CN115786286A - 一种γ-谷酰胺甲胺合成酶突变体、其重组体及其在连续催化中耦合ATP再生系统的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种γ‑谷酰胺甲胺合成酶突变体、其重组体及其在连续催化中耦合ATP再生系统的应用，该γ‑谷酰胺甲胺合成酶突变体基因与辅助侵染蛋白基因的融合表达后能够外泌到培养基中，在室温和偏中性的pH下与其生产细胞结合。本发明利用其与自身生产细胞一步纯化‑固定化的功能，获得稳定性提高的活性酶，为酶法工业化生产提供有效途径。该突变体耐受的pH域宽，解决了原始蛋白残基与活性酶融合表达最适pH不匹配的难点，且融合表达后的酶同时具有催化活性域与固定化能力，具有广泛的工业化应用场景。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物酶固定化技术领域，特别涉及一种γ-谷酰胺甲胺合成酶突变体、其重组体及其在连续催化中耦合ATP再生系统的应用。
背景技术
催化剂的发现为工业化生产加速，生物酶作为一种天然高分子催化剂，具有催化效率高、特异性强，反应条件温和、无有机试剂污染的特点。然而，由于游离生物酶的物理化学性质不稳定，导致在实际应用过程中生物酶无法长期保持催化活性，也就无法发挥其最大的催化性能。生物酶固定化技术的出现不仅实现了酶的重复利用，而且可以改善酶的催化性能及活性。
L-茶氨酸作为一种安全、集多种生理功能于一体的功能性活性因子，被广泛应用于食品、保健品和医药行业。日本于1964年将以茶氨酸列为食品添加剂，作为调味剂和强化剂使用，使用过程中不作限制用量的规定。美国食品和药物管理局于1985年确认茶氨酸是一般公认为安全的物质(GRAS)，在食品中使用没有特定用量限制。2014我国卫生部批准茶叶茶氨酸为新食品原料，规定L-茶氨酸摄入量不得超过0.4g/d，使用范围不包括婴幼儿食品。此外，国际食品法典委员会(CODEX)标准将L-茶氨酸批准为风味强化剂，不作限制用量的规定，韩国也批准L-茶氨酸为食品添加剂。
微生物酶法生产茶氨酸作为近年来较为经济和温和的方法，必将在未来产业应用中大有前景。γ-谷氨酰甲胺合成酶(γ-glutamylmethylamide synthetase，GMAS)是一种能够催化L- 谷氨酸和甲胺合成N-甲基-L-谷氨酰胺的催化用酶，该反应需要消耗ATP。专利CN201410316269利用大肠杆菌产γ-谷氨酰甲胺合成酶高效生产L-茶氨酸，在大肠杆菌中表达γ-谷酰胺甲胺合成酶基因，可以谷氨酸和乙胺为底物生产茶氨酸，50mM限制底物，8h谷氨酸转化率达到69.8％；专利CN201510755912在大肠杆菌中表达γ-谷酰胺甲胺合成酶基因，可以谷氨酸和乙胺为底物生产茶氨酸，150mM限制底物，转化率低于50％，生产周期长于30h，效率低，不适合工业生产。在CN201510973289中以γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶为催化剂，在咪唑溶液中以L-谷氨酸钠和乙胺盐酸盐为底物合成L-茶氨酸。100mL体系中限制底物最高200mM，转化率87％，反应体系较小，且咪唑为反应环境，对环境和成本均不友好。专利CN201880024038公开了一种使用以乙醛和丙氨酸作为底物生成乙胺的活性、以及γ-谷氨酰甲胺合成酶活性或谷氨酰胺酶活性增强的微生物，能够在不从外部添加乙胺且不会蓄积、残留乙胺作为副产物的情况下高效地制造茶氨酸，但乙醛并不安全，此举并无太多益处。γ-谷氨酰甲胺合成酶虽然是更为优良的催化剂，但据已有文献报道或专利发明文件来看，其生产茶氨酸的效率并不高。阻碍微生物酶法生产茶氨酸效率的一个原因是γ-谷氨酰甲胺合成酶容易失活。从相关文献的报道来看，茶氨酸的生产速率随着反应时间的延长而降低，符合酶的失活曲线，此为酶本身的性质决定。因此，如何提高γ-谷氨酰甲胺合成酶的热稳定性以及提高其生产茶氨酸的效率，为酶法工业化生产茶氨酸提供有效途径是当前亟需解决的技术问题。
