CN113832089B - 一种高产两性霉素b的重组结节链霉菌、构建方法及应用 - Google Patents

一种高产两性霉素b的重组结节链霉菌、构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种消除副产物AmA且高产两性霉素B的重组结节链霉菌，由如下方法构建获得：以结节链霉菌CCTCC NO：M 2017426为底盘菌，突变其聚酮合酶ER5结构域关键氨基酸位点，再导入SEQ ID NO.1～5所示基因的串联基因获得。本发明有益效果主要体现在：(1)本发明获得的突变菌株具有完全不产副产物AmA的特性，便于工业化生产分离纯化，同时AmB产量进一步提高；(2)过表达中心碳代谢及脂肪酸代谢途径关键基因，加强菌株对碳源的摄取，提高碳源转化率，进一步提高了AmB产量。

Description

一种高产两性霉素B的重组结节链霉菌、构建方法及应用
(一)技术领域
本发明属于代谢工程领域，具体涉及一种消除副产物AmA且高产两性霉素B的重组结节链霉菌、构建方法及应用。
(二)背景技术
两性霉素B(Amphotericin B，AmB)是由结节链霉菌(Streptomyces nodosus)产生的一种七烯大环内酯类抗生素。AmB分子式C47H73NO17，分子量为924.09，是一种橙黄色或黄色结晶粉末，无气味，易吸水，在光照下易分解失。菌株在生产过程中还会产生抗菌活性低的两性霉素A(Amphotericin A，AmA)，AmA与AmB结构上的唯一区别在于C28-C29之间的碳碳键，两者结构式如图1所示。AmB在紫外波长405nm具有吸收峰，而AmA在紫外波长305nm下具有吸收峰，故可这两个波长下区分检测该物质。都不溶于水，可溶于二甲基亚砜(DMSO)和甲醇，几乎不溶于乙醇、丙酮、苯等物质。
自上世纪90年代，人们就已意识到生物合成DPA的巨大前景，并开始摸索前行。在微生物体内，生物合成DPA途径由两部分组成，即泛解酸途径和β-丙氨酸途径。在泛解酸合成途径中，泛解酸可由糖酵解途径中的丙酮酸出发，经过乙酰乳酸、2,3-二羟基异戊酸、α-酮异戊酸、酮泛解酸生成。在此合成途径中，ilvBN、ilvIH编码的乙酰羟基酸合酶是其中一个关键酶，其受到L-缬氨酸的反馈抑制。panB编码的α-酮异戊酸羟甲基转移酶是另外一个关键酶，且在该反应过程中需要一分子的亚甲基四氢叶酸(CH2-THF)提供甲基供体。随着研究深入，人们又发现panB还具有叶酸裂解的活性；在panB的作用下，α-酮异戊酸和CH2-THF反应，生成以甲基相连的中间体，该中间体进一步水解裂解形成未变化的α-酮异戊酸和双羟甲基中间体，中间体再裂解成甲醛和四氢羟基蝶呤，并回到叶酸代谢中，这可能为我们今后研究泛解酸代谢与一碳单位代谢相互协同提供依据。在β-丙氨酸合成途径中，β-丙氨酸可由糖酵解途径中的丙酮酸出发，经过草酰乙酸、L-天冬氨酸生成。在大肠杆菌β-丙氨酸合成途径中，panD编码的天冬氨酸-1-脱羧酶活性比较低，因此在大肠杆菌合成DPA过程中，往往采用外源添加β-丙氨酸的方式来合成DPA。目前，人们已对DPA的生物合成做了许多研究。Miki Hiroshi等通过诱变筛选，获得了经过72h补料发酵DPA产量达65.4g/L的诱变高产菌株。随着合成生物学的兴起，为弥补传统诱变技术在菌种的稳定性上的缺陷，且不易解析DPA具体合成机制，2018年Zhang等通过合成生物学技术手段，成功构建遗传稳定的DPA产量达28.45g/L的大肠杆菌菌株，并应用于工业生产。S.nodosus菌株于1955年从委内瑞拉奥里诺科河三角洲的土样中收集分离获得，并发现其具有抗真菌活性。1959年，在S.nodosus菌株发酵液中提取获得AmB。1966年开始上市，已使用近半个世纪。临床上主要作用于新型隐球菌、组织胞浆菌、环孢子菌属、念珠菌属、犁头霉菌属、内胞霉属以及部分曲菌属等大多数真菌。普遍认为多烯类大环内酯抗生素作用机制为其能与真菌细胞表面麦角甾醇结合，使膜的通透性发生改变，最终导致重要的细胞内物质(K离子、核苷酸、氨基酸等)外流而造成菌体死亡。AmB也会与哺乳动物细胞膜上的胆固醇相互作用，从而引起一定程度的副作用，特别是肾毒性。但目前AmB仍然是治疗人类深部全身性真菌感染不可替代的特效药物。
在AmB的生产过程中还会伴随副产物AmA的产生，由其合成基因簇中聚酮合酶(Polyketide synthases，PKS)模块5的烯酰还原酶(Enoyl reductase，ER)对聚酮骨架中间体还原导致。副产物AmA的生成不仅制约了菌株S.nodosus高产目标产物AmB，且在工业化生产中不利于后期的分离纯化，消除副产物AmA的生成将为高纯度生产AmB奠定基础。AmB为次级代谢产物，但初级代谢的调节也至关重要，中心碳代谢的调控可以使更多的碳源流向合成AmB所需的前体。在糖酵解途径(EMP)从葡萄糖到乙酰-CoA为利用葡萄糖的过程，其中编码催化3-磷酸甘油酸(G3P)生成2-磷酸甘油酸(G2P)的磷酸甘油酸变位酶(PGM)基因和编码催化丙酮酸到乙酰-CoA的丙酮酸脱氢酶(PDH)基因均为关键基因。EMP途径中PGM和PDH基因的上调将增强碳源的利用，使更多的碳源流向乙酰-CoA的合成，乙酰-CoA作为AmB合成的关键前体增加其合成将有利于提高AmB产量。在磷酸戊糖途径(PPP)存在催化6-磷酸葡萄糖酸(6PG)生成5-磷酸核酮糖(RL5P)的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)基因，6PGDH催化6PG生成RL5P的同时产生NADPH，这将为菌体的生长和次级代谢产物的合成提供更多的还原力。脂肪酸代谢在链霉菌次级代谢产物的合成也至关重要，三酰基甘油(triacylglycerols，TAGs)降解生成短链脂肪酸，从而提供C2单元形成乙酸盐衍生物用于聚酮化合物的合成。脂肪酸酰基-CoA合成酶(ACS)是脂肪酸分解代谢的必需酶，能够硫脂化激活脂肪酸与辅酶A生成酰基-CoA进入β-氧化循环，进一步转化生成乙酰-CoA。过表达ACS将加速TAGs的降解，更多的碳源将流向乙酰-CoA的合成，从而进一步提高AmB的产量。TAGs的降解通过多轮β-氧化循环也能产生更多的还原当量以及ATP将有助于细胞的生长。
基因水平的多组学分析及分子生物学技术的革新，运用基于基因分子水平的基因工程育种将是一种精准快速高效的育种方法。构建链霉菌次级代谢产物的高产菌株研究中，普遍为对次级代谢网络的调控、过表达合成前体相关的酶及过表达基因簇中的关键酶，而在链霉菌初级代谢网络调控以及碳流向控制研究较少。随着S.nodosus菌株的全基因测序，AmB合成过程的关键基因被解析，通过基因工程的方法理性构建高产AmB的工程菌株更具合理性。在发酵生产过程中，基于次级代谢产物生物合成过程解析，通过添加前体物质及关键差异代谢物，将作为进一步提高次级代谢物产量的策略被广泛应用。
(三)发明内容
本发明目的是提供消除副产物AmA且高产两性霉素B的重组结节链霉菌、构建方法及其应用，通过对结节链霉菌聚酮合酶ER5结构域突变，获得消除副产物AmA生成工程菌株，进一步对该工程菌株过表达中心碳代谢及脂肪酸代谢关键基因，加强菌株对碳源的利用，生成更多的前体物质，有效提升AmB的产量。
为实现本发明的上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种消除副产物AmA且高产两性霉素B的重组结节链霉菌，由如下方法构建获得：以结节链霉菌CCTCC NO：M 2017426为底盘菌，突变其聚酮合酶ER5结构域关键氨基酸位点，再导入SEQ ID NO.1所示磷酸甘油酸变位酶基因(PGM)、SEQ ID NO.2所示丙酮酸脱氢酶基因(PDH)、SEQ ID NO.3所示6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(6PGDH)、SEQ ID NO.4所示葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因(G6PDH)、SEQ ID NO.5所示脂肪酸酰基-CoA基因(ACS)的串联基因获得。
具体的，所述的重组结节链霉菌，由如下方法构建获得：
以结节链霉菌(Streptomyces nodosus)CCTCC NO：M 2017426为底盘菌，将其聚酮合酶ER5结构域关键氨基酸位点突变，其中包含ER5结构域氨基酸序列(SEQ ID NO.6)中HAGAGGVGMA突变为HAGASPVGMA，PGDAGRYGHEAAG突变为PGDDVGSFGSEAAG，得到结节链霉菌ZJB2016050-ER5；
