCGAACCGGTTCAGGGTGAAGGTGGTTTCTACGCTGCTTCTCCGGCTTTCATGCAGCGTCTGCGTGCTCTGTGCGACCAGCACGGTATCATGCTGATCGCTGACGAAGTTCAGTCTGGTGCTGGTCGTACCGGTACCCTGTTCGCTATGGAACAGATGGGTGTTGCTGCTGACATCACCACCTTCGCTAAATCTATCGCGGGCGGCTTCCCGCTGGCTGGCGTTACCGGTCGTGCTGACGTTATGGACGCTATCGCTCCGGGTGGTCTGGGTGGTACCTACGCTGGTAACCCGATCGCTTGCGCTGCTGCTCTGGCTGTTCTGGACATCTTCGAACAGGAAAACCTGCTGCAGAAAGCTAACACCCTGGGTAACACCCTGCGTGACGGTCTGATGGAAATCGCTGAAACCCACCGTGAAATCGGTGACGTTCGTGGTCTGGGTGCTATGATCGCTATCGAACTGTTCGAAAACGGTGACCCGGGTAAACCGAACGCTGCTCTGACCGCTGACATCGTTACCCGTGCTCGTGAAAAAGGTCTGATCCTGCTGTCTTGCGGTCCGTACTACAACATCCTGCGTATCCTGGTTCCGCTGACCATCGAAGCTTCTCAGATCCGTCAGGGTCTGGAAATCATCGCTCAGTGCTTCGACGAAGCTAAACAGGCT。
优选的，所述转氨酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示(第241位的缬氨酸取代为异亮氨酸(V241I)。
SEQ ID NO.3：
MNTNNALMQRRHNAVPRGVGQIHPIFAERAENCRVWDVEGREYLDFAGGIAVLNTGHLHPGIVSAVEAQLKKLSHTCFQVLAYEPYLALCERMNQKVPGDFAKKTLLVTTGSEAVENAVKIARAATKRSGAIAFSGAYHGRTHYTLSLTGKVHPYSAGMGLMPGHVYRALYPCPLHNISDDDAIASIERIFKNDAAPEDIAAIIIEPVQGEGGFYAASPAFMQRLRALCDQHGIMLIADEIQSGAGRTGTLFAMEQMGVAADITTFAKSIAGGFPLAGVTGRADVMDAIAPGGLGGTYAGNPIACAAALAVLDIFEQENLLQKANTLGNTLRDGLMEIAETHREIGDVRGLGAMIAIELFENGDPGKPNAALTADIVTRAREKGLILLSCGPYYNILRILVPLTIEASQIRQGLEIIAQCFDEAKQA。
由于氨基酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在95％以上，均属于本发明保护范围之列。所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
本发明还涉及所述转氨酶突变体的编码基因。优选的，所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
SEQ ID NO.4：
ATGAACACCAACAACGCTCTGATGCAGCGTCGTCACAACGCTGTTCCGCGTGGTGTTGGTCAGATCCACCCGATCTTCGCTGAACGTGCTGAAAACTGCCGTGTTTGGGACGTTGAAGGTCGTGAATACCTGGACTTCGCTGGTGGTATCGCTGTTCTGAACACCGGTCACCTGCACCCGGGTATCGTTTCTGCTGTTGAAGCTCAGCTGAAAAAACTGTCTCACACCTGCTTCCAGGTTCTGGCTTACGAACCGTACCTGGCTCTGTGCGAACGTATGAACCAGAAAGTTCCGGGTGACTTCGCTAAAAAAACCCTGCTGGTTACCACCGGTTCTGAAGCTGTTGAAAACGCTGTTAAAATCGCTCGTGCTGCTACCAAACGTTCTGGTGCTATCGCTTTCTCTGGTGCTTACCACGGTCGTACCCACTACACCCTGTCTCTGACCGGTAAAGTTCACCCGTACTCTGCTGGTATGGGTCTGATGCCGGGTCACGTTTACCGTGCTCTGTACCCGTGCCCGCTGCACAACATCTCTGACGACGACGCTATCGCTTCTATCGAACGTATCTTCAAAAACGACGCTGCTCCGGAAGACATCGCTGCTATCATCATCGAACCGGTTCAGGGTGAAGGTGGTTTCTACGCTGCTTCTCCGGCTTTCATGCAGCGTCTGCGTGCTCTGTGCGACCAGCACGGTATCATGCTGATCGCTGACGAAATTCAGTCTGGTGCTGGTCGTACCGGTACCCTGTTCGCTATGGAACAGATGGGTGTTGCTGCTGACATCACCACCTTCGCTAAATCTATCGCGGGCGGCTTCCCGCTGGCTGGCGTTACCGGTCGTGCTGACGTTATGGACGCTATCGCTCCGGGTGGTCTGGGTGGTACCTACGCTGGTAACCCGATCGCTTGCGCTGCTGCTCTGGCTGTTCTGGACATCTTCGAACAGGAAAACCTGCTGCAGAAAGCTAACACCCTGGGTAACACCCTGCGTGACGGTCTGATGGAAATCGCTGAAACCCACCGTGAAATCGGTGACGTTCGTGGTCTGGGTGCTATGATCGCTATCGAACTGTTCGAAAACGGTGACCCGGGTAAACCGAACGCTGCTCTGACCGCTGACATCGTTACCCGTGCTCGTGAAAAAGGTCTGATCCTGCTGTCTTGCGGTCCGTACTACAACATCCTGCGTATCCTGGTTCCGCTGACCATCGAAGCTTCTCAGATCCGTCAGGGTCTGGAAATCATCGCTCAGTGCTTCGACGAAGCTAAACAGGCT。
