KR101028039B1 - 숙신산 내성능이 증가된 균주 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법 - Google Patents

숙신산 내성능이 증가된 균주 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 숙신산 내성능이 증가된 균주 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 고농도의 숙신산 농도에서도 생장이 가능한 숙신산 내성능이 증가된 균주 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 상기 숙신산(succinic acid) 내성능이 증가된 균주는 변이 대장균 DST160 또는 타트릭산 숙신산 역수송(Tartrate/Succinate Antiporter) 효소를 코딩하는 유전자 및 콜린 디하이드로게나제(choline dehydrogenase)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 변이 대장균 DST160 또는 숙신산 내성능이 증가된 재조합 균주는 고농도의 숙신산 조건에서 사멸되지 않고 빠른속도로 증식할 수 있어, 숙신산의 산업적 생산균주로 유용하다.
대장균, 숙신산, 내성, ygjE, betA,

Description

숙신산 내성능이 증가된 균주 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법 {Microorganism Enhanced Resistance of Succinic Acid and Method for Preparing Succinic Acid Using the Same}
본 발명은 숙신산 내성능이 증가된 균주 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 고농도의 숙신산 농도에서도 생장이 가능한 숙신산 내성능이 증가된 균주 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법에 관한 것이다.
숙신산(HOOCCH2CH2COOH)은 4개의 탄소로 이루어진 다이카르복실산으로서 의약용, 식품용, 화장품 및 그 외 산업에서 사용되는 화학제품의 전구체로서 널리 사용되는 산업적·경제적 이용 가치가 매우 높은 유기산이다 (Zeikus et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 51:545, 1999; Song et al., Enzyme Microbial Technol., 39:352, 2006). 특히 최근 급격한 원유 가격의 상승과 더불어 생분해성 고분자의 주요 원료물질로서 숙신산의 사용가능성이 증명됨에 따라 급격한 수요증대가 예상되고 있다 (Willke et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 66:131, 2004).
숙신산은 화학적 합성법과 발효에 의하여 생산할 수 있으나, 현재까지 산업적으로 사용되는 대부분의 숙신산은 BASF, DuPont, BP 케미칼 등의 화학회사에서 원유 유래의 n-부탄(butane)과 아세틸렌(acetylene)을 원료물질로 사용하여 화학합성법으로 생산하고 있으며, 의약품 등 특수한 용도로 사용되는 소량의 숙신산만이 고전적인 균주 발효법에 의하여 생산되고 있다. 이와 같은 숙신산의 화학적 합성법은 제조과정에서 다량의 유해성 폐기물, 폐용액 및 폐가스(일산화탄소 포함)를 배출한다는 문제점을 가지고 있으며, 특히 자원고갈의 가능성이 높은 화석원료를 기초물질로서 사용하기때문에 이를 대체할 숙신산 생산방법의 개발이 시급하다.
이와 같은 화학적 숙신산 합성공정에 따른 문제점들을 해결하기 위하여 균주 발효를 통하여 재생 가능한 원료로부터 숙신산을 생산하는 연구가 많은 연구자들에 의해 집중적으로 수행되어 왔다. 발효를 통한 숙신산 생산에 사용하는 균주는 매우 다양하나, 크게 재조합 대장균(recombinant E. coli)과 루멘 박테리아(ruminal bacteria: Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Bacteroides, Mannheimia, Succinimonas, Succinivibrio 등)로 나눌 수 있다 (Song et al., Enzyme Microbial Technol., 39:352, 2006).
재조합 대장균을 이용한 숙신산 생산 연구들을 살펴보면, 먼저 미국 시카고 대학 연구팀이 대장균의 젖산(lactic acid) 및 개미산(formic acid) 생산에 관여하는 유전자들(ldh 및 pfl)을 제거함과 동시에 글루코스 전달시스템 유전자(ptsG)를 조작한 변이균주인 AFP111 (ATCC No. 202021)을 제작하여 숙신산 생산 증가를 시도하였다 (미국특허 5,770,435).