将SEQ ID NO.1所示磷酸甘油酸变位酶基因、SEQ ID NO.2所示丙酮酸脱氢酶基因、SEQ ID NO.3所示6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因、SEQ ID NO.4所示葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因、SEQ ID NO.5所示脂肪酸酰基-CoA基因串联，并导入结节链霉菌ZJB2016050-ER5中，得到基因工程菌ZJB2016050-ER5-6PPGA，即所述消除副产物AmA且高产两性霉素B的重组结节链霉菌。
本发明还涉及构建所述重组结节链霉菌的方法，所述方法如下：
(1)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将底盘菌结节链霉菌(Streptomycesnodosus)CCTCC NO：M 2017426基因组中聚酮合酶ER5结构域其中部分氨基酸序列由HAGAGGVGMA突变为HAGASPVGMA，PGDAGRYGHEAAG突变为PGDDVGSFGSEAAG，得到结节链霉菌ZJB2016050-ER5；
(2)将PCR克隆获得的脂肪酸酰基-CoA基因(ACS)及启动子插入pJTU1278载体质粒多克隆位点处，得到重组载体pJTU1278-eACS；
(3)将步骤(2)中得到的重组载体转化入大肠杆菌DH5α，对得到的转化子进行测序，将确认无误的载体导入供体菌大肠杆菌；
(4)在步骤(3)构建完成的质粒上依次插入SEQ ID NO.4所示葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因、SEQ ID NO.1所示磷酸甘油酸变位酶基因、SEQ ID NO.2所示丙酮酸脱氢酶基因、SEQ ID NO.3所示6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因，得到质粒pJTU1278-e6PGDH-ePDH-ePGM-eG6PDH-eACS(pJTU1278-6PPGA)，导入供体菌大肠杆菌；
(5)将步骤(4)构建的含有重组质粒的供体菌株大肠杆菌通过接合转移方法将过表达载体转化到受体菌结节链霉菌ZJB2016050-ER5，得到基因工程菌ZJB2016050-ER5-6PPGA，即所述消除副产物AmA且高产两性霉素B的重组结节链霉菌。
本发明还涉及所述重组结节链霉菌在微生物发酵制备两性霉素B中的应用。
具体的，所述应用为：将所述重组结节链霉菌接种至发酵培养基中，于25～30℃、100～300rpm条件下进行发酵培养72～168h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到两性霉素B。
优选的，所述发酵培养基组成如下：葡萄糖60～80g/L，牛肉膏5～10g/L，大豆蛋白粉5～10g/L，棉子粉8～30g/L，CaCO3 5～10g/L，KH2PO4 0.1～0.4g/L，溶剂为水，pH 7.0，119℃灭菌30min。·
通常，所述重组结节链霉菌先经种子培养，再将种子液以体积浓度2～10％的接种量接种至发酵培养基，所述种子培养过程如下：将所述重组结节链霉菌接种在GYM平板上，26℃生长7天，获得灰色的孢子，使用棉花棒将表面孢子洗脱至无菌水中，将洗下的孢子悬液用含有棉花的注射器过滤，过滤后的孢子离心去上清，加入无菌水重悬，获得孢子悬液；孢子悬液接种至种子培养基26℃培养48h，获得种子液；所述GYM平板终浓度组成：葡萄糖1～5g/L，酵母粉1～5g/L，麦芽提取物5～29g/L，碳酸钙1～3g/L，琼脂15～20g/L，溶剂为水，pH7.0～7.5，115℃灭菌30min；所述种子液培养基终浓度组成为：蛋白胨10～20g/L，NaCl5～10g/L，葡萄糖10～15g/L，酵母粉5～10g/L，CaCO3 0.5～1g/L，溶剂为水，pH 7.0～7.2，119℃灭菌30min。
本发明有益效果主要体现在：(1)本发明获得的突变菌株具有完全不产副产物AmA的特性，便于工业化生产分离纯化，同时AmB产量进一步提高；(2)过表达中心碳代谢及脂肪酸代谢途径关键基因，加强菌株对碳源的摄取，提高碳源转化率，进一步提高了AmB产量。
(四)附图说明
图1为AmA和AmB化学结构式；
图2为突变ER5结构域载体构建；
图3为ER5结构域突变S.nodosus菌株摇瓶发酵结果；
图4为多基因过表达S.nodosus工程菌株摇瓶发酵结果；
图5为多基因过表达S.nodosus工程菌株5L发酵罐产AmB进程曲线。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：突变载体构建
克隆结节链霉菌Streptomyces nodosus ZJB2016050-ACC1(CCTCC NO：M2019343，已在在先申请CN110564718A中披露)中的AmphC ER5基因(SEQ ID NO.7所示)，首先将ER5结构域中关键氨基酸HAGAGGVGMA突变为HAGASPVGMA，根据其在NCBI中的核苷酸序列在ER5结构域突变位点上游同源臂2000bp处设计上游引物ER5-F(具有XbaI酶切位点)，在其下游同源臂1661bp处设计下游引物ER5-R(具有KpnI酶切位点)。关键氨基酸突变引物为M1-F、M1-R。扩增获得突变位点上游和下游同源臂片段，经测序分析扩增所得片段序列与目的基因序列相符，将此片段用核酸内切酶XbaI和KpnI酶切，然后clean-up此片段备用，将载体pJTU1278也用同样的XbaI和KpnI核酸内切酶酶切胶回收，将回收后的基因片段与酶切后的pJTU1278载体连接，得到单突变载体pJTU1278-ER5-1。
以AmphC ER5基因为模板，设计突变引物M2-F和M2-R，使用上述相同方法将ER5结构域中关键氨基酸PGDAGRYGHEAAG突变为PGDDVGSFGSEAAG，最终获得单突变载体，命名为pJTU1278-ER5-2。
同时在以上所构建的两个单突变载体基础上构建一个双突变载体，方法和上述相同，最终所构建双突变载体命名为pJTU1278-ER5-3。载体构建如图2所示。
其中克隆PCR体系：加入结节链霉菌全基因组模板1μL，加入2×Phanta MaxBuffer 25μL，dNTP(2.5mM)5μL，正反引物各1μL，Phanta Max DNA聚合酶1μL，补足去离子水至50μL。
其中克隆PCR程序：98℃变性10s，55～60℃退火15s，72℃延伸2min，共30个循环。最后72℃延伸10min。
其中连接过程：获得突变基因片段使用诺唯赞公司的重组克隆试剂盒通过一步克隆方法连接到线性化载体pJTU1278。
将5×CE II Buffer 4μL加入灭菌的PCR管中，加入回收的DNA片段4μL和载体DNA1μL，加入Exnase II连接酶2μL，加入ddH2O 9μL，将此体系37℃连接反应1h，。将连接产物转化入DH5α大肠杆菌感受态，利用氨苄青霉素抗性筛选，挑选转化子进行验证。
所用引物如下：
ER5-F CGGTGGCGGCCGCTCTAGAGCGTCGACCTGCCGACCTAT
ER5-R ATAGGGCGAATTGGGTACCATCACGATCGGGTCGTCGTC
M1-F ACGCCGGTGCCTCTCCAGTCGGCATGGC
M1-R GCCATGCCGACTGGAGAGGCACCGGCGT
M2-F CCGGGTGATGATGTCGGATCGTTCGGTTCGGAGGCGGCCGGT
M2-R ACCGGCCGCCTCCGAACCGAACGATCCGACATCATCACCCGG
实施例2：结节链霉菌中ER5结构域突变
1)含突变载体pJTU1278-ER5-1的E.coil ET12567/pUZ8002供体菌制备
将构建好的重组载体pJTU1278-ER5-1导入E.coil ET12567/puz8002(上海联迈生物工程有限公司)大肠杆菌感受态中，利用氨苄青霉素(Amp+，50μg/mL)、氯霉素(Cm+，50μg/mL)、卡那霉素(Kan+，50μg/mL)抗性筛选，挑取阳性转化子，通过M13上下游引物菌落PCR验证，结果证明重组载体pJTU1278-ER5成功转化入E.coil ET12567/puz8002。具体操作如下：
E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌感受态制备方法如下：
