CN113025546B

CN113025546B - 一种多酶级联转化l-酪氨酸生产酪醇的方法

Info

Publication number: CN113025546B
Application number: CN202110292484.1A
Authority: CN
Inventors: 吴静; 阮小波; 刘佳; 宋伟; 陈修来; 高聪
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-03-18
Filing date: 2021-03-18
Publication date: 2023-06-13
Anticipated expiration: 2041-03-18
Also published as: CN113025546A

Abstract

本发明公开了一种多酶级联转化L‑酪氨酸生产酪醇的方法，属于生物工程技术领域。本发明所述的生产方法在将中间产物转化为酪醇的过程中利用一辅酶再生体系，通过将NADP⁺转化为NADPH，降低反应成本，提高整体转化效率。更进一步地，通过模块化组装和基因重复表达实现各酶的平衡表达，避免了中间产物的积累。并从反应的pH、温度对催化体系进行优化，可使得酪醇产量达到21.84g/L，转化率达到95.5％。从而大大降低了的底物成本和环境污染等问题，为酪醇的工业化生产和绿色生产奠定了基础。

Description

一种多酶级联转化L-酪氨酸生产酪醇的方法

技术领域

本发明涉及一种多酶级联转化L-酪氨酸生产酪醇的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

酪醇(2-(4-羟基苯基)乙醇)是一种天然酚类化合物，具有抗氧化和抗炎活性。该化合物的衍生物，如羟基酪醇和红景天苷，是重要的抗氧化剂和心血管药物，广泛应用于制药工业。此外，酪醇还可用作食品添加剂，以改善食品的风味，如清酒和葡萄酒。因此，酪醇作为一种重要精细化学品在医药和其他和工业领域中应用广泛，备受研究者的关注。

酪醇的生产方法主要包括植物提取、化学合成和微生物合成。酪醇存在于天然植物如橄榄和红景天中。然而，初榨橄榄油中酪醇的含量仅为40-180mg/kg oil。尽管天然资源丰富，但由于植物中的含量较低，且提取复杂，限制了酪醇的工业化生产。目前，酪醇的工业制备主要通过化学合成。酪醇可以通过一步或多步反应由前体如苯酚、苯乙醇、对羟基苯乙酸和对羟基苯胺生产。但是这类工艺方法存在原料成本高，工艺条件苛刻，纯化复杂；同时大量使用有机溶剂易造成环境污染。

生物法合成酪醇具有成本低、反应条件温和、环境污染少等特点，具有广阔的工业化开发前景。生物法包括微生物发酵法和细胞外酶转化法。近年来，已经报道了一系列关于酪醇在大肠杆菌和酿酒酵母中生物合成的研究。通过代谢工程改造酿酒酵母用于酪醇的生物合成，在摇瓶中可达927.68±25.26mg/L，在5L发酵罐中达到9.9g/L。以大肠杆菌为宿主，引入酪醇生物合成途径，从葡萄糖从头合成，酪醇产量在摇瓶中达到1508.7mg/L，在5L发酵罐中达到3.9g/L。

此外，目前采用多酶级联构建的全细胞催化简单前体生成高副加值产物已广泛应用。酶催化转化是一种高选择性反应，可达到定向转化的目的。Xue等人将来自酿酒酵母的苯丙酮酸脱羧酶基因ARO10和转氨酶基因ARO8在大肠杆菌中共过表达，从1812mg/L酪氨酸中生产1203mg/L酪醇。此外，Mao等人共表达L-氨基酸脱氨酶(LAAD)、丙酮酸脱羧酶(ARO10)和苯乙醛还原酶(PAR)，可从0.9g/L L-酪氨酸合成0.65g/L酪醇。然而，这些方法由于酪醇产量低尚不能用于工业化生产。因此，开发一种高效生产酪醇的方法仍是一个挑战。

发明内容

[技术问题]

酪醇合成方法产量较低，且成本较高，不适于工业化生产。

[技术方案]

本发明提供了一种高效生产酪醇的方法，并构建了以大肠杆菌为宿主的共表达工程菌，实现了低价可再生底物L-酪氨酸到酪醇的高效生产。

本发明通过在大肠杆菌细胞中表达合成酪醇的路径酶：L-氨基酸脱氨酶、丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶；通过引入葡萄糖脱氢酶-葡萄糖辅因子再生系统，将NADP⁺再生为NADPH，降低反应成本。随后通过模块化组装与基因重复表达平衡路径酶的表达，消除中间产物积累，进而实现了酪醇的高效生产，为酪醇的工业化生产奠定了基础(图1)。

本发明的第一个目的是提供一种高效生产酪醇的重组大肠杆菌，双质粒表达系统表达L-氨基酸脱氨酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶。

在一种实施方式中，所述双质粒包括pETDuet-1质粒和pACYCDuet-1质粒。

在一种实施方式中，所述L-氨基酸脱氨酶和丙酮酸脱羧酶位于pETDuet-1质粒上，醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶位于pACYCDuet-1质粒上。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌用pETDuet-1质粒中表达两个拷贝的丙酮酸脱羧酶基因。

在一种实施方式中，所述L-氨基酸脱氨酶选自奇异变形杆菌，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示，其基因PmLAAD核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在一种实施方式中，所述丙酮酸脱羧酶选自热带假丝酵母1798，氨基酸序列如SEQID NO.3所示，其基因CtPDC核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在一种实施方式中，所述醇脱氢酶选自酿酒酵母BY4741，其相应的亲本氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其基因ScADH6核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在一种实施方式中，所述葡萄糖脱氢酶选自巨大芽孢杆菌，其相应的亲本氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，其基因BmGDH核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示

