CN111808829A - 一种γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种γ‑谷氨酰甲胺合成酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5，与野生型γ‑谷氨酰甲胺合成酶相比，提高了催化谷氨酸钠和乙胺反应生产茶氨酸的酶活力，最高可以生成63.01g/L的L‑茶氨酸，产物生成率超过90％，产物ee值超过99％，具有较好的工业化开发应用前景。

Description

一种γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于酶催化技术领域，具体地说，涉及一种γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体、及其用于酶法催化谷氨酰胺与乙胺发生缩合反应生成L-茶氨酸的用途。

背景技术

茶氨酸(Theanine)是1950年日本学者酒户弥二郎首次从绿茶中分离出来的，在自然界它仅存在于茶植物中，占茶叶干重的1％～2％，它以一种游离的形式存在而且是茶叶中主要的氨基酸，占所有游离氨基酸的50％左右。

茶氨酸为人体所必需，但人体内不能合成，要靠外界供给。自然界中存在的茶氨酸均为L型，化学名为N-乙基-γ-谷氨酰胺，纯品为白色针状晶体，熔点217-218℃，比旋光[α]D＝+7.7-8.5，分子量为174.2。茶氨酸极易溶于水，不溶于乙醇和乙醚，有茚三酮反应，加热后可生成紫色物质，跟碱式碳酸酮反应后可生成浅紫色柱状铜盐，可被25％硫酸或6M盐酸水解成L-谷氨酸和乙胺。

目前茶氨酸的制备方法主要有三种：植物提取法、化学合成法、酶催化合成法。植物提取法主要以茶叶为原料采用碱式碳酸酮沉淀法或离子交换分离提取法两种方法进行提取，其中离子交换分离提取法收率可达88％，但受限于原料问题，产能不足，纯品提取成本大；化学合成法中，国内湘潭大学2017年采用采用N-取代谷氨酸甲酯法，利用催化效率高的三乙胺和氨基保护剂乙酰丙酮，获得了底物转化率82％的生产工艺，是查到的化学合成工艺中转化率最高的，但产物手性纯度低、过程涉及多种有机溶剂，生产过程涉及易燃易爆，且原料成本等问题，使得化学法合成工艺也没有规模产业化；酶催化合成L-茶氨酸因为其廉价的底物、安全的催化过程、高手性纯度产物等方面的优点，成为非常有潜力的一种L-茶氨酸的合成方法，目前有四种类型的酶可以参与催化合成L- 茶氨酸，包括谷氨酰胺合成酶(GS)、γ-谷氨酰甲胺合成酶(GMAS)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)和γ-谷氨酰胺酶。但该方法现在存在的问题，要么体系中涉及ATP再生，生产成本上升(如GS和GMAS)，要么催化体系底物转化效率低，乙胺盐大量残留。2008 年，Yamamoto S等采用Methylovorus mays NO.9来源的大肠杆菌重组GMAS，催化等摩尔的谷氨酸钠和盐酸乙胺，最终获得110g/L L-茶氨酸，这是查阅到产量最高的文献报道，但一方面，因该酶的比活较低，该催化体系只能采用纯酶才能实现，另一方面，该催化体系采用了酵母菌作为ATP的再生工具，这两个方面的成本增加，导致该体系很难被产业化。专利文献CN201510973289.X报道了采用来源于Methylovorus mays的γ-谷氨酰甲胺合成酶和一种磷酸激酶为催化剂，以L-谷氨酸钠和乙胺盐酸盐为底物合成L-茶氨酸。

据该专利文献报道，其L-茶氨酸的转化率可高达80％以上，ee值达到99％以上。但我们在研究该技术时，发现重现性低，该反应中酶活力偏低，存在明显的产物抑制现象，难以实现产物的有效积累，因而不具有工业化前景。

发明内容

为了解决现有γ-谷氨酰甲胺合成酶(GMAS)催化制备L-茶氨酸，酶比活低、容易导致产物抑制性的工业化掣肘问题，本发明对多种微生物来源的酶GS、GMAS、GGT 进行了广泛筛选。并且重点对Methyloversatilis universalis和Methylovorus mays NO.9两种微生物来源的GMAS野生酶(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3)进行了研究，利用基因工程技术进行改造和鉴定，确定出一种酶比活相对较高的基因进行定向进化，筛选酶活力高、底物抑制性和产物抑制性低的γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体，提高了单位酶活的催化效率。具体而言，本发明包括如下技术方案：