从菌种的甘油冻存管中取E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌菌液在LB平板上分区划线，37℃培养至单菌落长出。挑取平板上的单菌落转移到2～5mL的LB培养基中37℃，200rpm过夜培养。取过夜培养的菌液200μL加入到50mL的LB培养基中37℃，200rpm培养至OD600为0.4～0.7。培养好的菌液转移至预冷的50mL离心管中，冰上静置10min。离心4℃，2500×g，5min。弃上清液，加入20mL 0.1mol/L CaCl2，冰上重悬后静置10min。离心4℃，2500×g，5min。弃上清，加入2mL 0.1mol/L CaCl2(溶液中含终浓度为15％的甘油)，重悬沉淀，冰上静置30min，获得E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌感受态细胞。分装100μL/tube，-80℃保藏。
含重组载体pJTU1278-ER5-1转化入E.coil ET12567/puz8002：
取1支上述的E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌感受态细胞，冰浴5min，加入5μL浓度为200ng/μL的pJTU1278-ER5-1重组突变载体，冰浴30min，于42℃水浴，热激90s，放回冰浴1min，加入600μL LB液体培养基，37℃，200rpm，培养1h。吸取200μL，均匀涂布于Kan+(终浓度50μg/mL)、Cm+(终浓度50μg/mL)、Amp+(终浓度50μg/mL)抗性的LB固体平板，于37℃培养箱培养15h。至长出含重组载体pJTU1278-ER5-1的E.coil ET12567/puz8002单菌落。
M13验证PCR体系：挑取单菌落，加入20μL无菌水，沸水浴5～10min，12000rpm离心1min。取1μL上清液作为模板，加入Genestar Taq Mix 5μL，M13正反引物各1μL，补足去离子水至10μL。
M13验证PCR程序：98℃变性10s，55～60℃退火15s，72℃延伸8min，共30个循环。最后72℃延伸10min。
M13引物如下：
M13(-21)F TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R CAGGAAACAGCTATGAC
将已导入pJTU1278-ER5-1质粒的ET12567/puz8002大肠杆菌，划线分离单菌落，37℃培养，挑单菌落于装有5mL LB培养基试管，并同时加入Kan+(终浓度50μg/mL)、Cm+(终浓度50μg/mL)、Amp+(终浓度50μg/mL)抗生素，37℃培养14h。转接500μL于50mL LB摇瓶中，同时加入Kan+(终浓度50μg/mL)、Cm+(终浓度50μg/mL)、Amp+(终浓度50μg/mL)抗性，37℃培养至OD600为0.6左右。用50mL离心管将供体菌离心，4000rpm，5min，再用50mL LB培养基洗两次，用5mL LB培养基重悬菌体，4℃保存备用。
其中LB培养基由以下方法制得：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，自来水定容至1L，pH自然，121度灭菌20min。
2)受体菌Streptomyces nodosus的制备
将实验室菌种的结节链霉菌Streptomyces nodosus ZJB2016050-ACC1(CCTCCNO：M 2019343)接种在GYM平板或斜面培养物上，26℃生长10d，获得灰黑色的孢子，使用棉花棒将表面孢子洗脱至10mL 2×YT培养基中，将洗下的孢子悬液用含有棉花的注射器过滤，过滤后的孢子12000rpm，离心5min后去上清，加入10mL2×YT培养基重悬，12000rpm离心5min重新洗脱一次，最后用500μL 2×YT培养基重悬。将重悬好的孢子在50℃热激15～20min后，常温下备用。
其中2×YT培养基由以下方法制得：蛋白胨16g，酵母粉10g，氯化钠5g，自来水定容至1L，pH自然，121度灭菌20min。
GYM固体培养基配制方法：葡萄糖4g，酵母粉4g，麦芽提取物10g，碳酸钙2g，琼脂20g，自来水定容至1L，pH 7.2，121度灭菌20min。
3)供、受体菌接合过程：
将步骤2)500μL热激完的孢子悬液与步骤1)500μL供体大肠杆菌悬液混合重悬后，6000rpm离心2min，去掉800μL上清液，剩余上清将沉淀重悬涂布在含有10mM氯化镁的MS固体培养基平板上。26℃培养20h后，涂布1mL含0.5mg萘碇酸和0.5mg硫链丝菌素抗生素的水溶液，继续26℃培养10天，至出现转化子。
将转化子在含有终浓度50μg/mL萘碇酮酸和终浓度50μg/mL硫链丝菌素抗性的GYM固体平板上连续纯化3次，直至获得单一菌落，使用16S RNA上下游引物(16S-8和16S-1541)以及M13上下游引物(M13(-21)F、M13R)对转化子菌落PCR验证后，测序对比分析，证实质粒(pJTU1278-ER5-1)已导入受体菌Streptomyces nodosus ZJB2016050-ACC1中，最终获得降低AmA产AmB的基因工程菌，即重组结节链霉菌Streptomyces nodosus ZJB2016050-AER5-1。该菌株在降低副产物AmA的同时AmB产量提高，AmA产量下降约80％至0.5g/L，同时AmB产量增加26％至4.8g/L。
其中MS固体培养基由以下方法制得：黄豆粉20g，甘露醇20g，琼脂20g，自来水定容至1L，pH自然，121度灭菌20min。使用前加入终浓度10mM无菌氯化镁。
其中M13验证PCR操作如步骤1)所述。
其中16sRNA验证PCR体系：挑取单菌落，加入20μL无菌水，沸水浴30min，12000rpm离心1min。取2μL上清液作为模板，加入2×Phanta Max Buffer 5μL，dNTP(2.5mM)0.5μL，16S正反引物各0.5μL，Phanta Max DNA聚合酶1μL，补足去离子水至10μL。
其中16S RNA验证PCR程序：98℃变性10s，55～60℃退火15s，72℃延伸1min 30s，共30个循环。最后72℃延伸10min。
其中所用引物如下：
16S-8 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
16S-1541 AAGGAGGTGATCCAGCCGCA
实施例3：结节链霉菌中ER5结构域突变
在Streptomyces nodosus ZJB2016050-ACC1中导入质粒pJTU1278-ER5-2，具体操作方法与实施例2描述相同。最终获得重组结节链霉菌Streptomyces nodosusZJB2016050-AER5-2。该菌株在降低副产物AmA的同时AmB产量提高，AmA产量下降约64％至0.9g/L，同时AmB产量增加21％至4.6g/L。
实施例4：结节链霉菌中ER5结构域突变
在Streptomyces nodosus ZJB2016050-ACC1中导入质粒pJTU1278-ER5-3，具体操作方法与实施例2描述相同。最终获得重组结节链霉菌Streptomyces nodosusZJB2016050-AER5-3。该菌株在降低副产物AmA的同时AmB产量提高，AmA产量下降至0-0.3g/L降低约88％-98％，同时AmB产量增加26％至4.8g/L。
实施例5：结节链霉菌中ER5结构域突变
在结节链霉菌Streptomyces nodosus ZJB2016050(即CCTCC NO：M 2017426，已在CN 110577921 A中披露)中导入质粒pJTU1278-ER5-3，具体操作方法与实施例2描述相同。最终获得重组结节链霉菌Streptomyces nodosus ZJB2016050-ER5，该菌株AmB产量增加8％至5.57g/L，副产物AmA下降约98％几乎被消除。
实施例6：多基因串联过表达载体构建
以结节链霉菌Streptomyces nodosus全基因组为模板，设计引物ACS-F和ACS-R以全基因组为模板扩增出脂肪酸酰基-CoA合成酶(ACS)基因，片段大小为1512bp左右，片段用核酸内切酶HindIII和KpnI酶切后，clean-up此片段备用。带有红霉素强启动子的质粒pJTU1278-ermEp*同样使用核酸内切酶HindIII和KpnI酶切，clean-up回收线性化质粒。将回收后的基因片段与线性化质粒pJTU1278-ermEp*连接，获得单基因过表达质粒pJTU1278-eACS。运用上述方法分别构建葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因(G6PDH)、磷酸甘油酸变位酶基因(PGM)、丙酮酸脱氢酶基因(PDH)、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(6PGDH)的串联红霉素强启动子的单基因过表达质粒pJTU1278-e6PGDH、pJTU1278-ePDH、pJTU1278-ePGM、pJTU1278-eG6PDH。以单基因过表达质粒为模板设计引物分别扩增红霉素强启动子ermEp*与目的基因串联的四个片段。以单基因过表达质粒pJTU1278-eACS为基础，使用核酸内切酶XbaI单酶切，使用clean-up试剂盒回收酶切体系，获得线性化载体备用，将以上四个红霉素强启动子ermEp*与目的基因串联的片段分别插入载体pJTU1278-eACS中，使用连接酶进行连接，最终得到多基因串联过表达重组质粒为pJTU1278-e6PGDH-ePDH-ePGM-eG6PDH-eACS(pJTU1278-6PPGA)。