在一种实施方式中，所述大肠杆菌为Escherichia coli BL21(DE3)。

本发明的第二个目的是提供一种全细胞催化剂，所述全细胞催化剂含有上述重组大肠杆菌。

本发明的第三个目的是提供一种构建所述重组大肠杆菌的方法，所述方法为以pETDuet-1质粒为表达载体表达L-氨基酸脱氨酶和丙酮酸脱羧酶；以pACYCDuet-1质粒为表达载体表达醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶；其中丙酮酸脱羧酶CtPDC在pETDuet-1质粒中串联表达两个拷贝。

本发明的第四个目的是提供一种生产酪醇的方法，所述方法以L-酪氨酸为反应底物，应用上述重组大肠杆菌或全细胞催化剂将L-酪氨酸转化为酪醇。

在一种实施方式中，所述转化的体系包括L-酪氨酸浓度为20～30g/L，辅酶焦磷酸硫胺素TPP浓度为1.5～2.5mmol/L，七水硫酸镁浓度为3～7mmol/L，NADP⁺浓度为0.4～0.6mmol/L，葡萄糖浓度为20～30g/L。

在一种实施方式中，所述反应体系中添加18～22g/L经IPTG诱导10～14h的上述重组大肠杆菌或全细胞催化剂。

在一种实施方式中，所述转化的pH为7～8。

在一种实施方式中，所述转化的温度为20～30℃。

在一种实施方式中，所述转化的时间为32～40h。

本发明提供了一种所述重组大肠杆菌和全细胞催化剂在制药、食品或化工领域中的应用。

有益效果：本发明构建了一种大肠杆菌重组菌，用于催化生产酪醇。该大肠杆菌重组菌同时表达四种酶，分别为L-氨基酸脱氨酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶，本发明所述的生产方法在将中间产物转化为酪醇的过程中利用一辅酶再生体系，通过将NADP⁺转化为NADPH，使得NADPH在体系中浓度相对稳定，转化能够高效进行。更进一步地，通过模块化组装和基因重复表达实现各酶的平衡表达，避免了中间产物的积累。以25g/L L-酪氨酸为底物催化36h后，生产摩尔得率达95.5％的酪醇；利用本发明的重组大肠杆菌生物转化L-酪氨酸合成酪醇，获得已知报道的以L-酪氨酸为底物生产酪醇最高产量21.84g/L，加快了酶转化法生产酪醇的工业化进程。

附图说明

图1所示为酪醇生物合成路径示意图；

图2所示为不同拷贝数质粒组装表达4种酶载体构建示意图；

图3所示为12种重组菌株在锥形瓶中转化的酪醇产量比较；

图4所示为CtPDC重复表达前后SDS-PAGE图；

图5所示转化温度和酪醇生产量的关系图；

图6所示转化缓冲液pH和酪醇生产量的关系图。

具体实施方式

基因来源：本发明所涉及到的生物酶PmLAAD、CtPDC、ScADH6、BmGDH基因分别来源于奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)1798、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4741、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)；其相对应的NCBI的AccessionNo.分别为U35383，XM_002549483，NM_001182831和LK055286。

质粒pACYCDuet-1，pCDFDuet-1，pETDuet-1和pRSFDuet-1质粒购自Novagen(Madison,WI,U.S.A.)；限制性内切酶、T4 DNA连接酶、primeSTAR等购自TaKaRa(Dalian,China)。标样购自SIGMA。实验材料均从商业途径可得。

样品预处理：取转化液12000rpm离心10min收集上清液，并以酪醇作为标准品，配制标准溶液。将适度稀释后的上清液和标准溶液分别经0.22μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法测定酪醇。

L-氨基酸脱氨酶酶活检测：取200μL终浓度为5g/L的L-氨基酸脱氨酶粗酶液加入3800μL底物(底物体系：采用200mmol/L pH 8.0磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液溶解50mmol/L L-酪氨酸)，于25℃恒温水浴反应15min，然后沸水浴10min以终止反应。样品稀释10倍，采用HPLC测量L-酪氨酸减少量。酶活单位定义为1min内L-酪氨酸减少1μmol所需的酶量。

丙酮酸脱羧酶酶活检测：分别取200μL终浓度为5g/L的丙酮酸脱羧酶粗酶液加入1800μL底物(底物体系：采用200mmol/L pH 7.0磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液溶解2mmol/L焦磷酸硫胺素、5mmol/L七水硫酸镁、20mmol/L对羟基苯丙酮酸)，于25℃恒温水浴反应15min，然后沸水浴10min以终止反应。样品稀释10倍，采用HPLC测量对羟基苯丙酮酸减少量。酶活单位定义为1min内对羟基苯丙酮酸减少1μmol所需的酶量。

醇脱氢酶酶活检测：分别取200μL终浓度为10g/L的醇脱氢酶粗酶液和葡萄糖脱氢酶粗酶液加入1600μL底物(底物体系：采用200mmol/L pH 7.5磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液溶解0.5mmol/L NADP⁺、20mmol/L的对羟基苯乙醛、20mmol/L的葡萄糖)，于25℃恒温水浴反应15min，然后沸水浴10min以终止反应。样品稀释10倍，采用HPLC测量酪醇生成量。酶活单位定义为1min内酪醇增加1μmol所需的酶量。

