CN113337491B

CN113337491B - 一种提高角蛋白酶耐高温稳定性的结构域及其应用

Info

Publication number: CN113337491B
Application number: CN202110773740.9A
Authority: CN
Inventors: 林敏�; 周正富; 张维; 唐殷; 王劲
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2021-07-08
Filing date: 2021-07-08
Publication date: 2022-08-16
Anticipated expiration: 2041-07-08
Also published as: CN113337491A

Abstract

本公开涉及一种具有耐高温稳定性的人工改造的角蛋白酶、一种分离的角蛋白酶、一种分离的角蛋白酶的片段、一种分离或人工合成的核酸、插入该基因的重组载体、转化有该基因的转化体、提高角蛋白酶耐高温稳定性的方法以及该角蛋白酶降解羽毛的方法。本公开实现了角蛋白酶基因片段进行氨基酸优化，改善了角蛋白酶的耐高温效果，为工业及环境用角蛋白酶优化提供更多的改良策略。

Description

一种提高角蛋白酶耐高温稳定性的结构域及其应用

技术领域

本公开涉及基因工程领域，具体地，涉及一种具有耐高温稳定性的人工改造的角蛋白酶、一种分离的角蛋白酶、一种分离的角蛋白酶的片段、一种分离或人工合成的核酸、插入该基因的重组载体、转化有该基因的转化体、提高角蛋白酶耐高温稳定性的方法以及该角蛋白酶降解羽毛的方法。

背景技术

角蛋白酶是一类能够特异性攻击角蛋白二硫键并降解角蛋白的一类酶，主要产自细菌。结构分析显示，角蛋白酶含有信号肽、N端前肽和成熟区，部分序列含有C端延伸结构。角蛋白酶成熟区也称催化结构域，由中央七股平行的β-折叠和六个α-螺旋组成主要的结构为活性位点中心和底物识别位点。活性位点中心为组氨酸、天冬氨酸和丝氨酸组成的催化三联体。成熟区结构性质影响着角蛋白酶的性质，其能特异攻击二硫键以降解角蛋白，但热稳定性差等因素限制了角蛋白酶的工业应用。

目前发现的生物酶热稳定性普遍较差，不利于工业应用，因而对酶热稳定性的改良变得尤为重要。目前对酶稳定性的改造策略主要包括引入二硫键、氢键、盐桥、增加疏水作用力等方式，而在特定温度下酶的稳定性和柔性之间的平衡也是优化酶催化功能的关键。极端微生物在自然进化中适应了高温、低温、高压等极端环境，是极端酶基因资源的优质来源。

目前国内生产的酶制剂品种较为单一，不能满足工业需求，因而仍需要对具有特殊性能的优质酶资源进行开发。

发明内容

本公开的目的是提供一种具有耐高温稳定性的人工改造的角蛋白酶，该角蛋白酶通过定点突变的方式进行了耐高温稳定性的氨基酸优化，提高了角蛋白酶的耐高温稳定性，可应用于洗涤、食品、化妆品以及废弃物降解等领域。

第一方面，本公开提供一种具有耐高温稳定性的人工改造的角蛋白酶，所述角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

可选地，其中，所述角蛋白酶是将如戈壁异常球菌的角蛋白酶的Asn243-Tyr276片段替换为嗜热异常球菌的角蛋白酶的Asn240-Tyr274片段后得到的蛋白；

戈壁异常球菌的角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

嗜热异常球菌的角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

第二方面，本公开提供一种分离的角蛋白酶，该角蛋白酶是来源于嗜热异常球菌的角蛋白酶，且该角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

第三方面，本公开提供一种分离的角蛋白酶的片段，该角蛋白酶的片段是嗜热异常球菌的角蛋白酶的Asn240-Tyr274片段，且该角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

第四方面，本公开提供一种分离的或人工合成的核酸，该核酸编码第一方面和第二方面中任意一项所述的角蛋白酶或第三方面所述的角蛋白酶的片段。

可选地，其中，所述基因是核苷酸序列为SEQ ID NO.5、7、8中任意一个所示的DNA分子。

第五方面，本公开提供一种重组载体，其中，所述重组载体插入有第四方面所述的基因；

优选地，所述重组载体是重组表达载体，且所述重组表达载体是核苷酸序列为SEQID NO.9或10所示的DNA分子。

第六方面，本公开提供一种转化体，其中，所述转化体的宿主为基因工程菌；所述转化体导入的核酸包括第四方面所述的核酸，或者，所述转化体中导入的重组载体包括第五方面所述的重组载体。

