KR102177743B1

KR102177743B1 - 4-하이드록시발레르산을 생산하는 형질전환된 슈도모나스 푸티다

Info

Publication number: KR102177743B1
Application number: KR1020190040086A
Authority: KR
Inventors: 이성국; 찬드란사테쉬프라부
Original assignee: 울산과학기술원
Priority date: 2019-04-05
Filing date: 2019-04-05
Publication date: 2020-11-11
Also published as: KR20200117654A

Abstract

본 발명은 4-하이드록시발레르산을 고농도로 생산하기 위해 유전자 변형을 시킨 재조합 미생물 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)에 관한 것이다. 본 발명의 LvaAB 유전자의 발현이 억제되고, TesB 유전자가 과발현된 형질전환된 슈도모나스 푸티다 균주로부터 47 g/L의 4HV를 수득하였다. 이는 현재까지 재생 가능한 저비용 공급원료인 레불린산으로부터 수득 가능한 4HV의 생산량 중 가장 높은 생산량이다. 상기 증가된 생산율은 기질 또는 중간체를 중심 대사물질로 완전히 이화시킬 수 없는 균주를 구축함으로써 수득되었다. 본 발명에 따른 형질전환된 재조합 미생물은 외부 유도제를 필요로 하지 않고, 비용 효율적이며, 공정이 용이하고, 산업적 규모로의 확장이 가능하다. 본 발명의 형질전환된 재조합 미생물은 기질로부터 4HV를 대량 생산하는데 활용될 수 있다.

Description

4-하이드록시발레르산을 생산하는 형질전환된 슈도모나스 푸티다{RECOMBINANT PSEUDOMONAS PUTIDA PRODUCING 4-HYDROXYVALERATE}

본 발명은 4-하이드록시발레르산을 고농도로 생산하기 위해 유전자 변형을 시킨 재조합 미생물 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)에 관한 것이다.

4-하이드록시발레르산(4-hydroxyvalerate, 4HV)은 폴리에스터, 생분해성 및 생체-적합성 폴리에스터, 정밀 화학 및 의약품 등의 다양한 제품을 생산하는데 사용되는 화합물이다. 이러한 4HV로부터 연료, 용매, 식품 첨가제 및 부가 가치 탄소 화학 물질의 전구체로 사용될 수 있는 γ- 발레로락톤(gamma valerolactone, GVL)을 생성할 수 있다(Muzaiyanah AR and Amirul AA, 2013).

단량체 4HV는 화학적 합성을 통해 수득되거나, 생물학적 방법을 통해 수득될 수 있다. 그러나, 화학적 합성 방법은 낮은 수율, 가혹한 조건의 사용, 촉매 및 유기 용매의 사용과 같은 많은 단점이 있다. 반면, 생물학적 합성은 알칼리제니스 페칼리스(Alcaligenes faecalis) 균주로부터 수득된 효소인 3-하이드록시부티레이트 디히드로게나제(3-hydroxybutyrate dehydrogenase, 3HBDH)를 사용하여 4HV를 합성한 바 있다.

한편, 목적 화합물의 합성을 위해 통상적으로 사용되는 유도성 재조합 단백질 발현 시스템은 이소프로필-β-D-티오갈락토시드와 같은 효율적인 유도제를 필요로 한다. 이러한 유도 시스템은 비용 및 산업적 규모로의 확장 면에서 제한이 있다.

Muzaiyanah AR and Amirul AA, Studies on the microbial synthesis and characterization of polyhydroxyalkanoates containing 4-hydroxyvalerate using γ-valerolactone. Appl Biochem Biotechnol. 2013 Jul;170(5):1194-215. doi: 10.1007/s12010-013-0247-6. Epub 2013 May 7.

이에, 본 발명자들은 P. putida에서 재생 가능한 공급원료로부터 높은 역가의 4HV를 수득할 수 있는 시스템을 구축하였다.