葡萄糖脱氢酶酶活检测：在300μL反应体系中，加入2mmol/L NADP⁺，200mmol/L葡萄糖，共200μL；加入100μL葡萄糖脱氢酶粗酶液，缓冲液为200mmol/L pH 7.5的磷酸溶液。在25℃条件下反应，利用酶标仪每隔30s检测NADPH在340nm处的吸光度，并作图。配置不同浓度的NADPH标准溶液(0-0.6mmol/L)在340nm处测定吸光值，绘制标准曲线，拟合回归方程。酶活单位定义为1min内生成1μmol NADPH所需的酶量。

HPLC测定：高效液相色谱法，所使用的高效液相色谱仪为Dionex UltiMate 3000，色谱柱:Agilent Zorbax SB-C18，流动相A为添加0.1％三氟乙酸的甲醇，流动相B为添加0.1％三氟乙酸的水，梯度洗脱，甲醇浓度由16％增加到45％，持续20min，再由45％降低到16％，持续5min。流速0.5mL/min，进样体积：10μL；检测器：紫外检测器为Dionex UltiMate3000 VWD，波长为222nm。在此条件下，L-酪氨酸、对羟基苯丙酮酸和酪醇的保留时间时间分别为11.9、15.8和18.8min。

实施例1：构建重组大肠杆菌

(1)构建pACYC/pCDF/pET/pRSF-PmLAAD-CtPDC质粒，以奇异变形杆菌Proteusmirabilis中目的蛋白编码基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.2所示)为模板，以SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10为引物，利用标准的PCR扩增体系和程序，扩增获得PmLAAD基因片段。质粒pETDuet-1经过BamHI和SacI双酶切后，采用琼脂糖核酸电泳进行胶回收。将上述PmLAAD基因片段基因片段与双酶切后的质粒采用一步同源重组酶进行连接，体系为20μL，条件为37℃，30min。连接产物转化至JM109感受态细胞，挑取单菌落进行PCR验证，阳性转化子进行测序，测序结果与理论序列一致，证明单基因表达载体pET-PmLAAD构建成功。

在此基础上，以热带假丝酵母1798的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12为引物PCR扩增CtPDC基因片段，连接到经BglⅡ和XhoI双酶切后的质粒pET-PmLAAD上，验证后得到pET-PmLAAD-CtPDC。

以质粒pET-PmLAAD-CtPDC为模板，利用引物SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.12PCR扩增得到片段PmLAAD-CtPDC，质粒pACYCDuet-1、pCDFDuet-1和pRSFDuet-1经过BamHI和XhoI双酶切后，与片段PmLAAD-CtPDC一步同源重组连接，获得pACYC/pCDF/pRSF-PmLAAD-CtPDC质粒。具体引物如表1所示，下划线处为酶切位点序列。

(2)构建pACYC/pCDF/pET/pRSF-ScADH6-BmGDH质粒，以酿酒酵母BY4741的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14为引物PCR扩增ADH6基因片段；以巨大芽孢杆菌的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16为引物PCR扩增GDH基因片段，胶回收目的条带。

按上述步骤(1)中方法获得pET-ScADH6-BmGDH，进一步地获得pACYC/pCDF/pRSF-ScADH6-BmGDH质粒。具体引物如表1所示。

表1 引物序列

(3)根据质粒相容性原理，将上述步骤(1)和(2)获取的pACYC/pCDF/pET/pRSF-PmLAAD-CtPDC、pACYC/pCDF/pET/pRSF-ScADH6-BmGDH质粒两两组合转化大肠杆菌BL21。根据不同质粒上含有的抗性基因，含有氯霉素、链霉素、氨苄霉素和卡纳霉素四种抗生素两两组合的固体培养基中筛选重组菌株，如图2显示，获取12株大肠杆菌重组菌株E.coli01-E.coli 12。

实施例2：重组菌株E.coli 01-E.coli 12转化筛选

(1)诱导培养重组菌：挑取实施例1构建的E.coli 01-E.coli 12共12株重组菌株接种至含相应抗性(34μg/mL氯霉素，34μg/mL链霉素，50μg/mL卡那霉素，100μg/mL氨苄青霉素之间的组合)的LB培养基中，200rpm、37℃培养10-12h，以体积比5％的接种量接种至含相应抗性TB培养基中，200rpm、37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时加入0.1g/L终浓度IPTG诱导，诱导温度为25℃，诱导时间12h后以6,000×g离心10min收集细胞，-40℃冻存细胞并用于后续的转化。

(2)全细胞催化反应：在100mL锥形瓶中10mL反应体系，缓冲液为pH 8.0的200mmol/L磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，分别加入20g/L诱导培养后表达E.coli 01-E.coli12的全细胞，分别添加催化反应所需辅因子和底物：辅因子为2mmol/L焦磷酸硫胺素、5mmol/L七水硫酸镁和0.5mmol/L NADP⁺，底物为25g/L L-酪氨酸和25g/L的葡萄糖。转化温度30℃，转速200rpm，反应36h后，用等量2mol/L NaOH终止反应。HPLC方法测定酪醇的产量。

如图3显示，其中含有以中等拷贝数质粒pETDuet-1表达基因PmLAAD、CtPDC和以低拷贝数质粒pACYCDuet-1表达基因ScADH6、BmGDH的重组菌株E.coli 07转化L-酪氨酸生产酪醇的效果最好，可转化25g/L L-酪氨酸生成13.97g/L的酪醇，转化率为73.3％。此外，在转化液中检测到6.6g/L的中间产物对羟基苯丙酮酸。进一步测定全细胞中四种酶的酶活，发现四种酶的酶活比为PmLAAD:CtPDC:ScADH6:BmGDH＝1:0.8:1.1:2.8，丙酮酸脱羧酶CtPDC全细胞体内测定的酶活不足。