一种γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5： MSPSEAQQFLKENQVKYILAQFVDIHGSAKTKSVPAEHYKTVVTDGAGFAGFAIWGM GMTPNVDADYMAVGDASTLSLVPWQPGYARIACDGHTHGKPHEYDTRVVLKKQLE QITARGWTFFTGMEPEFSLLRKVEGKLLPADPGDTLSKPSYDYKGLSRARVFLERLSE SLRSVGIDVYQIDHEDANGQFEINYTLTDALTSCDHYTFAKMGAAEIAAELGLICSFM PKPFSNRPGNGLHMHMSIGDGKRNLFEDKSDKTGLALSKLAYHWAAGLLKHAPALA ALCCPTVNSYKRLVVGRSLTGATWAPAYICYGGNNRSGMIRSPGGRLELRLPDASCNA YLATAAVIAAGMDGVINELDPGAPQNDNLYEYSQAQLDAAGIKVLPQNLHEALLALE KDEVIRSALGPVVDEFLRLKHMEWVEYMRHVSDWEVNSYLEFF(SEQ ID NO:5)。

该突变体是野生型γ-谷氨酰甲胺合成酶SEQ ID NO:1第152位的C替换为S、第197位的F替换为L、第210位的F替换为A、第261位的H替换为T的突变体。

本发明的第二个方面在于提供编码上述γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体SEQ ID NO:5的基因。

优选地，编码上述γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体SEQ ID NO:5的基因可以是下述核苷酸序列：

ATGTCTCCGTCTGAAGCTCAGCAGTTCCTGAAAGAAAACCAGGTTAAATACATCCT GGCTCAGTTCGTTGACATCCACGGTTCTGCTAAAACCAAATCTGTTCCGGCTGAAC ACTACAAAACCGTTGTTACCGACGGCGCTGGCTTTGCGGGCTTCGCGATCTGGGG CATGGGTATGACCCCGAACGTTGACGCTGACTACATGGCTGTTGGTGACGCTTCTA CCCTGTCTCTGGTTCCGTGGCAGCCGGGTTACGCTCGTATCGCTTGCGACGGTCAC ACCCACGGTAAACCGCACGAATACGACACCCGTGTTGTTCTGAAAAAACAGCTGG AACAGATCACCGCTCGTGGTTGGACCTTCTTCACCGGTATGGAACCGGAATTCTCT CTGCTGCGTAAAGTTGAAGGTAAACTGCTGCCGGCTGACCCGGGTGACACCCTGT CTAAACCGAGCTACGACTACAAAGGTCTGTCTCGTGCTCGTGTTTTCCTGGAACGT CTGTCTGAATCTCTGCGTTCTGTTGGTATCGACGTTTACCAGATCGACCACGAAGA CGCTAACGGTCAGTTCGAAATCAACTACACCTTGACCGACGCTCTGACCTCTTGCG ACCACTACACCTTCGCCAAAATGGGTGCTGCTGAAATCGCTGCTGAACTGGGTCT GATCTGCTCTTTCATGCCGAAACCGTTCTCTAACCGTCCGGGTAACGGTCTGCACA TGCACATGTCTATCGGTGACGGTAAACGTAACCTGTTCGAAGACAAATCTGACAAA ACCGGTCTGGCTCTGTCTAAACTGGCTTACCACTGGGCTGCTGGTCTGCTGAAACA CGCTCCGGCTCTGGCTGCTCTGTGCTGCCCGACCGTTAACTCTTACAAACGTCTGG TTGTTGGTCGTTCTCTGACCGGTGCTACCTGGGCTCCGGCTTACATCTGCTACGGT GGTAACAACCGTTCTGGTATGATCCGTTCTCCGGGTGGTCGTCTGGAACTGCGTCT GCCGGACGCTTCTTGCAACGCTTACCTGGCTACCGCTGCTGTTATCGCTGCTGGTAT GGACGGTGTTATCAACGAACTGGACCCGGGTGCTCCGCAGAACGACAACCTGTAC GAATACTCTCAGGCTCAGCTGGACGCTGCTGGTATCAAAGTTCTGCCGCAGAACCT GCACGAAGCTCTGCTGGCTCTGGAAAAAGACGAAGTTATCCGTTCTGCTCTGGGT CCGGTTGTTGACGAATTCCTGCGTCTGAAACACATGGAATGGGTTGAATACATGCG TCACGTTTCTGACTGGGAAGTTAACTCTTACCTGGAATTCTTCTAA(SEQ IDNO: 6)。

本发明的第三个方面在于提供包含上述基因的质粒。该质粒是pET系列载体，比如载体是pET24a(+)，但并不受限于此。

本发明的第四个方面在于提供表达上述编码基因的微生物，其转化了上述质粒。

优选地，上述微生物选自大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的第五个方面在于提供上述γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体或者上述微生物用于生产L-茶氨酸的用途。

在L-茶氨酸生产中，以谷氨酸钠和乙胺盐酸盐为原料，用上述γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体或者微生物作为催化剂来催化缩合反应，得到产物L-茶氨酸。