微生物表面展示技术是近年来应用极为广泛的一种基因工程技术，通过锚定蛋白和外源蛋白的基因序列共表达，使表达的外源蛋白以融合蛋白的形式展现于微生物细胞表面，并保持相对独立的空间结构和生物活性。将外源蛋白表面展示于微生物细胞表面，提高酶的稳定性并且实现了酶的固定化。而整个微生物细胞可以直接作为全细胞催化剂，减少了底物和产物的胞内运输过程，克服了跨膜阻力的影响，提高了反应速率；此外，与胞内酶相比，一方面避免了胞内蛋白酶和肽酶的水解作用，有利于维持酶活力的稳定和产物的积累；然而，一般所选择的锚定蛋白都是外膜蛋白或转运蛋白，在细胞外表面上的位点有限，且表达后过多的结合，富集于细胞表面，不利于细胞摄取营养物质进行生长和代谢。另一方面，锚定蛋白本身作为蛋白质，其组成氨基酸，与酶催化所需要的最适条件匹配的概率并不高，表面展示后用于催化反应，与细胞固定化的结合力可能大打折扣。这也是现有的细胞固定化体系不能应用于所有酶的原因之一。
总之，本领域亟需一种能够降低生产成本、提高经济效益、实现酶的重复利用，还能解决酶回收难、成本高等问题的新技术。
发明内容
针对现有技术中的不足之处，本发明获得热稳定性提高和最适温度提高的γ-谷酰胺甲胺合成酶突变体，并通过γ-谷酰胺甲胺合成酶突变基因与辅助侵染蛋白的基因的融合表达，构建出外泌的固定化酶，该酶可在中性的pH(7.5)和室温温度(25℃)与其生产细胞结合，完成一步纯化-固定化过程，形成稳定性提高的酶以及连续催化生产，为酶法工业化生产提供有效途径。该突变体耐受的pH域广，与活性酶进行融合表达，融合表达后的酶同时具有催化活性域与固定化能力。
本发明首先公开一种γ-谷酰胺甲胺合成酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明另一方面保护一种γ-谷酰胺甲胺合成酶重组质粒，其所述重组质粒为将辅助侵染蛋白的基因与γ-谷酰胺甲胺合成酶突变体的基因重组；其中，所述辅助侵染蛋白的基因，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述γ-谷酰胺甲胺合成酶突变体的基因，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第三方面在于保护一种含上午所述重组质粒的外泌γ-谷酰胺甲胺合成酶重组菌体；所述外泌γ-谷酰胺甲胺合成酶重组菌体是通过将辅助侵染蛋白的基因与γ-谷酰胺甲胺合成酶突变体的基因进行融合表达而得，其中，所述的辅助侵染蛋白残基，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述的γ-谷酰胺甲胺合成酶突变体，其氨基酸序列如SEQID NO.2 所示。
进一步地，所述的γ-谷酰胺甲胺合成酶重组菌体的宿主选自谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或乳酸菌中的一种。
本发明的第四方面在于保护所述的外泌γ-谷酰胺甲胺合成酶重组菌体在高浓度底物连续循环催化中的应用；包括利用所述γ-谷酰胺甲胺合成酶重组菌体发酵获得的γ-谷酰胺甲胺合成酶在其生产菌株上的自固定化过程，发酵过程中的底物溶液包括L-谷氨酸钠以200-850 mM。更优选750-850mM。
进一步的，所述底物溶液I包括：L-谷氨酸钠200-800mM、乙胺盐酸盐250-1000mM、MgSO4·7H2O 100-150mM、ATP 150-750mM，温度35-45℃，pH 6.5-7.5。优选范围是L-谷氨酸钠800mM、乙胺盐酸盐1000mM、MgSO4·7H2O 150mM、ATP 750mM，温度45℃， pH 6.5-7.5。
更进一步优选的，上文所述自固定化过程还包括：所述重组菌体发酵所得的γ-谷酰胺甲胺合成酶在其生产菌株上自固定化得γ-谷酰胺甲胺合成酶固定化载体后，进行发酵培养，发酵过程中的γ-谷酰胺甲胺合成酶固定化载体浓度为60～150g/50L，发酵培养结束后，通过调节温度为室温，pH中性条件下，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入到新的底物溶液I中重复所述固定化过程，进行新一轮发酵；如此循环不少于20次，每次发酵时间不超过16h。
本发明的又一方面在于保护所述的γ-谷酰胺甲胺合成酶突变体在连续催化中耦合ATP 再生系统的应用，包括以下步骤：所述γ-谷酰胺甲胺合成酶重组菌体发酵所得的γ-谷酰胺甲胺合成酶在其生产菌株上自固定化后，加入ppk菌体，投入底物溶液II中进行发酵；发酵过程中的γ-谷酰胺甲胺合成酶固定化载体浓度为60-100g/50L，ppk菌体浓度为0.5g/L；进行发酵培养，在发酵培养结束后，通过调节温度为室温，pH中性条件下，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入到新的底物溶液II中重复所述固定化过程，进行新一轮发酵；如此循环不少于25次，每次发酵时间不超过12h；其中，所述发酵过程中的底物溶液 II包括L-谷氨酸钠与ATP以(770-830mM)：(6-10mM)计。