본 발명은 4-하이드록시발레르산을 고농도로 생산하기 위해 유전자 변형을 시킨 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 LvaAB 유전자의 발현이 억제되고, TesB 유전자가 과발현된 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 LvaAB 유전자의 발현이 억제되고, TesB 유전자가 과발현된 형질전환된 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 재조합 미생물로부터 생산되는 4-하이드록시발레르산을 수득하는 단계를 포함하는, 4-하이드록시발레르산의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 LvaAB 유전자의 발현이 억제되고, TesB 유전자가 과발현된 형질전환된 슈도모나스 푸티다 균주로부터 47 g/L의 4HV를 수득하였다. 이는 현재까지 재생 가능한 저비용 공급원료인 레불린산으로부터 수득 가능한 4HV의 생산량 중 가장 높은 생산량이다. 상기 증가된 생산율은 기질 또는 중간체를 중심 대사물질로 완전히 이화시킬 수 없는 균주를 구축함으로써 수득되었다. 본 발명에 따른 형질전환된 재조합 미생물은 외부 유도제를 필요로 하지 않고, 비용 효율적이며, 공정이 용이하고, 산업적 규모로의 확장이 가능하다. 본 발명의 형질전환된 재조합 미생물은 기질로부터 4HV를 대량 생산하는데 활용될 수 있다.

도 1은 Pseudomonas putida 균주 내 레불린산(levulinic acid, LA)으로부터 4-하이드록시발레르산(4-hydroxyvalerate, 4HV)을 합성하는 경로를 도식화한 것이다.
도 2는 PCR을 통해 LvaAB의 결실을 확인한 것이다.
도 3은 LA가 보충된 배지에서 LvaAB 결실이 균주 성장에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 4는 LA로 보충된 배지에서 Pp:ΔAB 및 WT에 의한 LA 소비 및 4HV의 생산량을 나타낸 것이다.
도 5는 LA 또는 4HV가 포함된 배지에서 성장시킨 Pp:ΔAB:eGFP 균주에서 형광 강도(eGFP)를 측정하여 나타낸 것이다.
도 6은 LA로 보충된 배지에서 성장시킨 WT:TesB 및 Pp:ΔAB:TesB 균주에 의한 LA 소비 및 4HV 생산량을 나타낸 것이다.
도 7은 Glu 또는 Gly이 포함된 LB 또는 TB 배지에서 Pp:ΔAB:TesB에 의해 생산된 4HV의 농도를 나타낸 것이다.
도 8은 증가된 농도의 LA 및 글리세롤이 포함된 배지에서 Pp:ΔAB:TesB의 균주에 의해 생산된 4HV의 농도를 나타낸 것이다.
도 9는 4개의 조건(LA_15x3,LA_15x4,LA_20x3 및LA_25x3)에서 성장시킨 Pp:ΔAB:TesB 균주의 성장 패턴을 나타낸 것이다.
도 10은 LA_15x4 조건에서 Pp:ΔAB:TesB 균주에 의한 4HV 생산량, LA 소모량, LA에서 4HV로의 몰 전환율을 나타낸 것이다.

본 발명은 일 측면으로, LvaAB 유전자의 발현이 억제되고, TesB 유전자가 과발현된 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.

본 명세서에서 사용한 용어, "LvaAB"는 Pseudomonas putida 균주 내 lva 오페론에 존재하는 효소로서, 반응물 4HV-CoA(4-hydroxyvaleryl-CoA)와 ATP가 반응하여 4PV-CoA(4-phosphovaleryl-CoA)를 생성하는데 기여하는 단백질이다. 구체적으로, 상기 LvaAB는 인산기의 전이를 촉매하는 효소인 인산전이효소(phosphotransferase) LvaA와 가설 단백질(hypothetical protein)인 LvaB가 합성된 효소이다.

본 발명에서, LvaAB 유전자 발현의 억제는 LvaA 유전자의 발현이 억제된 것일 수 있고, LvaB 유전자의 발현이 억제된 것일 수 있으며, LvaA 유전자 및 LvaB 유전자의 발현이 모두 억제된 것일 수 있다.

이때, 상기 LvaA는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 LvaA는 서열번호 1의 아미노산 서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다. 한편, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드인 LvaA를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 상기 LvaA 단백질을 코딩하는 염기 서열은 서열번호 2의 염기 서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다.