作为一种可选的实施方式，上述微生物可以呈菌体或者其细胞破碎物形式，作为缩合反应的催化剂。

生产可采用常规的工艺条件，比如，反应温度选择20-40℃，例如25-35℃。

反应体系可以为缓冲液体系比如磷酸盐缓冲液，pH5.0-9.0，例如pH6.0-8.0，优选pH6.5-7.5。

在一种优选的实施方式中，上述反应体系中可以加入以六聚偏磷酸钠为供体的磷酸激酶ATP再生系统，降低体系中ATP的使用成本。

上述磷酸激酶ATP再生系统例如包含ATP(三磷酸腺苷二钠)、六聚偏磷酸、多聚磷酸激酶。

上述多聚磷酸激酶可以是酶形式，也可以是其表达微生物形式例如专利文献CN202010213070.0中报道的多聚磷酸激酶生产菌株PET24a-cgPPK2-Mut41/BL21(DE3) 或者PET24a-cgPPK2/BL21(DE3)，更优选菌株PET24a-cgPPK2-Mut41/BL21(DE3)或者其表达的多聚磷酸激酶。本申请以引用的方式将该专利文献内容并入本文。

相较微生物Methyloversatilis universalis来源的野生型γ-谷氨酰甲胺合成酶SEQ ID NO:1、微生物Methylovorus mays NO.9来源的γ-谷氨酰甲胺合成酶SEQ ID NO:3，本发明构建的γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体SEQ ID NO:5催化进行反应的酶活性有明显提高，具有工业化开发应用前景。

附图说明

图1为用于表达野生型γ-谷氨酰甲胺合成酶基因SEQ ID NO:2的重组质粒 pET24a-muGMAS的结构示意图。

图2为用于表达野生型γ-谷氨酰甲胺合成酶基因SEQ ID NO:4的重组质粒 pET24a-mmGMAS的结构示意图。

具体实施方式

本发明构建的γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体SEQ ID NO:5是Methyloversatilisuniversalis来源的野生型γ-谷氨酰甲胺合成酶SEQ ID NO:1的突变体，是SEQ ID NO: 1序列中多个氨基酸发生替换后形成的新蛋白质。

在本文中，术语“野生(型)酶”、“野生γ-谷氨酰甲胺合成酶”表示相同的意义，都是指Methyloversatilis universalis来源的γ-谷氨酰甲胺合成酶，其氨基酸序列为SEQID NO:1。

相对应地，术语“γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体”、“突变γ-谷氨酰甲胺合成酶”、“突变GMAS”和“突变酶”表示相同的意义，都是指以野生型酶SEQ ID NO:1为基础通过氨基酸改变所形成的突变体SEQ ID NO:5。

为表述方便起见，蛋白质的氨基酸缩写既可以使用英文三字母、也可以采用英文单字母，这是本领域技术人员熟知的，这些缩写列于下表中：

表1氨基酸中英文对照及缩写

丙氨酸	Alanine	A或Ala	脂肪族类
				精氨酸	Arginine	R或Arg	碱性氨基酸类
天冬酰胺	Asparagine	N或Asn	酰胺类
				天冬氨酸	Aspartic acid	D或Asp	酸性氨基酸类
半胱氨酸	Cysteine	C或Cys	含硫类
				谷氨酰胺	Glutamine	Q或Gln	酰胺类
谷氨酸	Glutamic acid	E或Glu	酸性氨基酸类
				甘氨酸	Glycine	G或Gly	脂肪族类
组氨酸	Histidine	H或His	碱性氨基酸类
				异亮氨酸	Isoleucine	I或Ile	脂肪族类
亮氨酸	Leucine	L或Leu	脂肪族类
				赖氨酸	Lysine	K或Lys	碱性氨基酸类
蛋氨酸	Methionine	M或Met	含硫类
				苯丙氨酸	Phenylalanine	F或Phe	芳香族类
脯氨酸	Proline	P或Pro	亚氨基酸
				丝氨酸	Serine	S或Ser	羟基类
苏氨酸	Threonine	T或Thr	羟基类
				色氨酸	Tryptophan	W或Trp	芳香族类
酪氨酸	Tyrosine	Y或Tyr	芳香族类
				缬氨酸	Valine	V或Val	脂肪族类

本发明的γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体的氨基酸数量只有442个，且结构明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。

这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。

上述转化体宿主可以是任何适合表达γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体的微生物，包括细菌和真菌。优选微生物是大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌等，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。

为了在不同微生物中进行蛋白质SEQ ID NO:5的最佳表达，可以针对特定的微生物比如大肠杆菌、毕赤酵母、或者枯草芽孢杆菌进行密码子优化。密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组 tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以被用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。在本文中所提供的基因序列SEQ ID NO:6是针对γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体SEQ ID NO:5经过密码子优化的核苷酸序列，但本发明的γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体SEQ ID NO:5表达基因不限于此。

当作为生物催化剂用于生产时，本发明的γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶、细胞破碎物等；所述菌体的形式包括存活菌体细胞和死亡菌体细胞。

作为另一种可选的实施方式，可以采用表达上述γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体SEQID NO:5的微生物菌体细胞作为酶催化反应的生物催化剂。菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体，当微生物比如枯草芽孢杆菌、毕赤酵母或者大肠杆菌不再进行发酵增殖、而是用于酶催化反应时，本身就是一种天然的固定化酶，而且不需要进行破碎处理、甚至提取纯化处理，就可以作为一种酶制剂用于催化反应。由于反应底物和反应产物都是小分子化合物，可以很方便地穿过菌体的生物屏障--细胞膜，因此不需要对菌体进行破碎处理，这在经济方面是有利的。

