CN113151214B - 一种具有脂肪酶活性的蛋白PnlipA及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本公开涉及一种具有脂肪酶活性的蛋白PnlipA、编码该蛋白的基因、插入有该基因的重组载体、转化有该基因的转化体、扩展该基因的引物、制备脂肪酶的方法和脂肪酶在降解脂肪类化合物中的应用。本公开为新型脂肪酶的应用提供了极大的方便，更好地满足了脂肪酶在实际工业应用中的需求。

Description

一种具有脂肪酶活性的蛋白PnlipA及其基因和应用

技术领域

本公开涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种具有脂肪酶活性的蛋白、编码该蛋白的基因、插入有该基因的重组载体、转化有该基因的转化体、扩展该基因的引物、制备脂肪酶的方法和脂肪酶在降解脂肪类化合物中的应用。

背景技术

脂肪酶是重要的工业酶制剂品种之一，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。脂肪酶在自然界中普遍存在，是从植物、动物和微生物中分离出来的。其中，微生物脂肪酶主要来源于真菌和细菌，其产生时间短，易于遗传操作、规模扩大和纯化，有利于工业应用，与真菌脂肪酶相比，细菌脂肪酶通常使用更多，并且表现出更高的活性，在生物技术应用领域有着重要的作用。

但是，目前脂肪酶仍然不能完全满足实际应用的需求，仍然需要提高产量以进一步降低生产成本和/或进一步提高催化活性。因此，需要探索和发现更多的脂肪酶。

发明内容

为了进一步满足实际应用的需求，本公开提供了具有脂肪酶活性的蛋白PnlipA、编码该蛋白的基因、插入有该基因的重组载体、转化有该基因的转化体、扩展该基因的引物、制备脂肪酶的方法和脂肪酶在降解脂肪类化合物中的应用。

本公开第一方面提供了一种具有脂肪酶活性的蛋白，所述蛋白为如下蛋白(a)或(b)：

(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加n个氨基酸且具有脂肪酶活性的由(a)衍生的蛋白，其中，n为1～28之间的任意一个整数。

本公开第二方面提供了一种编码如下蛋白(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加n个氨基酸且具有脂肪酶活性的由(a)衍生的蛋白，其中，n为1～28之间的任意一个整数。

本公开第三方面提供了一种重组载体，所述重组载体插入有第二方面所述的基因。

本公开第四方面提供了一种转化体，所述转化体的宿主为基因工程菌；所述转化体中导入的基因包括第二方面所述的基因，或者，所述转化体中导入的重组载体包括第三方面所述的重组载体。

本公开第五方面提供了一种引物，所述引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物是核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示的DNA分子；所述反向引物是核苷酸序列为SEQ IDNO.5所示的DNA分子。

本公开第六方面提供了一种制备脂肪酶的方法，所述方法包括：将第四方面所述的转化体接种于培养基中进行培养，得到培养后的物料。

本公开第七方面提供了一种脂肪酶在降解脂肪类化合物中的应用，其中，所述脂肪酶含有第一方面所述的蛋白。

通过上述技术方案，本公开提供了具有脂肪酶活性的蛋白、编码该蛋白的基因、插入有该基因的重组载体、转化有该基因的转化体、扩展该基因的引物、制备脂肪酶的方法和脂肪酶在降解脂肪类化合物中的应用，为低成本生产高产新型的脂肪酶奠定基础，在油脂加工、食品、医药、日化等工业产业中具有重要的应用潜力。

本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：

图1是脂肪酶PnlipA的纯化；1.破碎液上清；2.破碎液沉淀；3.NTA-0洗脱；4.NTA-10洗脱；5.NTA-30洗脱；6.NTA-50洗脱；7\8.NTA-80洗脱；9.NTA-100洗脱；10.NTA-150洗脱；11.NTA-200洗脱；12\13.NTA-250洗脱；14.NTA-300洗脱；

图2是脂肪酶PnlipA降解不同底物的相对酶活。

图3是脂肪酶PnlipA最适温度分析。

具体实施方式

以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

本公开第一方面提供一种具有脂肪酶活性的蛋白，其特征在于，所述蛋白为如下蛋白(a)或(b)：

(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加n个氨基酸且具有脂肪酶活性的由(a)衍生的蛋白，其中，n为1～28之间的任意一个整数。

其中，本公开第一方面提供的一种具有脂肪酶活性的蛋白即为蛋白PnlipA。其中，n可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28。