또한, 상기 LvaB는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 LvaB는 서열번호 3의 아미노산 서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다. 한편, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드인 LvaB를 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 상기 LvaB 단백질을 코딩하는 염기 서열은 서열번호 4의 염기 서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, P. putida KT2440의 lva 오페론에서 효소인 LvaAB의 발현을 억제시킴으로써 4HV-CoA 소비 경로를 차단하였다. 이후, 레불린산(LA)이 보충된 배지 상에서 야생형(WT) 및 LvaAB가 결실된 균주(Pp:ΔAB)의 성장을 평가한 결과, WT는 성장한 반면 Pp:ΔAB 균주는 성장하지 않았다. 이는 LvaAB의 결실이 4HV-CoA가 다른 물질로 전환되는 것을 차단함으로써 LA 이화작용에 영향을 준다는 것을 의미한다. 이때, 상기 Pp는 P. putida를 의미하며, Pp:ΔAB는 LvaAB 유전자가 결실된 P. putida 균주를 의미한다.

이때, 유전자의 발현을 억제시키는 방법은 목적 유전자의 일부 또는 전부 결실, 유전자의 일부를 치환하거나 유전자의 외부 핵산을 도입한 것일 수 있다. 일 구체예로, 재조합 미생물은 LvaAB 유전자의 활성이 내재적 활성에 비해 약화 또는 불활성화되어 4-하이드록시발레르산의 생산능이 향상될 수 있다. 또한, TesB 유전자가 도입된 균주는 더욱 효과적으로 4-하이드록시발레르산을 생산할 수 있다.

본 명세서에서 사용한 용어, "TesB"는 P. putida 균주에서 4HV-CoA를 4HV로 전환시키는 짧은 사슬 또는 넓은 사슬-길이에 특이적인 티오에스터라제(thioesterase)로서, 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 TesB는 서열번호 5의 아미노산 서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다. 한편, 상기 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드인 TesB 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 6의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 상기 TesB 단백질을 코딩하는 염기 서열은 서열번호 6의 염기 서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용한 용어, "재조합 미생물"은 본 발명의 목적상 기질을 4-하이드록시발레르산으로 전환시킬 수 있는 능력을 지닌 미생물을 의미한다. 이때, 상기 기질은 레불린산일 수 있다. 상기 미생물의 일 구체예로는 자이모모나스(Zymomonas), 에스케리키아(Escherichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 알칼리제네스(Alcaligenes), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 버크홀데리아(Burkholderia), 올리고트로파(Oligotropha), 클렙시엘라(Klebsiella), 피치아(Pichia), 칸디아(Candida), 한세눌라(Hansenula), 사카로마이세스(Saccharomyces), 또는 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속에 속하는 미생물일 수 있다. 구체적으로 상기 재조합 미생물은 슈도모나스 푸티다(P.putida)일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 P. putida KT2440일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 레불린산으로부터 4-하이드록시발레르산의 생산능을 가지는 재조합 미생물의 제작하기 위해 P. putida KT2440를 사용하였다.

본 명세서에서 사용한 용어, "4-하이드록시발레르산"은 CH₃CH(OH)(CH₂)₂COOH의 화학식을 가지며, 하기 화학식 1과 같은 구조를 가질 수 있다.

[화학식 1]

본 발명에서 4-하이드록시발레르산은 생물학적으로 생산될 수 있다. 구체적으로, 상기 4-하이드록시발레르산은 본원의 형질전환된 미생물을 이용하여 레불린산(LA)으로부터 생산될 수 있다. 즉, 본 발명의 LvaAB 유전자의 발현이 억제되고, TesB 유전자가 과발현된 형질전환된 재조합 미생물은 기질로서 레불린산을 이용할 수 있다.

본 명세서에서 사용한 용어, "레불린산"은 C₅H₈O₃의 화학식을 가지며, 하기 화학식 2와 같은 구조를 가질 수 있다.

[화학식 2]

본 발명은 다른 측면으로, 본 발명의 LvaAB 유전자의 발현이 억제되고, TesB 유전자가 과발현된 형질전환된 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 재조합 미생물로부터 생산되는 4-하이드록시발레르산을 수득하는 단계를 포함하는, 4-하이드록시발레르산의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 4-하이드록시발레르산을 제조하는 방법은, 본 발명의 발명의 LvaAB 유전자의 발현이 억제되고, TesB 유전자가 과발현된 형질전환된 재조합 미생물을 레불린산 또는 글리세롤을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 레불린산을 포함하는 배지를 글루코스 또는 글리세롤과 같은 추가의 탄소 공급원으로 보충하였다. 그 결과, Pp:ΔAB:TesB 균주는 글루코스 또는 글리세롤로 보충된 배지로부터 약 7 g/L 및 11 g/L의 4HV를 각각 생산하였다. 글리세롤을 첨가하면 글루코스를 첨가한 것보다 역가가 57% 증가하는 것을 알 수 있었다.