其中克隆PCR体系：加入结节链霉菌全基因组模板1μL，加入2×Phanta MaxBuffer 25μL，dNTP(2.5mM)5μL，正反引物各1μL，Phanta Max DNA聚合酶1μL，补足去离子水至50μL。
其中克隆PCR程序：98℃变性10s，55-60℃退火15s，72℃延伸2min，共30个循环。最后72℃延伸10min。
其中连接过程：获得基因片段使用诺唯赞公司的重组克隆试剂盒通过一步克隆方法连接到线性化载体。
将5×CE II Buffer 4μL加入灭菌的PCR管中，加入回收的DNA片段4μL和载体DNA1μL，加入Exnase II连接酶2μL，加入ddH2O 9μL，将此体系37℃连接反应1h。将连接产物转化入DH5α大肠杆菌感受态，利用氨苄青霉素抗性筛选，挑选转化子进行验证。
实施例7：结节链霉菌多基因串联过表达
1)含多基因串联过表达载体pJTU1278-6PPGA的E.coil ET12567/pUZ8002供体菌制备：
将构建好的过表达载体pJTU1278-6PPGA导入E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌感受态中，利用氨苄青霉素(Amp+，50μg/mL)、氯霉素(Cm+，50μg/mL)、卡那霉素(Kan+，50μg/mL)抗性筛选，挑取阳性转化子，通过M13上下游引物菌落PCR验证，结果证明过表达载体pJTU1278-6PPGA成功转化入E.coil ET12567/puz8002。具体操作如下：
E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌感受态制备方法如下：
从菌种的甘油冻存管中取E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌菌液在LB平板上分区划线，37℃培养至单菌落长出。挑取平板上的单菌落转移到2～5mL的LB培养基中37℃，200rpm过夜培养。取过夜培养的菌液200μL加入到50mL的LB培养基中37℃，200rpm培养至OD600为0.4～0.7。培养好的菌液转移至预冷的50mL离心管中，冰上静置10min。离心4℃，2500×g，5min。弃上清液，加入20mL 0.1mol/L CaCl2，冰上重悬后静置10min。离心4℃，2500×g，5min。弃上清，加入2mL 0.1mol/L CaCl2(溶液中含终浓度为15％的甘油)，重悬沉淀，冰上静置30min，获得E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌感受态细胞。分装100μL/tube，-80℃保藏。
含重组载体pJTU1278-6PPGA转化入E.coil ET12567/puz8002：
取1支上述的E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌感受态细胞，冰浴5min，加入5μL浓度为200ng/μL的pJTU1278-6PPGA重组突变载体，冰浴30min，于42℃水浴，热激90s，放回冰浴1min，加入600μL LB液体培养基，37℃，200rpm，培养1h。吸取200μL，均匀涂布于Kan+(终浓度50μg/mL)、Cm+(终浓度5 0μg/mL)、Amp+(终浓度50μg/mL)抗性的LB固体平板，于37℃培养箱培养15h。至长出含重组载体pJTU1278-6PPGA的E.coil ET12567/puz8002单菌落。
M13验证PCR体系：挑取单菌落，加入20μL无菌水，沸水浴5～10min，12000rpm离心1min。取1μL上清液作为模板，加入Genestar Taq Mix 5μL，M13正反引物各1μL，补足去离子水至10μL。
M13验证PCR程序：98℃变性10s，55～60℃退火15s，72℃延伸8min，共30个循环。最后72℃延伸10min。
M13引物如下：
M13(-21)F TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R CAGGAAACAGCTATGAC
将已导入pJTU1278-6PPGA质粒的ET12567/puz8002大肠杆菌，划线分离单菌落，37℃培养，挑单菌落于装有5mL LB培养基试管，并同时加入Kan+(终浓度50μg/mL)、Cm+(终浓度50μg/mL)、Amp+(终浓度50μg/mL)抗生素，37℃培养14h。转接500μL于50mL LB摇瓶中，同时加入Kan+(终浓度50μg/mL)、Cm+(终浓度50μg/mL)、Amp+(终浓度50μg/mL)抗性，37℃培养至OD600为0.6左右。用50mL离心管将供体菌离心，4000rpm，5min，再用50mL LB培养基洗两次，用5mL LB培养基重悬菌体，4℃保存备用。
其中LB培养基由以下方法制得：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，自来水定容至1L，pH自然，121度灭菌20min。
2)受体菌Streptomyces nodosus的制备：
将实施例5所构建菌株Streptomyces nodosus ZJB2016050-ER5接种在GYM平板或斜面培养物上，26℃生长10d，获得灰黑色的孢子，使用棉花棒将表面孢子洗脱至10mL 2×YT培养基中，将洗下的孢子悬液用含有棉花的注射器过滤，过滤后的孢子12000rpm，离心5min后去上清，加入10mL 2×YT培养基重悬，12000rpm离心5min重新洗脱一次，最后用500μL 2×YT培养基重悬。将重悬好的孢子在50℃热激15～20min后，常温下备用。
其中2×YT培养基由以下方法制得：蛋白胨16g，酵母粉10g，氯化钠5g，自来水定容至1L，pH自然，121度灭菌20min。
GYM固体培养基配制方法：葡萄糖4g，酵母粉4g，麦芽提取物10g，碳酸钙2g，琼脂20g，自来水定容至1L，pH 7.2，121度灭菌20min。
3)供、受体菌接合过程：
将步骤2)500μL热激完的孢子悬液与步骤1)500μL供体大肠杆菌悬液混合重悬后，6000rpm离心2min，去掉800μL上清液，剩余上清将沉淀重悬涂布在含有10mM氯化镁的MS固体培养基平板上。26℃培养20h后，涂布1mL含0.5mg萘碇酸和0.5mg硫链丝菌素抗生素的水溶液，继续26℃培养10天，至出现转化子。
将转化子在含有终浓度50μg/mL萘碇酮酸和终浓度50μg/mL硫链丝菌素抗性的GYM固体平板上连续纯化3次，直至获得单一菌落，使用16S RNA上下游引物(16S-8和16S-1541)以及M13上下游引物(M13(-21)F、M13R)对转化子菌落PCR验证后，测序对比分析，证实质粒(pJTU1278-6PPGA)已导入受体菌Streptomyces nodosus ZJB2016050-ER5中，最终获得消除AmA高产AmB的基因工程菌，即重组结节链霉菌Streptomyces nodosus ZJB2016050-ER5-6PPGA。
其中MS固体培养基由以下方法制得：黄豆粉20g，甘露醇20g，琼脂20g，自来水定容至1L，pH自然，121度灭菌20min。使用前加入终浓度10mM无菌氯化镁。
其中M13验证PCR操作如步骤1)所述。
其中16sRNA验证PCR体系：挑取单菌落，加入20μL无菌水，沸水浴30min，12000rpm离心1min。取2μL上清液作为模板，加入2×Phanta Max Buffer 5μL，dNTP(2.5mM)0.5μL，16S正反引物各0.5μL，Phanta Max DNA聚合酶1μL，补足去离子水至10μL。
其中16S RNA验证PCR程序：98℃变性10s，55～60℃退火15s，72℃延伸1min 30s，共30个循环。最后72℃延伸10min。
其中所用引物如下：