其中，脂肪酶的活性是指作用于甘油三酯的酯键，使甘油三酯降解为甘油二酯、单甘油酯、甘油和脂肪酸的活性，也就是EC 3.1.1.1的活性。衍生的蛋白的脂肪酶的活性的证明方法可以是已知的方法，例如文献Zhang,Y.；Lu,W.；Wang,J.；Chen,M.；Zhang,W.；Lin,M.；Zhou,Z.；Liu,Z.Characterization of EstDR4,a Novel Cold-adaptedInsecticides-metabolizing Esterase from DeinococcusRadiodurans.Appl.Sci.2021,11,1864.所述的方法。

本公开第二方面提供一种编码如下蛋白(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加n个氨基酸且具有脂肪酶活性的由(a)衍生的蛋白，其中，n为1～28之间的任意一个整数。

根据本公开，所述基因的序列可以基于密码子简并性进行适当地变化，优选地，所述基因是核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的DNA分子。

本公开第三方面提供一种重组载体，所述重组载体插入有第二方面所述的基因。其中，重组载体中插入基因的方式可以为已知的各种方式。

根据本公开，所述重组载体可以是重组克隆载体或重组表达载体。所述重组表达载体可以是核苷酸序列为pET28a载体的NdeⅠ酶切位点和Xho I酶切位点之间插入SEQ IDNO.2所示的DNA分子后得到的重组表达载体，也就是SEQ ID NO.3所示的DNA分子。

本公开第四方面提供一种转化体，所述转化体的宿主为基因工程菌；所述转化体中导入的基因包括第二方面所述的基因，或者，所述转化体中导入的重组载体包括第三方面所述的重组载体。

根据本公开，所述基因工程菌可以是野生型的基因工程菌或人工改造的基因工程菌，例如为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母和丝状真菌中的至少一种。

本公开第五方面提供一种引物，所述引物可以用于特异性地PCR扩增如上所述的基因，所述引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物是核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示的DNA分子；所述反向引物是核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示的DNA分子。

本公开第六方面提供一种制备脂肪酶的方法，其中，所述方法包括：将第四方面所述的转化体接种于培养基中进行培养，得到培养后的物料。其中，培养基和培养条件可以为已知的各种合适的选择。培养后的物料含有本公开第一方面提供的具有脂肪酶活性的蛋白，因而具有脂肪酶活性，可以根据需要直接作为脂肪酶组合物使用，也可以根据需要纯化出本公开第一方面提供的具有脂肪酶活性的蛋白，再进行使用。

本公开第七方面提供一种脂肪酶在降解脂肪类化合物中的应用，其中，所述脂肪酶含有第一方面所述的蛋白。其中，所述脂肪类化合物可以包括甘油三酯、单酸甘油酯、双酸甘油酯、苯酯、神经节苷脂、植物油脂和磷脂中的至少一种。

下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。

实施例1

本实施例用于说明表达PnlipA基因的转化体的构建过程

本公开所用到的表达质粒pET28a为德国默克公司市售产品，大肠杆菌BL21(DE3)为北京诺唯赞公司市售产品。

首先，使用如下引物对海洋沉积物宏基因组进行扩增得到PnlipA基因：

PnlipA-F:5′ACCCATATGCGTAACAGGATCTCCATCCCGCTG3′SEQ ID NO.4，

PnlipA-R:5′ACCCTCGAGTTACAGACCGGCGTTCTTCAGCC3′SEQ ID NO.5；

扩增产物经过测序，确认PnlipA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

然后通过PCR方法从菌株基因组DNA中扩增出目的基因序列，PCR反应程序如表1所示：

表1 PCR反应程序

回收PCR产物，通过重组酶连接于经过NdeⅠ/Xho I双酶切获得的含有粘性末端的pET-28a载体上，构建重组表达载体pET28a-PnlipA。

pET28a-PnlipA的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。

将该重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经PCR、酶切，测序验证插入序列正确，得到转化体，将该转化体命名为BL21-PnlipA。含有pET28a对照空质粒的E.coli BL21命名为BL21-pET28a。

实施例2

本实施例用于制备纯品蛋白，测定PnlipA的脂肪酶活性。

实验材料：重组工程菌株为实施例1得到的含有基因的BL21-PnlipA转化体，对照菌株为实施例1所述含空质粒的BL21-pET28a菌株。

实验方法：

脂肪酶蛋白PnlipA的诱导表达

(1)以1％的接种量将转化体BL21-PnlipA接种到20mL的含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃下摇床过夜培养；

(2)种子液以OD₆₀₀为0.1的初始浓度的接种量将菌液转接到500mL的含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃下培养至菌液浓度至0.6～0.8；