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

实施例

材料和方法

实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，pH7.2。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K₂HPO₄.3H₂O、2.31g/LKH₂PO₄、5g/L甘油，pH7.0-7.5。(TB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

培养基使用前在121℃高温高压灭菌20分钟。

实施例1野生型γ-谷氨酰甲胺合成酶的活力比较

1.1两种微生物来源γ-谷氨酰甲胺合成酶基因的构建

全基因合成Methyloversatilis universalis(GenBank号为WP_008064112)来源的γ- 谷氨酰甲胺合成酶基因SEQ ID NO:2和Methylovorus mays NO.9(GenBank号为 WP_008064112)来源的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因SEQ ID NO:4，并分别在基因两端设计限制性内切酶位点NdeI和XhoI，亚克隆到载体pET24a(+)，获得两个野生型基因重组质粒pET24a-muGMAS(参见图1)和pET24a-mmGMAS(参见图2)，分别转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌pET24a-muGMAS/BL21(DE3)和 pET24a-mmGMAS/BL21(DE3)。

1.2两种微生物来源γ-谷氨酰甲胺合成酶菌株摇瓶发酵

分别挑取菌株pET24a-muGMAS/BL21(DE3)和pET24a-mmGMAS/BL21(DE3)平板单菌落，接种至5ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜。取2ml过夜培养物接种至200ml TB培养基中，37℃，250rpm培养2-3h，至OD600 为0.6-0.8时，加入0.05mM IPTG，20℃，200rpm培养过夜。4℃，10000rpm，离心10min，收集菌体。

1.3两种微生物来源γ-谷氨酰甲胺合成酶活力测定

反应体系：100mM谷氨酸钠，150mM乙胺盐酸盐，150mM ATP，100mM磷酸钾盐缓冲液(PH7.0)，0.5％湿菌体，37℃反应2h，HPLC测定L-茶氨酸的含量。

HPLC分析方法：XDB-C18 250mm*4.6,5μm柱，波长338nm，流动相为40mM磷酸二氢钠(pH3.0):乙腈＝80:20，流速为1ml/min，温度35℃。

两种微生物来源γ-谷氨酰甲胺合成酶活力测定结果见表1：

表1、两种微生物来源γ-谷氨酰甲胺合成酶的酶活力对比

由表1可见，γ-谷氨酰甲胺合成酶SEQ ID NO:1的酶活力高于另一种γ-谷氨酰甲胺合成酶SEQ ID NO:3。将前者作为重点研究对象。

实施例2定点突变体的构建及其活力的鉴定

2.1定点突变体的构建

以基因序列SEQ ID NO:3为模板，分别采用引物对muGMAS-152F/muGMAS-197R,muGMAS-210F/muGMAS-261R进行PCR，扩增分别获得两个PCR产物P1和P2，PCR 引物序列如下：

muGMAS-152F：

5’-GTGACACCCTGTCTAAACCGAGCTACGACTACAAAGGTCTGTCTC-3’；

muGMAS-197R：

5’-CAGCACCCATTTTGGCGAAGGTGTAGTGGTCGCAAGAGGTCAGAGCGTCGGTCAAGGTGTAGTTGATTTCGAAC-3’。

muGMAS-210F：

5’-GTTCGAAATCAACTACACCTTGACCGACGCTCTGACCTCTTGCGACCACTACACCTTCGCCAAAATGGGTGCTG-3’；

muGMAS-261R：

5’-CCAGTGGTAAGCCAGTTTAGACAGAGCCAGACCGGTTTTGTCAGATTTGTC TTCGAAC-3’。

50μl的PCR反应体系包括：10ng pET24a-muGMAS质粒模板，10pmol的引物对，1×KOD plus buffer，0.2mM dNTP，1.5mM MgSO₄，5个单位的KOD-plus DNA聚合酶。

PCR反应条件为：95℃1min；98℃10s，57℃30s，68℃1min/kbp，30个循环； 68℃10min。胶回收片段P1和P2，大小分别为210bp和247bp。

以胶回收的PCR产物P1和P2为模板，以muGMAS-152F/muGMAS-261R为引物，进行PCR扩增。

50μl的PCR反应体系包括：50ng P1 PCR产物回收模板，50ng P2 PCR产物回收模板，10pmol的引物对，1×KOD plus buffer，0.2mM dNTP，1.5mM MgSO₄，5个单位的 KOD-plus DNA聚合酶。

PCR反应条件为：95℃5min；98℃15s，55℃30s，68℃1min/kbp，35个循环； 68℃10min。胶回收大小为383bp的片段，记作P3。

以片段P3作为大引物，100ng pET24a-muGMAS质粒模板，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃5min；98℃15s，60℃30s，68℃2min/kbp，25个循环；68℃10min。DpnI消化质粒模板，化学转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得突变菌株pET24a-muGMAS-no21/BL21(DE3)。