16S-8 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
16S-1541 AAGGAGGTGATCCAGCCGCA
实施例8：摇瓶发酵产AmB
对实施例2、3、4、5所构建降低副产物AmA生成菌株S.nodosus ZJB2016050-AER5-1、S.nodosus ZJB2016050-AER5-2、S.nodosus ZJB2016050-AER5-3和S.nodosusZJB2016050-ER5摇瓶发酵产AmB。
(1)种子培养：
从GYM斜面培养基上取一环带灰色孢子菌落接种于一瓶含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得种子液。所述种子培养基组成如下：蛋白胨15g，酵母提取物10g，氯化钠5g，葡萄糖10g，碳酸钙1g，蒸馏水1L，pH为7.0，以NaOH调节pH值为7.0，115℃灭菌30min。
(2)发酵培养：
将2mL种子液接种到50mL发酵培养基中，发酵容器为500mL三角瓶，在25℃、200r/min条件下摇床培养。所述发酵培养基组成如下：葡萄糖70g，棉籽粉25g，碳酸钙9g，磷酸二氢钾0.1g，蒸馏水1L，pH为7.0，115℃灭菌30min。
在发酵培养第5天时结束发酵，取样检测AmA和AmB含量。用高效液相色谱测得重组结节链霉菌Streptomyces nodosus ZJB2016050-AER5-3在降低副产物AmA的同时AmB产量提高，AmA产量下降至0～0.3g/L降低约88％～98％，同时AmB产量增加26％至4.8g/L。重组结节链霉菌Streptomyces nodosus ZJB2016050-ER5，该菌株AmB产量增加8％至5.57g/L，副产物AmA下降约98％，几乎被消除。结果如图3所示。
实施例9：多基因过表达菌株摇瓶发酵产AmB
实施例7所构建多基因过表达菌株Streptomyces nodosus ZJB2016050-ER5-6PPGA摇瓶发酵产AmB。
(1)种子培养：
从GYM斜面培养基上取一环带灰色孢子菌落接种于一瓶含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得种子液。所述种子培养基如实施例5所述。
(2)发酵培养：
将2mL种子液接种到50mL发酵培养基中，发酵容器为500mL三角瓶，在25℃、200r/min条件下摇床培养。所述发酵培养基如实施例5所述。
在发酵培养第5天时结束发酵，取样检测AmB含量。用高效液相色谱测得Streptomyces nodosus ZJB2016050-ER5-6PPGA菌株AmB产量为6.53g/L，且不产副产物AmA。结果如图4所示。
实施例10：5L发酵罐产AmB
实施例7所构建多基因过表达菌株Streptomyces nodosus ZJB2016050-ER5-6PPGA在5L发酵产AmB。
(1)种子培养：
从GYM斜面培养基上取一环带灰色孢子菌落接种于一瓶含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得种子液。所述种子培养基如实施例5所述。
(2)5L发酵罐发酵培养：
5L发酵罐中装发酵液量2L，接种量按体积浓度5％接种种子液，26℃培养，压力0.05MPa、通气比1.2vvm，转速500rpm，在发酵72h进行1.5g/L/h葡萄糖恒速补料，发酵培养至168h，获得发酵液。所述发酵培养基如实施例5所述。
在发酵培养第168h结束发酵，取样检测AmB含量。用高效液相色谱测得Streptomyces nodosus ZJB2016050-ER5-6PPGA菌株AmB产量为14.85g/L，且不产副产物AmA。结果如图5所示。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种高产两性霉素B的重组结节链霉菌、构建方法及应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 693
<212> DNA
<213> Streptomyces nodosus
<400> 1
atggcacgac cgcggcgcat cgttctggtc cggcacggcg agtcggtggg caacgccgac 60
gtctccgtgt acgaacgcga gcccgaccat gcgctgccgc tcaccgagcg gggctggcag 120
caggcggagg agacgggcgg gcggttgcgg gagctcttcg gcgaggagcg ggtcagcgtg 180
tatgtctccc cctaccgccg cacccatgag acgctgcgcg ccttccgcct ggaccccgac 240
ctcgtccggg tccgcgagga gccccgactg cgtgagcagg actggggtaa ctggcaggac 300
ggcgacgacg tacggctcca gaagacatac cgggacgcct acgggcactt cttctaccgc 360
ttcgcccagg gcgagtccgg ggcggatgtg tacgaccggg tcggcaactt cctggagagc 420
ctgttccgca gtttcgaggc gcccgaccac ccgccgaacg tgctcctggt gacccatggc 480
ctggccatgc ggctgttctg catgcgctgg ttccactgga cggtcgcgga attcgagtcc 540
ctctccaacc cggggaacgg cgagacgcgg atgctcctcc tcggggagga cggcaaatat 600
cgactcgacc atccctttga gcgctggcgt gagccggagc ccttctgggt caccggaaaa 660
cgtcatccgg ggcccttccg ccccaccgga tag 693
<210> 2
<211> 1146
<212> DNA
<213> Streptomyces nodosus
<400> 2
atgacggtca tggagcagcg gggcgcctac cggcccacac cgccgcccgc ctggcagccc 60
cgtaccgacc ccgctcccct gttgcccgac gcactgccgt atcgcgtcct cggcaccgag 120
gcggccgccg aggccgaccc ggagctgctg cgccggctgt acgcacagct ggtgcgcggc 180
cgccggtaca acgtgcaggc gacggcgctc acgaagcagg gccgcctggc cgtctacccc 240
gccagcaccg ggcaggaggc ctgccaggtc gccgccgccc tggtcctgga ggagcgcgac 300
tggctcttcc ccagctatcg cgacacgctc gccgtcatcg cccgtggcgt cgaccccgtg 360
gagaccctga ccctgctgcg cggcgactgg cacaccggct acgaccccca cgcacaccga 420
gtggcccccc tgtccacccc gctcgccacc cagttgccgc acgccgtggg cctggcgcac 480
gccgcgcgtc tgaagggcga cgacgtggtc gcgctcgcca tgatcggcga cggcggcacc 540
agcgagggcg acttccacga ggcgatgaac ttcgccgcgg tctggcaggc gccggtcgtc 600
ttcctcgtcc agaacaacgg cttcgcgatc tccgtcccgc tcgccaagca gaccgccgcc 660
ccctccctgg cccacaaggc cgtcgggtac ggcatgccgg gccggctggt cgacggcaac 720
gacgcggccg ccgtgcacca ggtcctcgcc gaggccgtgc ggcgcgcccg cgagggcggc 780
ggacccacgc tggtcgaggc ggtgacctac cgcatcgacg cccacaccaa cgccgacgac 840
gcgacccgct accgggtcga cgccgaggtc gaggcatggc gcgcccacga cccgatcctg 900