(3)加入IPTG(终浓度为0.1μmol/L)进行蛋白诱导表达，诱导条件为16℃，18h；

(4)将诱导后的菌液离心处理，离心条件为5000rpm、10min，然后收集菌体，用NTA-0重新悬浮菌体；

(5)菌液超声破碎：将含有悬浮菌体的离心管置于冰水混合物的烧杯中，置于超声破碎仪超声5-10min，超声仪设定程序为：超声3s停5s，功率＜400W；

(6)超声破碎后的样品13000rpm离心30min，用离心管分别收集破碎样品的上清液和沉淀液，离心得到的破碎上清液即为粗酶液，破碎样品用于后续实验。

2、亲和层析纯化重组脂肪酶蛋白PnlipA

目的蛋白的纯化按如下步骤进行：(1)取出镍柱，用去离子水清洗镍柱两遍，然后用NTA-0平衡柱子，流速保持在1mL/min；(2)粗酶液挂柱，穿透两次，流速同上；(3)用配置好的NTA-10，NTA-30，NTA-50，NTA-80，NTA-100，NTA-150，NTA-200，NTA-250，NTA-300梯度洗脱，使用蛋白检测液检测蛋白，收集洗脱峰；(4)用浓度为20％的乙醇溶液清洗镍柱，清洗后将镍柱保存在4℃冰箱；(5)用SDS-PAGE检测所得蛋白大小与纯度；(6)使用超滤离心置换蛋白溶液的缓冲液，从而去除蛋白溶液中的咪唑，所得的蛋白溶液即为酶液(脂肪酶蛋白PnlipA)。

3、脂肪酶活力测定

1.5mL离心管中加入600μL底物测试液，并加入25μL适当稀释后的酶液；对照组加入25μL pH＝8的Tris-HCl缓冲液；在30℃下保温5min后，加入500μL的95％乙醇终止反应，在410nm下测定吸光值，计算酶活力。

将酶液加入pH＝8的Tris-HCl缓冲液中，分别在不同温度(5，10，20，30，40，50，60，70℃)下测定脂肪酶/酯酶的降解活力，反应5min，确定脂肪酶的最适温度，测定最高酶活性，并计算相对酶活性(酶在各种温度下酶活性相对最高酶活性的百分比)。

1个酶活单位(U)定义为：单位时间内释放1μmol的产物pNP(对硝基苯酚)所需要的酶量。

对硝基苯酚(pNP)标准曲线制作方法：称量pNP 0.1391g，将其溶于50mL异丙醇中制备pNP母液(20mM)，取其中10mL的pNP母液，用异丙醇定容至100mL，得到pNP工作液(2.0mM)。按表2中各试剂的添加量和操作步骤添加8组样品(标准曲线的体积和反应条件均与实际测定样品酶活反应条件一致)。

(1)底物溶液：分别将0.3％对硝基苯酚癸酸酯(pNPC10)、对硝基苯酚月桂酸酯(pNPC12)、对硝基苯酚豆蔻酸酯(pNPC14)、对硝基苯酚棕榈酸酯(pNPC16)、对硝基苯酚硬脂酸酯(pNPC18)。溶于异丙醇中，4℃保存。

(2)缓冲液：20mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.5，0.11％阿拉伯胶)。

(3)底物测试液：底物溶液分别与缓冲液按1:3的比例混匀后作为底物测试液使用。

表2制作pNP标准曲线所需试剂

注：上述实验中，IPNG是诱导重组菌株表达PnlipA蛋白的诱导物，并非催化反应的底物。

测试实施例1

对硝基苯酯类化合物是检测脂肪酶功能基因的通用模式底物，通过比色法可以测定对硝基苯酯类化合物分解后生成对硝基苯酚的量，鉴定脂肪酶的活力。

测定结果表明：海洋宏基因组PnlipA基因编码的PnlipA蛋白能够降解对硝基苯酯类底物(pNPC10、pNPC12、pNPC14、pNPC16、pNPC18)的酯键从而生成对硝基苯酚，其中对pNPC16的降解最佳(图2)，最适降解温度为30℃(图3)，酶活可达312.14U/mg。

本申请提供的一种具有脂肪酶活性的蛋白、编码该蛋白的基因、插入有该基因的重组载体、转化有该基因的转化体、扩展该基因的引物、制备脂肪酶的方法和新型的脂肪酶，均为脂肪酶有效降解硝基苯酯类底物奠定了基础，在洗涤剂、食品加工、化妆品、制药等工业化生产和酯类农药降解的环境修复等方面具有重要的应用价值。