由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.4所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的突变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的突变体可以是生的等位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变编码氨基酸的功能。
本发明还涉及含有所述转氨酶突变体编码基因的重组载体以及含有所述重组载体的重组基因工程菌。所述重组载体以pET28b为基础载体，插入位点为NcoI与NotI之间，所述重组基因工程菌的宿主菌优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明关键在于新型高活力转氨酶及其突变位点的选择，在已知所述新型高活力转氨酶序列及其突变体位点的前提下，本领域普通技术人员可根据SEQ ID NO.1所示的转氨酶(SeTA)，设计定点突变的突变引物，以携带转氨酶的克隆载体为模板进行定点突变构建突变体，以质粒pET28b或能表达该酶的载体为表达载体，将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)细胞或能表达该酶的宿主细胞，高通量筛选验证后的阳性单克隆进行培养，获得含有本发明突变体的重组菌的湿菌体。
本发明还提供一种所述转氨酶突变体在微生物催化2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸(PPO)不对称合成L-草铵膦中的应用，所述应用为：以含所述转氨酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎后经镍柱纯化得到的纯酶液作为催化剂，以2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸为底物，以磷酸吡哆醛(PLP)为辅酶，以天然氨基酸L-谷氨酸为氨基供体，于pH6.0～10.0(优选pH8.5)缓冲液中构成转化体系，在25～75℃(优选35℃)、400～600r/min(优选600r/min)条件下反应，反应结束后，反应液经分离纯化得到L-草铵膦。
所述转化体系中，底物初始浓度为20～500mM(优选20～200mM，更优选20mM)，湿菌体用量为10～100g/L(优选20g/L)，纯酶用量为0.02～6U/mL(优选4U/mL)，辅酶用量为0.1mM～1M(优选1mM)，L-谷氨酸用量为20mM～1M(优选100mM)。
本发明所述含转氨酶突变体基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体可按如下方法制备：构建含有所述优良催化活力和底物耐受性的转氨酶突变体基因的重组载体，将所述重组载体转化至E.coliBL21(DE3)中，获得的重组基因工程菌进行诱导表达，取培养液分离得到湿菌体细胞。具体为：将含有转氨酶突变体基因的工程菌接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃、200rpm下培养9h，再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃、180rpm下培养至菌体OD600达到0.4～0.6，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。所述LB培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，溶剂为水，pH值7.0。
所述纯酶制备方法为：(1)将含转氨酶突变体基因的重组基因工程菌诱导表达得到的湿菌体用20mM磷酸盐缓冲液(pH 8.5)悬浮后，在40W条件下超声破碎10min，将破碎混合液在4℃、8000r/min离心10min，弃去沉淀，收集上清液；超声破碎条件：功率为40W，破碎1s，暂停3s；(2)将步骤(1)上清液用Ni亲和柱(40×12.6mm,Bio-Rad,USA)进行纯化：先用平衡缓冲液(Binding Buffer)冲洗Ni柱，流速为1mL/min，冲洗5-7个柱体积直到UV基线平衡；将步骤(1)上清液进行上样，流速为1mL/min，上样量为1～2个柱体积，使目的蛋白和Ni柱充分结合；接着用冲洗缓冲液(Washing Buffer)冲洗杂蛋白，流速为1mL/min，洗脱3-5个柱体积，将杂蛋白冲洗干净，直到UV基线平衡；最后用洗脱缓冲液(Elution Buffer)洗脱目的蛋白，流速为1mL/min，当吸光度达到0.25并上升时开始收集，当吸光度降到0.25时，停止收集；将收集的洗脱液放入透析袋(MD44，MW：8000～14000)，以PBS缓冲液(20mM、pH 8.5)为透析液，在4℃温度下透析脱盐(优选重复透析2次)，取截留液，获得所述的纯酶液；平衡缓冲液：300mM氯化钠、20mM磷酸盐缓冲液，pH8.5；冲洗缓冲液：300mM氯化钠、50mM咪唑、20mM磷酸盐缓冲液，pH8.5；洗脱缓冲液：300mM氯化钠、500mM咪唑、50mM磷酸盐缓冲液，pH8.5。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种来源于沙门氏菌新的高活力转氨酶突变体，酶活可达79.81U/(mg蛋白)。所述转氨酶突变体能够生物催化2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸制备L-草铵膦，200mM底物反应3h，底物转化率为83.19％，产物ee>99.9％，相比于原始酶，转化率提高了2.23倍，在生产L-草铵膦中具有较好的应用前景。