본 발명의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 슈도모나스 속 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 구체적으로는 본 발명의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.

탄소원의 예로는 수크로오스 또는 글루코오스가 포함될 수 있고, 수크로오스를 다량으로 포함한 당밀 또한 탄소원으로 이용될 수 있으며, 그 외의 적적량의 탄소원이 다양하게 이용될 수 있다.

질소원의 예로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원이 포함될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산 철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다.

배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다.

배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 40℃, 구체적으로는 25℃ 내지 35℃, 더욱 구체적으로는 30℃일 수 있으나, 목적하는 목적에 따라 제한 없이 변경될 수 있다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량에 도달할 때까지 계속 할 수 있으며, 구체적으로는 10 내지 100 시간일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 4-하이드록시발레르산을 생산하는 방법은, 상기 배양에 따른 배지 또는 상기 미생물로부터 생산되는 4-하이드록시발레르산을 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 미생물 또는 배지로부터 4-하이드록시발레르산을 회수하는 방법은 당업계에 알려진 방법, 예컨대 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. LvaAB 유전자가 결실된 형질전환된 슈도모나스 푸티다 제작

본 발명자들은 전구체 가용성(4HV-CoA)을 증가시킴으로써 원하는 생성물(4HV)의 합성이 향상될 수 있다는 가설을 세웠다. 이를 달성하기 위해, P. putida KT2440(ATCC 47054)의 lva 오페론에서 효소인 LvaAB를 결실시킴으로써 4HV-CoA 소비 경로를 차단하였다. 이때, LvaAB를 결실시키는 방법은 하기와 같다: LvaAB 유전자는 pQSAK 플라스미드를 사용하는 sacB 음성 카운터-셀렉션(counter-selection) 시스템에 기초한 scar-less chromosomal in-frame 유전자 결실 방법을 사용하여 결실시켰다. 구체적으로, LvaAB를 결실시키기 위해, 표적 유전자의 500 bp 업스트림(PCR 프라이머: lvaAB_US_FP(서열번호 7) 및 lvaAB_US_RP(서열번호 8)) 및 다운스트림을 함유하는 단편을 PCR 증폭시키고, 상기 두 단편을 overlap extension PCR에 의해 연결시키고, PCR 산물을 제한 효소(AatII 및 XbaI)로 절단하였다. 이어서, 상기 절단된 단편을 pQSAK에 클로닝하였다. 그 다음, 상기 구성된 플라스미드를 MicroPulser 전기천공기(Bio-Rad)를 사용하여 전기천공법에 의해 P. putida 균주의 electro-competent 세포로 형질전환 시켰다. 이후, 상기 세포를 200 rpm의 속도로 2시간 동안 30℃에서 인큐베이션하였다. 그리고, 상기 세포를 Kanamycin(50 μg/mL)을 포함한 LB 평면 한천(agar plate)에 도포하고 30℃에서 밤샘 배양하였다. 이후, 상기 콜로니들을 하기 프라이머 세트(lvaAB5(서열번호 9), lvaAB_DS_RP(XbaI; 서열번호 10), lvaAB_US_FP(AatII; 서열번호 11) 및 lvaAB6(서열번호 12))를 사용하여 플라스미드 통합을 위해 스크리닝하였다.

양성 콜로니들은 골라내고 200 uL의 LB 브로스(broth)와 함께 세포 현탁액을을 제조하였다. 이후, 적절한 희석(1:100) 후, 상기 세포를 10% 수크로오스(sucrose)를 포함하는 LB 배지에 도포하였다. 상기 플레이트는 30℃에서 인큐베이션하였다. 이후, LB+수크로오스 플레이트에서 자란 약 50개의 콜로니들을 취하여 LB+ Kanamycin 플레이트 및 LB+수크로오스 플레이트에 복제 평판하였다. 30℃에서 인큐베이션한 후, 상기 수크로오스 플레이트에서만 자란 콜로니들을 결실 변이로서 간주하였다. 상기 결실은 프라이머 lvaAB5(서열번호 9) 및 lvaAB6(서열번호 12)를 사용한 콜로니 PCR에 의해 확인하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, lvaAB 결실은 프라이머 lvaAB5 및 프라이머 lvaAB6를 사용하여 PCR에 의해 확인되었다. 이때, LvaAB 유전자 사이즈는 1.4kb로 나타났다.

