CN109929883A

CN109929883A - 重组酵母、构建方法和其在制备酪醇及衍生物中的应用

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Publication number: CN109929883A
Application number: CN201910262724.6A
Authority: CN
Inventors: 方诩; 郭伟; 侯少莉
Original assignee: Yantai Huakang Rongzan Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Yantai Huakang Rongzan Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-04-02
Filing date: 2019-04-02
Publication date: 2019-06-25
Also published as: WO2020199952A1; US20220213512A1; EP3835411B9; CN113388538B; WO2020199571A1; EP3835411B1; JP7083959B2; EP3835411A1; JP2021522852A; EP3835411A4; CN111139194B; CN113388538A; ES2954682T3; EP3835411C0; CN111139194A

Abstract

本发明涉及重组酵母、构建方法和其在制备酪醇及衍生物中的应用，所述重组酵母为将外源性的果糖‑6‑磷酸盐磷酸酮酶的表达基因导入经过改造的酵母细胞中构建获得，所述经过改造的酵母细胞为具有经4‑磷酸赤藓糖和磷酸烯醇式丙酮酸合成酪醇代谢途径的酵母细胞。本发明首次公开了在酵母中表达果糖‑6‑磷酸盐磷酸酮酶的过程中，果糖‑6‑磷酸在合成1,6‑二磷酸果糖的同时，被催化为赤藓糖‑4‑磷酸和乙酰磷酸，木酮糖‑5‑磷酸被催化为甘油醛‑3‑磷酸和乙酰磷酸，这改变了酵母中的碳代谢流量分布，增强酪醇生物合成重要中间物质的赤藓糖‑4‑磷酸的合成，优化了合成酪醇的代谢途径，提高酪醇及羟基酪醇等衍生物的产率。

Description

重组酵母、构建方法和其在制备酪醇及衍生物中的应用

技术领域

本发明涉及重组酵母、构建方法和其在制备酪醇及衍生物中的应用，特别涉及一株通过外源性的果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶(Fructose-6-phosphate phosphoketolase，fxp)的表达基因导入酵母，以及利用该菌株高效生产酪醇及其衍生物的方法，属于微生物基因工程技术领域。

背景技术

酪醇是天然的抗氧化剂，来源于橄榄油，是苯乙醇的一种衍生物。别名红景天苷元，是红景天的主要药用活性成分，是红景天苷、羟基酪醇的前体物质。可以保护细胞免受氧化伤害，是一种具有重要工业价值的酚类化合物，酪醇及其衍生物是多种有机化合物的合成前体，酪醇可被用于医药剂。酪醇的衍生物羟基酪醇是一种具有很强的抗氧化作用及多种生理医药功能，羟基酪醇的抗氧化性强于酪醇，同时可以合成很多聚合物，且没有已知毒性，在生物医药、功能食品等行业应用广泛，具有预防心血管、骨质缺乏等疾病的发生。目前，羟基酪醇的获得主要是从橄榄叶中提取，从植物中提取，成本高，占用大量的耕地。

化学法中利用苯乙醇合成法，大多先采用保护羟基，然后硝化、还原、重氮化、水解得到对羟基苯乙醇，收率为70％。苯乙醇价格高供应紧张，利用硝基甲苯合成，价格低廉但步骤较长，产率低，利用对羟基苯乙烯合成产率达到96％，纯度99％，产率和纯度都很高，具有一定的价值，但原料成本较高。化学法制备酪醇原料成本高且环境不友好，这些都直接制约了酪醇的工业化生产。因此，生物法合成酪醇及其衍生物已经成为研究热点。

酪醇(Tyrosol)具有以下特征：化学名称为4-(2-Hydroxyethyl)phenol，分子式为C₈H₁₀O₂，分子量为138.164，CAS号为501-94-0，结构式为

中国专利文献CN108753636A(申请号201810601213.8)公开了一种生产酪醇及羟基酪醇的酵母及构建方法，将PcAAS和ADH序列导入酵母BY4741，得到生产酪醇的PcAAS-ADH重组酵母；在所述PcAAS-ADH重组酵母中导入pdc1基因敲除盒、tyrA表达盒得到生产酪醇的PcAAS-ADH-Δpdc1-tyrA重组酵母；将HpaBC的DNA序列导入PcAAS-ADH-Δpdc1-tyrA重组酵母，得到生产羟基酪醇的PcAAS-ADH-HpaBC-Δpdc1-tyrA重组酵母。在酵母BY4741中构建酪醇或羟基酪醇生物合成途径，提高酪醇或羟基酪醇的产量。该技术虽然可以提高酵母中酪醇的产量，但酪醇产量仍然无法达到工业化生产的要求。受限于酵母中酪醇的合成受多种代谢途径的影响，且相关代谢途径并未完全研究清楚，因此，如何实现酪醇酵母发酵工业化仍然是目前亟需解决的技术难题。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供重组酵母、构建方法和其在制备酪醇及衍生物中的应用。

本发明的目的之一是在发明专利申请(申请号201810601213.8)的基础上，在酵母中表达来源于青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)菌种编号为ATCC 15703的果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶(Fructose-6-phosphate phosphoketolase,EC 4.1.2.22)(氨基酸序列如GenBank:BAF39468.1所示，SEQ ID NO.1)或短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)BBRI4的果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶(Fructose-6-phosphate phosphoketolase,EC4.1.2.22)(氨基酸序列如GenBank:KND53308.1所示，SEQ ID NO.2)的基因片段等，通过构建由果糖-6-磷酸催化生成酪醇生物合成重要前体物质赤藓糖-4-磷酸的新途径，提高酪醇的产率。

本发明的目的之二是提供一种生产羟基酪醇的方法。

本发明的目的之三是提供一种生产酪醇的酵母的构建方法。

本发明的目的之四是提供所述一种生产酪醇的酵母或构建方法在生产酪醇中的应用。

本发明的目的之五是提供所述一种生产酪醇的酵母或构建方法在生产羟基酪醇中的应用。

为了解决以上技术问题，本发明的技术方案如下：

重组酵母在生产酪醇中的应用，所述重组酵母为将外源性的果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶的表达基因导入经过改造的酵母细胞中构建获得，所述经过改造的酵母细胞为具有经4-磷酸赤藓糖和磷酸烯醇式丙酮酸合成酪醇代谢途径的酵母细胞。

根据本发明优选的，所述经过改造的酵母细胞为将芳香醛合成酶和分支酸变位酶/预苯酸脱水酶整合后获得。

根据本发明进一步优选的，所述芳香醛合成酶来源于香芹，酶的系统编号EC4.1.1.25；所述分支酸变位酶来源于大肠杆菌(E.coli)，酶的系统编号EC1.3.1.12；所述预苯酸脱水酶来源于大肠杆菌(E.coli)，酶的系统编号EC1.3.1.12，EC 5.4.99.5。

根据本发明优选的，所述果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶的表达基因来源于青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、两歧双歧杆菌短双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)、肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、摩恩格里艾恩斯双歧(Bifidobacterium mongoliense)、类植物乳杆菌(Lactobacillusparaplantarum)、胚牙乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、加德纳菌(Gardnerella vaginalis)、腐生性酵母菌红酵母菌(Rhodotorula glutinis)、禾本红酵母(Rhodotorula graminis)、巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)等。

更优的，所述果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示，表达基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

根据本发明优选的，所述酵母细胞为：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、耶氏解脂酵母(Yarrowia lipolytica)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)、腐生性酵母菌红酵母菌(Rhodotorula glutinis)、禾本红酵母(Rhodotorula graminis)、巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、德布尔有孢酵母(Torulaspora delbrueckii)、汉斯德巴氏酵母菌(Debaryomyces hansenii)、树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipites)、季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)、长孢洛德酵母(Lodderomyces elongisporus)、白假丝酵母菌(Candida albicans)、拟平滑念珠菌(Candida orthopsilosis)、似平滑念珠菌(Candida metapsilosis)、都柏林酵母菌(Candida dubliniensis)、葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)、耳念珠菌(Candidaauris)等。

进一步优选的，所述酵母细胞为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，菌种编号为CICC1964。

根据本发明更优选的，所述经过改造的酵母细胞为将来源于香芹(Petroselinumcrispum)的芳香醛合成酶整合到酿酒酵母CICC1964的delta12位点，并将来源于大肠杆菌(E.coli)的分支酸变位酶/预苯酸脱水酶替换酿酒酵母CICC1964的pdc1基因，获得。