(四)附图说明
图1为实施例4中转氨酶及突变体PCR扩增产物的凝胶电泳图：泳道M为蛋白质分子量Marker，泳道1为转氨酶SeTA，泳道2为转氨酶突变体SeTA-V241I，泳道3为转氨酶突变体SeTA-V241L。
图2为实施例6镍柱纯化前后野生型转氨酶及突变体的SDS-PAGE图：泳道M为蛋白质分子量Marker，泳道1为纯化前的转氨酶SeTA，泳道2为纯化后转氨酶SeTA，泳道3为纯化前的转氨酶突变体SeTA-V241I，泳道4为纯化后转氨酶突变体SeTA-V241I；泳道5为纯化前的转氨酶突变体SeTA-V241L，泳道6为纯化后转氨酶突变体SeTA-V241L。
图3为HPLC检测底物的峰图示意图。
图4为HPLC检测产物的峰图示意图。
图5为转氨酶突变体的最适温度示意图。
图6为转氨酶突变体的温度稳定性示意图。
图7为转氨酶突变体的最适pH示意图。
图8为转氨酶突变体的pH稳定性示意图。
图9为转氨酶突变体的底物转化率示意图。
图10为不同浓度氨基供体对转氨酶突变体的转化率影响示意图。
图11为L-草铵膦合成方程式。
(五)具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，该实施例仅用于解释本发明，并不对本发明的保护范围构成限定。
本发明实施例所用LB液体培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH值7.0。LB平板组成是在LB液体培养基中添加20g/L的琼脂。
实施例1：野生型重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-SeTA的构建
将Genbank中源自沙门氏菌(Salmonella enterica)的SeTA片段(Genbankaccession WP_001095559.1)进行克隆，得到野生型转氨酶SeTA(氨基酸序列为SEQ IDNo.1所示，核苷酸序列SEQ ID No.2所示)，转入载体pET28b(保留载体本身的His-Tag基因)的NcoI与NotI之间，构建表达载体pET28b-SeTA；再将表达载体pET28b-SeTA转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)(Invitrogen)中(42℃，90s)，涂布于含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB平板，37℃下培养8-12h，随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定，筛选获得含有表达重组质粒pET28b-SeTA的野生型重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-SeTA。
实施例2：野生型转氨酶SeTA的诱导表达
将实施例1构建的野生型重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-SeTA接种至含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养9h，再以1％(v/v)接种量接种至新鲜的含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，180rpm下培养至菌体OD600达0.4～0.6，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集沉淀，即获得野生型重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-SeTA湿菌体。该菌体可直接作为生物催化剂或者用于蛋白纯化。
实施例3：野生型转氨酶SeTA的氨基供体特异性
将实施例2获得的野生型湿菌体直接作为生物催化剂，检测SeTA对草铵膦前体酮PPO的氨基供体特异性。
反应体系(10mL)：湿菌体10g/L，磷酸吡哆醛(PLP)1mM，100mM氨基供体(过量的各种L-氨基酸)，20mM 2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，反应介质为pH 8.5、50mMTris-HCl缓冲液。
反应条件：温度35℃、搅拌速度600r/min，反应时间24h。反应结束后，取反应液200μL，将反应液离心(12000rpm，1min)。取100μL上清液用900μL的超纯水稀释，然后取稀释后的反应液进行衍生化反应，采用高效液相色谱法检测产物L-PPT和底物PPO的含量，计算相应的酶活和产物ee值，SeTA对各种氨基供体的比活力如表1所示，各个产物ee值>99.9％。表1表明SeTA对L-Glu显示出最好的活性(35.71U/mg)。因此，L-Glu被选为以下实验的氨基供体。