实施例3：CtPDC酶的重复表达与验证

基于重组菌株E.coli 07，构建pET-PmLAAD-CtPDC-CtPDC质粒，在实施例1(1)中构建的pET-PmLAAD基础上，以SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.17为引物PCR扩增CtPDC基因片段，质粒pET-PmLAAD经过BglII和EcoRⅤ双酶切，胶回收后与CtPDC基因片段一步同源重组得到pET-PmLAAD-CtPDC，进一步地，以SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.12为引物PCR扩增CtPDC基因片段，具体引物如表1所示。将纯化回收的片段与经过EcoRⅤ和XhoI双酶切得到线性质粒pET-PmLAAD-CtPDC连接，验证后获得pET-PmLAAD-CtPDC-CtPDC质粒，与质粒pACYCDuet-1-ScADH6-BmGDH一同导入BL21感受态细胞，得到大肠杆菌重组菌株E.coli07-2。

将工程菌E.coli 07-2接入LB培养基，培养12h后得到活化液，将活化液接种至新鲜的TB培养基，培养2h后，加入0.1g/L的IPTG，25℃培养12h，诱导表达重组目的蛋白。取150mL诱导发酵液经6000r/min离心收集菌体。SDS-PAGE结果如图4所示，CtPDC酶在E.coli07-2中的表达比E.coli 07中表达所显示的条带更粗，因此，通过重复表达增强了CtPDC酶的表达。

以实施例2所述转化条件，验证E.coli 07-2全细胞催化剂的转化效果，以25g/L的L-酪氨酸为底物，酪醇产量提高至17.42g/L，无中间产物的积累，转化率为91.4％。测定全细胞中四种酶的酶活，发现四种酶的酶活比为PmLAAD、CtPDC、ScADH6和BmGDH的酶活比为1:1.5:1.2:3。

实施例4：全细胞最适反应温度

(1)诱导培养重组菌：将从甘油管中保存的实施例3获得的工程菌E.coli 07-2涂布于LB固体培养基上，在37℃下恒温培养至长出单克隆，挑取单克隆至新鲜的LB液体培养基中，以200rpm、37℃下恒温培养10-12h后得到活化液，将活化液以体积比5％的接种量接种至新鲜的TB培养基(34μg/mL氯霉素，100μg/mL氨苄青霉素)，200rpm、37℃培养2h后，加入0.1g/L终浓度IPTG诱导，于25℃下诱导培养12h，结束后收集细胞。

(2)全细胞催化反应：以30g/L L-酪氨酸为底物，添加30g/L的葡萄糖，在不同温度条件下(15、20、25、30、35℃)进行E.coli 07-2全细胞催化反应，其他反应条件与实施例2步骤(2)相同。HPLC方法测定酪醇的产量。

结果显示如图5，E.coli 07-2全细胞催化剂在15-25℃范围内催化效率随着温度的上升而升高，而在在25～35℃的范围内催化效率随着温度的上升而下降。在25℃酪醇产量达到峰值为20.63g/L，摩尔产率为90.2％；在35℃时转化率大幅下降。因此，E.coli 07-2全细胞催化剂催化反应最佳转化温度为25℃。

实施例5：全细胞最适反应pH

以30g/L L-酪氨酸为底物，添加30g/L的葡萄糖，在基于实施例4最适反应温度25℃的基础上，将20g/L E.coli 07-2全细胞分别置于pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0及pH8.5磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液组成的10mL转化体系进行E.coli 07-2全细胞催化反应，其他反应条件与实施例2步骤(2)相同。HPLC方法测定酪醇的产量。

结果显示如图6，E.coli 07-2全细胞催化剂在pH 6.5-7.5范围内环氧化活性随着pH的上升而增长，在pH 7.5左右达到峰值，酪醇产量为21.84g/L，摩尔产率为95.5％，随后E.coli 07-2催化活性随pH的升高而进一步下降。这说明E.coli 07-2最适反应pH值为7.5。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种多酶级联转化L-酪氨酸生产酪醇的方法

<130> BAA210212A

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 473

<212> PRT

<213> 人工序列

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Met Asn Ile Ser Arg Arg Lys Leu Leu Leu Gly Val Gly Ala Ala Gly