실시예 2. 형질전환된 균주의 표현형 확인

이후, 미량정량판(microtiter plate) 판독기 상에서 단독 탄소 공급원으로서 20 mM의 레불린산(LA)이 보충된 M9 배지 상에서 야생형(WT) 및 LvaAB가 결실된 균주(Pp:ΔAB)의 성장을 평가하였다. 또한, LA로 보충한 TB 배지에서 배양할 때 Pp:ΔAB 균주에서의 LA 소비를 WT와 비교하였다. 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, WT는 성장한 반면 Pp:ΔAB 균주는 LA 상에서 성장하지 않았다. 이는 lvaAB의 결실이 4HV-CoA의 중심 대사물질로의 전환을 차단함으로써 LA 이화작용에 영향을 준다는 것을 의미한다. 또한, 도 4에 나타난 바와 같이, 배양 48시간 후에도 Pp:ΔAB 균주의 배양 배지에서 약 75%의 LA가 남아있었다. 반면에, WT는 거의 대부분의 LA를 활용하였다. 이는 세포 성장에 잘 반영되어 있다. Pp:ΔAB 균주는 2.4 g/L(보정된 LA의 25%를 차지함)의 4HV를 생산하였다. 본 발명에서는 기질(LA)의 효율적인 활용을 위해, P. putida KT2440 균주를 조작하고, 조작된 Pp:ΔAB 균주를 추가의 실험에서 사용하였다. 이때, 도 4의 데이터는 3개의 상이한 실험의 평균을 나타내며, 오차 막대는 표준편차를 나타낸다.

실시예 3. 기질 유도성 발현 시스템

본 발명자들은 LA로부터 4HV를 생산하기 위해 기질(LA) 유도성 발현 시스템을 구축하여 TesB를 발현시켰다. lva 오페론이 전사 활성화제인 LvaR에 의해 상향조절 된다는 보고에 따라, LvaR 단백질을 사용하여 LA 유도성 시스템을 구축하였다. 천연 프로모터(P _lvaR ) 및 LvaA의 프로모터(P _lvaA ) 영역을 갖는 LvaR을 함유하는 분절(lvaR-P _lvaR -P _lvaA )을 pPROBE의 eGFP의 상류에 연결시켰다. 이때, P _lvaR _-P _lvaA 프로모터의 서열을 서열번호 13에 나타내었다. LA 또는 4HV(각각 10 mM)로 보충된 LB 배지에서 배양시킨 Pp:ΔAB:eGFP 균주(pPROBE_LvaR_ P _lvaA _eGFP를 보유함)의 형광 강도를 평가함으로써 LvaR을 통한 P _lvaA 의 유도를 분석하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, LA로 배양한 Pp:ΔAB:eGFP 균주는 대조 조건과 비교하여 유의하게 더 높은 형광 강도를 나타내었다. 이때, 도 5의 데이터는 3개의 상이한 실험의 평균을 나타내며, 오차 막대는 표준편차를 나타낸다.

실시예 4. 기질 유도성 발현 시스템에 의한 4HV의 생산

P _lvaA 의 조절 하에 E. coli로부터 TesB를 과발현시켜, 4HV-CoA로부터 CoA를 제거하여 4HV를 생성하였다. WT:TesB 및 Pp:ΔAB:TesB 균주에서 4HV 역가를 평가함으로써 본 기질 유도성 발현 시스템의 효율을 평가하였다. 구체적으로, 250 mL의 진탕 플라스크에서 10 g/L의 LA로 보정된 20 mL의 TB 배지에서 상기 균주를 성장시켰다. 배양 3시간 후(OD₆₀₀=1.0-1.5) 배양물에 LA(10 g/l)를 첨가하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, Pp:ΔAB:TesB 균주가 WT:TesB 균주에 비해 거의 3배 양(4.6 g/L의 4HV)의 4HV를 생산하였다. Pp:ΔAB:TesB 균주는 약 99%의 전환율을 나타내었으며, 이는 WT:TesB(24%)보다 4배 이상 더 높았다. 또한, 배양 24시간 후에도 Pp:ΔAB:TesB의 TB 배양물에 약 55%의 LA가 여전히 남아있었다.