酶活定义：在酶活测定条件下，每分钟每生成1μmol L-PPT所需的酶量定义为一个酶活单位U。
比活力：每毫克蛋白所含的酶活力单位数。
衍生化试剂配制：称取0.1g邻苯二甲醛(OPA)、0.12g N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)，以10mL无水乙醇溶解，用0.1mol/L pH 9.8的硼酸缓冲液定容至50mL，4℃冰箱下保藏(不超过3天)。
衍生化反应：取200μL稀释后的反应液，添加400μL衍生化试剂，30℃、600rpm衍生化5min，加400μL超纯水补足至1mL，混匀后用针筒吸取并过0.22μm微滤膜，滤液作为液相待检样品。
产物L-PPT的HPLC检测条件：使用Ultimate 3000高效液相色谱系统(ThermoFisher,Dionex,USA)，配备荧光检测器(UltiMate FLD-3100)。分析柱为C18(4.6×250mm，5μm，China)。L-PPT的保留时间为13.6分钟。流动相：甲醇:0.05M乙酸铵(pH5.7)，体积比为10:90；流速1.0mL/min，检测波长Ex＝340nm、Em＝450nm，进样量10μL，柱温35℃。
底物PPO检测条件：使用Ultimate 3000高效液相色谱系统(ThermoFisher,Dionex,USA)，Unitary C18色谱柱(5μm，100A，4.6mm×250mm)，流动相为50mM磷酸二氢铵溶液：乙腈＝88：12(磷酸二氢铵溶液：称取5.75g磷酸二氢铵溶于800mL超纯水中，加入1.0g四丁基氢氧化铵，用磷酸调pH到3.8，定容至1L)，流速为1mL/min，柱温箱40℃，紫外检测波长为232nm。
L-PPT非对映体过量e.e.值计算公式如下所示：
式中，CL-PPT和CD-PPT分别表示产物L-PPT和D-PPT的摩尔浓度，mol/L。
表1、SeTA对PPO氨基供体的特异性
实施例4：转氨酶突变体的构建
1、突变体的构建
根据实施例1野生型转氨酶SeTA(氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示)设计定点突变的引物，以实施例1构建的重组载体pET28b/SeTA为模板，采用BioRad的PCR仪，对第241位氨基酸引入定点突变，引物为：
V241I正向引物：CTGACGAAATTCAGTCTGGTGCTG(下划线为突变碱基)
V241I反向引物：CAGACTGAATTTCGTCAGCGATCAG(下划线为突变碱基)
V241L正向引物：CTGACGAACTGCAGTCTGGTGCTGG(下划线为突变碱基)
V241L反向引物：CAGACTGCAGTTCGTCAGCGATCA(下划线为突变碱基)
PCR反应体系(总体积50μL)：10×DNA Polymerase Buffer 25μL，10mM dNTPmixture(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)2μL，浓度均为50μM的正向引物、反向引物各1μL，模板DNA 1μL，DNA Polymerase 2μL，ddH2O18μL。
PCR反应条件：预变性95℃3min，95℃变性30s，55℃～65℃退火30s，72℃延伸7min，共30个循环，最后72℃延伸10min。
PCR产物进行DNA琼脂糖凝胶电泳阳性验证(图1)，结果显示扩增产物为单一条带，大小分别为6600bp左右。
将PCR产物使用Dpn I酶消化模板，用DNA回收纯化试剂盒(AxyPrep PCR CleanupKit)对PCR产物进行纯化回收，具体步骤参照纯化试剂盒说明书。
2、突变体工程菌的构建及培养
取3μL纯化回收的PCR产物，加入100μL冰浴后的E.coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中，冰上静置30min，于42℃热击90s，迅速置于冰上冷却5min，向管中加入600μL的LB液体培养基，37℃，150r/min培养60min，离心，弃600μL上清液，将剩余的全部菌液涂布于含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB平板，37℃倒置培养12h，分别获得重组突变体基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-SeTA-V241I和E.coli BL21(DE3)/pET28b-SeTA-V241L。
实施例5：重组突变体基因工程菌发酵产酶
分别将实施例4方法制备的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-SeTA-V241I、E.coli BL21(DE3)/pET28b-SeTA-V241L接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃、200r/min培养OD600为0.8，获得种子液；将种子液以1％(v/v)接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、180r/min培养OD600至0.4～0.6，再向培养液中加入终浓度为0.1mM的IPTG，于28℃下诱导表达12h后，4℃、8000r/min离心10min，弃去上清液，用0.85％的生理盐水清洗两遍湿菌体，并收集突变体湿菌体，备用。
实施例6：转氨酶及其突变体纯酶的酶活测定