第七方面，本公开提供一种提高角蛋白酶的耐高温稳定性的方法，其中，所述方法包括：对原始的角蛋白酶进行重组改造，所述重组改造包括：将原始的角蛋白酶中对应于嗜热异常球菌的角蛋白酶的Asn243-Tyr276片段的同源片段替换为嗜热异常球菌的角蛋白酶的Asn243-Tyr276片段；

所述嗜热异常球菌的角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述原始的角蛋白酶中对应于嗜热异常球菌的角蛋白酶的Asn243-Tyr276片段的同源片段，与嗜热异常球菌的角蛋白酶的Asn243-Tyr276片段的一致性在80％以上。

第八方面，本公开提供一种降解羽毛的方法，其中，该方法包括，将羽毛与角蛋白酶接触进行酶解；

所述角蛋白酶为第一方面和第二方面中任意一项所述的角蛋白酶，或者为第七方面所述的方法得到的角蛋白酶；

优选地，所述酶解的温度为60-80℃，时间为0-200min。

更优选地，所述酶解的温度为65-75℃，时间为10-120min。

本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

图1角蛋白酶DgeKer的酶活特性(A)最适温度(B)60℃热稳定性(C)最适pH(D)pH耐受性。

图2角蛋白酶DgeKer的羽毛降解分析。

图3功能域Asn240-Tyr274的序列分析。

图4功能域Asn240-Tyr274提高了重组酶温度稳定性。

图5功能域Asn240-Tyr274提高了重组酶高温下羽毛降解力。

序列表信息

1、SEQ ID NO.1：具有耐高温稳定性的人工改造的角蛋白酶的氨基酸序列。

2、SEQ ID NO.2：戈壁异常球菌的角蛋白酶的氨基酸序列。

3、SEQ ID NO.3：嗜热异常球菌的角蛋白酶的氨基酸序列。

4、SEQ ID NO.4：嗜热异常球菌的角蛋白酶的Asn240-Tyr274片段的氨基酸序列。

5、SEQ ID NO.5、6、7：编码SEQ ID NO.1-3的氨基酸序列的核苷酸序列。

6、SEQ ID NO.8：编码嗜热异常球菌的角蛋白酶的Asn240-Tyr274片段的氨基酸序列的核苷酸序列。

7、SEQ ID NO.9：具有耐高温稳定性的人工改造的角蛋白酶重组表达载体的核苷酸序列。

8、SEQ ID NO.10：嗜热异常球菌的角蛋白酶重组表达载体的核苷酸序列。

具体实施方式

以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

戈壁异常球菌的角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

嗜热异常球菌的角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本公开中，所述戈壁异常球菌的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本公开中，体外酶活性分析结果表明，来源于嗜热异常球菌的角蛋白酶具有良好的角蛋白酶活性；来源于嗜热异常球菌的角蛋白酶的羽毛降解实验结果表明，角蛋白酶能够在120min完成羽毛降解，60℃酶活性最高，60℃下角蛋白酶的酶活性稳定性是商品酶KerA的3.96倍。

本公开中，嗜热异常球菌的角蛋白酶的Asn240-Tyr274片段的功能域位于成熟区C端、α5螺旋结构下游第240位天冬氨酸残基至274位酪氨酸残基的35个氨基酸残基，结构上包含一段α-螺旋和一股β-折叠，保守性较弱，在稳定蛋白结构上发挥重要作用。所述嗜热异常球菌的角蛋白酶的Asn240-Tyr274片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本公开中，体外酶活性分析结果表明，重组后的角蛋白酶最适温度提高了10℃，60℃下重组角蛋白酶的酶活性延长了2.39倍。实验证明角蛋白酶成熟区α5螺旋结构下游第240位天冬氨酸残基至274位酪氨酸(Asn240-Tyr274)结构域的优化具有显著提高角蛋白酶耐高温稳定性的功能。