2.2突变酶菌株摇瓶发酵

取菌株pET24a-muGMAS/BL21(DE3)和pET24a-muGMAS-no21/BL21(DE3)单菌落，接种至5ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜。取2ml过夜培养物接种至200ml TB培养基中，37℃，250rpm培养2-3h，至OD600 为0.6-0.8时，加入0.05mMIPTG，20℃，200rpm培养过夜。4℃，10000rpm，离心10min，收集菌体，-20℃冻存备用。

2.3突变酶菌株γ-谷氨酰甲胺合成酶活力测定

测定方法同实施例1中步骤1.3。

野生型和突变型γ-谷氨酰甲胺合成酶活力测定结果见表2：

表2、两种微生物来源γ-谷氨酰甲胺合成酶的酶活力对比

菌株名称	酶氨基酸序列号	L-茶氨酸量(mM)
			pET24a-muGMAS/BL21(DE3)	1	100％
pET24a-muGMAS-no21/BL21(DE3)	5	278.6％

由表2可见，突变体SEQ ID NO:5的酶活力显著高于野生酶SEQ ID NO:1。

实施例3偶联多聚磷酸ATP再生系统的L-茶氨酸合成反应

反应体系为1L，200mM谷氨酸钠、450mM盐酸乙胺、30mM MgCl₂、5mM MnCl₂、5mM ATP、75mM六聚偏磷酸、3.5％专利文献CN202010213070.0中报道的多聚磷酸激酶生产菌株PET24a-cgPPK2-Mut41/BL21(DE3)发酵冻融菌体、6.5％实施例2中所得菌株 pET24a-muGMAS-no21/BL21(DE3)冻融菌体，37℃，200rpm反应12h；向反应体系内补加200mM谷氨酸钠、50mM六聚偏磷酸、2.5％pET24a-muGMAS-no21/BL21(DE3)冻融菌体，反应过程控制pH为7.0，继续反应20h，取样检测，生成了63.01g/L L-茶氨酸，产率超过90％，产物ee值大于99％。

综上所述，本发明构建的γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体SEQ ID NO:5酶活力明显高于两个野生型γ-谷氨酰甲胺合成酶SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3，采用该突变体催化谷氨酸钠与盐酸乙胺，在偶联多聚磷酸ATP再生系统下，催化反应32h，可生成L-茶氨酸63.01g/L，具有工业化开发和应用前景。