收集实施例5制备的突变体湿菌体1g用10mL的20mM磷酸盐缓冲液(pH8.5)悬浮后，在40W条件下超声破碎10min，超声破碎条件：功率为40W，破碎1s，暂停3s，将破碎混合液在4℃、8000r/min离心10min，弃去沉淀，收集上清液使用镍柱(40×12.6mm,Bio-Rad,USA)进行纯化，具体步骤如下：
(1)用平衡缓冲液(Binding Buffer)冲洗Ni柱，流速为1mL/min，直到UV基线平衡，用量大约为6倍镍柱体积。
(2)将上清液上样步骤(1)平衡后的Ni柱，流速为1mL/min，上样量为1～2个柱体积，使目的蛋白和Ni柱充分结合。
(3)步骤(2)上样结束后，用冲洗缓冲液(Washing Buffer)冲洗杂蛋白，流速为1mL/min，将杂蛋白冲洗干净，直到UV基线平衡，用量大约为4倍镍柱体积。
(4)用洗脱缓冲液(Elution Buffer)冲洗步骤(3)Ni柱洗脱目的蛋白，流速为1mL/min，当吸光度达到0.25并上升时开始收集，当吸光度降到0.25时，停止收集。
(5)步骤(4)收集洗脱液后的Ni柱继续用Elution Buffer冲洗，流速调为1mL/min，到基线冲平为止。将Elution Buffer换为Binding Buffer继续冲洗，用Binding Buffer平衡Ni柱，流速调为1mL/min，直至基线冲平，大约用量为6倍镍柱体积。用8倍柱体积的20％的乙醇保存Ni柱，将Ni柱保存在4℃冰箱中。
(7)去除盐离子：将步骤(4)收集的洗脱液放入透析袋(MD44，MW：8000～14000)，置于PBS缓冲液(20mM、pH 8.5)中，在4℃温度下透析脱盐8h后，再以相同的方式透析一次，取截留液即为纯酶液，分别获得纯酶液SeTA-V241I和纯酶液SeTA-V241L。
平衡缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.5)：称取3.12g的二水合磷酸二氢钠(终浓度为20mM)和17.53g的氯化钠(终浓度为300mM)置于1L的烧杯中加入超纯水溶解，最终定容到1L，并用磷酸或氢氧化钠将缓冲液pH调制8.5。
冲洗缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，50mM咪唑，pH 8.5)：称取3.12g的二水合磷酸二氢钠(终浓度为20mM)、17.53g的氯化钠(终浓度为300mM)和3.4g的咪唑(终浓度为50mM)置于1L的烧杯中加入超纯水溶解，最终定容到1L，并用磷酸或氢氧化钠将缓冲液pH调制8.5。
洗脱缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，500mM咪唑，pH 8.5)：称取3.12g的二水合磷酸二氢钠(终浓度为20mM)、17.53g的氯化钠(终浓度为300mM)和34g的咪唑(终浓度为500mM)置于1L的烧杯中加入超纯水溶解，最终定容到1L，并用磷酸或氢氧化钠将缓冲液pH调制8.5。
同样条件下，用实施例2方法制备的野生型湿菌体替换实施例5制备的突变体湿菌体，制备野生型纯酶(SeTA-WT)。镍柱纯化前的上清液和纯化后的纯酶液的凝胶电泳图见图2所示。
酶活检测体系(1mL)：1mL的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)中，加入20mM PPO、100mM L-谷氨酸、1M PLP，35℃保温5min，然后加入2μL纯酶液，于35℃、600rpm反应5min，用6M的HCl终止反应，反应液经离心(12,000rpm、1min)，取上清液采用实施例3所述HPLC检测产物L-PPT和底物PPO的浓度，计算比活力，结果见表2所示。
HPLC检测底物标准品的峰图如图3所示，产物标准品液相峰图如图4所示。
表2：转氨酶酶活测定
实施例7：转氨酶突变体最适温度
将实施例6中的纯酶液SeTA-V241I作为催化用酶，测定酶的最适温度，具体操作如下：1mL的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)中，加入20mM PPO、100mM L-谷氨酸、1M PLP和2μL(27.489U/mL)纯酶液。分别于不同温度25-75℃(25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃和75℃下反应，其他操作同实施例6酶活测试，同样条件下，以野生型纯酶(SeTA-WT)为对照，结果见图5。转氨酶突变体pET28b-SeTA-V241I在60℃时获得最大活性。
实施例8：转氨酶突变体的温度稳定性
将实施例6中的纯酶液SeTA-V241I作为催化用酶，测定酶的温度稳定性，具体操作如下：将纯酶液分别于不同温度35-50℃(35℃、40℃、45℃、50℃)下进行孵育24h，每隔60min，分别取出2μL(27.489U/mL)纯酶液按照实施例6方法进行酶活测试，以未孵育的纯酶液作为对照组，对照组酶活定义为100％。转氨酶突变体的温度稳定性见图6，转氨酶变体在35℃温度稳定性最好，因此我们选择35℃作为实际反应温度。
实施例9：转氨酶突变体的最适pH
将实施例6中的纯酶液SeTA-V241I作为催化用酶，测定酶的最适pH，具体操作如下：1mL不同pH的缓冲液中，加入20mM PPO、100mM L-谷氨酸、1mM PLP和2μL(27.489U/mL)纯酶液。同实施例6酶活测定方法测定磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(PB buffer，pH pH6.0～8.0)，Tris-HCl缓冲液(Tris-HCl buffer，pH pH7.5～9.0)和Na2B4O7-NaOH缓冲液(pH9.0～10.0)三种不同pH(6.0-10.0)缓冲液下的酶活，结果见图7。转氨酶突变体pET28b-SeTA-V241I的最适pH为9.0。