1 5 10 15

Val Leu Ala Gly Gly Ala Ala Leu Val Pro Met Val Arg Arg Asp Gly

20 25 30

Lys Phe Val Glu Ala Lys Ser Arg Ala Ser Phe Val Glu Gly Thr Glu

35 40 45

Gly Ala Leu Pro Lys Glu Ser Asp Ala Val Ile Ile Gly Gly Gly Ile

50 55 60

Gln Gly Ile Met Thr Ala Ile Asn Leu Ala Glu Arg Gly Met Ser Val

65 70 75 80

Thr Ile Leu Glu Lys Gly Glu Ile Gly Gly Glu Gln Ser Gly Arg Ala

85 90 95

Tyr Ser Gln Ile Ile Ser Tyr Gln Thr Ser Pro Glu Ile Phe Pro Leu

100 105 110

His His Tyr Gly Lys Ile Leu Trp Arg Gly Met Asn Glu Lys Ile Gly

115 120 125

Ala Asp Thr Ser Tyr Arg Thr Gln Gly Arg Val Glu Ala Leu Ala Asp

130 135 140

Glu Lys Ala Phe Asp Lys Ala Gln Ala Trp Ile Lys Thr Ala Lys Glu

145 150 155 160

Thr Ala Gly Phe Asp Thr Pro Leu Asn Thr Arg Ile Ile Lys Gly Glu

165 170 175

Glu Leu Ser Asn Arg Leu Val Gly Ala Gln Thr Pro Trp Thr Val Ala

180 185 190

Ala Phe Glu Glu Asp Ser Gly Ser Val Asp Pro Glu Thr Gly Thr Pro

195 200 205

Ala Leu Ala Arg Tyr Ala Lys Gln Ile Gly Val Lys Ile Tyr Thr Asn

210 215 220

Cys Ala Val Arg Gly Ile Glu Thr Ala Gly Gly Lys Ile Ser Asp Val

225 230 235 240

Val Thr Glu Lys Gly Ala Ile Arg Thr Ser His Val Val Leu Ala Gly

245 250 255

Gly Ile Trp Ser Arg Leu Phe Met Gly Asn Met Gly Ile Asp Ile Pro

260 265 270

Thr Leu Asn Val Tyr Leu Ser Gln Gln Arg Val Ser Gly Val Pro Gly

275 280 285

Ala Pro Arg Gly Asn Val His Leu Pro Asn Gly Ile His Phe Arg Glu

290 295 300

Gln Ala Asp Gly Thr Tyr Ala Val Ala Pro Arg Ile Phe Thr Ser Ser

305 310 315 320

Ile Val Lys Asp Ser Phe Leu Leu Gly Pro Lys Phe Met His Leu Leu

325 330 335

Gly Gly Gly Glu Leu Pro Leu Glu Phe Ser Ile Gly Glu Asp Leu Phe

340 345 350

Asn Ser Phe Lys Met Pro Thr Ser Trp Lys Leu Asp Glu Lys Thr Pro

355 360 365

Phe Glu Gln Tyr Arg Ile Ala Thr Ala Thr Gln Asn Thr Glu His Leu

370 375 380

Asp Ala Val Phe Gln Arg Met Lys Ala Glu Phe Pro Val Phe Glu Lys

385 390 395 400

Ser Gln Val Val Glu Arg Trp Gly Ala Val Val Ser Pro Thr Phe Asp

405 410 415

Glu Leu Pro Ile Ile Ser Glu Val Lys Glu Tyr Pro Gly Leu Val Ile

420 425 430

Asn Thr Ala Thr Val Trp Gly Met Thr Glu Gly Pro Ala Ala Gly Glu

435 440 445

Val Thr Ala Asp Ile Val Thr Gly Lys Lys Pro Val Ile Asp Pro Thr

450 455 460

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atgaacattt caaggagaaa gctgctttta ggtgttggtg ctgcgggtgt tttggccggt 60

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gcatcatttg tcgaaggtac agagggtgcg ctgcctaaag agtctgatgc agtgattatt 180

ggtggtggta ttcaaggtat catgactgct atcaaccttg cagaacgtgg catgagtgtc 240

actattttag aaaaaggcga gattggtggt gaacaatccg gccgtgcata cagccaaatt 300

attagttatc aaacatcacc agaaattttc ccattgcacc attatgggaa aatcttatgg 360

cgcggaatga acgagaaaat tggtgctgat actagttatc gtacacaagg tcgtgtagaa 420

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atctatacta actgcgcggt aagaggcatt gaaactgctg gtggtaaaat ttctgatgtt 720

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cgtttattta tgggtaacat gggcattgat attccaacgc tgaatgttta cttatcacaa 840

caacgtgtat caggtgttcc tggcgcacct cgtggtaacg tgcatttacc gaatggtatt 900

cacttccgtg aacaagctga cggtacttat gctgtcgcac cgcgtatttt caccagttct 960

attgtaaaag atagcttttt attagggcct aagttcatgc acctattagg tggtggtgag 1020

ctgccattag aattctctat cggtgaagac ttgtttaatt cattcaagat gccaacatct 1080

tggaaattag atgaaaaaac accgtttgaa caatatcgta ttgcaacagc aacacaaaat 1140

actgagcact tagatgcggt attccaaaga atgaaagctg aattcccagt atttgaaaaa 1200

tcacaagttg ttgaacgttg gggtgctgtt gttagcccaa catttgatga attaccaatt 1260

atctctgagg ttaaagaata ccctggctta gtcattaata cggcgacggt atggggtatg 1320

accgaaggcc cagcagcagg tgaagttact gctgatatcg taacgggcaa aaaaccagtt 1380

attgatccaa caccatttag tttggatcgt tttaagaagt aa 1422

<210> 3

<211> 567

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Ser Glu Ile Thr Leu Gly Arg Phe Phe Phe Glu Arg Leu His Gln

1 5 10 15

Leu Gln Val Asp Thr Val Phe Gly Leu Pro Gly Asp Phe Asn Leu Ala

20 25 30

Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Glu Val Asp Gly Met Arg Trp Ala Gly Asn

35 40 45

Ala Asn Glu Leu Asn Ala Gly Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Val