进一步的，所述底物溶液II包括：L-谷氨酸钠600-1000mM、乙胺盐酸盐800-1200mM、 MgSO4·7H2O 200-250mM、ATP 5-10mM、六偏磷酸钠200-300mM；pH＝6.5-7.5。更进一步优选的，所述底物溶液II包括：L-谷氨酸钠800mM、乙胺盐酸盐1000mM、MgSO4·7H2O250mM、ATP 8mM、六偏磷酸钠250mM。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明提供了一种适应高底物浓度和具有更高催化温度的γ-谷酰胺甲胺合成酶蛋白的突变体；
2.将辅助侵染蛋白IAP与突变的γ-谷酰胺甲胺合成酶蛋白融合表达的设计方案，能够同时实现催化过程和外泌酶的纯化固定化；
3.与表面展示不同，培养过程中外泌γ-谷酰胺甲胺合成酶外泌表达，分布于发酵液中，大量生产后不会影响细胞营养的摄入和代谢空间；
4.所述固定化酶的催化工艺可放大和循环，其能够在25次的循环次数下仍保持催化活性；产物浓度不降低。
5.固定化酶能够高效催化高浓度底物(800mM)生成茶氨酸。
6.通过本申请的对比例和实施例数据对比分析可知：所获得的外泌蛋白能够在特定的环境下(在pH7.5附近结合、室温)固定化到基质上，所述基质来源于生产蛋白的基因工程细胞——实施例为外泌蛋白的宿主细胞。
附图说明
图1不同pH下固定化酶结合效果比较；
图2不同温度下固定化酶结合效果比较
图3催化过程的放大后的茶氨酸产量。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细地描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
本发明中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从商业途径购买。
热稳定性测定：用PBS将表达活性酶的细胞重悬液稀释至30g/L，在35℃和45℃下孵育，每次取一定体积使得反应体系中细胞浓度为2g/L，在200mM底物体系中测定孵育不同时间的残余酶活。
实施例1
1.质粒和菌株构建
将密码子优化后的γ-谷酰胺甲胺合成酶的编码基因(SEQ ID NO:1)送生工合成并在两端引入XbaI和EcoRI酶切位点，连入pXMJ19质粒，获得pXMJ-GMAS质粒。质粒经菌落PCR和测序验证正确后转入到谷氨酸棒杆菌中，得到C.g-pXMJ-GMAS菌株。质粒测序获得突变体pXMJ-GMAS-M12质粒，同样转入到谷氨酸棒杆菌中，得到C.g-pXMJ-GMAS-M12 菌株。
将辅助侵染蛋白IAP残基(SEQ ID No.3)的编码基因在质粒pXMJ-GMAS-M12上与GMAS-M12基因融合表达，经测序验证正确后同样转入谷氨酸棒杆菌中，命名为 C.g-pXMJ-iap-GMAS-M12。
④蛋白的表达
将C.g-pXMJ-GMAS和C.g-pXMJ-GMAS-M12程菌接入含有20mg/L氯霉素的BHI培养基中，35℃，200rpm过夜培养后按照10％的接种量转接入新鲜的含有50mg/L的BHI培养基中，35℃，200rpm培养至OD562＝0.6～0.8时后加入0.2mM IPTG进行诱导，诱导12h 后收集细胞。
将C.g-pXMJ-iap-GMAS-M12工程菌接入含有20mg/L氯霉素的BHI培养基中，35℃，200rpm过夜培养后按照10％的接种量转接入新鲜的含有50mg/L氯霉素的BHI培养基中，35℃，200rpm培养至OD562＝0.6～0.8时后加入0.2mM IPTG进行诱导，诱导12h。
⑤融合酶的纯化固定化
将C.g-pXMJ-iap-GMAS-M12的发酵液调至25-30℃，pH 7.5下结合1h，洗涤一次后即为固定于细胞表面的纯酶，亦为固定化酶。
实施例2
不同pH对γ-谷酰胺甲胺合成酶及其突变体效果的影响