본 발명자들은 숙신산 생산에 관여하는 말릭 유전자(sfcA)를 ldh 유전자 및 pfl 유전자가 제거된 재조합 대장균인 NZN111 균주에 증폭시켜, NZN111 균주의 발효과정에서 축적되는 피루브산(pyruvic acid)을 억제함으로써 숙신산 생산을 증대시킨 바 있으며(Hong et al., Biotechnol. Bioeng., 74:89, 2001), 미국 조지아 대학 연구팀은 Rhizobium etli 균주의 피루브산 카르복실화 유전자(pyc)를 상기의 AFP111 균주에 발현시킴으로써 AFP111/pTrc99A-pyc 균주를 제작하고, 이를 숙신산 생산에 이용한 바 있다 (Vemuri et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 28:325, 2001).
최근에는 호기성 조건에서 숙신산 생산을 유도하기 위하여, 미국 라이스 대학 연구팀이 해당과정(Glycolysis), TCA사이클 및 글리옥실레이트(Glyoxylate) 경로에 관여하는 유전자들을 조작한 재조합 대장균 균주들을 제작하여 발표하였다 (Lin et al., Metabol. Eng., 7:116, 2005; Lin et al., Biotechnol. Bioeng., 90:775, 2005).
숙신산 생산에 있어서는 루멘 박테리아의 일종인 Actinobacillus, Anaerobiospirillum 및 Mannheimia 균주가 가장 우수한 것으로 알려져 있으며, 이들 균주에 대한 연구가 상대적으로 많이 진행되어 왔다. 미국의 Michigan Biotechnology Institute(MBI) 연구진은 Actinobacillus succinogenes 130Z 균주 (ATCC No. 55618)를 발굴하여 숙신산 생산공정(미국특허 5,504,004)을 개발하였으며, 고전적인 화학적 돌연변이 방법을 이용하여 Anaerobiospirillum succiniciproducens의 다양한 변이균주들을 개발하여 이를 숙신산 생산 및 정제공 정 개발에 이용하였다 (미국등록특허 5,521,075, 5,168,055, 및 5,143,834).
그러나 현재까지 개발된 균주들은 고농도의 숙신산이 존재하는 배지에서 기대하지 않은 세포적 생리 변화가 일어난다. 즉, 상기 균주들은 배지내에 숙신산이 고농도로 축적되면, 결국 사멸하게 된다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 숙신산의 농도를 점차적으로 증가시킨 배지에서 숙신산 생산능을 가지는 균주를 연속적으로 배양시킴으로써, 고농도의 숙신산에서 지연기 없이 생장하는 변이 대장균 DST160(E. coli W3110 DST160)를 선별하였고, 선별된 균주의 RNA 분석을 통하여 고농도의 숙신산 조건에서 생장을 강화시키는 유전자를 확인하였으며, 또한, 확인된 유전자를 숙신산 생산능을 가지는 균주에 도입 또는 증폭시킬 경우 숙신산 내성능이 증가된 재조합 균주를 제조할 수 있다는 사실을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 숙신산(succinic acid) 내성능이 증가된 변이균주를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 숙신산 내성능이 증가된 재조합 균주의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 숙신산 내성능이 증가된 변이균주 또는 재조합 균주를 이용한 숙신산의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 숙신산(succinic acid) 내성능이 증가된 변이 대장균 DST160을 제공한다.
본 발명은 또한, 숙신산 생산능을 가지는 균주에 타트릭산 숙신산 역수송(Tartrate/Succinate Antiporter) 효소를 코딩하는 유전자 및 콜린 디하이드로게나제(choline dehydrogenase)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 숙신산 내성능이 증가된 재조합 균주 및 이의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 변이 대장균 DST160 또는 숙신산 내성능이 증가된 재조합 균주를 배양하여 숙신산을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 숙신산을 회수하는 것을 특징으로 하는 숙신산의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 변이 대장균 DST160 또는 숙신산 내성능이 증가된 재조합 균주는 고농도의 숙신산 조건에서 사멸되지 않고 빠른속도로 증식할 수 있어, 숙신산의 산업적 생산균주로 유용하다.