50 55 60

Asn Pro Asn Gly Leu Ala Ala Leu Val Ser Thr Phe Gly Val Gly Glu

65 70 75 80

Leu Ser Leu Thr Asn Ala Ile Ala Gly Ser Tyr Ser Glu His Val Gly

85 90 95

Ile Ile Asn Leu Val Gly Val Pro Ser Ser Ser Ala Gln Ala Lys Gln

100 105 110

Leu Leu Leu His His Thr Leu Gly Asn Gly Asp Phe Thr Val Phe His

115 120 125

Arg Met Phe Lys Asn Ile Ser Gln Thr Ser Ala Phe Ile Ser Asp Pro

130 135 140

Asn Thr Ala Ala Ser Glu Ile Asp Arg Cys Ile Arg Asp Ala Tyr Val

145 150 155 160

Tyr Gln Arg Pro Val Tyr Ile Gly Leu Pro Ser Asn Leu Val Asp Val

165 170 175

Lys Val Pro Lys Ser Leu Leu Asp Lys Lys Ile Asp Leu Ser Leu His

180 185 190

Pro Asn Glu Pro Glu Ser Gln Ala Glu Val Val Glu Thr Val Glu Lys

195 200 205

Phe Ile Ser Glu Ala Ser Asn Pro Val Ile Leu Val Asp Ala Cys Ala

210 215 220

Ile Arg His Asn Cys Leu Lys Glu Val Ala Glu Leu Ile Ala Glu Thr

225 230 235 240

Gln Phe Pro Val Phe Thr Thr Pro Met Gly Lys Ser Ser Val Asp Glu

245 250 255

Ser Asn Pro Arg Phe Gly Gly Val Tyr Val Gly Ser Leu Ser Ser Pro

260 265 270

Asp Val Lys Glu Ala Val Glu Ser Ala Asp Leu Val Leu Ser Val Gly

275 280 285

Ala Met Leu Ser Asp Phe Asn Thr Gly Ala Phe Ser Tyr Asn Tyr Lys

290 295 300

Thr Arg Asn Val Val Glu Phe His Ser Asp Tyr Thr Lys Ile Arg Gln

305 310 315 320

Ala Thr Phe Pro Gly Val Gln Met Lys Glu Ala Leu Gln Val Leu Leu

325 330 335

Lys Thr Val Lys Lys Ser Val Asn Pro Lys Tyr Val Pro Ala Pro Val

340 345 350

Pro Ala Thr Lys Ala Ile Thr Thr Pro Gly Asn Asn Asp Pro Val Ser

355 360 365

Gln Glu Tyr Leu Trp Arg Lys Val Ser Asp Trp Phe Gln Glu Gly Asp

370 375 380

Val Ile Ile Ser Glu Thr Gly Thr Ser Ala Phe Gly Ile Val Gln Ser

385 390 395 400

Lys Phe Pro Lys Asn Ala Ile Gly Ile Ser Gln Val Leu Trp Gly Ser

405 410 415

Ile Gly Tyr Ala Thr Gly Ala Thr Cys Gly Ala Ala Met Ala Ala Gln

420 425 430

Glu Ile Asp Pro Lys Lys Arg Val Ile Leu Phe Thr Gly Asp Gly Ser

435 440 445

Leu Gln Leu Thr Val Gln Glu Ile Ser Thr Met Cys Lys Trp Asp Cys

450 455 460

Tyr Asn Thr Tyr Leu Tyr Val Leu Asn Asn Asp Gly Tyr Thr Ile Glu

465 470 475 480

Arg Leu Ile His Gly Glu Lys Ala Gln Tyr Asn Asp Ile Gln Pro Trp

485 490 495

Asn Asn Leu Gln Leu Leu Pro Leu Phe Asn Ala Lys Lys Tyr Glu Thr

500 505 510

Lys Arg Ile Ser Thr Val Gly Glu Leu Asn Asp Leu Phe Thr Asn Lys

515 520 525

Glu Phe Ala Val Pro Asp Arg Ile Arg Met Val Glu Ile Met Leu Pro

530 535 540

Val Met Asp Ala Pro Ala Asn Leu Val Ala Gln Ala Lys Gln Ser Ala

545 550 555 560

Ala Thr Asn Ala Ala Gln Glu

565

<210> 4

<211> 1704

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgtctgaaa ttactttggg tagattcttc tttgaaagat tgcaccaatt gcaagttgac 60