优选地，所述酶解的温度为60-80℃，时间为0-200min。

更优选地，所述酶解的温度为65-75℃，时间为10-120min。

下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。

以下实施例中所举的质粒、菌株以及微生物催化羟基化的对象只用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。

凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例中所举的质粒、菌株来源如下：

表达质粒pET28a：为德国默克公司市售产品；

大肠杆菌BL21(DE3)：为北京诺唯赞公司市售产品。

实施例1

本实施例用于说明角蛋白酶DgeKer的功能鉴定

(一)实验方法

1、角蛋白酶表达菌株的构建

根据嗜热异常球菌基因组序列设计PCR特异性引物：

Dgeker-F：ACCCATATGAACTCACGTCTTGCGCTTG(SEQ ID NO.11)

Dgeker-R：ACCCTCGAGTGGTGTAGAGCAGGCGGTTGGG(SEQ ID NO.12)

通过PCR方法从嗜热异常球菌基因组DNA中扩增出目的基因序列。

PCR反应程序：

PCR产物经胶回收后，通过重组酶连接于经过Nde I/Xho I双酶切获得的含有粘性末端的pET-28a载体上，构建大肠杆菌表达载体pET28a-DgeKer。将该表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，经PCR、酶切，测序验证插入序列正确，将该菌株命名为BL21-DgeKer。

2、角蛋白酶的诱导表达与纯化

活化重组菌，挑取单菌落制备种子液；将种子液按OD₆₀₀＝0.1转接至新鲜LB培养基中。37℃培养至OD₆₀₀＝0.5，加入IPTG，并转移至16℃进行蛋白表达(过夜)。离心收集菌体，Tris-HCl(pH 7.5)重悬菌体。超声破碎菌体，收集上清及沉淀。采用Ni-NTA琼脂糖凝胶纯化目的角蛋白酶，SDS-PAGE检测蛋白。

3、角蛋白酶的酶活测定

酶活性定义：样品比对照增加0.01个吸光值定义为1个酶活力单位(U)。

将0.1mL可溶性角蛋白(1％)、0.08mL缓冲液与0.02mL角蛋白酶混匀，对照组加入0.2mL TCA、0.08mL缓冲液及0.02mL角蛋白酶；50℃孵育15min；加入0.2mL TCA终止反应，对照组加入0.1mL可溶性角蛋白(1％)；4℃、12000rpm/min离心5min；0.2mL上清与1mL Na2CO3及0.2mL福林混匀；40℃显色反应20min；取0.2mL上清液测680nm处吸光值。

4、角蛋白酶温度耐受性及pH耐受性分析

酶活性测定体系加入纯化酶液、缓冲液及1％可溶性底物，在30、40、50、60、70、80℃下反应20min，测定角蛋白酶酶活。

酶活性测定体系加入纯化酶液、不同pH值缓冲液及底物，在角蛋白酶最适温度下测定角蛋白酶酶活。

温度耐受性：提前将纯化角蛋白酶酶液于60℃、70℃预处理5min、10min、20min、30min、40min、50min、60min后，置于冰上冷却，对照组不做处理，酶活性测定体系及步骤在最适反应温度下测定角蛋白酶残余酶活。

pH耐受性：将纯化角蛋白酶酶液置于不同pH缓冲液中于冰上处理预处理1h，酶活性测定体系及步骤于最适温度下测定残余酶活。

5、角蛋白酶体外羽毛降解实验

羽毛预处理：高压蒸汽(121℃，1.034×105Pa)灭菌30min。

将灭菌的完整羽毛加入1.5mL纯化酶中(5mmol/L DTT)，于60℃、220rpm摇床中孵育，定时拍照观察羽毛降解情况。

(二)实验结果

本实施例成功构建了表达角蛋白酶DgeKer的重组大肠杆菌工程菌株。蛋白诱导条件及时间与DgeKer一致，使用浓度为0.1mmol/L，于16℃条件下IPTG诱导蛋白表达的DgeKer以可溶形式存在，纯化后DgeKer蛋白分子量约为28kDa，为N端前肽切割后的成熟蛋白。