一种高产酪醇的重组酵母的构建方法，包括如下步骤：

(1)构建表达盒，表达盒由启动子、终止子、同源臂以及果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶的表达基因经融合后获得；

(2)将步骤(1)构建的表达盒转化至经过改造的酵母细胞，制得高产酪醇的重组酵母；

所述经过改造的酵母细胞为具有经4-磷酸赤藓糖和磷酸烯醇式丙酮酸合成酪醇代谢途径的酵母细胞。所述经过改造的酵母细胞为将来源于香芹(Petroselinum crispum)的芳香醛合成酶整合到酿酒酵母CICC1964的delta12位点，并将来源于大肠杆菌(E.coli)的分支酸变位酶/预苯酸脱水酶替换酿酒酵母CICC1964的pdc1基因，获得。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶的表达基因来源于青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)、两歧双歧杆菌短双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)、肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、摩恩格里艾恩斯双歧(Bifidobacterium mongoliense)、类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、胚牙乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)、钩虫贪铜菌(Cupriavidusnecator)、加德纳菌(Gardnerella vaginalis)、腐生性酵母菌红酵母菌(Rhodotorulaglutinis)、禾本红酵母(Rhodotorula graminis)、巴氏酵母(Saccharomycespastorianus)等。

更优的，所述果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶的的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示，表达基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中同源臂为以酿酒酵母菌株CICC1964的基因组为模板，利用引物扩增预苯酸脱水酶(prephenate dehydratase)基因pha2上游及下游500bp的基因片段，所述上游同源臂扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示；下游同源臂扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；

根据本发明优选的，所述步骤(1)中启动子为以酿酒酵母菌株CICC1964的基因组为模板利用引物扩增的启动子tpi1，所述启动子tpi1的扩增引物的核苷酸序列分别如SEQID NO.5和SEQ ID NO.6所示；

根据本发明优选的，所述步骤(1)中启动子为以酿酒酵母菌株CICC1964的基因组为模板利用引物扩增的终止子gpm1，所述终止子gpm1的扩增引物的核苷酸序列分别如SEQID NO.9和SEQ ID NO.10所示；

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，经过改造的酵母细胞为将芳香醛合成酶和分支酸变位酶/预苯酸脱水酶整合后获得。

根据本发明进一步优选的，所述步骤(2)中，芳香醛合成酶来源于香芹(Petroselinum crispum)，酶的系统编号EC4.1.1.25；所述分支酸变位酶/预苯酸脱水酶来源于大肠杆菌(E.coli)，酶的系统编号EC1.3.1.12，EC 5.4.99.5。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中所述酵母细胞为：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、耶氏解脂酵母(Yarrowia lipolytica)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)、腐生性酵母菌红酵母菌(Rhodotorula glutinis)、禾本红酵母(Rhodotorula graminis)、巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、光滑念珠菌(Candidaglabrata)、德布尔有孢酵母(Torulaspora delbrueckii)、汉斯德巴氏酵母菌(Debaryomyces hansenii)、树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipites)、季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)、长孢洛德酵母(Lodderomyces elongisporus)、白假丝酵母菌(Candida albicans)、拟平滑念珠菌(Candida orthopsilosis)、似平滑念珠菌(Candida metapsilosis)、都柏林酵母菌(Candida dubliniensis)、葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)、耳念珠菌(Candida auris)等。

进一步优选的，所述酵母细胞为酿酒酵母，菌种编号为CICC1964。

根据本发明更优选的，所述步骤(2)中，经过改造的酵母细胞为将来源于香芹(Petroselinum crispum)的芳香醛合成酶整合到酿酒酵母CICC1964的delta12位点，并将来源于大肠杆菌(E.coli)的分支酸变位酶/预苯酸脱水酶替换酿酒酵母CICC1964的pdc1基因，获得。

上述方法构建的高产酪醇的重组酵母。

上述高产酪醇的重组酵母在发酵制备酪醇中的应用。

根据本发明优选的，所述发酵的发酵培养基中至少含有葡萄糖、果糖、蔗糖之一或二者以上的组合与酪氨酸。

上述高产酪醇的重组酵母在发酵制备羟基酪醇中的应用。

根据本发明优选的，将上述高产酪醇的重组酵母通过发酵制备酪醇后，经过羟化酶反应获得羟基酪醇。

根据本发明优选的，将上述高产酪醇的重组酵母经发酵所得酪醇，利用过表达4-羟基苯乙酸羟化酶的大肠杆菌催化，获得羟基酪醇。

根据本发明进一步优选的，所述的发酵的发酵培养基中至少含有葡萄糖、果糖、蔗糖之一或二者以上的组合与酪氨酸。

本发明的有益效果：

1、本发明首次公开了在酵母中表达过程中，果糖-6-磷酸(Fructose-6-phosphate)在合成1,6-二磷酸果糖(beta-D-Fructose 1,6-bisphosphate)的同时，被催化为赤藓糖-4-磷酸(Erythrose-4-phosphate)和乙酰磷酸(Acetyl-phosphate)，木酮糖-5-磷酸(Xylulose-5-phosphate)被催化为甘油醛-3-磷酸(Glyceraldehydes-3-phosphate)和乙酰磷酸，这改变了酵母中的碳代谢流量分布，增强酪醇生物合成重要中间物质的赤藓糖-4-磷酸的合成，优化了合成酪醇的代谢途径，提高酪醇及羟基酪醇等衍生物的产率；

2、本发明将外源性的果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶的表达基因导入经过改造的酵母细胞中，获得了一种重组酵母，该重组酵母可以提高酪醇的产率，并利用过表达4-羟基苯乙酸羟化酶的大肠杆菌催化酪醇后，获得羟基酪醇。

3、本发明提供了一种新型且环境友好型酪醇及羟基酪醇生物制备技术，为酪醇及羟基酪醇的大规模工业生产奠定了基础，具有重要的经济价值和社会效益。

附图说明

图1为实施例1中所述的重组质粒pUG6的结构图；

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

下面结合实施例对本发明进一步说明：

表1中英文名称的对照

以下实施例中，大肠杆菌BL21和表达载体pET-28a为市售常用。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件进行，例如《分子克隆：实验室手册》中所述的条件，或按照相应生物学试剂的制造厂商所建议的条件。PCR扩增反应的反应程序可以为常规的PCR扩增反应程序。

酿酒酵母CICC1964，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CICC1964，为已知非保藏菌株；

按照发明专利申请(申请号201810601213.8)的方法，将来源于香芹(Petroselinum crispum)的芳香醛合成酶(AAS，aromatic aldehyde synthase，EC4.1.1.25)整合到酿酒酵母CICC1964的delta12位点，并将来源于大肠杆菌(E.coli)的分支酸变位酶/预苯酸脱水酶(TyrA，fused chorismate mutase T/prephenatedehydrogenase，EC1.3.1.12，EC 5.4.99.5)替换酿酒酵母CICC1964的pdc1基因，获得SC-1菌株。

实施例1

Bafxpk和Bbfxpk表达盒的构建

将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的氨基酸序列根据宿主酿酒酵母密码子偏好性进行密码子优化，获得SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2对应的优化后核苷酸序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4后，进行基因合成。选用引物对Bafxpk-F/Bafxpk-R和Bbfxpk-F/Bbfxpk-R，用Vazyme公司的Phanta Max High-Fidelity DNA聚合酶扩增获得目标基因果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶的表达基因(Bafxpk片段核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，Bbfxpk片段核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)。以酿酒酵母CICC1964的基因组为模板，以引物对U-F/U-R和D-F/D-RPCR扩增上下游同源臂的DNA片段，以引物对Ptpi1-F/Ptpi1-R和Tgpm1-F/Tgpm1-R扩增启动子tpi1和终止子gpm1片段。以带有遗传霉素(Geneticin)抗性基因KanMX4(核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示)的重组质粒pUG6见附图1的DNA为模板，以引物对G418-F/G418-R经PCR扩增抗性基因KanMX4的DNA片段。琼脂糖凝胶电泳验证条带大小正确后切取条带，用OMEGA凝胶提取试剂盒回收基因片段。PCR扩增引物如下：

引物对Bafxpk-F/Bafxpk-R的序列为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；引物对Bbfxpk-F/Bbfxpk-R的序列为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；引物对U-F/U-R的序列为SEQID NO.5和SEQ ID NO.6；引物对D-F/D-R的序列为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；引物对Ptpi1-F/Ptpi1-R的序列为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；引物对Tgpm1-F/Tgpm1-R的序列为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；引物对G418-F/G418-R的序列为SEQ ID NO.17和SEQ IDNO.18；