实施例10：转氨酶突变体的pH稳定性
将实施例6中的纯酶液SeTA-V241I作为催化用酶，测定酶的pH稳定性，具体操作如下：1mL的pH8.0～9.0Tris-HCl缓冲液中，加入20mM PPO、100mM L-谷氨酸、1mM PLP和2μL(27.489U/mL)纯酶液。同实施例6方法测定不同pH下的酶活，结果见图8。转氨酶突变体pET28b-SeTA-V241I催化应用的最适pH为8.5。
实施例11：转氨酶突变体催化制备L-草铵膦
以实施例5方法制备的E.coli BL21(DE3)/pET28b-SeTA-V241I和E.coli BL21(DE3)/pET28b-SeTA-WT的湿菌体为催化剂，以2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸(PPO)为底物，不对称合成L-草铵膦，反应体系(10mL)组成：200mM PPO，700mM L-谷氨酸，1mMPLP，湿菌体20g/L，反应介质为pH8.5、50mM的Tris-HCl缓冲液，在35℃、600rpm下反应，分别于0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h和3h取200μL转化液，将转化液同实施实例6方法检测底物PPO的浓度。结果如图9所示，反应2h时转氨酶突变体的转化率为83.19％，而野生型转氨酶的转化率只有54.13％。
实施例12：转氨酶突变体在不同氨基供体浓度条件下制备L-草铵膦
以实施例5方法制备的E.coli BL21(DE3)/pET28b-SeTA-V241I的湿菌体为催化剂，以2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸(PPO)为底物，不对称合成L-草铵膦，反应体系(10mL)组成：200mM PPO，1mM PLP，湿菌体20g/L，分别加入不同浓度的L-谷氨酸(200mM、400mM、600mM、800mM和1M)，反应介质为pH8.5、50mM的Tris-HCl缓冲液，在35℃、600rpm下反应，分别于0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h和3h取200μL转化液，同实施实例6方法检测底物PPO的浓度。结果如图10所示，随着L-Glu用量的增加，L-PPT的产量也随之增加，L-Glu与底物PPO的最佳配比为5:1。
由以上实验结果可知，本发明得到的含有转氨酶基因的重组大肠杆菌具有较强的转氨能力，可直接以含酶的菌体细胞为酶源进行生物催化，可以利用2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸为底物，进行生物催化不对称合成高光学纯的农药L-草铵膦。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种转氨酶突变体及其工程菌与应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 427
<212> PRT
<213> 沙门氏菌(Salmonella enterica)
<400> 1
Met Asn Thr Asn Asn Ala Leu Met Gln Arg Arg His Asn Ala Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Val Gly Gln Ile His Pro Ile Phe Ala Glu Arg Ala Glu Asn
20 25 30
Cys Arg Val Trp Asp Val Glu Gly Arg Glu Tyr Leu Asp Phe Ala Gly
35 40 45
Gly Ile Ala Val Leu Asn Thr Gly His Leu His Pro Gly Ile Val Ser
50 55 60
Ala Val Glu Ala Gln Leu Lys Lys Leu Ser His Thr Cys Phe Gln Val
65 70 75 80
Leu Ala Tyr Glu Pro Tyr Leu Ala Leu Cys Glu Arg Met Asn Gln Lys
85 90 95
Val Pro Gly Asp Phe Ala Lys Lys Thr Leu Leu Val Thr Thr Gly Ser
100 105 110
Glu Ala Val Glu Asn Ala Val Lys Ile Ala Arg Ala Ala Thr Lys Arg
115 120 125
Ser Gly Ala Ile Ala Phe Ser Gly Ala Tyr His Gly Arg Thr His Tyr
130 135 140
Thr Leu Ser Leu Thr Gly Lys Val His Pro Tyr Ser Ala Gly Met Gly
145 150 155 160
Leu Met Pro Gly His Val Tyr Arg Ala Leu Tyr Pro Cys Pro Leu His
165 170 175
Asn Ile Ser Asp Asp Asp Ala Ile Ala Ser Ile Glu Arg Ile Phe Lys
180 185 190
Asn Asp Ala Ala Pro Glu Asp Ile Ala Ala Ile Ile Ile Glu Pro Val
195 200 205