角蛋白酶活测定结果显表明：DgeKer最适反应温度为70℃，最适反应pH为9，60℃预处理60min后，DgeKer残余酶活性约为69％，半衰期为103.4min。pH11缓冲液预处理60min后，DgeKer残余酶活性接近100％。商品酶KerA在60℃处理下，酶活性丧失较快，处理60min后,残余酶活性不足20％，半衰期为26.4min。相比之下DgeKer半衰期为KerA半衰期的3.91倍。

羽毛降解实验表明：60℃处理下，角蛋白酶DgeKer孵育60min时，羽毛羽枝大量脱落，反应体系溶液开始变浑浊。随后反应体系中出现更多羽枝脱落并分解成小的颗粒，孵育120min时羽片基本完成降解。

实施例2

本实施例用于说明角蛋白酶热稳定性功能域Asn240-Tyr274的挖掘与分析

(一)实验方法

生物信息学分析

利用BLAST对数据库进行相似性分析和比对。在ExPASy服务器上使用ProtParam分析了蛋白的分子量和消光系数。利用ESPript3.0氨基酸序列比对，进行二级结构分析。利用Phyre2server对DgeKer的三维结构进行了预测。使用VMD1.9.3可视化并编辑由Phyre2生成的PDB文件。利用Interpro软件对DgeKer的蛋白结构域及催化中心进行预测。利用MEGA 7.0软件按照邻接法构建系统发育树。利用SCHEMA软件进行热点结构域分析与蛋白模块化重组。

(二)实验结果

生物信息学分析显示：角蛋白酶DgeKer成熟区由279个氨基酸残基组成，由中央7股平行的β-折叠和6个α-螺旋组成主要的结构为活性位点中心和底物识别位，包含催化三联体Asp39、His71和Ser222，与KerA、MtaKer催化三联体结构高度保守。

表面电荷分布分析显示：DgeKer的Asn240-Tyr274与同源蛋白差异较大。Asn240-Tyr274功能域位于成熟区C端，α5螺旋结构下游第240位天冬氨酸残基至274位酪氨酸残基的35个氨基酸残基，结构上包含一段α-螺旋和一股β-折叠，可变性较强，推测在稳定蛋白结构上发挥重要作用。

实施例3

本实施例用于说明功能域Asn240-Tyr274在角蛋白酶优化上的应用

(一)实验方法

1、功能域Asn240-Tyr274重组角蛋白酶表达菌株的构建

利用合成生物学方法，以戈壁异常球菌角蛋白酶KerDG1为模板，人工设计将角蛋白酶DgeKer功能域Asn240-Tyr274片段替换KerDG1同源结构Asn243-Tyr276，重组基因命名为KerDG1-AT。

通过重组酶连接于pET-28a载体上，构建大肠杆菌表达载体pET28a-KerDG1-AT。将该表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，经PCR、酶切，测序验证插入序列正确，将该菌株命名为BL21-KerDG1-AT。

2、功能域Asn240-Tyr274重组角蛋白酶的诱导表达与纯化

活化重组菌，挑取单菌落制备种子液；将种子液按OD600＝0.1转接至新鲜LB培养基中。37℃培养至OD600＝0.5，加入IPTG，并转移至16℃进行蛋白表达(过夜)。离心收集菌体，Tris-HCl(pH 7.5)重悬菌体。超声破碎菌体，收集上清及沉淀。采用Ni-NTA琼脂糖凝胶纯化目的角蛋白酶，SDS-PAGE检测蛋白。

3、角蛋白酶的酶活测定

4、角蛋白酶温度耐受性及pH耐受性分析

酶活性测定体系加入纯化酶液、缓冲液及1％可溶性底物，在30、40、50、60、70、80℃下反应20min，测定角蛋白酶酶活。酶活性测定体系加入纯化酶液、不同pH值缓冲液及底物，在角蛋白酶最适温度下测定角蛋白酶酶活。

5、角蛋白酶体外羽毛降解实验

将灭菌的完整羽毛加入1.5mL纯化酶中(5mmol/L DTT)，于60℃和70℃、220rpm摇床中孵育，定时拍照观察羽毛降解情况。

(二)实验结果

利用合成生物学方法，以戈壁异常球菌角蛋白酶KerDG1为模板，将角蛋白酶DgeKer功能域Asn240-Tyr274片段替换KerDG1同源结构Asn243-Tyr276，重组基因命名为KerDG1-AT。利用大肠杆菌表达纯化了KerDG1-AT蛋白。体外酶活分析结果显示，重组酶KerDG1-AT具有良好的角蛋白酶活性。与改造前的KerDG1相比，KerDG1-AT的最适温度从60℃到了70℃，提高了10℃，60℃下酶活稳定性延长了2.39倍。