또한, TB 배지를 글루코스 또는 글리세롤과 같은 추가의 탄소 공급원으로 보충하였다. 이때, 상이한 농도의 글루코스 또는 글리세롤을 보다 높은 농도의 LA(20 g/L)를 포함하는 TB 배지에 첨가하여 4HV를 생산하였다. 배양 3시간 후 및 24시간 후에 LA를 2회의 회분 식으로(각각 10 g/L) 배양물에 첨가하였다. TB 배지(2배 더 높은 4HV 역가)는 추가의 탄소 공급원이 없더라도 LB 배지의 것보다 더 잘 수행되었다. 따라서, 경로가 훨씬 더 풍부한 배지를 요구하는 것이 반복되었다. 그러나, Pp:ΔAB:TesB 균주는 배양 48시간에 글루코스 또는 글리세롤(각각 0.4%)로 보충된 TB 배지로부터 약 7 g/L 및 11 g/L의 4HV를 각각 생산하였다. 글리세롤을 첨가하면 글루코스를 첨가한 것보다 역가가 57% 증가하는 것으로 밝혀졌다. 이후, 글리세롤 농도를 0.8% 및 1.6%로 추가로 증가시켰다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 1.6% 글리세롤로 보충된 TB 배지의 경우, Pp:ΔAB:TesB 균주는 배양 48시간에 약 19 g/L 내지 20 g/L의 LA의 가장 높은 4HV를 생산하였다.

실시예 5. LA로부터 높은 4HV 생산

Pp:ΔAB:TesB 균주가 우수한 전환 효율을 나타냈기 때문에, TB 배지에 LA 및 글리세롤을 공급함으로써 4HV를 과잉생산 하려는 노력을 시도하였다. LA 및 글리세롤을 1:0.68의 비율로 TB 배지에 첨가하였다. Pp:ΔAB:TesB 균주를 TB 배지에서 3시간 동안 성장시켰다. 이후, 최대 48시간 또는 72시간 동안 배양 24시간 마다 상이한 농도의 LA를 회분 방식(각각의 배치는 15 g/L, 20 g/L 또는 25 g/L을 함유함)으로 배양물에 첨가하였다. 이를 4개의 군으로 분류하였다: LA_15x3(15 g/L의 LA를 3시간, 24시간, 및 48시간에 첨가하였음), LA_15x4(15 g/L의 LA를 3시간, 24시간, 48시간 및 72시간에 첨가하였음), LA_20x3(20 g/L LA를 3시간, 24시간 및 48시간에 첨가하였음) 및 LA_25x3(25 g/L LA를 3시간, 24시간 및 48시간에 첨가하였음). 그 결과를 도 8 내지 도 10에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, LA_15x3,LA_15x4,LA_20x3 및LA_25x3의 4HV 역가는 각각 약 44 g/L, 47 g/L, 38 g/L 및 37 g/L이었다. LA의 총 농도가 60 g/L를 초과하거나(LA_25x3) 회분 방식의 농도가 15 g/L를 초과하는 경우(LA_20x3 및LA_25x3), 4HV 역가의 감소가 있다는 것을 나타내었다. 또한, LA 농도가 15 g/L 또는 20 g/L를 초과하여 증가하는 경우 성장이 지연되는 것이 관찰되었다. 한편, 2L 생물반응기가 있는 유가배양 시스템에서 조차, 독성을 피하기 위해 LA 농도가 약 20 g/L로 유지되었다. 50 g/L 초과의 4HV의 축적은 세포 성장에 치명적인 것으로 밝혀졌다. 이때, 도 7의 데이터는 3개의 상이한 실험의 평균을 나타내며, 오차 막대는 표준편차를 나타낸다.