본 발명에서는 숙신산 생산능을 가지는 균주를 숙신산의 농도를 점차적으로 증가시킨 배지에서 연속적으로 배양시킬 경우, 고농도의 숙신산 조건에서 생장이 가능한 숙신산 내성능이 증가된 변이균주를 제작할 수 있을 것으로 예측하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, E. coli W3110 균주를 숙신산을 함유하는 배지에 접종한 후, 숙신산의 농도를 점차적으로 증가시키면서 연속배양시켰다. 그 결과, 고농도의 숙신산 조건에서도 생장이 가능한 균주를 선별하였으며, 선별된 균주는 최종적으로 숙신산 농도가 160g/L의 조건에서도 생장이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 숙신산(succinic acid) 내성능이 증가된 변이 대장균 DST160에 관한 것이다.
상기 변이 대장균 DST160은 한국생명공학연구원 유전자은행에 2009년 06월 15일자로 기탁(기탁번호: KCTC 11521BP) 되었다.
한편, 상기 숙신산(succinic acid) 내성능이 증가된 변이 대장균 DST160의 RNA를 분석할 경우, 숙신산 내성능 증가와 관련된 유전자를 확인할 수 있을 것으로 예측하였다.
따라서, RNA extraction kit(RNeast mini kit; Quiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 E. coli W3110 DST 160과 E. coli W3110의 RNA를 추출하고 DNA microarray를 이용하여 두 균주의 RNA 수준을 비교하였다. microarray 결과를 증명 하기 위해, mRNA 농도는 real-time PCR을 통해서 확인하였다. 그 결과, 능동 수송 기작 관련 유전자(oppA, kdpB, malK), 센서 키나아제 유전자(barA), 조절 유전자(narL, gutM), 추정되는 수송 유전자(putative carrier genes; ygjE, ybbL, citA) 및 삼투보호제 생합성 유전자(betA, betB, proV)가 E. coli W3110 균주보다 E. coli W3110 DST 160 균주에서 3~4 배 정도 더 많이 전사 된 것을 확인하였다. 그리고, 상기 유전자들을 대상으로 E. coli W3110 균주에 발현하는 실험을 진행하여, 최종적으로 타트릭산 숙신산 역수송(Tartrate/Succinate Antiporter) 효소를 코딩하는 유전자(ygjE) 및 콜린 디하이드로게나제(choline dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(betA)가 숙신산 내성능 증가와 관련되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
상기 타트릭산 숙신산 역수송 유전자(ygjE)는 타트릭산을 유입하면서 숙신산을 세포밖으로 유출하는 기능을 담당한다. 즉 상기 유전자가 발현되면 세포 내부에 숙신산이 축적되는 것을 막고, 합성된 숙신산을 밖으로 배출시킴으로써, 고농도의 숙신산 조건에서 내성을 갖으며, 숙신산을 생산할 수 있도록 할 수 있다.
또한, 상기 콜린 디하이드로게나제(choline dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(betA)는 삼투보호제로 알려진 베타인을 세포 내부에서 합성하는 기능을 담당한다. 즉, 상기 유전자가 발현되면 세포 내에 삼투보호제인 베타인을 축적시켜, 세포내의 물 활성(water activity)과 이온 강도의 변화를 감소시키는 것을 조절함으로써, 세포가 고농도의 숙신산 조건으로부터 내성을 가질 수 있게 된다. 이와 관련하여, 많은 연구자들은 고염분의 스트레스 조건에서 균주들의 생리현상을 관찰하였다. 염분은 이온 수송, 신호 전달, 대사, 그리고 삼투압조절 등의 생리현상에 아주 중요하다. 특히 고농도의 염분 조건에서 세포벽을 통한 나트륨 이온의 유입 또는 유출은 수송 단백질 또는 세포막에 있는 채널들에 의해서 일어난다. 또 상기에서 언급한 염분의 특징중에 하나인 삼투압조절 기작은 세포내에 삼투보호제를 축적하는 것이다. 삼투보호제로는 글리신 베타인, 프롤린, 엑토인, 마니톨 등이 알려져 있다. 또한, 삼투보호제들의 축적은 세포내의 삼투압을 결정하고 이것들이 세포 내 대사를 방해하지는 않으며, 삼투압 조절현상은 세포의 항상성을 유지하는데 아주 중요한 기작으로 알려져 있다.