序列表

<110> 浙江华睿生物技术有限公司

<120> 一种γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体及其应用

<130> SHPI2010361

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 442

<212> PRT

<213> Methyloversatilis universalis

<400> 1

Met Ser Pro Ser Glu Ala Gln Gln Phe Leu Lys Glu Asn Gln Val Lys

1 5 10 15

Tyr Ile Leu Ala Gln Phe Val Asp Ile His Gly Ser Ala Lys Thr Lys

20 25 30

Ser Val Pro Ala Glu His Tyr Lys Thr Val Val Thr Asp Gly Ala Gly

35 40 45

Phe Ala Gly Phe Ala Ile Trp Gly Met Gly Met Thr Pro Asn Val Asp

50 55 60

Ala Asp Tyr Met Ala Val Gly Asp Ala Ser Thr Leu Ser Leu Val Pro

65 70 75 80

Trp Gln Pro Gly Tyr Ala Arg Ile Ala Cys Asp Gly His Thr His Gly

85 90 95

Lys Pro His Glu Tyr Asp Thr Arg Val Val Leu Lys Lys Gln Leu Glu

100 105 110

Gln Ile Thr Ala Arg Gly Trp Thr Phe Phe Thr Gly Met Glu Pro Glu

115 120 125

Phe Ser Leu Leu Arg Lys Val Glu Gly Lys Leu Leu Pro Ala Asp Pro

130 135 140

Gly Asp Thr Leu Ser Lys Pro Cys Tyr Asp Tyr Lys Gly Leu Ser Arg

145 150 155 160

Ala Arg Val Phe Leu Glu Arg Leu Ser Glu Ser Leu Arg Ser Val Gly

165 170 175

Ile Asp Val Tyr Gln Ile Asp His Glu Asp Ala Asn Gly Gln Phe Glu

180 185 190

Ile Asn Tyr Thr Phe Thr Asp Ala Leu Thr Ser Cys Asp His Tyr Thr

195 200 205

Phe Phe Lys Met Gly Ala Ala Glu Ile Ala Ala Glu Leu Gly Leu Ile

210 215 220

Cys Ser Phe Met Pro Lys Pro Phe Ser Asn Arg Pro Gly Asn Gly Leu

225 230 235 240

His Met His Met Ser Ile Gly Asp Gly Lys Arg Asn Leu Phe Glu Asp

245 250 255

Lys Ser Asp Lys His Gly Leu Ala Leu Ser Lys Leu Ala Tyr His Trp

260 265 270

Ala Ala Gly Leu Leu Lys His Ala Pro Ala Leu Ala Ala Leu Cys Cys

275 280 285

Pro Thr Val Asn Ser Tyr Lys Arg Leu Val Val Gly Arg Ser Leu Thr

290 295 300

Gly Ala Thr Trp Ala Pro Ala Tyr Ile Cys Tyr Gly Gly Asn Asn Arg

305 310 315 320

Ser Gly Met Ile Arg Ser Pro Gly Gly Arg Leu Glu Leu Arg Leu Pro

325 330 335

Asp Ala Ser Cys Asn Ala Tyr Leu Ala Thr Ala Ala Val Ile Ala Ala

340 345 350

Gly Met Asp Gly Val Ile Asn Glu Leu Asp Pro Gly Ala Pro Gln Asn

355 360 365

Asp Asn Leu Tyr Glu Tyr Ser Gln Ala Gln Leu Asp Ala Ala Gly Ile

370 375 380

Lys Val Leu Pro Gln Asn Leu His Glu Ala Leu Leu Ala Leu Glu Lys

385 390 395 400

Asp Glu Val Ile Arg Ser Ala Leu Gly Pro Val Val Asp Glu Phe Leu

405 410 415

Arg Leu Lys His Met Glu Trp Val Glu Tyr Met Arg His Val Ser Asp

420 425 430

Trp Glu Val Asn Ser Tyr Leu Glu Phe Phe

435 440

<210> 2

<211> 1329

<212> DNA

<213> Methyloversatilis universalis

<400> 2

atgtctccgt ctgaagctca gcagttcctg aaagaaaacc aggttaaata catcctggct 60

cagttcgttg acatccacgg ttctgctaaa accaaatctg ttccggctga acactacaaa 120

accgttgtta ccgacggcgc tggctttgcg ggcttcgcga tctggggcat gggtatgacc 180

ccgaacgttg acgctgacta catggctgtt ggtgacgctt ctaccctgtc tctggttccg 240

tggcagccgg gttacgctcg tatcgcttgc gacggtcaca cccacggtaa accgcacgaa 300

tacgacaccc gtgttgttct gaaaaaacag ctggaacaga tcaccgctcg tggttggacc 360

ttcttcaccg gtatggaacc ggaattctct ctgctgcgta aagttgaagg taaactgctg 420

ccggctgacc cgggtgacac cctgtctaaa ccgtgctacg actacaaagg tctgtctcgt 480

gctcgtgttt tcctggaacg tctgtctgaa tctctgcgtt ctgttggtat cgacgtttac 540

cagatcgacc acgaagacgc taacggtcag ttcgaaatca actacacctt caccgacgct 600

ctgacctctt gcgaccacta caccttcttc aaaatgggtg ctgctgaaat cgctgctgaa 660

ctgggtctga tctgctcttt catgccgaaa ccgttctcta accgtccggg taacggtctg 720

cacatgcaca tgtctatcgg tgacggtaaa cgtaacctgt tcgaagacaa atctgacaaa 780

cacggtctgg ctctgtctaa actggcttac cactgggctg ctggtctgct gaaacacgct 840

ccggctctgg ctgctctgtg ctgcccgacc gttaactctt acaaacgtct ggttgttggt 900

cgttctctga ccggtgctac ctgggctccg gcttacatct gctacggtgg taacaaccgt 960

tctggtatga tccgttctcc gggtggtcgt ctggaactgc gtctgccgga cgcttcttgc 1020

aacgcttacc tggctaccgc tgctgttatc gctgctggta tggacggtgt tatcaacgaa 1080

ctggacccgg gtgctccgca gaacgacaac ctgtacgaat actctcaggc tcagctggac 1140

gctgctggta tcaaagttct gccgcagaac ctgcacgaag ctctgctggc tctggaaaaa 1200

gacgaagtta tccgttctgc tctgggtccg gttgttgacg aattcctgcg tctgaaacac 1260

atggaatggg ttgaatacat gcgtcacgtt tctgactggg aagttaactc ttacctggaa 1320

ttcttctaa 1329

<210> 3

<211> 444

<212> PRT

<213> Methylovorus mays NO.9