使用高保真性Phanta Max High-Fidelity DNA聚合酶扩增目的基因片段，并保证每条片段都与相邻片段存在50bp的同源序列，PCR产物经凝胶电泳后使用DNA片段胶回收试剂盒回收，并测定DNA浓度。随后将获得的纯化后的带有同源序列的DNA片段采用融合PCR的方法进行融合：

(1)使用Phanta Max High-Fidelity DNA聚合酶对片段进行连接。反应体系如表2所示：

表2反应体系

将上述试剂加入PCR管中，反应条件如表3所示：

表3反应条件

(2)以步骤1的PCR反应产物作为PCR扩增模板，选用引物对Yzaw-F/Yzaw-R，用Vazyme公司的Phanta Max High-Fidelity DNA聚合酶扩增获得目标片段。琼脂糖凝胶电泳验证条带大小正确后切取条带，用OMEGA凝胶提取试剂盒回收DNA片段即Bafxpk和Bbfxpk表达盒的DNA片段。PCR扩增引物如下：

Yzaw-F的序列为SEQ ID NO.19；Yzaw-R的序列为SEQ ID NO.20；

(3)将步骤2所获得的Bafxpk和Bbfxpk表达盒的DNA片段，测序验证。

实施例2

Bafxpk和Bbfxpk异源表达菌株的构建，以酿酒酵母为例：

采用PEG/LiAc法转化酿酒酵母酪醇合成菌株CICC1964，通过在培养基中添加G418抗性进行筛选挑取单克隆，提取基因组，利用引物对Yzaw-F/Yzaw-R进行PCR验证，获得SC-bafxpk和SC-bbfxpk菌株。

实施例3

合成酪醇微生物的发酵，以酿酒酵母为例：

在产酪醇的菌株CICC1964和SC-bafxpk和SC-bbfxpk的平板上挑取单克隆，接种到5mL YPD液体培养基中，在30～32℃，200rpm条件下培养24h，转接到50mL YPD液体培养基中，初始接种OD₆₀₀为0.2，30℃，200rpm条件下培养12h后，转接到100mL YPD液体培养基中，初始接种OD₆₀₀为0.2，培养基中分别含有2％葡萄糖或者2％蔗糖或者2％葡萄糖和1％酪氨酸等碳源，培养24小时后，再次加入2％葡萄糖或者2％蔗糖或者2％葡萄糖和1％酪氨酸等碳源，共进行72小时发酵。采用文献(Satoh et al.,Journal of Agricultural and FoodChemistry,60,979-984,2012)报道的HPLC法检测发酵液中酪醇的浓度。不同碳源培养条件下酪醇产量如表4所示。

表4不同碳源下发酵72小时后酪醇的产量

实施例4

基因HpaBC及大肠杆菌表达载体的获得方法

将来源于大肠杆菌的4-羟基苯乙酸羟化酶(HpaBC，4-hydroxyphenylacetate3-hydroxylase，酶的系统编号EC 1.5.1.37)的DNA序列基因簇在大肠杆菌中过表达，利用大肠杆菌全细胞将酪醇催化为羟基酪醇。

所述4-羟基苯乙酸羟化酶的氨基酸序列基因簇包括4-羟基苯乙酸羟化酶(HpaB)的氨基酸序列为SEQ ID NO.21，对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.23；4-羟基苯乙酸羟化酶(HpaC)的氨基酸序列为SEQ ID NO.22，对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.24。

利用细菌基因组试剂盒提取大肠杆菌DE3基因组作为模板，分别使用引物对hpaB-F/hpaB-R和hpaC-F/hpaC-R来扩增SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24，测序验证。hpaB-F的序列为SEQ ID NO.25；hpaB-R的序列为SEQ ID NO.26；hpaC-F的序列为SEQ ID NO.27；hpaC-R的序列为SEQ ID NO.28。

以pET-28a作为表达载体，培养含有pET-28a空载体的大肠杆菌，利用细菌质粒提取试剂盒提取pET-28a质粒，采用常规分子生物学方法，构建表达载体pEThpaBC(SEQ IDNO.29)。然后将pEThpaBC转化大肠杆菌表达型载体BL21，以卡那霉素为筛选标记，获得单克隆BL21-pEThpaBC。

摇瓶培养BL21-pEThpaBC，使用1mM IPTG诱导表达HPAB/C的表达。

将获得的BL21-pEThpaBC菌培养液添加到实施例3的培养液中，反应3小时后，检测获得的羟基酪醇产量结果如表5所示：

表5在表4所示的培养液中添加BL21-pEThpaBC菌后混合3小时后羟基酪醇的产量

实施例5

采用马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)，菌种编号为NBRC1777，按照发明专利申请(申请号201810601213.8)的方法，将来源于香芹(Petroselinum crispum)的芳香醛合成酶(AAS，aromatic aldehyde synthase，EC4.1.1.25)整合到马克斯克鲁维酵母的delta12位点，并将来源于大肠杆菌(E.coli)的分支酸变位酶/预苯酸脱水酶(TyrA，fused chorismate mutase T/prephenate dehydrogenase，EC1.3.1.12，EC 5.4.99.5)替换马克斯克鲁维酵母的pdc1基因，获得具有经4-磷酸赤藓糖和磷酸烯醇式丙酮酸合成酪醇代谢途径的马克斯克鲁维酵母菌株。

按照本发明实施例1-2所述方法，将果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶(Fructose-6-phosphate phosphoketolase,EC 4.1.2.22)制备获得的KM-bafxp和KM-bbfxp菌株，不同之处在于，马克斯克鲁维酵母细胞的培养温度为42～49℃。

结果分析

通过上述结果本领域技术人员可以发现，当酵母细胞中表达外源性的果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶时，可以显著提高酪醇的产量，并且该现象并非仅限于一种来源的果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶和特异的酵母细胞，而是酵母细胞中表达果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶后均具有该现象，从而可以得出外源性的果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶的表达影响了酵母细胞的糖代谢途径，从而促进了酪醇产物的生成。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

序列表

<110> 烟台华康荣赞生物科技有限公司

<120> 重组酵母、构建方法和其在制备酪醇及衍生物中的应用

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 825

<212> PRT

<213> 青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)