또한, 본 발명자들은 상기 두 유전자가 숙신산 생산능을 가지는 균주에 도입 또는 증폭될 경우, 숙신산 내성능이 증가된 재조합 균주를 제조할 수 있을 것으로 예측하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 타트릭산 숙신산 역수송(Tartrate/Succinate Antiporter) 효소를 코딩하는 유전자(ygjE) 발현벡터(pEcYgjE) 및 콜린 디하이드로게나제(choline dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(betA) 발현벡터(pEcBetA)를 제작하고, 이를 숙신산 생산능을 가지는 균주에 도입시킨 E. coli W3110(DE3)/pEcYgjE 균주 및 E. coli W3110(DE3)/pEcBetA 균주를 제조한 후, 이를 고농도의 숙신산 조건에서 배양한 결과, 고농도의 숙신산 조건에서 생장할 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 숙신산 생산능을 가지는 균주에 타트릭산 숙신산 역수송(Tartrate/Succinate Antiporter) 효소를 코딩하는 유전자 및 콜린 디하이드로게나제(choline dehydrogenase)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 숙신산 내성능이 증가된 재조합 균주에 관한 것이다.
상기 균주는 숙신산 생산능을 가지는 균주라면 제한없이 사용될 수 있으며, 박테리아, 효모, 곰팡이 등을 예시할 수 있다. 상기 박테리아는 대장균, 루멘 박테리아 등을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 타트릭산 숙신산 역수송(Tartrate/Succinate Antiporter) 효소를 코딩하는 유전자는 ygjE(ttdT이라고도 함)이고, 상기 콜린 디하이드로게나제(choline dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 betA인 것을 특징으로 할 수 있다.
앞서, 언급한 바와 같이, 상기 타트릭산 숙신산 역수송 효소를 코딩하는 유전자는 타트릭산을 유입하면서 숙신산을 세포밖으로 유출하는 기능을 담당하는 유전자이며, 상기 콜린 디하이드로게나제(choline dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(betA)는 삼투보호제로 알려진 베타인을 세포 내부에서 합성하는 기능을 담당하는 유전자이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 숙신산 생산능을 가지는 균주에 타트릭산 숙신산 역수송(Tartrate/Succinate Antiporter) 효소를 코딩하는 유전자 및 콜린 디하이드로게나제(choline dehydrogenase)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되 는 하나 이상의 유전자를 도입 또는 증폭시키는 것을 특징으로 하는 숙신산 내성능이 증가된 재조합 균주의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서 "증폭"이란 해당 유전자의 일부 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나, 일부 염기를 도입시키거나, 또는 동일한 효소를 코딩하는 다른 미생물 유래의 유전자를 도입시켜 대응하는 효소의 활성을 증가시키는 것을 포괄하는 개념이다.
본 발명은 또한, 상기 변이 대장균 DST160을 배양하여 숙신산을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 숙신산을 회수하는 것을 특징으로 하는 숙신산의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 균주를 배양하여 숙신산을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 숙신산을 회수하는 것을 특징으로 하는 숙신산의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 변이 균주 및 재조합 균주들의 배양 및 숙신산의 수득 과정은 종래 발효공정에서 통상적으로 알려진 배양방법 및 숙신산의 분리 및 정제방법을 사용하여 수행할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
특히, 하기 실시예에서는 본 발명에 따른 특정 벡터와 숙주세포로 현재까지 가장 많은 숙신산을 생산하는 미생물인 대장균 속 미생물만을 예시하였으나, 다른 종류의 벡터와 숙신산 생성 미생물들을 사용하는 것 역시 당업자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
실시예 1: E. coli W3110 DST160의 제조
E. coli W3110(ATCC 39936)의 콜로니를 LB 액체배지 4mL에 접종하여 220 rpm, 37℃ 진탕 배양기에서 호기 조건으로 12시간 배양하였다. 배양이 끝난 세균배양액을 100 mL의 M9-글루코스 합성배지(3g/L의 glucose, 0.8g/L의 NH4Cl, 0.5g/L의 NaCl, 7.5g/L의 Na2HPO4·2H2O, 3g/L의 KH2PO4, 0.2g/L의 MgSO4·7H2O, 0.1g/L의 CaCl2, 0.001g/L의 thiamine)와 숙신산 30g/L를 함유한 미생물 반응기에 접종하여 연속 발효를 진행하였다. 발효는 37℃, 350 rpm, 100mL/min 공기 주입 조건에서 발효시켰다. 발효 중 pH는 6N 수산화나트륨을 사용하여 7.5로 조정하였다. 회분식 발효로 12시간 배양하여, 희석 비율을 0.1 h-1으로 고정시켰다. 새 배지 저장소(10L)에 있는 배지는 처음 배양기의 배지 조성과 같다. 100시간 마다(1번의 새 배지 전환) 숙신산 농도를 제외한 나머지 배지 조성은 똑같이 만들어 주었다. 저장소에 있는 숙신산 배지의 농도는 outlet에서 나오는 세포 농도에 의해 3g/L ~ 10g/L 정도로 점차적으로 증가시켰다. 저장소에 있는 숙신산 농도가 160g/L인 조건에서 발효기 안의 세포 농도가 정상 상태에 도달할 때까지 연속발효를 진행시킴으로써, 최종 적으로 E. coli W3110 DST160을 제조하였다. 도 1은 제조된 E. coli W3110 DST160의 생장 그래프를 나타낸 것이다.