또한, 도 9는 4개의 조건(LA_15x3,LA_15x4,LA_20x3 및LA_25x3)에서 성장시키는 동안 Pp:ΔAB:TesB 균주의 성장 패턴을 나타내었다. LA_15x3 및LA_15x4에는 성장 결함이 없었다. 그러나, LA_20x3 및LA_25x3에서는 영향을 받았는데, 이는 LA의 농도가 높기 때문일 수 있다. 도 10은 LA_15x4의 조건 하에서 Pp:ΔAB:TesB 균주에 의한 4HV의 생합성에서, LA 첨가 및 소비, 4HV의 생산, 성장 및 몰 전환을 포함하는 다양한 파라미터를 나타내었다. 이때, 상기 균주는 진탕 플라스크에서 97%의 전환율을 갖는 가장 높은 역가(47 g/L)를 생산하였다. 상기 균주는 2L 생물반응기에서 2% 글루코스로 보충된 TB 배지에서 유가배양 시스템에 의해 수득되는 것보다 적어도 1.74배 더 높은 4HV를 생산하였다. 이때, 도 9 및 도 10의 데이터는 3개의 상이한 실험의 평균을 나타내며, 오차 막대는 표준편차를 나타낸다.

<110> UNIST(ULSAN NATIONAL INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY) <120> RECOMBINANT PSEUDOMONAS PUTIDA PRODUCING 4-HYDROXYVALERATE <130> FPD/201902-0036 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 376 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lvaA <400> 1 Met Lys Ser Trp Pro Arg Pro Cys Ser Trp Ala Cys Ala Asn Pro Glu 1 5 10 15 Thr Lys Gly Arg Ala Tyr Arg Thr Met Ser Ser Ser Pro Thr Ile Ser 20 25 30 Pro Ala Ser Asp Thr Phe Ala Ala Met Thr Asp Asp His Arg Leu Ala 35 40 45 Glu Phe Ile Arg Glu Gln Ala Ser Ala Thr Arg Val Val Ile Gln Ala 50 55 60 Arg Lys Arg Leu Ser Gly Gly Ala Ile Gln Glu Asn Trp Leu Leu Asp 65 70 75 80 Leu Leu Ile Glu Gly Gly Pro Trp Ala Gly Val Arg Arg Trp Val Leu 85 90 95 Arg Ser Asp Ala Leu Ser Ala Leu Pro Ala Ser Leu Asp Arg Glu Gln 100 105 110 Glu Phe Ala Val Leu Gln Val Val Tyr Gln Ala Gly Val Lys Val Pro 115 120 125 Arg Pro Leu Trp Leu Cys Arg Asp Val Arg Val His Gly Arg Val Phe 130 135 140 Phe Leu Met Glu Tyr Val Pro Gly Ser Ala Ala Gly Arg Ala Leu Ser 145 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ggcaactacc tggccagcga agaagggctg 780 gaggccgtgc tcgactggga gttcaccggc tggggagatc cttgcgagga cctcggctgg 840 ttcaccgccc gttgctggcg ttttacccgt ccagacctcg aagccggcgg cattggccag 900 ctggaggatt ttctgcgtgg ttatcacgag gtgtcttcgc tgtgcatcga gcgcagtcgg 960 ctccactact ggcaagtcat ggccaccctg cgctgggcgg tgattgcctt gcagcaaggg 1020 cagcgccatc tgtccggtga agaaccgtcg ctcgagctag cactgacagc ccggctgttg 1080 ccggagctcg aactcgacat cctgcacatg accggagccg aagcgccatg a 1131 <210> 3 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lvaB <400> 3 Met Thr Gln Pro Asn Ala His Glu Leu Leu Glu Ile Ala Arg Ala Thr 1 5 10 15 Leu Leu Glu Gln Leu Leu Pro Ala Leu Pro Gly Glu Leu Arg Tyr Pro 20 25 30 Ala Leu Met Ile Ala Asn Ala Met Ala Ile Ala Ala Arg Glu Asn Arg 35 40 45 Leu Gly Ala Gln Ala Glu Asp Gln Glu Gln Ala Arg Leu Ala Ala Leu 50 55 60 Val Asp Asp Ala Pro Ser Thr Leu Pro Asp Leu Arg Arg Gln Leu Ala 65 70 75 80 Arg Ala Ile Arg Gln Gly Ser His Asp Ala Pro Gln Thr Arg Arg Thr 85 90 95 Leu Val Glu Thr Leu Arg Gln 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gccgccacaa ggttgtgcgg ctgatgccga gacggcgggc 60 ggcttcgtcg aggttgccgc ggcagctttc caacgtttcc tttacatggc gcagttgcgc 120 gaccttgccg atggtgtgca ggtccgtttc gcctgacgac tttttccggg cgggtgaagg 180 gggagggcct tcgcacagtt caggtagcac gcgtgctagg tactgctcgt tcacgcggtg 240 ttcctcaagc agttcgcgtg ccgagagcat cgcgcgctcg atcacattct ccagttcccg 300 gacattgccc ggccaggcat agcgttcaag gtacggcagc agcgcggcgg ggatgtctgc 360 agctcccggt ggttgcccct gaacgagcag gcgctggctg atgccccggc agatcagggc 420 aatgtcctca gggcgctctc gcagcggggt ggtctgcaga cgcaggatgt tgagccggaa 480 atacaggtcg gtacggaaat cgccatcgtc catggcgctg cgcaggtcct tgtgggtggc 540 ggcaatgatg cgcacgtcga tggcaatcgg ttcggtgctg cccaggcgca ggacttcgcg 600 ctcttgcagc acgcgcagca ggcgtgtttg cagcgacacc ggcatgtcgc cgatctcgtc 660 gaggaacagc gtgccgcggt gtgctgcttc gaacaggcct ggcttgccac ctttgcgcga 720 gccgctgaag gcgccttcct cgtagccgaa caattcactt tccagcaacg actcgggaaa 780 cgccgcgcag ttgatggcga cgaaggggcc ttgccggcgc gggctttcgt tatggattcc 840 ctgggcgagc agttccttgc cggtgccgct ttcaccggta 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ttgcgcaggt aggcggcggt 1740 cgccccggcg cagacgaaca catcgacctt gcctgcctgc tccaattctc gggcggtctg 1800 tagtgcttca gccaccgagg tgtcgaggac ttcgatacga gtatctgggt agtccgtcgt 1860 gagcccggcc accacatggg cgagccggct ccgttgttgg gggcgctgca agtggctgat 1920 cagcacgacg acctgggagg caagagcatc catcacgggg cctgttcatg tttgaaatgt 1980 ttcgataatg aatcaatagc ttgcaaatat gcaacaagca gcctgacttt cgctcggcgg 2040 tgaggcgtca gaacccaggc tgtatgcggc ctgtggctga cttttgaaga gttggcccag 2100 gccttgctct tgggcttgtg ccaacccaga aaccaaaggc agggcctaca gaaccatg 2158