ctgctggagc gcgagctgac cgagcgggag ctgctggacg agcaggggaa gaaggccgcc 960
catgaggacg ccgaggcgat ggcggccgat ctgcgcgccc ggatgaacca ggacccggag 1020
ctcgggacga aggatctctt cgcccatgtg tacgcccggc ccaccaccca actcctcgaa 1080
caggaggccc agttgcaggc cgagctggac gcggagaccg ccggaccgga aggagccgga 1140
cgatga 1146
<210> 3
<211> 879
<212> DNA
<213> Streptomyces nodosus
<400> 3
atggagctcg gtctcgtcgg cctcggcaag atgggcggca acatgcgcga gcggatacgc 60
cgcgcgggcc acaccgtcgt cggatacgac cgcaacccgg acctcgccga tgtccagagc 120
ctcgaggagc ttgtgggcaa gctcgccgag ggccctcgta cggtgtgggt gatggtcccg 180
gccggcgccc cgacccagtc cacgatcgac gagctcgccg agctcctgga gcccggcgac 240
gtcgtcgtgg acggcggcaa ctcccgctgg accgacgacg agaagcacgc cgagcagctc 300
gcggccaagg gcatcggctt tgtggactgc ggggtctccg gcggtgtctg gggcctggag 360
aacggctatg cgctgatgta cggcggcgac gccgaggaca tcgccaaggt gcagccggtc 420
ttcgacgccc tcaagcccga gggcgagttc ggcgcggtgc acgcgggcaa ggtcggtgcg 480
ggccacttcg cgaagatggt ccacaacggc atcgagtacg ccatgatgca ggcctacgcc 540
gagggctggg agctgctgga gaaggtcgac tccgtggaga acgtccgcga ggtcttccgc 600
tcctggcagg agggcacggt catccgctcc tggctgctgg acctcgcggt caacgccctg 660
gacgaggacg agcacctgga ccagctgcgc ggttatgcct cggactccgg cgagggccgc 720
tggaccgtcg aggccgcgat cgacaacgcg gtgccgctgc ccgcgatcac cgcctcgctg 780
ttcgcccggt tcgcctcccg gcaggacgac tccccgcaga tgaagatgat cgcggcgctg 840
cgcaatcagt tcggcggcca cgcggtcgag aagaagtag 879
<210> 4
<211> 1617
<212> DNA
<213> Streptomyces nodosus
<400> 4
atgagtgagg agaggtccga ggggaccact gccgggaaca cggagccgga gaccgtgacg 60
accggagcca cgggtgagaa cggaagcgcg gcggaggact ggggcaaccc cctccgtgat 120
ccccgcgacc ggcgtctccc ccggatcgcg ggcccctccg gtctggtgat cttcggtgtc 180
acgggcgatc tgtcccgcaa gaagctgatg cccgccgtct acgacctcgc caaccggggt 240
ctgctgccgc cgggcttctc gctcgtcggc ttcgcccggc gcgactgggc cgacgaggac 300
ttcgccgagg tggtgcacca ggcggtgcgc gagcatgccc gtacgccctt ccgcgaggag 360
gtgtggcagc agctcgccga aggcatgcgg ttcgtccccg gcaccttcga ggacgacgac 420
gccttcgcac agctgtgcac ggccatcgac gagctgaacg cgtcccgggg caccggcggc 480
aactatgcgt tctatctctc cgtgccgccg aagttcttcc cgcaggtcgt ccggcagctg 540
aagaagcacg ggctcgccga cgccccggcg ggctcctggc ggcgcgcggt catcgaaaag 600
ccgttcggcc atgatctggc gagcgcgcgt gacctcaatg cgatcgtgca cgatgtgttc 660
gaacctgacc aggtcttccg catcgaccac tatctgggca aggagacggt ccagaacatc 720
ctggcactgc gcttcgccaa tcagatgtac gagccggtgt ggaaccgctc gtatgtcgac 780
catgtgcaga tcaccatggc cgaggacatc ggcatcggcg gccgggccgg ctactacgac 840
ggcatcggcg ccgcccgcga cgtcatccag aaccacctcc tccagctgct ggccctcacg 900
gccatggagg agcccatcgc cttcgacgcg gaggcgctgg tcaccgagaa gctgaaggtc 960
ctcaggtcgg tggaactccc ggaggacctc ggcggccaca ccgtgcgggg acagtacgcg 1020
gccggctggc agggcggcga gcgggtcggc ggctatctgg aggaggaggg catcgacccc 1080
gggtccacca cggacaccta tgcggcgatc aggctgggga tcgacaaccg ccgctgggcg 1140
ggcgtgccct tctatctgcg caccggcaag cggctgggcc gccgggtcac cgagatcgcg 1200
gtcgtcttcc agcgggcgcc gcactccccc ttcgacacca ccgccaccga ggagctcggc 1260
gagaacgcga tcgtcatccg cgtccagccc gacgagggca tgaccgtgcg cttcggttcc 1320
aaggtgccgg gtacctcgat ggagctccgg gacgtcagca tggacttcgc ctacggcgag 1380
tccttcaccg agtcgagccc ggaggcctac gaacggctga tcctggacgt actgctcggc 1440
gacgccaatc tgttcccccg caccgaggag gtggaggagt cctggaggat cctcgacccg 1500
atcgaggagt actgggcctc ccacggcaag cccgcacagt atcccgcggg cacctggggt 1560
ccggaggaag ccgacgagat gctcgcacga gacggacgga gctggcgcag gccatga 1617
<210> 5
<211> 1512
<212> DNA
<213> Streptomyces nodosus
<400> 5
atggcgcagt tgacgacggc gggacggagc atcacggtcg acggcacact gcggcgcagc 60
gcacggcgca cccccgagcg cacggcgatc cactaccggg accgctcgtg gacctatgcc 120
gcactcgacg acgccgtctc ccgggcggcc cggatgctgc gcgagtccgg gctcgcgcac 180
ggggaccggg tcggcgccta cggccacaac tccgacgcct atctgatcgg cttcctggcc 240
tgcgcccgcg ccggactggt gcatgtgccg gtgaaccaga acctgaccgg ggacgacctg 300