<400> 1

Met Thr Ser Pro Val Ile Gly Thr Pro Trp Lys Lys Leu Asn Ala Pro

1 5 10 15

Val Ser Glu Glu Ala Ile Glu Gly Val Asp Lys Tyr Trp Arg Ala Ala

20 25 30

Asn Tyr Leu Ser Ile Gly Gln Ile Tyr Leu Arg Ser Asn Pro Leu Met

35 40 45

Lys Glu Pro Phe Thr Arg Glu Asp Val Lys His Arg Leu Val Gly His

50 55 60

Trp Gly Thr Thr Pro Gly Leu Asn Phe Leu Ile Gly His Ile Asn Arg

65 70 75 80

Leu Ile Ala Asp His Gln Gln Asn Thr Val Ile Ile Met Gly Pro Gly

85 90 95

His Gly Gly Pro Ala Gly Thr Ala Gln Ser Tyr Leu Asp Gly Thr Tyr

100 105 110

Thr Glu Tyr Phe Pro Asn Ile Thr Lys Asp Glu Ala Gly Leu Gln Lys

115 120 125

Phe Phe Arg Gln Phe Ser Tyr Pro Gly Gly Ile Pro Ser His Tyr Ala

130 135 140

Pro Glu Thr Pro Gly Ser Ile His Glu Gly Gly Glu Leu Gly Tyr Ala

145 150 155 160

Leu Ser His Ala Tyr Gly Ala Val Met Asn Asn Pro Ser Leu Phe Val

165 170 175

Pro Ala Ile Val Gly Asp Gly Glu Ala Glu Thr Gly Pro Leu Ala Thr

180 185 190

Gly Trp Gln Ser Asn Lys Leu Ile Asn Pro Arg Thr Asp Gly Ile Val

195 200 205

Leu Pro Ile Leu His Leu Asn Gly Tyr Lys Ile Ala Asn Pro Thr Ile

210 215 220

Leu Ser Arg Ile Ser Asp Glu Glu Leu His Glu Phe Phe His Gly Met

225 230 235 240

Gly Tyr Glu Pro Tyr Glu Phe Val Ala Gly Phe Asp Asn Glu Asp His

245 250 255

Leu Ser Ile His Arg Arg Phe Ala Glu Leu Phe Glu Thr Val Phe Asp

260 265 270

Glu Ile Cys Asp Ile Lys Ala Ala Ala Gln Thr Asp Asp Met Thr Arg

275 280 285

Pro Phe Tyr Pro Met Ile Ile Phe Arg Thr Pro Lys Gly Trp Thr Cys

290 295 300

Pro Lys Phe Ile Asp Gly Lys Lys Thr Glu Gly Ser Trp Arg Ser His

305 310 315 320

Gln Val Pro Leu Ala Ser Ala Arg Asp Thr Glu Ala His Phe Glu Val

325 330 335

Leu Lys Asn Trp Leu Glu Ser Tyr Lys Pro Glu Glu Leu Phe Asp Glu

340 345 350

Asn Gly Ala Val Lys Pro Glu Val Thr Ala Phe Met Pro Thr Gly Glu

355 360 365

Leu Arg Ile Gly Glu Asn Pro Asn Ala Asn Gly Gly Arg Ile Arg Glu

370 375 380

Glu Leu Lys Leu Pro Lys Leu Glu Asp Tyr Glu Val Lys Glu Val Ala

385 390 395 400

Glu Tyr Gly His Gly Trp Gly Gln Leu Glu Ala Thr Arg Arg Leu Gly

405 410 415

Val Tyr Thr Arg Asp Ile Ile Lys Asn Asn Pro Asp Ser Phe Arg Ile

420 425 430

Phe Gly Pro Asp Glu Thr Ala Ser Asn Arg Leu Gln Ala Ala Tyr Asp

435 440 445

Val Thr Asn Lys Gln Trp Asp Ala Gly Tyr Leu Ser Ala Gln Val Asp

450 455 460

Glu His Met Ala Val Thr Gly Gln Val Thr Glu Gln Leu Ser Glu His

465 470 475 480

Gln Met Glu Gly Phe Leu Glu Gly Tyr Leu Leu Thr Gly Arg His Gly

485 490 495

Ile Trp Ser Ser Tyr Glu Ser Phe Val His Val Ile Asp Ser Met Leu

500 505 510

Asn Gln His Ala Lys Trp Leu Glu Ala Thr Val Arg Glu Ile Pro Trp

515 520 525

Arg Lys Pro Ile Ser Ser Met Asn Leu Leu Val Ser Ser His Val Trp

530 535 540

Arg Gln Asp His Asn Gly Phe Ser His Gln Asp Pro Gly Val Thr Ser

545 550 555 560

Val Leu Leu Asn Lys Cys Phe Asn Asn Asp His Val Ile Gly Ile Tyr

565 570 575

Phe Pro Val Asp Ser Asn Met Leu Leu Ala Val Ala Glu Lys Cys Tyr

580 585 590

Lys Ser Thr Asn Lys Ile Asn Ala Ile Ile Ala Gly Lys Gln Pro Ala

595 600 605

Ala Thr Trp Leu Thr Leu Asp Glu Ala Arg Ala Glu Leu Glu Lys Gly

610 615 620

Ala Ala Glu Trp Lys Trp Ala Ser Asn Val Lys Ser Asn Asp Glu Ala

625 630 635 640

Gln Ile Val Leu Ala Ala Thr Gly Asp Val Pro Thr Gln Glu Ile Met

645 650 655

Ala Ala Ala Asp Lys Leu Asp Ala Met Gly Ile Lys Phe Lys Val Val

660 665 670

Asn Val Val Asp Leu Val Lys Leu Gln Ser Ala Lys Glu Asn Asn Glu

675 680 685

Ala Leu Ser Asp Glu Glu Phe Ala Glu Leu Phe Thr Glu Asp Lys Pro

690 695 700

Val Leu Phe Ala Tyr His Ser Tyr Ala Arg Asp Val Arg Gly Leu Ile

705 710 715 720

Tyr Asp Arg Pro Asn His Asp Asn Phe Asn Val His Gly Tyr Glu Glu

725 730 735

Gln Gly Ser Thr Thr Thr Pro Tyr Asp Met Val Arg Val Asn Asn Ile

740 745 750

Asp Arg Tyr Glu Leu Gln Ala Glu Ala Leu Arg Met Ile Asp Ala Asp

755 760 765

Lys Tyr Ala Asp Lys Ile Asn Glu Leu Glu Ala Phe Arg Gln Glu Ala

770 775 780

Phe Gln Phe Ala Val Asp Asn Gly Tyr Asp His Pro Asp Tyr Thr Asp

785 790 795 800

Trp Val Tyr Ser Gly Val Asn Thr Asn Lys Gln Gly Ala Ile Ser Ala

805 810 815

Thr Ala Ala Thr Ala Gly Asp Asn Glu

820 825

<210> 2

<211> 825

<212> PRT

<213> 短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)