以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 一种具有脂肪酶活性的蛋白PnlipA及其基因和应用

<130> 19982CAAS-B-ZW

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 311

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Arg Asn Arg Ile Ser Ile Pro Leu Ala Val Gly Leu Ala Ala Ser

1 5 10 15

Leu Ala Gly Phe Ser Gln Gln Ala Leu Ala Ser Gly Tyr Thr Gln Thr

20 25 30

Arg Tyr Pro Ile Val Leu Ala His Gly Met Leu Gly Phe Asp Ser Ile

35 40 45

Leu Gly Ile Asp Tyr Trp Tyr Gly Ile Pro Ser Ala Leu Arg Arg Asp

50 55 60

Gly Ala Arg Val Tyr Ile Thr Glu Val Ser Gln Leu Asp Thr Ser Glu

65 70 75 80

Ala Arg Gly Glu Gln Leu Leu Arg Gln Val Glu Glu Ile Ala Ala Ile

85 90 95

Ser Gly Lys Gly Lys Val Asn Leu Ile Gly His Ser His Gly Gly Pro

100 105 110

Thr Ala Arg Tyr Val Ala Ala Val Arg Pro Asp Leu Ile Ala Ser Val

115 120 125

Thr Ser Val Gly Ala Pro His Lys Gly Ser Lys Thr Ala Asp Phe Leu

130 135 140

Arg Gln Ile Pro Glu Gly Ser Gly Gly Glu Ala Val Leu Ala Gly Ile

145 150 155 160

Val Asn Gly Leu Gly Gly Leu Ile Asn Phe Leu Ser Gly Ser Ser Ser

165 170 175

Thr Ser Pro Gln Asn Ser Leu Gly Ser Leu Glu Ser Leu Asn Ser Ala

180 185 190

Gly Ala Glu Arg Phe Asn Ala Lys Phe Pro Gln Gly Ile Pro Thr Ser

195 200 205

Ala Cys Gly Glu Gly Ala Tyr Gln Val Arg Gly Val Arg Tyr Tyr Ser

210 215 220

Trp Gly Gly Thr Lys Pro Leu Thr Asn Ile Leu Asp Val Ser Asp Val

225 230 235 240

Leu Leu Gly Ala Ser Ser Val Pro Phe Gly Phe Glu Ala Asn Asp Gly

245 250 255

Leu Val Gly Arg Cys Ser Ser His Leu Gly Met Val Ile Arg Asp Asn

260 265 270

Tyr Arg Met Asn His Leu Asp Glu Val Asn Gln Thr Phe Gly Leu Thr

275 280 285

Ser Leu Phe Glu Thr Ser Pro Val Ser Val Tyr Arg Gln His Ala Asn

290 295 300

Arg Leu Lys Asn Ala Gly Leu

305 310

<210> 2

<211> 936

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcgtaaca ggatctccat cccgctggct gtggggcttg ccgcctcgct cgccggtttc 60

agtcaacagg cattggcctc cggctatacc cagacccgct accccattgt gctggcgcac 120

ggcatgctgg gcttcgacag cattctcggc atcgattact ggtacggcat cccgtcggcc 180

ctgcgccggg acggcgccag ggtctacatt accgaggtca gccagctcga cacctccgaa 240

gcgcgcggcg aacagctgct gcgtcaggtc gaggaaatcg ccgcgatcag cggcaagggc 300

aaggtcaacc tgatcggtca cagccatggc ggccccactg cccgctacgt cgctgcagtg 360

cggcccgatc tgattgcctc ggtcaccagc gtcggcgcgc cacacaaggg ctcgaagacg 420

gccgacttcc ttcgccagat ccctgaagga tcaggtggag aggccgttct ggcgggcatc 480

gtcaatggtc tgggtgggct gatcaatttt ctctcgggca gttcatccac cagcccgcag 540

aactcactcg gttcgctgga atcactcaac tcggccggcg cggagcgctt caacgccaaa 600

tttccgcagg gcattcctac cagcgcctgt ggcgaaggcg cttatcaggt gcgcggcgtg 660

cgctattact cctggggcgg taccaagccg ctgaccaaca ttctcgacgt gtctgacgtg 720

ttactgggcg cctcgtcggt tcccttcggt ttcgaagcca acgatggcct ggtaggacgc 780

tgtagctcgc atctgggcat ggtgattcgc gacaactacc gcatgaacca tctggacgag 840

gtcaaccaga ccttcggcct gaccagcctg ttcgagacca gtccggtgtc ggtctaccgc 900

cagcatgcca accggctgaa gaacgccggt ctgtaa 936

<210> 3

<211> 6231

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

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gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgcc tcccttatgc gactcctgca ttaggaagca gcccagtagt aggttgaggc 4740