gagtacatcc tcgagcagtc cggctgtgcg ctggtcctcg cggatccggc tctcaccggg 360
aaccttcccg agggcgtccg ggtgctgccg ctgcgcgaca gcgacgactc cctgctggcc 420
cggctcgcca ccacccagcc gtacgacggg gaggaggcgc gcggcgagga cctggtgcag 480
ctgctctaca cctctggcac gaccgcgctg cccaagggcg cgatgctgac ccaccgtgcg 540
ctggtgcacg agtatctgag cgcgatcacc gccctggacc tgagtcccgg cgaccggccc 600
gtgcacgcgc tgccgctcta ccactccgcg cagctgcatg tcttcctgct gccctgtctt 660
gccgtgggcg cgcagaacac cgtcctggac gcacccgacg gcgaccagct cctcgagctg 720
atcgaggagg gccgcgcgga cagtctcttc gcgccgccca ccgtatgggt ctctctcgcg 780
ggccgccccg acttcgccga ccgggacctg agcgggctgc gcaaggccta ctacggcgcc 840
tcgatcatgc cggtgccggt cctggaacgc cttcgggagc ggctgccgcg gctggcgttc 900
tacaactgct tcggacagag cgagatcggc ccgctggcca tggtcctcgg gcccgacgag 960
cacaaggggc gcatggactc ctgcgggcgc ccggtgctgt tcgtggaggc gaagctcgtc 1020
gacgcctccg gggccgatgt gccggacggg gagcggggtg agatcgtcta ccggtcaccg 1080
cagttgtgcg aggggtactg gaaccggccg gaggagaccg cggaggcctt ccgggacggc 1140
tggttccact caggggatct cgccgtacgg gacgcggacg gctacttcac gatcgtcgac 1200
cgggtcaagg acgtcatcaa ctccggtggt gtgctggtcg cctcacggca ggtcgaggac 1260
gccctctaca cccatgaggg ggttgccgag gtcgcggtga tcgggctgcc cgacgaacgc 1320
tggatcgagg cggtcaccgc ggtcgtggta cgccgcggcg aggtgaccga ggccgaactc 1380
ctcgcccacg cccgggagaa gctcgcccgt ttcaaggcac ccaaacaggt gctgttcgtg 1440
gaccggctgc cgcgcaacgc gagcggaaag atcctcaagc gggagctgcg ggaccgcttc 1500
acccgggcct ga 1512
<210> 6
<211> 280
<212> PRT
<213> Streptomyces nodosus
<400> 6
Ile Glu Val Arg Ala Ala Gly Leu Asn Phe Arg Asp Val Leu Lys Ala
1 5 10 15
Leu Gly Met Tyr Pro Gly Asp Ala Gly Arg Tyr Gly His Glu Ala Ala
20 25 30
Gly Val Val Val Glu Val Gly Pro Asp Val Thr His Ile Ala Pro Gly
35 40 45
Asp Arg Val Met Gly Met Val Ser Gly Ser Phe Ala Ser Phe Ala Val
50 55 60
Thr Asp Ala Arg Arg Leu Thr His Leu Pro Glu Gln Cys Thr Trp Glu
65 70 75 80
Ile Gly Ala Ser Leu Pro Leu Val Phe Leu Thr Ala Tyr His Ala Leu
85 90 95
Lys Glu Leu Gly Gly Leu Thr Ala Gly Glu Lys Val Leu Ile His Ala
100 105 110
Gly Ala Gly Gly Val Gly Met Ala Ala Ile Gln Ile Ala Arg His Phe
115 120 125
Gly Ala Glu Val Phe Ala Thr Ala Ser Glu Ala Lys Met Asp Val Leu
130 135 140
Arg Ser Leu Gly Val Ala Asp Asp His Ile Ala Ser Ser Arg Thr Leu
145 150 155 160
Asp Phe Glu Ala Ala Phe Ala Ala Val Ala Gly Glu Asn Gly Leu Asp
165 170 175
Val Val Leu Asn Ser Leu Ala Gly Glu Phe Val Asp Ala Ser Met Arg
180 185 190
Leu Leu Gly Thr Gly Gly Arg Phe Leu Glu Met Gly Lys Thr Asp Ile
195 200 205
Arg Glu Asp Asp Ser Val Pro Asp Gly Ile Thr Tyr Gln Ser Phe Asp
210 215 220
Leu Ala Phe Val Asp Pro Glu Val Ile Gly Ala Met Gly Arg Glu Leu
225 230 235 240
Thr Glu Leu Phe Ala Ala Gly Asp Leu His Pro Leu Pro Val Arg Ala
245 250 255
Trp Asp Ile Arg His Ala Thr Asp Ala Phe Arg His Met Ser Met Ala
260 265 270
Arg His Ile Gly Lys Ile Val Leu
275 280
<210> 7
<211> 840
<212> DNA
<213> Streptomyces nodosus
<400> 7
atcgaggtcc gcgccgcggg cctcaacttc cgcgacgtcc tcaaggccct cggcatgtat 60
cccggcgacg ccgggcgata cggccacgag gccgccggcg tggtcgtcga ggtcggcccg 120
gacgtcacgc acatcgcccc cggtgaccgc gtcatgggca tggtctccgg tagcttcgcc 180
tcgttcgccg tgaccgacgc ccgccgtctc acccacctcc cggagcagtg cacctgggag 240
atcggtgcct ccctgccgct ggtgttcctc accgcctacc acgcgctgaa ggaactcggc 300
gggctgaccg cgggggagaa ggtcctcatc cacgccggtg ccggtggtgt cggcatggcg 360
gcgatccaga tcgcccgcca cttcggcgcg gaggtcttcg cgacggccag cgaggccaag 420
atggacgtgc tgcgctccct cggagtcgcc gacgaccaca tcgcctcctc ccgcaccctc 480
gacttcgagg cggccttcgc cgccgtcgcg ggcgagaacg gtctcgacgt cgtactgaac 540
tccctggccg gggagttcgt cgacgcctcg atgcggctgc tcggcacggg cggccggttc 600
ctggagatgg gcaagaccga catccgcgag gacgactcgg tcccggacgg catcacctat 660
cagtccttcg acctcgcctt tgtggacccc gaggtgatcg gcgccatggg ccgcgagctg 720