accgttttcg gtttaccagg tgattttaac ttggctttat tagataaaat ctacgaagtc 120

gatggtatga gatgggctgg taacgccaat gaattgaacg ctggttacgc tgctgatggt 180

tacgccagag ttaatccaaa tggtttggct gctttagtct ccaccttcgg tgttggtgaa 240

ttgtctttga ctaacgccat tgctggttct tactctgaac acgttggtat cattaacttg 300

gttggtgttc catcttcttc tgctcaagct aaacaattgt tgttgcacca caccttgggt 360

aacggtgatt tcactgtttt ccacagaatg ttcaagaaca tttctcaaac ttctgctttc 420

atctccgacc caaacactgc tgcttctgaa attgacagat gtatcagaga tgcttacgtt 480

taccaaagac cagtttacat tggtttgcca tctaacttgg ttgatgttaa agttccaaaa 540

tctttgttgg acaaaaaaat tgacttgtcc ttgcatccaa atgaaccaga atcccaagct 600

gaagttgttg aaaccgttga aaaattcatt tctgaagctt ctaacccagt tatcttggtt 660

gatgcttgtg ctatcagaca caactgtctt aaagaagttg ctgaattgat tgctgaaact 720

caattcccag tcttcaccac tccaatgggt aaatcaagtg ttgatgaatc caacccaaga 780

ttcggtggtg tttacgttgg ttctttgtct tctccagatg ttaaagaagc cgttgaaagt 840

gctgacttgg tcttatctgt tggtgctatg ttgtctgatt tcaacactgg tgctttctct 900

tacaactaca agaccagaaa tgttgttgaa ttccactctg attacaccaa gatcagacaa 960

gctactttcc caggtgtcca aatgaaagaa gctttgcaag ttttgttgaa gactgtcaag 1020

aaatctgtca atccaaaata cgtcccagct ccagttccag ctaccaaagc tattaccact 1080

ccaggtaaca acgacccagt ctctcaagaa tacttgtgga gaaaagtttc tgactggttc 1140

caagaaggtg atgttatcat ttctgaaacc ggtacctctg ctttcggtat tgtccaatct 1200

aaattcccaa agaatgccat tggtatttcc caagtcttgt ggggttctat tggttacgct 1260

actggtgcta cttgtggtgc tgctatggct gctcaagaaa ttgacccaaa gaagagagtt 1320

atcttgttca ctggtgatgg ttctttgcaa ttgactgtcc aagaaatctc taccatgtgt 1380

aaatgggatt gttacaacac ctatctttac gttttgaaca acgatggtta caccattgaa 1440

agattgattc acggtgaaaa agctcaatat aacgacattc aaccatggaa caacttgcaa 1500

cttttgccat tgttcaacgc taagaaatac gaaaccaaga gaatttctac tgttggtgaa 1560

ttgaacgatt tgttcactaa caaagaattt gctgttccag acagaattag aatggttgaa 1620

attatgttgc cagttatgga tgctccagct aacttggttg cccaagctaa acaatctgct 1680

gctaccaacg ctgctcaaga ataa 1704

<210> 5

<211> 360

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Ser Tyr Pro Glu Lys Phe Glu Gly Ile Ala Ile Gln Ser His Glu

1 5 10 15

Asp Trp Lys Asn Pro Lys Lys Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Pro Phe Tyr

20 25 30

Asp His Asp Ile Asp Ile Lys Ile Glu Ala Cys Gly Val Cys Gly Ser

35 40 45

Asp Ile His Cys Ala Ala Gly His Trp Gly Asn Met Lys Met Pro Leu

50 55 60

Val Val Gly His Glu Ile Val Gly Lys Val Val Lys Leu Gly Pro Lys

65 70 75 80

Ser Asn Ser Gly Leu Lys Val Gly Gln Arg Val Gly Val Gly Ala Gln

85 90 95

Val Phe Ser Cys Leu Glu Cys Asp Arg Cys Lys Asn Asp Asn Glu Pro

100 105 110

Tyr Cys Thr Lys Phe Val Thr Thr Tyr Ser Gln Pro Tyr Glu Asp Gly

115 120 125

Tyr Val Ser Gln Gly Gly Tyr Ala Asn Tyr Val Arg Val His Glu His

130 135 140

Phe Val Val Pro Ile Pro Glu Asn Ile Pro Ser His Leu Ala Ala Pro

145 150 155 160

Leu Leu Cys Gly Gly Leu Thr Val Tyr Ser Pro Leu Val Arg Asn Gly

165 170 175

Cys Gly Pro Gly Lys Lys Val Gly Ile Val Gly Leu Gly Gly Ile Gly

180 185 190

Ser Met Gly Thr Leu Ile Ser Lys Ala Met Gly Ala Glu Thr Tyr Val

195 200 205

Ile Ser Arg Ser Ser Arg Lys Arg Glu Asp Ala Met Lys Met Gly Ala

210 215 220

Asp His Tyr Ile Ala Thr Leu Glu Glu Gly Asp Trp Gly Glu Lys Tyr

225 230 235 240

Phe Asp Thr Phe Asp Leu Ile Val Val Cys Ala Ser Ser Leu Thr Asp

245 250 255

Ile Asp Phe Asn Ile Met Pro Lys Ala Met Lys Val Gly Gly Arg Ile

260 265 270

Val Ser Ile Ser Ile Pro Glu Gln His Glu Met Leu Ser Leu Lys Pro

275 280 285

Tyr Gly Leu Lys Ala Val Ser Ile Ser Tyr Ser Ala Leu Gly Ser Ile

290 295 300

Lys Glu Leu Asn Gln Leu Leu Lys Leu Val Ser Glu Lys Asp Ile Lys

305 310 315 320

Ile Trp Val Glu Thr Leu Pro Val Gly Glu Ala Gly Val His Glu Ala

325 330 335

Phe Glu Arg Met Glu Lys Gly Asp Val Arg Tyr Arg Phe Thr Leu Val

340 345 350

Gly Tyr Asp Lys Glu Phe Ser Asp

355 360

<210> 6

<211> 1083

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgtcttatc ctgagaaatt tgaaggtatc gctattcaat cacacgaaga ttggaaaaac 60