反应体系如下：L-谷氨酸钠200mM、乙胺盐酸盐250mM、MgSO4·7H2O 100mM、ATP150mM，用30％盐酸/20％硫酸调节pH＝6-8，投入2g/L C.g-pXMJ-GMAS、C.g-pXMJ-GMAS-M12；C.g-pXMJ-iap-GMAS-M12的细胞，在45℃下反应60min取样，用10％三氯乙酸等比例终止反应，8000rpm离心5min后，HPLC检测产物茶氨酸的浓度及底物剩余。
在上述反应体系中，比较pH对反应效果的影响。从图1中可以看出，γ-谷酰胺甲胺合成酶最pH＝7.0-7.5，其突变体最适pH＝6.5-7.0，而融合表达辅助侵染残基的序列后，C.g-pXMJ-iap-GMAS-M12的最佳pH＝6.5-7.5。
实施例3
不同温度对结合效果的影响
反应体系如实施例2：，用30％盐酸/20％硫酸调节至各自的最佳pH，投入2g/LC.g-pXMJ-GMAS、C.g-pXMJ-GMAS-M12；C.g-pXMJ-iap-GMAS-M12的细胞，在35～45℃下反应，每隔30min取样，用10％三氯乙酸等比例终止反应，8000rpm离心5min后，HPLC 检测产物茶氨酸的浓度及底物剩余。
在上述反应体系中，比较温度对反应效果的影响。从图2中可以看出，γ-谷酰胺甲胺合成酶的突变使得其最适温度C.g-pXMJ-GMAS-M12比C.g-pXMJ-GMAS提高，由35℃提高至45℃，且反应速度增快；而融合表达辅助侵染残基的序列后，C.g-pXMJ-iap-GMAS-M12 最适温度仍为45℃。
将各个细胞分别于35℃和45℃下孵育，以未孵育时酶活为100％，测定孵育不同时间的残余酶活。从表3中的数据可见，突变体使得酶的热稳定性提升，8h时突变体的残余酶活是C.g-pXMJ-GMAS的1.05倍，12h时该差距已增加至1.18倍，孵育24h， C.g-pXMJ-GMAS-M12的残余酶活是C.g-pXMJ–GMAS的1.5倍多。融合表达对于酶的热稳定性影响不大，C.g-pXMJ-iap-GMAS-M12的热稳定性相比于C.g-pXMJ-GMAS-M12略有提升，在孵育24h后可见3％的差距。
表3γ-谷酰胺甲胺合成酶及其突变体、固定化酶的热稳定性
实施例4催化过程的放大
配置底物溶液I：L-谷氨酸钠800mM、乙胺盐酸盐1000mM、MgSO4·7H2O 150mM、 ATP750mM，用30％盐酸/20％硫酸调节pH＝6.5-7.5；
在50L的反应体系中，用30％盐酸/20％硫酸调节pH＝6.5-7.5；将分别投入60～150g固定化酶C.g-pXMJ-iap-GMAS-M12，在45℃下反应，每隔2～4h取样，用10％三氯乙酸等比例终止反应，8000rpm离心5min后，HPLC检测产物茶氨酸的浓度及底物剩余。图3中可观察到，放大后的反应在12h达到终点，产物茶氨酸浓度达127.2g/L，转化率达91.3％。
在底物溶液I中L-谷氨酸钠800mM的情况下，固定化酶的投入量在60-150g/50L范围内都能够达到超过90％的转化率，更少的酶在12h内不足以完成这一催化过程。
实施例5
试验组-固定化酶的循环
取80g固定化酶C.g-pXMJ-iap-GMAS-M12，投入到实施例4所述的底物溶液I中，反应体积为50L，在pH＝6.5-7.5，45℃下反应9h可生成125±2.5g/L的L-茶氨酸。
反应结束后，调节溶液pH＝7.5，降低温度至25-30℃，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物作为固定化酶重新投入底物溶液I中，反应体积为50L，在45℃下反应，每隔2h取样检测产物浓度及底物剩余；如此循环20次产物浓度不降低，且能保证每次反应时间在15h内。
对比组1
取80g固定化酶C.g-pXMJ-iap-GMAS-M12，投入到底物溶液I中，反应体积为50L，在pH＝6.5-7.5，45℃下反应9h可生成125±2.5g/L的L-茶氨酸。
反应结束后，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入到底物溶液I中，反应体积同样为50L，在45℃下反应，每隔2h取样检测产物浓度及底物剩余；如此循环的次数有所降低，最多能够达到16次循环的情况下保证产物浓度不降低，但每次反应时间逐渐延，甚至延长1-2h，最后的循环在20h才完成，延长的反应时间不利于规模化生产中的实际应用。
实施例6耦合ATP再生系统的固定化酶的循环
1，配置底物溶液II：包括L-谷氨酸钠800mM、乙胺盐酸盐1000mM、MgSO4·7H2O 250mM、ATP 8mM、六偏磷酸钠250mM，pH7.5；