실시예 2: ygjE 발현벡터(pEcYgjE)의 제작
E. coli W3110(DE3) 균주에, ygjE 유전자를 발현시키기 위하여 유전자 발현벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 E. coli W3110의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 하기 SEQ ID NO: 1과 2의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여, YgjE-FR을 제작하였다.
SEQ ID NO: 1: 5'-GAATTCATGAAACCTTCCACTGAATGGT-3'
SEQ ID NO: 2: 5'-CTCGAGTTAAAGCAACACCACGGGCAT-3'
그런 다음 얻어진 PCR 절편을 EcoRI과 XhoI으로 절단하고 이를 pET41a에 도입하여 도 2와 같이 ygjE 발현벡터(pEcYgjE)를 제작하였다.
실시예 3: betA 발현벡터(pEcBetA)의 제작
E. coli W3110(DE3) 균주에, betA 유전자를 발현시키기 위하여 유전자 발현벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 E. coli W3110의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 하기 SEQ ID NO: 3과 4의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여, YGJE-FR을 제작하였다.
SEQ ID NO: 3: 5'-GGATCCATGCAATTTGACTACATCATTATTG-3'
SEQ ID NO: 4: 5'-AAGCTTATTTTTTCGCTCTCACCGGC-3'
그런 다음 얻어진 PCR 절편을 BamHI과 HindⅢ으로 절단하고 이를 pET41a에 도입하여 도 3과 같이 betA 발현벡터(pEcBetA)를 제작하였다.
실시예 4: 재조합 E. coli W3110(DE3)/pEcYgjE의 제조
E. coli W3110(DE3)를 LB 배지에 도말하여, 12시간 동안 37℃에서 배양한 다음, 콜로니를 LB 액체배지 10mL에 접종하여, 12시간 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 LB-포도당 액체배지 100mL에 1% 접종하여 37℃ 진탕 배양기에서 배양하였다.
약 4~5시간 후, 세균배양액의 OD600가 0.3 ~ 0.4 정도가 되면, 상기 세균배양액을 4℃, 4,500rpm에서 20분 동안 원심분리하여 세포를 수득한 다음, 4℃ 상태의 10% 글리세롤 용액 200mL로 세포를 재현탁하였다. 현탁된 세포용액을 4℃, 5,500rpm에서 20분 동안 다시 원심분리하여 세포를 수득하였다. 재현탁 시 사용되는 글리세롤 용액을 반으로 줄여가며 상기 과정을 두 번 더 반복한 후, 세포와 글리세롤 부피비가 1:1이 되도록 재현탁하여 세포 농축액을 수득하였다.
상기 수득된 세포 농축액과 실시예 2에서 제작한 유전자 발현벡터 pEcYgjE를 혼합한 다음, 2.5kV, 25μF, 200ohms의 조건으로 electroporation을 수행하였다. 전기충격 후, LB 액체배지 0.8 mL를 가하여 37℃ 진탕배양기에서 1 시간 동안 배양하였다.