Claims

LvaAB 유전자의 발현이 억제되고, TesB 유전자가 과발현된 형질전환된 재조합 미생물로서, 상기 LvaAB 유전자의 발현 억제는 LvaA 유전자 및 LvaB 유전자의 발현이 모두 억제된 것이고, 상기 LvaA, LvaB 및 TesB는 각각 서열번호 1, 3 및 5의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지며, 상기 미생물은 슈도모나스(Pseudomonas) 균주인 것인, 재조합 미생물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 LvaA는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 미생물.
제3항에 있어서,
상기 서열번호 1의 아미노산을 갖는 LvaA는 서열번호 2의 염기서열에 의해 코딩되는 것인 재조합 미생물.
제1항에 있어서,
상기 LvaB는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 미생물.
제5항에 있어서,
상기 서열번호 3의 아미노산을 갖는 LvaB는 서열번호 4의 염기서열에 의해 코딩되는 것인 재조합 미생물.
제1항에 있어서,
상기 TesB는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 것인, 재조합 미생물.
제1항에 있어서,
상기 TesB 유전자는 서열번호 6의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드인 것인, 재조합 미생물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 슈도모나스 균주가 슈도모나스 푸티다(P.putida)인 것인, 재조합 미생물.
제1항에 있어서,
상기 재조합 미생물은 4-하이드록시발레르산(4HV)을 생산할 수 있는 것인, 재조합 미생물.
제11항에 있어서,
상기 재조합 미생물은 기질로 레불린산(LA)을 이용하는 것인, 재조합 미생물.
제1항의 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및
상기 재조합 미생물로부터 생산되는 4-하이드록시발레르산을 수득하는 단계를 포함하는, 4-하이드록시발레르산의 제조방법.
제13항에 있어서,
레불린산 존재하에 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 것인, 제조방법.
제13항에 있어서,
글리세롤 존재하에 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 것인, 제조방법.