高温条件下羽毛降解能力也大幅度提升。60℃处理下，改造前的角蛋白酶KerDG1孵育100min时，羽毛羽枝开始脱落，反应体系溶液开始变浑浊；而重组角蛋白酶KerDG1-AT孵育60min时，羽毛羽枝大量脱落，孵育100min时，羽毛仅剩羽轴残留基本完成降解。70℃处理下，改造前的角蛋白酶KerDG1孵育120min内，羽毛降解较弱，反应体系溶液未见浑浊；而重组角蛋白酶KerDG1-AT孵育60min时，羽毛羽枝大量脱落，孵育100min时，羽毛仅剩羽轴残留基本完成降解，热稳定性显著提升。

本公开证明了来自嗜热异常球菌的角蛋白酶DgeKer具有的高温稳定性，其成熟区α5螺旋结构下游第240位天冬氨酸残基至274位酪氨酸(Asn240-Tyr274)结构域的优化具有显著提高角蛋白酶耐高温稳定性的功能。此外角蛋白酶DgeKer的Asn240-Tyr274功能域在商用角蛋白酶热稳定性优化改造中的应用，为工业及环境用角蛋白酶优化提供更多的改良策略。

以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 一种提高角蛋白酶耐高温稳定性的结构域及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 413

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asn Gly Arg Leu Thr Leu Gly Val Leu Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Ala Ala Cys Gly Thr Ser Thr Thr Pro Met Ala Gln Thr Pro Ala Gln

20 25 30

Gly Ser Ala Pro Ala Ala Asp Ser Gly Leu Ala Pro Leu Arg Gly Thr

35 40 45

Asp Asn Pro Ser Ala Ile Ala Gly Gln Tyr Ile Val Val Leu Lys Glu

50 55 60

Gly Thr Gln Ser Ala Leu Ser Ala Gln Ser Ala Gly Gly Leu Ile Gly

65 70 75 80

Ser Leu Gly Leu Asp Pro Gln Gly Ile Thr Val Leu Ser Val Tyr Gly

85 90 95

Gln Ala Ile Glu Gly Phe Ala Ala Lys Leu Ser Ala Gln Asn Leu Glu

100 105 110

Lys Val Arg Ala Asn Ala Asn Val Ala Tyr Val Glu Gln Asp Gly Met

115 120 125

Met Tyr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Ser Ala Thr Trp Gly Leu Asp Arg

130 135 140

Ile Asp Gln Arg Asn Leu Pro Leu Asn Gly Thr Tyr Val Tyr Asn Lys

145 150 155 160

Thr Gly Ser Gly Val Lys Ala Phe Ile Ile Asp Thr Gly Ile Asn Thr

165 170 175

Ser His Thr Ser Phe Gly Gly Arg Ala Val Trp Gly Thr Asn Thr Thr

180 185 190

Gly Asp Gly Arg Asn Thr Asp Cys Gln Gly His Gly Thr His Val Ala

195 200 205

Gly Thr Val Gly Ser Ser Thr Trp Gly Val Ala Lys Ser Thr Ser Leu

210 215 220

Ile Ala Val Lys Val Leu Asp Cys Asn Gly Ser Gly Ser Asn Ser Gly

225 230 235 240

Val Ile Ser Gly Ile Asn Trp Ala Leu Asn Asn Lys Gly Ser Ala Thr

245 250 255

Ala Val Ala Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Ala Ser Ser Ala Val Asp

260 265 270

Asp Ala Val Asn Asn Ala Gly Ser Arg Gly Leu Val Met Val Val Ala

275 280 285

Ala Gly Asn Glu Asn Gln Asp Ala Cys Asn Val Ser Pro Ala Arg Ala

290 295 300

Ser Gly Ser Gly Val Ile Thr Val Gly Ala Thr Thr Arg Ser Asp Val

305 310 315 320

Arg Ala Ser Tyr Ser Asn Tyr Gly Ser Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro

325 330 335

Gly Ser Asp Ile Thr Ser Ala Trp Ile Gly Ser Thr Thr Ala Thr Asn

340 345 350

Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala Val

355 360 365

Ala Leu Leu Leu Gln Gly Asn Pro Ser Tyr Thr Thr Ala Gln Val Thr

370 375 380

Ser Ala Leu Leu Asn Asn Ala Thr Thr Gly Lys Val Thr Ser Ala Gly

385 390 395 400

Ser Gly Ser Pro Asn Arg Leu Leu Tyr Thr Leu Asn Phe

405 410

<210> 2

<211> 412

<212> PRT

<213> 戈壁异常球菌(Deinococcus gobiensis)

<400> 2

Met Asn Gly Arg Leu Thr Leu Gly Val Leu Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Ala Ala Cys Gly Thr Ser Thr Thr Pro Met Ala Gln Thr Pro Ala Gln

20 25 30

Gly Ser Ala Pro Ala Ala Asp Ser Gly Leu Ala Pro Leu Arg Gly Thr

35 40 45

Asp Asn Pro Ser Ala Ile Ala Gly Gln Tyr Ile Val Val Leu Lys Glu

50 55 60

Gly Thr Gln Ser Ala Leu Ser Ala Gln Ser Ala Gly Gly Leu Ile Gly

65 70 75 80

Ser Leu Gly Leu Asp Pro Gln Gly Ile Thr Val Leu Ser Val Tyr Gly

85 90 95

Gln Ala Ile Glu Gly Phe Ala Ala Lys Leu Ser Ala Gln Asn Leu Glu

100 105 110

Lys Val Arg Ala Asn Ala Asn Val Ala Tyr Val Glu Gln Asp Gly Met

115 120 125

Met Tyr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Ser Ala Thr Trp Gly Leu Asp Arg

130 135 140

Ile Asp Gln Arg Asn Leu Pro Leu Asn Gly Thr Tyr Val Tyr Asn Lys

145 150 155 160

Thr Gly Ser Gly Val Lys Ala Phe Ile Ile Asp Thr Gly Ile Asn Thr

165 170 175

Ser His Thr Ser Phe Gly Gly Arg Ala Val Trp Gly Thr Asn Thr Thr

180 185 190

Gly Asp Gly Arg Asn Thr Asp Cys Gln Gly His Gly Thr His Val Ala

195 200 205

Gly Thr Val Gly Ser Ser Thr Trp Gly Val Ala Lys Ser Thr Ser Leu

210 215 220

Ile Ala Val Lys Val Leu Asp Cys Asn Gly Ser Gly Ser Asn Ser Gly

225 230 235 240

Val Ile Ser Gly Ile Asn Trp Ala Leu Asn Asn Lys Gly Ser Ala Thr

245 250 255

Ala Val Ala Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Ala Ser Ser Ala Val Asp

260 265 270

Asp Ala Val Asn Asn Ala Gly Ser Arg Gly Leu Val Met Val Val Ala

275 280 285

Ala Gly Asn Glu Asn Gln Asp Ala Cys Asn Val Ser Pro Ala Arg Ala

290 295 300

Ser Gly Ser Gly Val Ile Thr Val Gly Ala Thr Thr Arg Ser Asp Val

305 310 315 320

Arg Ala Ser Tyr Ser Asn Tyr Gly Ser Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro

325 330 335

Gly Ser Asp Ile Thr Ser Ala Trp Ile Gly Ser Thr Thr Ala Thr Asn

340 345 350

Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala Val

355 360 365

Ala Leu Leu Leu Gln Gly Asn Thr Gly Ile Ser Ala Ser Thr Ala Arg

370 375 380

Ser Thr Val Leu Asn Asn Thr Thr Asn Gly Val Val Ser Ser Glu Asn

385 390 395 400

Gly Ser Pro Asp Lys Leu Leu Tyr Thr Leu Asn Phe

405 410

<210> 3

<211> 407

<212> PRT

<213> 嗜热异常球菌(Deinococcus geothermalis)

<400> 3

Met Asn Ser Arg Leu Ala Leu Gly Leu Leu Gly Leu Thr Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ala Ala Cys Gly Gln Gln Ala Asn Thr Pro Ala Asp Thr Ala Gln Ala