배양액을 항생제 카나마이신(최종농도 50 ㎍/L)를 함유한 LB 고체 배지에 도말하여, 37℃에서 24시간 이상 배양하였다. 형성된 콜로니를, LB 액체 배지에 접종 을 하여, 37℃에서 12시간 이상 배양하여, 최종적으로 재조합 E. coli W3110(DE3)/pEcYgjE를 제조하였다. 벡터가 잘 도입이 되었는지 확인하기 위해 배양된 균주로부터, 플라스미드 mini-prep kit를 이용하여 벡터를 분리하였다.
실시예 5: 재조합 E. coli W3110(DE3)/pEcBetA의 제조
E. coli W3110(DE3)를 LB 배지에 도말하여, 12시간 동안 37℃에서 배양한 다음, 콜로니를 LB 액체배지 10mL에 접종하여, 12시간 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 LB-포도당 액체배지 100mL에 1% 접종하여 37℃ 진탕 배양기에서 배양하였다.
상기 배양액으로부터, 실시예 4와 동일한 방법으로, 세포 농축액을 수득한 다음 상기 수득된 세포 농축액과 실시예 3에서 제작한 유전자 발현벡터 pEcBetA와 혼합한 다음, 2.5kV, 25μF, 200ohms의 조건에서 electroporation을 수행하였다. 전기충격 후, LB 액체배지 0.8mL를 가하여 37℃ 진탕배양기에서 1 시간 동안 배양하였다.
배양액을 항생제 카나마이신(최종농도 50㎍/L)를 함유한 LB 고체 배지에 도말하여, 37℃에서 24시간 이상 배양하였다. 형성된 콜로니를, LB 액체 배지에 접종을 하여, 37℃에서 12시간 이상 배양하여 최종적으로 재조합 E. coli W3110(DE3)/pEcBetA를 제조하였다. 벡터가 잘 도입이 되었는지 확인하기 위해 배양된 균주로부터, 플라스미드 mini-prep kit를 이용하여 벡터를 분리하였다.
실시예 6: 재조합 대장균을 이용한 ygjE 효소의 활성 측정
실시예 4에서 제조된 재조합 E. coli W3110(DE3)/pEcYgjE를 4mL M9-글루코스 배지에서 37℃, 220rpm의 조건으로 배양한 배양액을 원심분리하였다. 13,000rpm에서 5분간 원심분리하였다. 그런 다음 침전된 세포를 12ml 0.01mM IPTG, 10g/L의 NaHCO3이 첨가된 M9-글루코스 배지에 접종하여 37℃ 조건에서 혐기 발효를 진행하였다. 24시간 후에 세포 성장 속도와 숙신산의 농도를 측정하기 위해 세포 및 상등액을 수득하였다. 효소 활성은 세포 안과 세포 밖의 숙신산 농도를 측정하여 판단하였다. 세포 밖의 숙신산 농도는 상등액의 HPLC 분석을 통해 결과를 얻었고, 세포 안의 숙신산 농도는 세포를 10mL의 50mM 인산 버퍼용액으로 현탁한 후, 초음파로 세포막을 파쇄하였다. 원심분리기를 이용하여 세포잔해를 제거하고 세포추출 상등액을 이용하여 HPLC 분석을 통해 결과를 얻었다.
그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, E. coli W3110(DE3)/pEcYgjE 경우, E. coli W3110(DE3) 보다 세포 외의 숙신산 농도가 1.7배 향상되었음을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명에 따른 ygjE는 E. coli W3110(DE3)/pEcYgjE 균주에서 활성을 가짐을 확인할 수 있었다.
[표 1]
균주 세포 외 숙신산 농도
(mM/cell(g))		 세포 내 숙신산 농도
(mM/cell(g))
W3110(DE3) 18.16 0.03
W3110(DE3)/pEcYgjE 31.32 <0.01
실시예 7: 재조합 대장균을 이용한 betA 효소의 활성 측정
실시예 5에서 제조된 재조합 E. coli W3110(DE3)/pEcBetA의 원심분리를 통하 여 세포들을 수득하고 초음파로 세포막을 파쇄하였다. 원심분리기를 이용하여 세포잔해를 제거하고 세포추출 상등액을 효소활성 측정에 이용하였다.