2.取80g固定化酶C.g-pXMJ-iap-GMAS-M12，投入到底物溶液II，加入专利CN110387379A中的ppk湿菌体0.5g/L，反应体积为50L，在pH＝6.5-7.5，45℃下反应，8h 内可生成126±3.1g/L的L-茶氨酸。反应结束后，调节溶液pH＝7.5，降低温度至25-30℃，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物(作为固定化酶)重新投入到底物溶液II中，重复上述步骤2，每隔2h取样检测产物浓度及底物剩余；如此循环25次，产物浓度不降低，且能保证每次反应时间在12h内。
实施例7
按照常规操作在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌中表达iap-GMAS-M12的融合酶，培养结束后将发酵液调至25-30℃，pH 7.5下结合1h，洗涤一次后，将细胞浓度调整至800g/50L，取反应体积的1/10投入到底物溶液II中，加入专利CN 110387379 A中的ppk湿菌体0.5g/L，过程中小心维持混合过程中pH＝6.5-7.5，反应体积为50L，在45℃下，分别在 7h、5h、12h可生成125±3g/L的L-茶氨酸。反应结束后，调节溶液pH＝7.5，降低温度至 25-30℃，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入底物溶液中进行反应，有效循环次数分别达到26次、29次和21次。
对比例1
游离酶
将获得的C.g-pXMJ-GMAS-M12工程菌接入含有20mg/L的BHI培养基中，35℃，200rpm过夜培养后按照10％的接种量转接入新鲜的含有20mg/L的BHI培养基中，35℃，200 rpm培养12h后加入0.2mM IPTG进行诱导，诱导12h后收集细胞，将细胞浓度调整为800 g/50L后破碎，破碎后取反应体积的1/10投入到底物溶液II中，加入专利CN 110387379A 中的ppk湿菌体0.5g/L，反应体积为50L，在45℃下反应，8h可生成127g/L的L-茶氨酸。上清液具有较高的催化活性，但不能实现连续催化。同时，由于细胞最终反应液组分较为复杂，增加了分离成本。
对比例2
细胞表面展示
构建以C末端截短NCgl1221蛋白(SEQ ID NO:4)作为锚定蛋白，与GMAS-M12基因融合表达，连接于pXMJ19质粒上，转入谷氨酸棒杆菌，构建菌株命名为
C.g-pXMJ-NCg11221-GMAS-M12，接入含有20mg/L氯霉素的BHI培养基中，35℃，200rpm 过夜培养后按照10％的接种量转接入新鲜的含有20mg/L的BHI培养基中，35℃，200rpm 培养至OD562＝0.6～0.8时加入0.2mM IPTG进行诱导，诱导12h后分别收集不溶物和上清。不溶物洗涤一次后即为表面展示细胞。
同样培养条件下，细胞的生物量低于将酶分泌于培养液中；说明细胞表面展示的位点可能并不能完全分布于细胞表面，或者布满表面后不利于细菌物质代谢，影响了生长。
取80g表面展示细胞，投入到底物溶液II，加入专利CN 110387379 A中的ppk湿菌体 0.5g/L，反应体积为50L，在pH＝6.5-7.5，45℃下反应，8h时茶氨酸产量仅为89.2g/L，是固定化酶催化效率的70.2％。
对比例3
包埋法固定化
1)海藻酸钠载体制备：将海藻酸钠用15g甘油浸润，然后加入约75mL去离子水，搅拌溶解后，加入1％聚乙二醇辛基苯基醚、0.8％聚乙二醇、0.5mM二硫苏糖醇，搅拌溶解，得到终浓度为4.5％海藻酸钠溶液；2)培养C.g-pXMJ-GMAS-M12细胞，收集后将细胞浓度调整至80g/50L后破碎，破碎酶液加入步骤(1)制备的海藻酸钠溶液，二者混合均匀，得到海藻酸钠酶溶液；3)用恒流泵外接注射器针头将海藻酸钠酶匀速速度滴入到5％的CaCl2溶液中搅拌固定；4)过滤，PBS缓冲液反复洗涤凝胶沉淀，干燥，得到粒状固定化γ-谷酰胺甲胺合成酶。
取上述固定化产物，投入到底物溶液II，加入专利CN 110387379 A中的ppk湿菌体0.5 g/L，反应体积为50L，在pH＝6.5-7.5，45℃下反应，8h时茶氨酸产量为82g/L，转化率接近60％，是固定化酶催化效率的65.6％。
对比例4