<400> 2

Met Thr Ser Pro Val Ile Gly Thr Pro Trp Lys Lys Leu Asn Ala Pro

1 5 10 15

Val Ser Glu Glu Ser Leu Glu Gly Val Asp Lys Tyr Trp Arg Val Ala

20 25 30

Asn Tyr Leu Ser Ile Gly Gln Ile Tyr Leu Arg Ser Asn Pro Leu Met

35 40 45

Lys Ala Pro Phe Thr Arg Glu Asp Val Lys His Arg Leu Val Gly His

50 55 60

Trp Gly Thr Thr Pro Gly Leu Asn Phe Leu Ile Gly His Ile Asn Arg

65 70 75 80

Phe Ile Ala Asp His Gly Gln Asn Thr Val Ile Ile Met Gly Pro Gly

85 90 95

His Gly Gly Pro Ala Gly Thr Ser Gln Ser Tyr Leu Asp Gly Thr Tyr

100 105 110

Thr Glu Thr Phe Pro Lys Ile Thr Lys Asp Glu Ala Gly Leu Gln Lys

115 120 125

Phe Phe Arg Gln Phe Ser Tyr Pro Gly Gly Ile Pro Ser His Phe Ala

130 135 140

Pro Glu Thr Pro Gly Ser Ile His Glu Gly Gly Glu Leu Gly Tyr Ala

145 150 155 160

Leu Ser His Ala Tyr Gly Ala Ile Met Asp Asn Pro Ser Leu Phe Val

165 170 175

Pro Ala Ile Val Gly Asp Gly Glu Ala Glu Thr Gly Pro Leu Ala Thr

180 185 190

Gly Trp Gln Ser Asn Lys Leu Val Asn Pro Arg Thr Asp Gly Ile Val

195 200 205

Leu Pro Ile Leu His Leu Asn Gly Tyr Lys Ile Ala Asn Pro Thr Ile

210 215 220

Leu Ser Arg Ile Ser Asp Glu Glu Leu His Glu Phe Phe His Gly Met

225 230 235 240

Gly Tyr Glu Pro Tyr Glu Phe Val Ala Gly Phe Asp Asp Glu Asp His

245 250 255

Met Ser Ile His Arg Arg Phe Ala Glu Leu Trp Glu Thr Ile Trp Asp

260 265 270

Glu Ile Cys Asp Ile Lys Ala Ala Ala Gln Thr Asp Asn Val His Arg

275 280 285

Pro Phe Tyr Pro Met Leu Ile Phe Arg Thr Pro Lys Gly Trp Thr Cys

290 295 300

Pro Lys Tyr Ile Asp Gly Lys Lys Thr Glu Gly Ser Trp Arg Ala His

305 310 315 320

Gln Val Pro Leu Ala Ser Ala Arg Asp Thr Glu Ala His Phe Glu Val

325 330 335

Leu Lys Asn Trp Leu Glu Ser Tyr Lys Pro Glu Glu Leu Phe Asp Ala

340 345 350

Asn Gly Ala Val Lys Asp Asp Val Leu Ala Phe Met Pro Lys Gly Glu

355 360 365

Leu Arg Ile Gly Ala Asn Pro Asn Ala Asn Gly Gly Val Ile Arg Asp

370 375 380

Asp Leu Lys Leu Pro Asn Leu Glu Asp Tyr Glu Val Lys Glu Val Ala

385 390 395 400

Glu Tyr Gly His Gly Trp Gly Gln Leu Glu Ala Thr Arg Thr Leu Gly

405 410 415

Ala Tyr Thr Arg Asp Ile Ile Arg Asn Asn Pro Arg Asp Phe Arg Ile

420 425 430

Phe Gly Pro Asp Glu Thr Ala Ser Asn Arg Leu Gln Ala Ser Tyr Glu

435 440 445

Val Thr Asn Lys Gln Trp Asp Ala Gly Tyr Ile Ser Asp Glu Val Asp

450 455 460

Glu His Met His Val Ser Gly Gln Val Val Glu Gln Leu Ser Glu His

465 470 475 480

Gln Met Glu Gly Phe Leu Glu Ala Tyr Leu Leu Thr Gly Arg His Gly

485 490 495

Ile Trp Ser Ser Tyr Glu Ser Phe Val His Val Ile Asp Ser Met Leu

500 505 510

Asn Gln His Ala Lys Trp Leu Glu Ala Thr Val Arg Glu Ile Pro Trp

515 520 525

Arg Lys Pro Ile Ala Ser Met Asn Leu Leu Val Ser Ser His Val Trp

530 535 540

Arg Gln Asp His Asn Gly Phe Ser His Gln Asp Pro Gly Val Thr Ser

545 550 555 560

Val Leu Leu Asn Lys Cys Phe His Asn Asp His Val Ile Gly Ile Tyr

565 570 575

Phe Ala Thr Asp Ala Asn Met Leu Leu Ala Ile Ala Glu Lys Cys Tyr

580 585 590

Lys Ser Thr Asn Lys Ile Asn Ala Ile Ile Ala Gly Lys Gln Pro Ala

595 600 605

Ala Thr Trp Leu Thr Leu Asp Glu Ala Arg Ala Glu Leu Ala Lys Gly

610 615 620

Ala Ala Ala Trp Asp Trp Ala Ser Thr Ala Lys Asn Asn Asp Glu Ala

625 630 635 640

Glu Val Val Leu Ala Ala Ala Gly Asp Val Pro Thr Gln Glu Ile Met

645 650 655

Ala Ala Ser Asp Lys Leu Lys Glu Leu Gly Val Lys Phe Lys Val Val

660 665 670

Asn Val Ala Asp Leu Leu Ser Leu Gln Ser Ala Lys Glu Asn Asp Glu

675 680 685

Ala Leu Ser Asp Glu Glu Phe Ala Asp Ile Phe Thr Ala Asp Lys Pro

690 695 700

Val Leu Phe Ala Tyr His Ser Tyr Ala His Asp Val Arg Gly Leu Ile

705 710 715 720

Tyr Asp Arg Pro Asn His Asp Asn Phe Asn Val His Gly Tyr Glu Glu

725 730 735

Glu Gly Ser Thr Thr Thr Pro Tyr Asp Met Val Arg Val Asn Arg Ile

740 745 750

Asp Arg Tyr Glu Leu Thr Ala Glu Ala Leu Arg Met Ile Asp Ala Asp

755 760 765

Lys Tyr Ala Asp Lys Ile Asp Glu Leu Glu Lys Phe Arg Asp Glu Ala

770 775 780

Phe Gln Phe Ala Val Asp Lys Gly Tyr Asp His Pro Asp Tyr Thr Asp

785 790 795 800

Trp Val Tyr Ser Gly Val Asn Thr Asp Lys Lys Gly Ala Val Thr Ala

805 810 815

Thr Ala Ala Thr Ala Gly Asp Asn Glu

820 825

<210> 3

<211> 2478

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

atgacctctc cagttattgg tactccatgg aaaaaattga acgccccagt ttctgaagag 60

gctattgaag gtgttgataa gtattggaga gctgccaact atttgtccat tggtcaaatc 120

tacttgaggt ctaacccatt gatgaaggaa ccattcacta gggaagatgt taagcacaga 180

ttggttggtc attggggtac tactccaggt ttgaattttt tgatcggtca catcaacaga 240

ttgatcgctg atcatcaaca aaacaccgtt attatcatgg gtccaggtca tggtggtcca 300

gctggtactg ctcaatctta tttggatggt acttacaccg aatacttccc aaacattact 360

aaggatgaag ctggcttgca aaagttcttc agacaatttt cttacccagg tggtatccca 420

tctcattatg ctccagaaac accaggttct attcatgaag gtggtgaatt gggttatgct 480

ttgtctcatg cttatggtgc tgttatgaac aacccatctt tgtttgttcc agctatagtt 540

ggtgatggtg aagctgaaac tggtccattg gctactggtt ggcaatctaa caaattgatt 600

aacccaagaa ccgacggtat cgttttgcca attttacatt tgaacggtta caagatcgct 660

aacccaacca ttttgtccag aatctctgat gaagaattgc acgaattctt ccatggtatg 720

ggttatgaac catacgaatt tgttgctggt ttcgacaacg aagatcattt gtctatccat 780

agaagattcg ccgagttgtt cgaaactgtt ttcgacgaaa tttgcgatat taaggctgct 840

gctcaaactg atgatatgac tagaccattt taccccatga tcattttcag aactccaaaa 900

ggttggacct gtccaaagtt tatcgatggt aaaaagactg aaggctcttg gagatctcat 960

caagttccat tggcatctgc tagagatact gaagctcatt tcgaagtttt gaagaactgg 1020

ttggaaagct acaaacctga agagttgttt gacgaaaatg gtgcagttaa gcctgaagtt 1080

actgctttta tgccaacagg tgaattgaga attggtgaaa atccaaatgc taacggtggt 1140

agaatcaggg aagaattgaa attgccaaag ttggaagatt acgaggtcaa agaagttgct 1200

gaatacggtc atggttgggg tcaattggaa gctactagaa gattgggtgt ttacaccaga 1260

gacatcatca agaacaatcc agactccttc agaatttttg gtccagacga aactgcttct 1320

aacagattgc aagctgctta cgatgttacc aacaaacaat gggatgctgg ttatttgtct 1380

gcccaagttg atgaacatat ggctgttact ggtcaagtta ccgaacaatt gtcagaacat 1440

caaatggaag gtttcttgga gggttacttg ttgactggta gacatggtat ttggtcctct 1500

tacgaatctt tcgttcacgt tatcgactct atgttgaatc aacacgctaa gtggttagaa 1560

gctaccgtta gagaaattcc ttggagaaag ccaatctcct ctatgaactt gttggtttct 1620

tcacacgttt ggagacaaga tcataacggt ttttcacatc aagatccagg tgttacttct 1680

gtcttgttga acaagtgttt caacaacgat catgtcatcg gtatctactt cccagttgac 1740

tctaatatgt tgttggctgt tgctgaaaag tgctacaaat ctaccaacaa gatcaacgct 1800

attatcgctg gtaagcaacc agctgctact tggttgactt tagatgaagc tagagctgaa 1860

ttggaaaaag gtgctgctga atggaaatgg gcttctaatg ttaagtccaa cgatgaagct 1920

caaatcgttt tggctgctac aggtgatgtt ccaactcaag aaattatggc tgcagctgat 1980

aagttggatg ctatgggtat taagttcaag gttgttaacg ttgtcgacct ggttaagttg 2040

caatcagcta aagaaaacaa cgaagccttg tccgacgaag aatttgctga gttgtttact 2100

gaagataagc cagttttgtt cgcctaccat tcttacgcta gagatgttag aggtttgata 2160

tacgatagac caaaccacga taacttcaac gttcatggtt atgaagaaca aggttctact 2220

actaccccat acgatatggt tagagttaac aacatcgaca ggtacgaatt acaagctgaa 2280

gccttgagaa tgattgatgc agataagtac gccgacaaga ttaacgaact agaagctttt 2340

agacaagagg cctttcaatt cgctgttgat aatggttacg atcacccaga ttataccgat 2400

tgggtttatt ctggtgtcaa cactaacaag caaggtgcta tttctgctac tgctgcaact 2460

gctggtgata atgaataa 2478

<210> 4

<211> 2475

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

atgacctctc cagttattgg tactccatgg aaaaaattga acgccccagt ttctgaagaa 60

tccttggaag gtgttgataa gtattggaga gttgccaact acttgtccat tggtcaaatc 120

tacttgaggt ctaacccatt gatgaaggct ccattcacta gagaagatgt taagcacaga 180