효소 활성은 스펙트로포토미터를 이용하여 측정하였으며, 반응의 파장은 535 nm에서는 여기, 587nm에서는 방출이 일어난다. 그리하여 E. coli W3110(DE3)/pEcBetA 균주의 콜린 디하이드로게나제(choline dehydrogenase)의 활성을 측정하여 표 2와 같이 0.98μmole/protein(mg)·min의 결과를 얻었는데, 이는 야생형 균주보다 약 30배 이상 강한 활성을 띄었다. 따라서, 본 발명에 따른 betA는 E. coli W3110(DE3)/pEcBetA 균주에서 활성을 가짐을 확인할 수 있었다.
[표 2]
균주 효소 활성(μmole/mg-proteinㅇmin)
W3110(DE3) <0.03
W3110(DE3)/pEcYgjE 0.98
실시예 8: E. coli W3110 DST160의 숙신산 내성 확인
실시예 1에서 제조된 E. coli W3110 DST160의 콜로니를 M9-글루코스 액체배지 4mL에 접종하여 220rpm, 37℃ 진탕 배양기에서 호기 조건으로 12시간 배양하였다. 배양이 끝난 세균배양액을 50mL의 M9-글루코스 합성배지(3g/L의 glucose, 0.8g/L의 NH4Cl, 0.5g/L의 NaCl, 7.5g/L의 Na2HPO4·2H2O, 3g/L의 KH2PO4, 0.2g/L의 MgSO4·7H2O, 0.1g/L의 CaCl2, 0.001g/L의 thiamine)와 숙신산 160g/L를 함유한 Erlenmeyer 플라스크에 접종하고, 37℃, 220rpm의 발효조건에서 발효를 진행하였다. 발효 중 pH는 6N 수산화나트륨을 사용하여 7.5로 조정하였다. 상기의 균주를 야생형 균주와 비교하였을 때, 도 4와 같이 최고 생장 속도가 0.20 h-1으로 야생형보다 53.8% 더 빨랐고 글루코스 수율(세포 질량/글루코스 소비량)도 0.192 cell(g)/glucose(g)로 야생형 보다 12.3% 더 높았다. 또 도 4와 같이 상기의 균주는 지체기 없이 지수 생장기에 들어갔고, 야생형 균주는 38시간의 지체기 후에 지수 생장기에 들어갔다. 상기와 같은 결과로 E. coli W3110 DST160가 고농도의 숙신산에서 내성을 가짐을 알 수 있었다.
실시예 9: 재조합 E. coli W3110(DE3)/pEcYgjE 및 재조합 E. coli W3110(DE3)/pEcBetA의 숙신산 내성 확인
실시예 4 및 5에서 제조된 E. coli W3110(DE3)/pEcYgjE와 E. coli W3110(DE3)/pEcBetA의 콜로니를 M9-글루코스 액체배지 4mL에 접종하여 220 rpm, 37℃ 진탕 배양기에서 호기 조건으로 12시간 배양하였다. 배양이 끝난 세균배양액을 50 mL의 M9-글루코스 합성배지(3g/L의 glucose, 0.8g/L의 NH4Cl, 0.5g/L의 NaCl, 7.5g/L의 Na2HPO4·2H2O, 3g/L의 KH2PO4, 0.2g/L의 MgSO4·7H2O, 0.1g/L의 CaCl2, 0.001g/L의 thiamine)와 숙신산 160g/L를 함유한 Erlenmeyer 플라스크에 접종하여 37℃, 220rpm의 발효조건에서 발효하였다. 발효 중 pH는 6N 수산화나트륨을 사용하여 7.5로 조정하였다. 이때, 항생제로 50μg/L의 카나마이신과 0.01 mM의 IPTG를 첨가하였다. 그리하여 상기의 균주들을 야생형 균주와 비교하였을 때, 표 3과 같이 E. coli W3110(DE3)/pEcYgjE의 초기 생장 속도가 0.11 h-1, E. coli W3110(DE3)/pEcBetA는 0.09h-1로 야생형보다 각각 3.67배, 3배 더 빨랐고, 48시간 후의 세포 질량도 E. coli W3110(DE3)/pEcYgjE는 OD600에서 0.775, E. coli W3110(DE3)/pEcBetA는 OD600에서 0.450으로 야생형 보다 각각 4.05배, 2.36배 더 많았다. 상기와 같은 결과로 ygjE 및 betA 유전자를 가진 균주가 고농도의 숙신산에서 내성을 가짐을 알 수 있었다.