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种γ-谷酰胺甲胺合成酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种γ-谷酰胺甲胺合成酶重组质粒，其特征在于：所述重组质粒为将辅助侵染蛋白的基因与γ-谷酰胺甲胺合成酶突变体的基因重组；其中，所述辅助侵染蛋白的基因，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述γ-谷酰胺甲胺合成酶突变体的基因，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种含权利要求1所述重组质粒的外泌γ-谷酰胺甲胺合成酶重组菌体；其特征在于，所述外泌γ-谷酰胺甲胺合成酶重组菌体是通过将辅助侵染蛋白的基因与γ-谷酰胺甲胺合成酶突变体的基因进行融合表达而得，其中，所述辅助侵染蛋白残基，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述γ-谷酰胺甲胺合成酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求3所述的重组菌体，其特征在于，所述γ-谷酰胺甲胺合成酶重组菌体的宿主选自谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或乳酸菌中的一种。
5.如权利要求3所述的外泌γ-谷酰胺甲胺合成酶重组菌体在高浓度底物连续循环催化中的应用；其特征在于，包括利用所述γ-谷酰胺甲胺合成酶重组菌体发酵获得的γ-谷酰胺甲胺合成酶在其生产菌株上的自固定化过程，发酵过程中的底物溶液包括L-谷氨酸钠以200-850mM。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述底物溶液I包括：L-谷氨酸钠200-800mM、乙胺盐酸盐250-1000mM、MgSO4·7H2O 100-150mM、ATP 150-750mM，温度35-45℃，pH＝6.5-7.5。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述自固定化过程还包括：所述重组菌体发酵所得的γ-谷酰胺甲胺合成酶在其生产菌株上自固定化得γ-谷酰胺甲胺合成酶固定化载体后，进行发酵培养，发酵过程中的γ-谷酰胺甲胺合成酶固定化载体浓度为60～150g/50L，发酵培养结束后，通过调节温度为室温，pH中性条件下，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入到新的底物溶液I中重复所述固定化过程，进行新一轮发酵；如此循环不少于20次，每次发酵时间不超过16h。
8.如权利要求4所述的γ-谷酰胺甲胺合成酶重组菌体耦合ATP再生系统固定化酶循环工艺中的应用；其特征在于，所述应用包括：所述γ-谷酰胺甲胺合成酶重组菌体发酵所得的γ-谷酰胺甲胺合成酶在其生产菌株上自固定化后，加入ppk菌体，投入底物溶液II中进行发酵；发酵过程中的γ-谷酰胺甲胺合成酶固定化载体浓度为60-100g/50L，ppk菌体浓度为0.5g/L；进行发酵培养，在发酵培养结束后，通过调节温度为室温，pH中性条件下，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入到新的底物溶液II中重复所述固定化过程，进行新一轮发酵；如此循环不少于25次，每次发酵时间不超过12h；其中，所述发酵过程中的底物溶液II包括L-谷氨酸钠与ATP以(770-830mM)：(6-10mM)计。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述底物溶液II包括：L-谷氨酸钠600-1000mM、乙胺盐酸盐800-1200mM、MgSO4·7H2O 200-250mM、ATP 5-10mM、六偏磷酸钠200-300mM；温度35-45℃，pH＝6.5-7.5。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述底物溶液II包括：L-谷氨酸钠800mM、乙胺盐酸盐1000mM、MgSO4·7H2O 250mM、ATP 8mM、六偏磷酸钠250mM。
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