ttggttggtc attggggtac tactccaggt ttgaattttt tgatcggtca catcaacaga 240

ttcattgctg atcatggtca aaacaccgtt attatcatgg gtccaggtca tggtggtcca 300

gctggtactt ctcaatctta tttggatggt acttacaccg agactttccc aaagattaca 360

aaagatgaag ctggcttgca gaagttcttc agacaatttt cttatccagg tggtatccca 420

tctcattttg ctccagaaac accaggttct attcatgaag gtggtgaatt gggttatgct 480

ttgtctcatg cttatggtgc cattatggat aacccatctt tgtttgttcc agccatagtt 540

ggtgatggtg aagctgaaac tggtccattg gctactggtt ggcaatctaa caaattggtt 600

aacccaagaa ccgatggtat cgttttgcca atcttgcatt tgaacggtta caagattgct 660

aacccaacca tcttgtccag aatctctgat gaagaattgc atgagttctt ccatggtatg 720

ggttatgaac catacgaatt tgttgctggt ttcgatgatg aagatcacat gtccattcat 780

agaagattcg ctgaattgtg ggaaaccatt tgggacgaaa tttgcgatat taaggctgct 840

gctcaaaccg ataatgttca tagaccattt taccccatgc tgattttcag aactccaaaa 900

ggttggactt gcccaaagta cattgatggt aaaaagactg aaggttcttg gagagcacat 960

caagttccat tggcatctgc tagagatact gaagctcatt tcgaagtttt gaagaactgg 1020

ttggaaagct acaaacctga agagttgttt gatgctaatg gtgctgttaa ggatgatgtt 1080

ttggctttta tgccaaaggg tgaattgaga attggtgcta atccaaatgc aaacggtggt 1140

gttattagag atgatctgaa gttgccaaac ttggaagatt acgaagtcaa agaagttgcc 1200

gaatacggtc atggttgggg tcaattggaa gctactagaa ctttgggtgc ttacaccaga 1260

gatatcatta gaaacaaccc aagagacttc agaattttcg gtccagacga aactgcttct 1320

aatagattgc aagcttctta cgaggttacc aacaaacaat gggatgctgg ttacatttcc 1380

gatgaagttg atgaacatat gcacgtttct ggtcaagttg tcgaacaatt gtcagaacat 1440

caaatggaag gttttttgga ggcttacttg ttgactggta gacatggtat ttggtcctct 1500

tacgaatctt tcgttcacgt tatcgactct atgttgaatc aacacgctaa atggttggaa 1560

gccaccgtta gagaaattcc ttggagaaaa cctattgcct ccatgaactt gttggtttct 1620

tcacatgttt ggagacaaga tcacaacggt ttctctcatc aagatccagg tgttacttct 1680

gtcttgttga acaagtgttt ccacaacgat catgtcatcg gtatctactt tgctactgat 1740

gctaacatgt tgttggctat tgctgaaaag tgttacaagt ccaccaacaa gattaacgct 1800

attattgctg gtaaacaacc agctgctact tggttgactt tggatgaagc tagagctgaa 1860

ttggctaaag gtgctgctgc ttgggattgg gcttctactg ctaaaaacaa tgatgaagcc 1920

gaagttgttt tagctgctgc tggtgatgtt ccaactcaag aaattatggc tgcttccgac 1980

aagttgaaag aattgggtgt taagttcaag gttgttaacg ttgccgattt gttgtcattg 2040

caatccgcta aagaaaacga cgaagctttg tcagacgaag aatttgctga tatcttcact 2100

gctgataagc cagttttgtt cgcttatcat tcttacgccc atgatgtcag aggtttgata 2160

tacgatagac caaaccacga taacttcaac gttcatggtt atgaagaaga aggttctact 2220

actaccccat acgatatggt tagagttaac agaatcgaca ggtacgaatt gactgctgaa 2280

gctttgagaa tgattgatgc agataagtac gccgataaga tcgacgaatt ggaaaagttc 2340

agagatgaag cctttcaatt cgcagttgat aagggttatg atcacccaga ttataccgat 2400

tgggtttact ctggtgttaa taccgataag aaaggtgcag ttactgctac tgctgcaaca 2460

gctggtgata atgaa 2475

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 5

atatttccgc attcatcctt caattgtgtt taaagattac ggatatttaa 50

<210> 6

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 6

accaataact ggagaggtca tttttagttt atgtatgtgt tttttgt 47

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 7

gctatacgaa gttattaggt gatatatgtt atatagtctt tttatttatg 50

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 8

ctatgttcac tctggcgtgc 20

<210> 9

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 9

atatttccgc attcatcctt caattgtgtt taaagattac ggatatttaa 50

<210> 10

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 10

accaataact ggagaggtca tttttagttt atgtatgtgt tttttgt 47

<210> 11

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 11

tgcaactgct ggtgataatg aataagtctg aagaatgaat gatttgatga 50

<210> 12

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 12

cattatacga agttatatta agggttattc gaactgccca ttcagc 46

<210> 13

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 13

acaaaaaaca catacataaa ctaaaaatga cctctccagt tattggt 47

<210> 14

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 14

tcatcaaatc attcattctt cagacttatt cattatcacc agcagttgca 50

<210> 15

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 15

acaaaaaaca catacataaa ctaaaaatga cctctccagt tattggt 47

<210> 16

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 16

tcatcaaatc attcattctt cagacttatt cattatcacc agctgttgca 50

<210> 17

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 17

gctgaatggg cagttcgaat aacccttaat ataacttcgt ataatg 46

<210> 18

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 18

cataaataaa aagactatat aacatatatc acctaataac ttcgtatagc 50

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 19

ctccgtttat gataagatga tggc 24

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 20

gttaattgcc tccgcatcta a 21

<210> 21

<211> 520

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(E Coli.)

<400> 21

Met Lys Pro Glu Asp Phe Arg Ala Ser Thr Gln Arg Pro Phe Thr Gly

1 5 10 15

Glu Glu Tyr Leu Lys Ser Leu Gln Asp Gly Arg Glu Ile Tyr Ile Tyr

20 25 30

Gly Glu Arg Val Lys Asp Val Thr Thr His Pro Ala Phe Arg Asn Ala

35 40 45

Ala Ala Ser Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Leu His Lys Pro Glu Met

50 55 60

Gln Asp Ser Leu Cys Trp Asn Thr Asp Thr Gly Ser Gly Gly Tyr Thr

65 70 75 80

His Lys Phe Phe Arg Val Ala Lys Ser Ala Asp Asp Leu Arg His Glu

85 90 95

Arg Asp Ala Ile Ala Glu Trp Ser Arg Leu Ser Tyr Gly Trp Met Gly

100 105 110

Arg Thr Pro Asp Tyr Lys Ala Ala Phe Gly Cys Ala Leu Gly Gly Thr

115 120 125

Pro Gly Phe Tyr Gly Gln Phe Glu Gln Asn Ala Arg Asn Trp Tyr Thr

130 135 140

Arg Ile Gln Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Asn His Ala Ile Val Asn Pro

145 150 155 160

Pro Ile Asp Arg His Leu Pro Thr Asp Lys Val Lys Asp Val Tyr Ile

165 170 175

Lys Leu Glu Lys Glu Thr Asp Ala Gly Ile Ile Val Ser Gly Ala Lys

180 185 190

Val Val Ala Thr Asn Ser Ala Leu Thr His Tyr Asn Met Ile Gly Phe

195 200 205

Gly Ser Ala Gln Val Met Gly Glu Asn Pro Asp Phe Ala Leu Met Phe

210 215 220

Val Ala Pro Met Asp Ala Asp Gly Val Lys Leu Ile Ser Arg Ala Ser

225 230 235 240

Tyr Glu Met Val Ala Gly Ala Thr Gly Ser Pro Tyr Asp Tyr Pro Leu

245 250 255

Ser Ser Arg Phe Asp Glu Asn Asp Ala Ile Leu Val Met Asp Asn Val

260 265 270

Leu Ile Pro Trp Glu Asn Val Leu Leu Tyr Arg Asp Phe Asp Arg Cys

275 280 285

Arg Arg Trp Thr Met Glu Gly Gly Phe Ala Arg Met Tyr Pro Leu Gln

290 295 300

Ala Cys Val Arg Leu Ala Val Lys Leu Asp Phe Ile Thr Ala Leu Leu

305 310 315 320

Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Gly Thr Leu Glu Phe Arg Gly Val Gln

325 330 335

Ala Asp Leu Gly Glu Val Val Ala Trp Arg Asn Thr Phe Trp Ala Leu

340 345 350

Ser Asp Ser Met Cys Ser Glu Ala Thr Pro Trp Val Asn Gly Ala Tyr

355 360 365

Leu Pro Asp His Ala Ala Leu Gln Thr Tyr Arg Val Leu Ala Pro Met

370 375 380

Ala Tyr Ala Lys Ile Lys Asn Ile Ile Glu Arg Asn Val Thr Ser Gly

385 390 395 400

Leu Ile Tyr Leu Pro Ser Ser Ala Arg Asp Leu Asn Asn Pro Gln Ile

405 410 415

Asp Gln Tyr Leu Ala Lys Tyr Val Arg Gly Ser Asn Gly Met Asp His

420 425 430

Val Gln Arg Ile Lys Ile Leu Lys Leu Met Trp Asp Ala Ile Gly Ser

435 440 445

Glu Phe Gly Gly Arg His Glu Leu Tyr Glu Ile Asn Tyr Ser Gly Ser

450 455 460

Gln Asp Glu Ile Arg Leu Gln Cys Leu Arg Gln Ala Gln Ser Ser Gly

465 470 475 480

Asn Met Asp Lys Met Met Ala Met Val Asp Arg Cys Leu Ser Glu Tyr

485 490 495

Asp Gln Asn Gly Trp Thr Val Pro His Leu His Asn Asn Asp Asp Ile

500 505 510

Asn Met Leu Asp Lys Leu Leu Lys

515 520

<210> 22

<211> 170

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(E Coli.)