Gln Gly Glu Gly Gly Phe Tyr Ala Ala Ser Pro Ala Phe Met Gln Arg
210 215 220
Leu Arg Ala Leu Cys Asp Gln His Gly Ile Met Leu Ile Ala Asp Glu
225 230 235 240
Val Gln Ser Gly Ala Gly Arg Thr Gly Thr Leu Phe Ala Met Glu Gln
245 250 255
Met Gly Val Ala Ala Asp Ile Thr Thr Phe Ala Lys Ser Ile Ala Gly
260 265 270
Gly Phe Pro Leu Ala Gly Val Thr Gly Arg Ala Asp Val Met Asp Ala
275 280 285
Ile Ala Pro Gly Gly Leu Gly Gly Thr Tyr Ala Gly Asn Pro Ile Ala
290 295 300
Cys Ala Ala Ala Leu Ala Val Leu Asp Ile Phe Glu Gln Glu Asn Leu
305 310 315 320
Leu Gln Lys Ala Asn Thr Leu Gly Asn Thr Leu Arg Asp Gly Leu Met
325 330 335
Glu Ile Ala Glu Thr His Arg Glu Ile Gly Asp Val Arg Gly Leu Gly
340 345 350
Ala Met Ile Ala Ile Glu Leu Phe Glu Asn Gly Asp Pro Gly Lys Pro
355 360 365
Asn Ala Ala Leu Thr Ala Asp Ile Val Thr Arg Ala Arg Glu Lys Gly
370 375 380
Leu Ile Leu Leu Ser Cys Gly Pro Tyr Tyr Asn Ile Leu Arg Ile Leu
385 390 395 400
Val Pro Leu Thr Ile Glu Ala Ser Gln Ile Arg Gln Gly Leu Glu Ile
405 410 415
Ile Ala Gln Cys Phe Asp Glu Ala Lys Gln Ala
420 425
<210> 2
<211> 1281
<212> DNA
<213> 沙门氏菌(Salmonella enterica)
<400> 2
atgaacacca acaacgctct gatgcagcgt cgtcacaacg ctgttccgcg tggtgttggt 60
cagatccacc cgatcttcgc tgaacgtgct gaaaactgcc gtgtttggga cgttgaaggt 120
cgtgaatacc tggacttcgc tggtggtatc gctgttctga acaccggtca cctgcacccg 180
ggtatcgttt ctgctgttga agctcagctg aaaaaactgt ctcacacctg cttccaggtt 240
ctggcttacg aaccgtacct ggctctgtgc gaacgtatga accagaaagt tccgggtgac 300
ttcgctaaaa aaaccctgct ggttaccacc ggttctgaag ctgttgaaaa cgctgttaaa 360
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<211> 427
<212> PRT
<213> 沙门氏菌(Salmonella enterica)
<400> 3
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<211> 1281
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<213> 沙门氏菌(Salmonella enterica)
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cgtgaatacc tggacttcgc tggtggtatc gctgttctga acaccggtca cctgcacccg 180
ggtatcgttt ctgctgttga agctcagctg aaaaaactgt ctcacacctg cttccaggtt 240
ctggcttacg aaccgtacct ggctctgtgc gaacgtatga accagaaagt tccgggtgac 300
ttcgctaaaa aaaccctgct ggttaccacc ggttctgaag ctgttgaaaa cgctgttaaa 360
atcgctcgtg ctgctaccaa acgttctggt gctatcgctt tctctggtgc ttaccacggt 420
cgtacccact acaccctgtc tctgaccggt aaagttcacc cgtactctgc tggtatgggt 480
ctgatgccgg gtcacgttta ccgtgctctg tacccgtgcc cgctgcacaa catctctgac 540
gacgacgcta tcgcttctat cgaacgtatc ttcaaaaacg acgctgctcc ggaagacatc 600
gctgctatca tcatcgaacc ggttcagggt gaaggtggtt tctacgctgc ttctccggct 660