ccaaagaaga caaagtatga cccaaaacca ttttacgatc atgacattga cattaagatc 120

gaagcatgtg gtgtctgcgg tagtgatatt cattgtgcag ctggtcattg gggcaatatg 180

aagatgccgc tagtcgttgg tcatgaaatc gttggtaaag ttgtcaagct agggcccaag 240

tcaaacagtg ggttgaaagt cggtcaacgt gttggtgtag gtgctcaagt cttttcatgc 300

ttggaatgtg accgttgtaa gaatgataat gaaccatact gcaccaagtt tgttaccaca 360

tacagtcagc cttatgaaga cggctatgtg tcgcagggtg gctatgcaaa ctacgtcaga 420

gttcatgaac attttgtggt gcctatccca gagaatattc catcacattt ggctgctcca 480

ctattatgtg gtggtttgac tgtgtactct ccattggttc gtaacggttg cggtccaggt 540

aaaaaagttg gtatagttgg tcttggtggt atcggcagta tgggtacatt gatttccaaa 600

gccatggggg cagagacgta tgttatttct cgttcttcga gaaaaagaga agatgcaatg 660

aagatgggcg ccgatcacta cattgctaca ttagaagaag gtgattgggg tgaaaagtac 720

tttgacacct tcgacctgat tgtagtctgt gcttcctccc ttaccgacat tgacttcaac 780

attatgccaa aggctatgaa ggttggtggt agaattgtct caatctctat accagaacaa 840

cacgaaatgt tatcgctaaa gccatatggc ttaaaggctg tctccatttc ttacagtgct 900

ttaggttcca tcaaagaatt gaaccaactc ttgaaattag tctctgaaaa agatatcaaa 960

atttgggtgg aaacattacc tgttggtgaa gccggcgtcc atgaagcctt cgaaaggatg 1020

gaaaagggtg acgttagata tagatttacc ttagtcggct acgacaaaga attttcagac 1080

tag 1083

<210> 7

<211> 261

<212> PRT

<213> 如人工序列

<400> 7

Met Tyr Lys Asp Leu Glu Gly Lys Val Val Val Ile Thr Gly Ser Ser

1 5 10 15

Thr Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Ala Thr Glu Lys Ala

20 25 30

Lys Val Val Val Asn Tyr Arg Ser Lys Glu Glu Glu Ala Asn Ser Val

35 40 45

Leu Glu Glu Ile Lys Lys Val Gly Gly Glu Ala Ile Ala Val Lys Gly

50 55 60

Asp Val Thr Val Glu Ser Asp Val Ile Asn Leu Val Gln Ser Ala Ile

65 70 75 80

Lys Glu Phe Gly Lys Leu Asp Val Met Ile Asn Asn Ala Gly Met Glu

85 90 95

Asn Pro Val Ser Ser His Glu Met Ser Leu Ser Asp Trp Asn Lys Val

100 105 110

Ile Asp Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile

115 120 125

Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Thr Val Ile Asn Met Ser

130 135 140

Ser Val His Glu Lys Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala

145 150 155 160

Ser Lys Gly Gly Met Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu Tyr

165 170 175

Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn

180 185 190

Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Glu Gln Arg Ala Asp

195 200 205

Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile

210 215 220

Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Ser Glu Ala Ser Tyr Val Thr

225 230 235 240

Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Gln Tyr Pro Ser Phe

245 250 255

Gln Ala Gly Arg Gly

260

<210> 8

<211> 786

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgtataaag atttagaagg aaaagtagtt gtcataacag gttcatctac cggtttagga 60

aaagcaatgg cgattcgttt tgcgacagaa aaagctaaag tagttgtgaa ttatcgttcg 120

aaagaagaag aagctaacag cgttttagaa gaaattaaaa aagtcggcgg agaggcaatt 180

gcggttaaag gtgacgtaac agttgagtct gacgtgatca atttagttca atctgctatt 240

aaagaatttg gaaagttaga cgttatgatt aataacgcag gaatggaaaa tccggtttca 300

tctcatgaaa tgtctttaag cgattggaat aaagtaattg atacaaactt aacgggagca 360

tttttaggca gccgtgaagc gattaaatat tttgtggaaa atgatattaa gggaacagtt 420

attaacatgt cgagtgttca cgagaaaatt ccttggccat tatttgttca ttacgcagca 480

agtaaaggcg gaatgaagct catgaccgaa acacttgcat tagaatacgc tccaaaaggt 540

attcgtgtaa ataacattgg accgggagcg attaatacac cgattaacgc tgagaaattt 600

gctgatcctg agcagcgtgc agatgtagaa agcatgattc caatgggata cattggagag 660

ccggaagaaa ttgcagcggt tgctgcatgg ctagcttctt cagaggcaag ttatgtaaca 720

gggattacgc tctttgctga cggcggtatg acacagtacc catcattcca agcaggacga 780

ggataa 786

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ccacagccag gatccgatga acatttcaa 29

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

caggcgcgcc gagctcttac ttcttaaaac ga 32

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

acataggcag atctgatgtc tgaaattact ttgg 34

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ctttaccaga ctcgagttat tcttgagcag cg 32

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ccacagccag gatccgatgt cttatcctga gaa 33

<210> 14

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tgcggccgca agcttctagt ctgaaaattc t 31

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

acatatggca gatctatgta taaagattta 30

<210> 16

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ctttaccaga ctcgagttac ccgcgtcctg ct 32

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tggccggccg atatcttatt cttgagcagc gt 32

<210> 18

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ctgctcaaga ataagatatc taaggagata tataatgtct gaaatta 47

Claims

1.一种高效生产酪醇的重组大肠杆菌，其特征在于，双质粒表达系统表达L-氨基酸脱氨酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶；

所述L-氨基酸脱氨酶和丙酮酸脱羧酶位于pETDuet-1质粒上，醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶位于pACYCDuet-1质粒上；用pETDuet-1质粒表达两个拷贝的丙酮酸脱羧酶基因；所述L-氨基酸脱氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述丙酮酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQID NO.3所示；所述醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌为Escherichia coli BL21(DE3)。

3.一种全细胞催化剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述重组大肠杆菌。

4.一种生产酪醇的方法，其特征在于，应用权利要求1或2所述重组大肠杆菌或权利要求3所述全细胞催化剂进行转化生产，将L-酪氨酸转化为酪醇。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述转化的体系包括20~30 g/L L-酪氨酸，1.5~2.5 mmol/L 辅酶焦磷酸硫胺素TPP，3~7 mmol/L 七水硫酸镁，0.4~0.6 mmol/LNADP⁺，20~30 g/L 葡萄糖。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述转化的pH为7~8，转化的温度为20~30℃。

7.权利要求1或2所述重组大肠杆菌或权利要求3所述全细胞催化剂在制备酪醇中的应用。