<400> 22

Met Gln Leu Asp Glu Gln Arg Leu Arg Phe Arg Asp Ala Met Ala Ser

1 5 10 15

Leu Ser Ala Ala Val Asn Ile Ile Thr Thr Glu Gly Asp Ala Gly Gln

20 25 30

Cys Gly Ile Thr Ala Thr Ala Val Cys Ser Val Thr Asp Thr Pro Pro

35 40 45

Ser Leu Met Val Cys Ile Asn Ala Asn Ser Ala Met Asn Pro Val Phe

50 55 60

Gln Gly Asn Gly Lys Leu Cys Val Asn Val Leu Asn His Glu Gln Glu

65 70 75 80

Leu Met Ala Arg His Phe Ala Gly Met Thr Gly Met Ala Met Glu Glu

85 90 95

Arg Phe Ser Leu Ser Cys Trp Gln Lys Gly Pro Leu Ala Gln Pro Val

100 105 110

Leu Lys Gly Ser Leu Ala Ser Leu Glu Gly Glu Ile Arg Asp Val Gln

115 120 125

Ala Ile Gly Thr His Leu Val Tyr Leu Val Glu Ile Lys Asn Ile Ile

130 135 140

Leu Ser Ala Glu Gly His Gly Leu Ile Tyr Phe Lys Arg Arg Phe His

145 150 155 160

Pro Val Met Leu Glu Met Glu Ala Ala Ile

165 170

<210> 23

<211> 1563

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 23

atgaaaccag aagatttccg cgccagtacc caacgtccgt tcaccgggga agagtatctg 60

aaaagcctgc aggatggtcg cgagatctat atctatggcg agcgagtgaa agacgtcact 120

actcatccgg catttcgtaa tgcggctgcg tctgttgccc aactgtacga cgcgctacac 180

aaaccggaga tgcaggactc tctgtgctgg aacaccgaca ccggcagcgg cggctatacc 240

cataaattct tccgcgtggc gaaaagtgcc gacgacctgc gccacgaacg cgatgccatc 300

gctgagtggt cacgcctgag ctatggctgg atgggccgta ccccagacta caaagctgct 360

ttcggttgcg cactgggcgg aactccgggc ttttacggtc agttcgagca gaacgcccgt 420

aactggtaca cccgtattca ggaaactggc ctctacttta accacgcgat tgttaaccca 480

ccgatcgatc gtcatttgcc gaccgataaa gtaaaagacg tttacatcaa gctggaaaaa 540

gagactgacg ccgggattat cgtcagcggt gcgaaagtgg ttgccaccaa ctcggcgctg 600

actcactaca acatgattgg cttcggctcg gcacaagtaa tgggcgaaaa cccggacttc 660

gcactgatgt tcgttgcgcc aatggatgcc gatggcgtca aattaatctc ccgcgcctct 720

tatgagatgg tcgcgggtgc taccggctca ccgtatgact acccgctctc cagccgcttc 780

gatgagaacg atgcgattct ggtgatggat aacgtgctga tcccatggga aaacgtgctg 840

ctctaccgcg attttgatcg ctgccgtcgc tggacgatgg aaggcggttt cgcccgtatg 900

tatccgctgc aagcctgtgt gcgcctggca gtgaaactcg acttcattac ggcactgctg 960

aaaaaatcac tcgaatgtac cggcaccctg gagttccgtg gtgtgcaggc cgatctcggt 1020

gaagtggtgg cgtggcgcaa caccttctgg gcattgagtg actcgatgtg ttctgaagcg 1080

acgccgtggg tcaacggggc ttatttaccg gatcatgccg cactgcaaac ctatcgcgta 1140

ctggcaccaa tggcctacgc gaagatcaaa aacattatcg aacgcaacgt taccagtggc 1200

ctgatctatc tcccttccag tgcccgtgac ctgaacaatc cgcagatcga ccagtatctg 1260

gcgaagtatg tgcgcggttc gaacggtatg gatcacgtcc agcgcatcaa gatcctcaaa 1320

ctgatgtggg atgccattgg cagcgagttt ggtggtcgtc acgaactgta tgaaatcaac 1380

tactccggta gccaggatga gattcgcctg cagtgtctgc gccaggcaca aagctccggc 1440

aatatggaca agatgatggc gatggttgat cgctgcctgt cggaatacga ccagaacggc 1500

tggactgtgc cgcacctgca caacaacgac gatatcaaca tgctggataa gctgctgaaa 1560

taa 1563

<210> 24

<211> 513

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 24

atgcaattag atgaacaacg cctgcgcttt cgtgacgcaa tggccagcct gtcggcagcg 60

gtaaatatta tcaccaccga gggcgacgcc ggacaatgcg ggattacggc aacggccgtc 120

tgctcggtca cggatacacc accatcgctg atggtgtgca ttaacgccaa cagtgcgatg 180

aacccggttt ttcagggcaa cggtaagttg tgcgtcaacg tcctcaacca tgagcaggaa 240

ctgatggcac gccacttcgc gggcatgaca ggcatggcga tggaagagcg ttttagcctc 300

tcatgctggc aaaaaggtcc gctggcgcag ccggtgctaa aaggttcgct ggccagtctt 360

gaaggtgaga tccgcgatgt gcaggcaatt ggcacacatc tggtgtatct ggtggagatt 420

aaaaacatca tcctcagtgc agaaggtcac ggacttatct actttaaacg ccgtttccat 480

ccggtgatgc tggaaatgga agctgcgatt taa 513

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 25

atgaaaccag aagatttccg cg 22

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 26

ttatttcagc agcttatcca gc 22

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 27

atgcaattag atgaacaacg cct 23

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 28

ttaaatcgca gcttccattt cca 23

<210> 29

<211> 7347

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 29

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040

ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgggcagca gccatcatca tcatcatcac 5100