[표 3]
균주 초기 생장 속도 (h-1) 48시간 후 세포 질량(OD600)
W3110(DE3) 0.03 0.191
W3110(DE3)/pEcYgjE 0.11 0.775
W3110(DE3)/pEcBetA 0.09 0.450
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 E. coli W3110 DST160의 연속배양을 통한 배양특성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 E. coli W3110(DE3)에서 ygjE를 발현시켜 재조합 균주(E. coli W3110(DE3)/pEcYgjE) 제작에 사용되어진 ygjE 발현벡터(pEcYgjE)의 모식도이다.
도 3은 E. coli W3110(DE3)에서 betA를 발현시켜 재조합 균주(E. coli W3110(DE3)/pEcBetA) 제작에 사용되어진 betA 발현벡터(pEcBetA)의 모식도이다.
도 4는 본 발명에 따른 E. coli W3110 DST160과 야생형 균주의 160g/L 숙신산이 첨가된 M9-글루코스 배지에서의 배양특성을 비교한 그래프이다(○: E. coli W3110, ●: E. coli W3110 DST160).
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Microorganism Enhanced Resistance of Succinic Acid and Method for Preparing Succinic Acid Using the Same <130> P09-B118 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gaattcatga aaccttccac tgaatggt 28 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ctcgagttaa agcaacacca cgggcat 27 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggatccatgc aatttgacta catcattatt g 31 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 aagcttattt tttcgctctc accggc 26

Claims (12)

  1. 숙신산 생산능을 가지는 균주에 타트릭산 숙신산 역수송(Tartrate/Succinate Antiporter) 효소를 코딩하는 유전자 및 콜린 디하이드로게나제(choline dehydrogenase)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 숙신산 내성능이 증가된 재조합 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 숙신산 생산능을 가지는 균주는 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 숙신산 내성능이 증가된 재조합 균주.
  3. 제2항에 있어서, 상기 박테리아는 대장균인 것을 특징으로 하는 숙신산 내성능이 증가된 재조합 균주.
  4. 제1항에 있어서, 상기 타트릭산 숙신산 역수송(Tartrate/Succinate Antiporter) 효소를 코딩하는 유전자는 ygjE이고, 상기 콜린 디하이드로게나 제(choline dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 betA인 것을 특징으로 하는 숙신산 내성능이 증가된 재조합 균주.
  5. 숙신산 생산능을 가지는 균주에 타트릭산 숙신산 역수송(Tartrate/Succinate Antiporter) 효소를 코딩하는 유전자 및 콜린 디하이드로게나제(choline dehydrogenase)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 도입 또는 증폭시키는 것을 특징으로 하는 숙신산 내성능이 증가된 재조합 균주의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 숙신산 생산능을 가지는 균주는 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 숙신산 내성능이 증가된 재조합 균주의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 박테리아는 대장균인 것을 특징으로 하는 숙신산 내성능이 증가된 재조합 균주의 제조방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 타트릭산 숙신산 역수송(Tartrate/Succinate Antiporter) 효소를 코딩하는 유전자는 ygjE이고, 상기 콜린 디하이드로게나제(choline dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 betA인 것을 특징으로 하는 숙신산 내성능이 증가된 재조합 균주의 제조방법.
  9. 제1항의 재조합 균주를 배양하여 숙신산을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 숙신산을 회수하는 것을 특징으로 하는 숙신산의 제조방법.
  10. 숙신산(succinic acid) 내성능이 증가된 변이 대장균 DST160.
  11. 제10항에 있어서, 상기 변이 대장균 DST160은 KCTC 11521BP인 것을 특징으로 하는 숙신산 내성능이 증가된 변이 대장균 DST160.
  12. 제10항의 변이 대장균 DST160을 배양하여 숙신산을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 숙신산을 회수하는 것을 특징으로 하는 숙신산의 제조방법.
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