cgttgagcac cgccgccgca aggaatggtg catgcaagga gatggcgccc aacagtcccc 4800

cggccacggg gcctgccacc atacccacgc cgaaacaagc gctcatgagc ccgaagtggc 4860

gagcccgatc ttccccatcg gtgatgtcgg cgatataggc gccagcaacc gcacctgtgg 4920

cgccggtgat gccggccacg atgcgtccgg cgtagaggat cgagatctcg atcccgcgaa 4980

attaatacga ctcactatag gggaattgtg agcggataac aattcccctc tagaaataat 5040

tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tgggcagcag ccatcatcat catcatcaca 5100

gcagcggcct ggtgccgcgc ggcagccata tgatgcgtaa caggatctcc atcccgctgg 5160

ctgtggggct tgccgcctcg ctcgccggtt tcagtcaaca ggcattggcc tccggctata 5220

cccagacccg ctaccccatt gtgctggcgc acggcatgct gggcttcgac agcattctcg 5280

gcatcgatta ctggtacggc atcccgtcgg ccctgcgccg ggacggcgcc agggtctaca 5340

ttaccgaggt cagccagctc gacacctccg aagcgcgcgg cgaacagctg ctgcgtcagg 5400

tcgaggaaat cgccgcgatc agcggcaagg gcaaggtcaa cctgatcggt cacagccatg 5460

gcggccccac tgcccgctac gtcgctgcag tgcggcccga tctgattgcc tcggtcacca 5520

gcgtcggcgc gccacacaag ggctcgaaga cggccgactt ccttcgccag atccctgaag 5580

gatcaggtgg agaggccgtt ctggcgggca tcgtcaatgg tctgggtggg ctgatcaatt 5640

ttctctcggg cagttcatcc accagcccgc agaactcact cggttcgctg gaatcactca 5700

actcggccgg cgcggagcgc ttcaacgcca aatttccgca gggcattcct accagcgcct 5760

gtggcgaagg cgcttatcag gtgcgcggcg tgcgctatta ctcctggggc ggtaccaagc 5820

cgctgaccaa cattctcgac gtgtctgacg tgttactggg cgcctcgtcg gttcccttcg 5880

gtttcgaagc caacgatggc ctggtaggac gctgtagctc gcatctgggc atggtgattc 5940

gcgacaacta ccgcatgaac catctggacg aggtcaacca gaccttcggc ctgaccagcc 6000

tgttcgagac cagtccggtg tcggtctacc gccagcatgc caaccggctg aagaacgccg 6060

gtctgtaact cgagcaccac caccaccacc actgagatcc ggctgctaac aaagcccgaa 6120

aggaagctga gttggctgct gccaccgctg agcaataact agcataaccc cttggggcct 6180

ctaaacgggt cttgaggggt tttttgctga aaggaggaac tatatccgga t 6231

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acccatatgc gtaacaggat ctccatcccg ctg 33

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

accctcgagt tacagaccgg cgttcttcag cc 32

Claims (10)

1.一种具有脂肪酶活性的蛋白，其特征在于，所述蛋白为由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白。

2.一种编码具有脂肪酶活性的蛋白的基因，所述蛋白为由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白。

3.根据权利要求2所述的基因，其中，所述基因是核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的DNA分子。

4.一种重组载体，其中，所述重组载体插入有权利要求2或3所述的基因。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其中，所述重组载体是重组表达载体，且所述重组表达载体是核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示的DNA分子。

6.一种转化体，其中，所述转化体的宿主为基因工程菌；所述转化体中导入的基因包括权利要求2或3所述的基因，或者，所述转化体中导入的重组载体包括权利要求4或5所述的重组载体。

7.根据权利要求6所述的转化体，其中，所述基因工程菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母和丝状真菌中的至少一种。

8.一种引物在扩增权利要求2所述编码具有脂肪酶活性的蛋白的基因中的应用，其中，所述引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示的DNA分子；所述反向引物核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示的DNA分子。

9.一种制备脂肪酶的方法，其中，所述方法包括：将权利要求6或7所述的转化体接种于培养基中进行培养，得到培养后的物料。

10.一种脂肪酶在降解脂肪类化合物中的应用，其中，所述脂肪酶含有权利要求1所述的蛋白。

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