<400> 3

Met Lys Ser Leu Glu Glu Ala Gln Lys Phe Leu Glu Asp His His Val

1 5 10 15

Lys Tyr Val Leu Ala Gln Phe Val Asp Ile His Gly Val Ala Lys Val

20 25 30

Lys Ser Val Pro Ala Ser His Leu Asn Asp Ile Leu Thr Thr Gly Ala

35 40 45

Gly Phe Ala Gly Gly Ala Ile Trp Gly Thr Gly Ile Ala Pro Asn Gly

50 55 60

Pro Asp Tyr Met Ala Ile Gly Glu Leu Ser Thr Leu Ser Leu Ile Pro

65 70 75 80

Trp Gln Pro Gly Tyr Ala Arg Leu Val Cys Asp Gly His Val Asn Gly

85 90 95

Lys Pro Tyr Glu Phe Asp Thr Arg Val Val Leu Lys Gln Gln Ile Ala

100 105 110

Arg Leu Ala Glu Lys Gly Trp Thr Leu Tyr Thr Gly Leu Glu Pro Glu

115 120 125

Phe Ser Leu Leu Lys Lys Asp Glu His Gly Ala Val His Pro Phe Asp

130 135 140

Asp Ser Asp Thr Leu Gln Lys Pro Cys Tyr Asp Tyr Lys Gly Ile Thr

145 150 155 160

Arg His Ser Pro Phe Leu Glu Lys Leu Thr Glu Ser Leu Val Glu Val

165 170 175

Gly Leu Asp Ile Tyr Gln Ile Asp His Glu Asp Ala Asn Gly Gln Phe

180 185 190

Glu Ile Asn Tyr Thr Tyr Ala Asp Cys Leu Lys Ser Ala Asp Asp Tyr

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Ile Met Phe Lys Met Ala Ala Ser Glu Ile Ala Asn Glu Leu Gly Ile

210 215 220

Ile Cys Ser Phe Met Pro Lys Pro Phe Ser Asn Arg Pro Gly Asn Gly

225 230 235 240

Met His Met His Met Ser Ile Gly Asp Gly Lys Lys Ser Leu Phe Gln

245 250 255

Asp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Leu Gly Leu Ser Lys Leu Ala Tyr His

260 265 270

Phe Leu Gly Gly Ile Leu Ala His Ala Pro Ala Leu Ala Ala Val Cys

275 280 285

Ala Pro Thr Val Asn Ser Tyr Lys Arg Leu Val Val Gly Arg Ser Leu

290 295 300

Ser Gly Ala Thr Trp Ala Pro Ala Tyr Ile Ala Tyr Gly Asn Asn Asn

305 310 315 320

Arg Ser Thr Leu Val Arg Ile Pro Tyr Gly Arg Leu Glu Leu Arg Leu

325 330 335

Pro Asp Gly Ser Cys Asn Pro Tyr Leu Ala Thr Ala Ala Val Ile Ala

340 345 350

Ala Gly Leu Asp Gly Val Ala Arg Glu Leu Asp Pro Gly Thr Gly Arg

355 360 365

Asp Asp Asn Leu Tyr Asp Tyr Ser Leu Glu Gln Leu Ala Glu Phe Gly

370 375 380

Ile Gly Ile Leu Pro Gln Asn Leu Gly Glu Ala Leu Asp Ala Leu Glu

385 390 395 400

Ala Asp Gln Val Ile Met Asp Ala Met Gly Pro Gly Leu Ser Lys Glu

405 410 415

Phe Val Glu Leu Lys Arg Met Glu Trp Val Asp Tyr Met Arg His Val

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Ser Asp Trp Glu Ile Asn Arg Tyr Val Gln Phe Tyr

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<210> 4

<211> 1335

<212> DNA

<213> Methylovorus mays NO.9

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tggcagccgg gttatgcccg cctggtgtgc gatggccatg tgaatggcaa gccttacgaa 300

tttgataccc gcgttgtgct gaaacagcag attgcccgcc tggcggaaaa aggctggacg 360

ctctacaccg gtctggaacc tgaattctcc ctgctgaaaa aagacgagca tggtgcggtg 420

catccgtttg atgacagcga cacgctgcaa aagccctgtt atgactacaa gggcattacc 480

cgccactcgc cttttctgga aaagctgacc gaatcgctgg tggaagtggg cctggatatc 540

taccagatcg accacgaaga tgccaacggc cagtttgaaa tcaactacac ctatgccgac 600

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gctccggcgc tggcggcagt gtgcgcaccg accgtcaact cttacaaacg cctggtggtg 900

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cgttcaacgc tggtgcggat tccctacggt cgcctggaac tgcgtctgcc ggacggcagc 1020

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gtacagtttt actag 1335

<210> 5

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<212> PRT

<213> 人工序列()

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Tyr Ile Leu Ala Gln Phe Val Asp Ile His Gly Ser Ala Lys Thr Lys

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Ser Val Pro Ala Glu His Tyr Lys Thr Val Val Thr Asp Gly Ala Gly

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Phe Ala Gly Phe Ala Ile Trp Gly Met Gly Met Thr Pro Asn Val Asp

50 55 60

Ala Asp Tyr Met Ala Val Gly Asp Ala Ser Thr Leu Ser Leu Val Pro

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Trp Gln Pro Gly Tyr Ala Arg Ile Ala Cys Asp Gly His Thr His Gly

85 90 95

Lys Pro His Glu Tyr Asp Thr Arg Val Val Leu Lys Lys Gln Leu Glu

100 105 110

Gln Ile Thr Ala Arg Gly Trp Thr Phe Phe Thr Gly Met Glu Pro Glu

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Phe Ser Leu Leu Arg Lys Val Glu Gly Lys Leu Leu Pro Ala Asp Pro