acggagctgt tcgccgccgg agacctccac ccgctcccgg tccgtgcctg ggacatccgg 780
cacgccacgg acgccttccg ccatatgagc atggcccggc acatcggcaa gatcgtgctg 840

Claims (7)

1.一种消除副产物两性霉素A且产两性霉素B的重组结节链霉菌，由如下方法构建获得：以结节链霉菌CCTCC NO：M 2017426为底盘菌，突变其聚酮合酶ER5结构域NADPH结合位点，所述聚酮合酶ER5结构域氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，将其氨基酸序列中的HAGAGGVGMA突变为HAGASPVGMA，PGDAGRYGHEAAG突变为PGDDVGSFGSEAAG，再导入SEQ IDNO.1所示磷酸甘油酸变位酶基因（PGM）、SEQ ID NO.2所示丙酮酸脱氢酶基因（PDH）、SEQ IDNO.3所示6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因（6PGDH）、SEQ ID NO.4所示葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因（G6PD）、SEQ ID NO.5所示脂酰CoA合成酶基因（ACS）的串联基因获得。
2.如权利要求1所述的重组结节链霉菌，由如下方法构建获得：
（1）以结节链霉菌（Streptomyces nodosus ）CCTCC NO：M 2017426为底盘菌，将其聚酮合酶ER5结构域氨基酸序列中的HAGAGGVGMA突变为HAGASPVGMA，PGDAGRYGHEAAG突变为PGDDVGSFGSEAAG，得到结节链霉菌ZJB2016050-ER5，所述聚酮合酶ER5结构域氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
（2）将SEQ ID NO.1所示磷酸甘油酸变位酶基因、SEQ ID NO.2所示丙酮酸脱氢酶基因、SEQ ID NO. 3所示6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因、SEQ ID NO.4所示葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因、SEQ ID NO.5所示脂酰CoA合成酶基因串联，并导入结节链霉菌ZJB2016050-ER5中，得到基因工程菌ZJB2016050-ER5-6PPGA，即所述消除副产物两性霉素A且产两性霉素B的重组结节链霉菌。
3.构建权利要求1所述重组结节链霉菌的方法，其特征在于所述方法如下：
（1）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将底盘菌结节链霉菌（Streptomyces nodosus ）CCTCC NO：M 2017426基因组中聚酮合酶ER5结构域其中氨基酸序列由HAGAGGVGMA突变为HAGASPVGMA， PGDAGRYGHEAAG突变为PGDDVGSFGSEAAG，得到结节链霉菌ZJB2016050-ER5；
（2）将PCR克隆获得的SEQ ID NO.5所示脂酰CoA合成酶基因（ACS）及启动子插入pJTU1278载体质粒多克隆位点处，得到重组载体pJTU1278-eACS；
（3）将步骤（2）中得到的重组载体转化入大肠杆菌DH5α，对得到的转化子进行测序，将确认无误的载体导入供体菌大肠杆菌；
（4）在步骤（3）构建完成的质粒上依次插入SEQ ID NO.4所示葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因、SEQ ID NO.1所示磷酸甘油酸变位酶基因、SEQ ID NO.2所示丙酮酸脱氢酶基因、SEQ IDNO. 3所示6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因，得到质粒pJTU1278-e6PGDH-ePDH-ePGM-eG6PD-eACS（pJTU1278-6PPGA），导入供体菌大肠杆菌；
（5）将步骤（4）构建的含有重组质粒pJTU1278-6PPGA的供体菌株大肠杆菌通过接合转移方法将过表达载体转化到受体菌结节链霉菌ZJB2016050-ER5，得到基因工程菌ZJB2016050-ER5-6PPGA，即所述消除副产物两性霉素A且产两性霉素B的重组结节链霉菌。
4.权利要求1所述重组结节链霉菌在微生物发酵制备两性霉素Ｂ中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述重组结节链霉菌接种至发酵培养基中，于25~30 ℃、100~300 rpm条件下进行发酵培养72~168h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到两性霉素Ｂ。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述发酵培养基组成如下：葡萄糖60~80 g/L，牛肉膏5~10 g/L，大豆蛋白粉5~10 g/L，棉子粉8~30 g/L，CaCO3 5~10 g/L，KH2PO4 0.1~0.4g/L，溶剂为水，pH 7.0，119℃灭菌30 min。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述重组结节链霉菌先经种子培养，再将种子液以体积浓度2~10%的接种量接种至发酵培养基，所述种子培养过程如下：将所述重组结节链霉菌接种在GYM平板上，26℃生长7天，获得灰色的孢子，使用棉花棒将表面孢子洗脱至无菌水中，将洗下的孢子悬液用含有棉花的注射器过滤，过滤后的孢子离心去上清，加入无菌水重悬，获得孢子悬液；孢子悬液接种至种子培养基26℃培养48h，获得种子液；所述GYM平板组成为：葡萄糖1~5 g/L，酵母粉1~5 g/L，麦芽提取物5~29 g/L，碳酸钙1~3 g/L，琼脂15~20 g/L，溶剂为水，pH7.0~7.5，115℃灭菌30 min；所述种子液培养基组成为：蛋白胨10~20g/L，NaCl 5~10 g/L ，葡萄糖10~15 g/L，酵母粉5~10 g/L，CaCO3 0.5~1 g/L，溶剂为水，pH7.0~7.2，119℃灭菌30 min。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002258125A1 (en) * 2001-05-31 2002-12-09 University College Dublin Engineered biosynthesis of novel polyenes
CN110343650A (zh) * 2019-05-28 2019-10-18 浙江工业大学 一种高产两性霉素b的重组结节链霉菌及其应用
CN110564718A (zh) * 2019-05-28 2019-12-13 浙江工业大学 高通量诱变筛选高产两性霉素b结节链霉菌的方法及菌株
CN110577921A (zh) * 2019-05-28 2019-12-17 浙江工业大学 产两性霉素b的重组结节链霉菌及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002258125A1 (en) * 2001-05-31 2002-12-09 University College Dublin Engineered biosynthesis of novel polyenes
CN110343650A (zh) * 2019-05-28 2019-10-18 浙江工业大学 一种高产两性霉素b的重组结节链霉菌及其应用
CN110564718A (zh) * 2019-05-28 2019-12-13 浙江工业大学 高通量诱变筛选高产两性霉素b结节链霉菌的方法及菌株
CN110577921A (zh) * 2019-05-28 2019-12-17 浙江工业大学 产两性霉素b的重组结节链霉菌及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Comparative metabolomics analysis of amphotericin B high-yield mechanism for metabolic engineering;Bo Zhang等;Microb Cell Fact;第1-13页 *

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