atgaaaccag aagatttccg cgccagtacc caacgtccgt tcaccgggga agagtatctg 5160

aaaagcctgc aggatggtcg cgagatctat atctatggcg agcgagtgaa agacgtcact 5220

actcatccgg catttcgtaa tgcggctgcg tctgttgccc aactgtacga cgcgctacac 5280

aaaccggaga tgcaggactc tctgtgctgg aacaccgaca ccggcagcgg cggctatacc 5340

cataaattct tccgcgtggc gaaaagtgcc gacgacctgc gccacgaacg cgatgccatc 5400

gctgagtggt cacgcctgag ctatggctgg atgggccgta ccccagacta caaagctgct 5460

ttcggttgcg cactgggcgg aactccgggc ttttacggtc agttcgagca gaacgcccgt 5520

aactggtaca cccgtattca ggaaactggc ctctacttta accacgcgat tgttaaccca 5580

ccgatcgatc gtcatttgcc gaccgataaa gtaaaagacg tttacatcaa gctggaaaaa 5640

gagactgacg ccgggattat cgtcagcggt gcgaaagtgg ttgccaccaa ctcggcgctg 5700

actcactaca acatgattgg cttcggctcg gcacaagtaa tgggcgaaaa cccggacttc 5760

gcactgatgt tcgttgcgcc aatggatgcc gatggcgtca aattaatctc ccgcgcctct 5820

tatgagatgg tcgcgggtgc taccggctca ccgtatgact acccgctctc cagccgcttc 5880

gatgagaacg atgcgattct ggtgatggat aacgtgctga tcccatggga aaacgtgctg 5940

ctctaccgcg attttgatcg ctgccgtcgc tggacgatgg aaggcggttt cgcccgtatg 6000

tatccgctgc aagcctgtgt gcgcctggca gtgaaactcg acttcattac ggcactgctg 6060

aaaaaatcac tcgaatgtac cggcaccctg gagttccgtg gtgtgcaggc cgatctcggt 6120

gaagtggtgg cgtggcgcaa caccttctgg gcattgagtg actcgatgtg ttctgaagcg 6180

acgccgtggg tcaacggggc ttatttaccg gatcatgccg cactgcaaac ctatcgcgta 6240

ctggcaccaa tggcctacgc gaagatcaaa aacattatcg aacgcaacgt taccagtggc 6300

ctgatctatc tcccttccag tgcccgtgac ctgaacaatc cgcagatcga ccagtatctg 6360

gcgaagtatg tgcgcggttc gaacggtatg gatcacgtcc agcgcatcaa gatcctcaaa 6420

ctgatgtggg atgccattgg cagcgagttt ggtggtcgtc acgaactgta tgaaatcaac 6480

tactccggta gccaggatga gattcgcctg cagtgtctgc gccaggcaca aagctccggc 6540

aatatggaca agatgatggc gatggttgat cgctgcctgt cggaatacga ccagaacggc 6600

tggactgtgc cgcacctgca caacaacgac gatatcaaca tgctggataa gctgctgaaa 6660

taacgcagca ggaggttaag atgcaattag atgaacaacg cctgcgcttt cgtgacgcaa 6720

tggccagcct gtcggcagcg gtaaatatta tcaccaccga gggcgacgcc ggacaatgcg 6780

ggattacggc aacggccgtc tgctcggtca cggatacacc accatcgctg atggtgtgca 6840

ttaacgccaa cagtgcgatg aacccggttt ttcagggcaa cggtaagttg tgcgtcaacg 6900

tcctcaacca tgagcaggaa ctgatggcac gccacttcgc gggcatgaca ggcatggcga 6960

tggaagagcg ttttagcctc tcatgctggc aaaaaggtcc gctggcgcag ccggtgctaa 7020

aaggttcgct ggccagtctt gaaggtgaga tccgcgatgt gcaggcaatt ggcacacatc 7080

tggtgtatct ggtggagatt aaaaacatca tcctcagtgc agaaggtcac ggacttatct 7140

actttaaacg ccgtttccat ccggtgatgc tggaaatgga agctgcgatt caccaccacc 7200

accaccactg agatccggct gctaacaaag cccgaaagga agctgagttg gctgctgcca 7260

ccgctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt 7320

tgctgaaagg aggaactata tccggat 7347

Claims

1.重组酵母在生产酪醇中的应用，所述重组酵母为将外源性的果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶的表达基因导入经过改造的酵母细胞中构建获得，所述经过改造的酵母细胞为具有经4-磷酸赤藓糖和磷酸烯醇式丙酮酸合成酪醇代谢途径的酵母细胞。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述经过改造的酵母细胞为将芳香醛合成酶和分支酸变位酶/预苯酸脱水酶整合后获得；

进一步优选的，所述芳香醛合成酶来源于香芹，酶的系统编号EC4.1.1.25；所述分支酸变位酶来源于大肠杆菌，酶的系统编号EC1.3.1.12和EC5.4.99.5；所述预苯酸脱水酶来源于大肠杆菌，酶的系统编号5.4.99.5。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶的表达基因来源于青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)、两歧双歧杆菌短双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)、肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、摩恩格里艾恩斯双歧(Bifidobacterium mongoliense)、类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、胚牙乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)、钩虫贪铜菌(Cupriavidusnecator)、加德纳菌(Gardnerella vaginalis)、腐生性酵母菌红酵母菌(Rhodotorulaglutinis)、禾本红酵母(Rhodotorula graminis)、巴氏酵母(Saccharomycespastorianus)等；

更优的，所述果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，表达基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述酵母细胞为：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、耶氏解脂酵母(Yarrowia lipolytica)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)、腐生性酵母菌红酵母菌(Rhodotorula glutinis)、禾本红酵母(Rhodotorula graminis)、巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、光滑念珠菌(Candidaglabrata)、德布尔有孢酵母(Torulaspora delbrueckii)、汉斯德巴氏酵母菌(Debaryomyces hansenii)、树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipites)、季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)、长孢洛德酵母(Lodderomyces elongisporus)、白假丝酵母菌(Candida albicans)、拟平滑念珠菌(Candida orthopsilosis)、似平滑念珠菌(Candida metapsilosis)、都柏林酵母菌(Candida dubliniensis)、葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)、耳念珠菌(Candida auris)等；

进一步优选的，所述酵母细胞为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，菌种编号为CICC1964；

更优选的，所述经过改造的酵母细胞为将来源于香芹(Petroselinum crispum)的芳香醛合成酶整合到酿酒酵母CICC1964的delta12位点，并将来源于大肠杆菌(E.coli)的分支酸变位酶/预苯酸脱水酶替换酿酒酵母CICC1964的pdc1基因，获得。

5.一种高产酪醇的重组酵母的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

所述经过改造的酵母细胞为具有经4-磷酸赤藓糖和磷酸烯醇式丙酮酸合成酪醇代谢途径的酵母细胞。

6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶的表达基因来源于青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、两歧双歧杆菌短双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)、肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、摩恩格里艾恩斯双歧(Bifidobacterium mongoliense)、类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、胚牙乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)、钩虫贪铜菌(Cupriavidusnecator)、加德纳菌(Gardnerella vaginalis)、腐生性酵母菌红酵母菌(Rhodotorulaglutinis)、禾本红酵母(Rhodotorula graminis)、巴氏酵母(Saccharomycespastorianus)等；

更优的，所述果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，表达基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示；

优选的，所述步骤(1)中同源臂为以酿酒酵母菌株CICC1964的基因组为模板，利用引物扩增预苯酸脱水酶(prephenate dehydratase)基因pha2上游及下游500bp的基因片段，所述上游同源臂扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；下游同源臂扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；

优选的，所述步骤(1)中启动子为以酿酒酵母菌株CICC1964的基因组为模板利用引物扩增的启动子tpi1，所述启动子tpi1的扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9和SEQID NO.10所示；

优选的，所述步骤(1)中启动子为以酿酒酵母菌株CICC1964的基因组为模板利用引物扩增的终止子gpm1，所述终止子gpm1的扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11和SEQID NO.12所示；

优选的，所述步骤(2)中，经过改造的酵母细胞为将芳香醛合成酶和分支酸变位酶/预苯酸脱水酶整合后获得；

进一步优选的，所述步骤(2)中，芳香醛合成酶来源于香芹(Petroselinum crispum)，酶的系统编号EC4.1.1.25；所述分支酸变位酶/预苯酸脱水酶来源于大肠杆菌(E.coli)，酶的系统编号EC1.3.1.12，EC5.4.99.5；

优选的，所述步骤(2)中所述酵母细胞为：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、耶氏解脂酵母(Yarrowia lipolytica)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)、腐生性酵母菌红酵母菌(Rhodotorula glutinis)、禾本红酵母(Rhodotorula graminis)、巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、德布尔有孢酵母(Torulaspora delbrueckii)、汉斯德巴氏酵母菌(Debaryomyces hansenii)、树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipites)、季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)、长孢洛德酵母(Lodderomyces elongisporus)、白假丝酵母菌(Candida albicans)、拟平滑念珠菌(Candida orthopsilosis)、似平滑念珠菌(Candida metapsilosis)、都柏林酵母菌(Candida dubliniensis)、葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)、耳念珠菌(Candidaauris)等；

进一步优选的，所述酵母细胞为酿酒酵母，菌种编号为CICC1964；

更优选的，所述步骤(2)中，经过改造的酵母细胞为将来源于香芹(Petroselinumcrispum)的芳香醛合成酶整合到酿酒酵母CICC1964的delta12位点，并将来源于大肠杆菌(E.coli)的分支酸变位酶/预苯酸脱水酶替换酿酒酵母CICC1964的pdc1基因，获得。

7.权利要求5所述方法构建的高产酪醇的重组酵母。

8.权利要求7所述高产酪醇的重组酵母在发酵制备酪醇中的应用；

优选的，所述发酵的发酵培养基中至少含有葡萄糖、果糖、蔗糖之一或二者以上的组合与酪氨酸。

9.权利要求7所述高产酪醇的重组酵母在发酵制备羟基酪醇中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，将权利要求7所述高产酪醇的重组酵母通过发酵制备酪醇后，经过4-羟基苯乙酸羟化酶反应获得羟基酪醇；

优选的，利用过表达4-羟基苯乙酸羟化酶大肠杆菌催化权利要求8所述制备的酪醇后，获得羟基酪醇；

进一步优选的，所述的发酵的发酵培养基中至少含有葡萄糖、果糖、蔗糖之一或二者以上的组合与酪氨酸。