130 135 140

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Ala Arg Val Phe Leu Glu Arg Leu Ser Glu Ser Leu Arg Ser Val Gly

165 170 175

Ile Asp Val Tyr Gln Ile Asp His Glu Asp Ala Asn Gly Gln Phe Glu

180 185 190

Ile Asn Tyr Thr Leu Thr Asp Ala Leu Thr Ser Cys Asp His Tyr Thr

195 200 205

Phe Ala Lys Met Gly Ala Ala Glu Ile Ala Ala Glu Leu Gly Leu Ile

210 215 220

Cys Ser Phe Met Pro Lys Pro Phe Ser Asn Arg Pro Gly Asn Gly Leu

225 230 235 240

His Met His Met Ser Ile Gly Asp Gly Lys Arg Asn Leu Phe Glu Asp

245 250 255

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260 265 270

Ala Ala Gly Leu Leu Lys His Ala Pro Ala Leu Ala Ala Leu Cys Cys

275 280 285

Pro Thr Val Asn Ser Tyr Lys Arg Leu Val Val Gly Arg Ser Leu Thr

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Ser Gly Met Ile Arg Ser Pro Gly Gly Arg Leu Glu Leu Arg Leu Pro

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Asp Ala Ser Cys Asn Ala Tyr Leu Ala Thr Ala Ala Val Ile Ala Ala

340 345 350

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Asp Asn Leu Tyr Glu Tyr Ser Gln Ala Gln Leu Asp Ala Ala Gly Ile

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<211> 1329

<212> DNA

<213> 人工序列()

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atgtctccgt ctgaagctca gcagttcctg aaagaaaacc aggttaaata catcctggct 60

cagttcgttg acatccacgg ttctgctaaa accaaatctg ttccggctga acactacaaa 120

accgttgtta ccgacggcgc tggctttgcg ggcttcgcga tctggggcat gggtatgacc 180

ccgaacgttg acgctgacta catggctgtt ggtgacgctt ctaccctgtc tctggttccg 240

tggcagccgg gttacgctcg tatcgcttgc gacggtcaca cccacggtaa accgcacgaa 300

tacgacaccc gtgttgttct gaaaaaacag ctggaacaga tcaccgctcg tggttggacc 360

ttcttcaccg gtatggaacc ggaattctct ctgctgcgta aagttgaagg taaactgctg 420

ccggctgacc cgggtgacac cctgtctaaa ccgagctacg actacaaagg tctgtctcgt 480

gctcgtgttt tcctggaacg tctgtctgaa tctctgcgtt ctgttggtat cgacgtttac 540

cagatcgacc acgaagacgc taacggtcag ttcgaaatca actacacctt gaccgacgct 600

ctgacctctt gcgaccacta caccttcgcc aaaatgggtg ctgctgaaat cgctgctgaa 660

ctgggtctga tctgctcttt catgccgaaa ccgttctcta accgtccggg taacggtctg 720

cacatgcaca tgtctatcgg tgacggtaaa cgtaacctgt tcgaagacaa atctgacaaa 780

accggtctgg ctctgtctaa actggcttac cactgggctg ctggtctgct gaaacacgct 840

ccggctctgg ctgctctgtg ctgcccgacc gttaactctt acaaacgtct ggttgttggt 900

cgttctctga ccggtgctac ctgggctccg gcttacatct gctacggtgg taacaaccgt 960

tctggtatga tccgttctcc gggtggtcgt ctggaactgc gtctgccgga cgcttcttgc 1020

aacgcttacc tggctaccgc tgctgttatc gctgctggta tggacggtgt tatcaacgaa 1080

ctggacccgg gtgctccgca gaacgacaac ctgtacgaat actctcaggc tcagctggac 1140

gctgctggta tcaaagttct gccgcagaac ctgcacgaag ctctgctggc tctggaaaaa 1200

gacgaagtta tccgttctgc tctgggtccg gttgttgacg aattcctgcg tctgaaacac 1260

atggaatggg ttgaatacat gcgtcacgtt tctgactggg aagttaactc ttacctggaa 1320

ttcttctaa 1329

Claims (10)

1.一种γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5。

2.编码如权利要求1所述γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID NO:6。

4.包含如权利要求2或3所述基因的质粒。

5.转化了如权利要求4所述质粒的微生物。

6.如权利要求5所述的微生物，其特征在于，是所述微生物选自大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌。

7.如权利要求6所述的微生物，其特征在于，是所述微生物是大肠杆菌BL21(DE3)。

8.如权利要求1所述的γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体或者如权利要求6所述微生物在生产L-茶氨酸中的用途。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，以谷氨酸钠和盐酸乙胺为反应底物，用如权利要求1所述γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体或者如权利要求6所述微生物催化缩合反应生成L-茶氨酸。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，反应体系中添加有以六聚偏磷酸钠为供体的磷酸激酶ATP再生系统。

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