ttcatgcagc gtctgcgtgc tctgtgcgac cagcacggta tcatgctgat cgctgacgaa 720
attcagtctg gtgctggtcg taccggtacc ctgttcgcta tggaacagat gggtgttgct 780
gctgacatca ccaccttcgc taaatctatc gcgggcggct tcccgctggc tggcgttacc 840
ggtcgtgctg acgttatgga cgctatcgct ccgggtggtc tgggtggtac ctacgctggt 900
aacccgatcg cttgcgctgc tgctctggct gttctggaca tcttcgaaca ggaaaacctg 960
ctgcagaaag ctaacaccct gggtaacacc ctgcgtgacg gtctgatgga aatcgctgaa 1020
acccaccgtg aaatcggtga cgttcgtggt ctgggtgcta tgatcgctat cgaactgttc 1080
gaaaacggtg acccgggtaa accgaacgct gctctgaccg ctgacatcgt tacccgtgct 1140
cgtgaaaaag gtctgatcct gctgtcttgc ggtccgtact acaacatcct gcgtatcctg 1200
gttccgctga ccatcgaagc ttctcagatc cgtcagggtc tggaaatcat cgctcagtgc 1260
ttcgacgaag ctaaacaggc t 1281

Claims (7)

1.一种来源于沙门氏菌(Salmonella enterica)的转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种含有权利要求1所述转氨酶突变体编码基因的重组基因工程菌。
3.一种权利要求1所述转氨酶突变体在微生物催化2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸不对称合成L-草铵膦中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为：以含所述转氨酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎后经镍柱纯化得到的纯酶液作为催化剂，以2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸为底物，以磷酸吡哆醛为辅酶，以L-谷氨酸为氨基供体，于pH6.0～10.0缓冲液中构成转化体系，在25～75℃、400～600r/min条件下反应，反应结束后，反应液经分离纯化得到L-草铵膦。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述转化体系中，底物初始浓度为20～500mM，湿菌体用量为10～100g/L，纯酶用量为0.02～6U/mL，辅酶用量为0.1mM～1M，L-谷氨酸用量为20mM～1M。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述湿菌体按如下方法制备：将含有转氨酶突变体基因的重组基因工程菌接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃、200rpm下培养9h，再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃、180rpm下培养至菌体OD600达到0.4～0.6，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集湿菌体；所述LB液体培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH值7.0。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述纯酶液的制备方法为：(1)将含转氨酶突变体基因的重组基因工程菌诱导表达得到的湿菌体用pH8.5、20mM磷酸盐缓冲液悬浮后，在40W条件下超声破碎10min，将破碎混合液在4℃、8000r/min离心10min，弃去沉淀，收集上清液；超声破碎条件：功率为40W，破碎1s，暂停3s；(2)将步骤(1)上清液用Ni亲和柱进行纯化：先用平衡缓冲液冲洗Ni柱，流速为1mL/min，冲洗5-7个柱体积直到UV基线平衡；将步骤(1)上清液进行上样，流速为1mL/min，上样量为1～2个柱体积，使目的蛋白和Ni柱充分结合；接着用冲洗缓冲液冲洗杂蛋白，流速为1mL/min，洗脱3-5个柱体积，将杂蛋白冲洗干净，直到UV基线平衡；最后用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，流速为1mL/min，当吸光度达到0.25并上升时开始收集，当吸光度降到0.25时，停止收集；将收集的洗脱液放入透析袋，以PBS缓冲液为透析液，在4℃温度下透析脱盐，取截留液，获得所述的纯酶液；平衡缓冲液：300mM氯化钠、20mM磷酸盐缓冲液，pH8.5；冲洗缓冲液：300mM氯化钠、50mM咪唑、20mM磷酸盐缓冲液，pH8.5；洗脱缓冲液：300mM氯化钠、500mM咪唑、50mM磷酸盐缓冲液，pH8.5。
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