20 25 30

Ser Thr Pro Asp Arg Ser Ser His Thr Ala Pro Leu Leu Gly Thr Ser

35 40 45

Asn Pro Glu Ala Ile Pro Gly Gln Tyr Ile Val Val Phe Ser Asp Gly

50 55 60

Ala Leu Gly Ala Asn Leu Gly Ala Gln Asp Ala Gly Ser Leu Ile Arg

65 70 75 80

Thr Leu Gly Leu Asp Pro Gln Gly Ile Ser Val Gln His Ile Tyr Thr

85 90 95

Gln Ala Leu Ser Gly Phe Ala Ala Lys Leu Ser Ala Gln Asn Leu Ala

100 105 110

Lys Leu Gln Ala Asp Arg Arg Val Lys Tyr Ile Glu Gln Asp Ala Thr

115 120 125

Val His Ala Thr Ala Thr Gln Ser Gly Ala Thr Trp Gly Leu Asp Arg

130 135 140

Ile Asp Gln Arg Asn Leu Pro Leu Asp Gly Asn Tyr Ser Tyr Ser Thr

145 150 155 160

Thr Ala Ser Asn Val Thr Ala Tyr Ile Ile Asp Thr Gly Ile Asn Thr

165 170 175

Ala His Thr Asp Phe Gly Gly Arg Ala Val Trp Gly Thr Asn Thr Thr

180 185 190

Gly Asp Gly Asn Asn Ser Asp Cys Gln Gly His Gly Thr His Val Ala

195 200 205

Gly Thr Val Gly Ser Ser Thr Trp Gly Val Ala Lys Gly Val Lys Leu

210 215 220

Val Ala Val Lys Val Leu Gly Cys Asp Gly Ser Gly Thr Asn Ser Gly

225 230 235 240

Val Ile Ala Gly Val Asn Trp Ala Val Ser Asn Lys Ser Gly Pro Ala

245 250 255

Val Ala Asn Met Ser Leu Gly Gly Gly Val Ser Gln Ala Leu Asp Asp

260 265 270

Ala Val Asn Asn Ala Ala Ser Lys Asn Leu Val Met Ala Val Ala Gly

275 280 285

Gly Asn Asp Asn Val Asp Ala Cys Thr Ser Ser Pro Ala Arg Ala Ala

290 295 300

Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Asp Arg Asn Asp Ala Arg Ala Ser

305 310 315 320

Phe Ser Asn Tyr Gly Ser Cys Leu Asp Leu Phe Ala Pro Gly Val Asn

325 330 335

Ile Thr Ser Thr Trp Ile Gly Ser Thr Thr Ala Thr Asn Thr Ile Ser

340 345 350

Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Thr Gly Ala Ala Ala Leu Ile

355 360 365

Leu Ala Ala Asn Pro Ser Tyr Thr Thr Ala Gln Val Thr Ser Ala Leu

370 375 380

Leu Asn Asn Ala Thr Thr Gly Lys Val Thr Ser Ala Gly Ser Gly Ser

385 390 395 400

Pro Asn Arg Leu Leu Tyr Thr

405

<210> 4

<211> 35

<212> PRT

<213> 嗜热异常球菌(Deinococcus geothermalis)

<400> 4

Asn Pro Ser Tyr Thr Thr Ala Gln Val Thr Ser Ala Leu Leu Asn Asn

1 5 10 15

Ala Thr Thr Gly Lys Val Thr Ser Ala Gly Ser Gly Ser Pro Asn Arg

20 25 30

Leu Leu Tyr

35

<210> 5

<211> 1242

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgaacggac gtcttaccct cggtgttctg gccctttccc tcgccctcgc ggcctgcgga 60

acctcgacta cccccatggc ccagacgccg gcccagggca gcgccccggc cgccgacagc 120

ggtctggccc ccctgcgcgg caccgacaac cccagcgcca tcgccgggca gtacatcgtg 180

gtcctcaagg aaggcaccca gagcgccctg agcgcccaga gcgccggcgg cctgatcggc 240

agcctgggtc tggacccgca gggcatcacg gtcctgagcg tgtacggtca ggccattgag 300

ggcttcgccg ccaagctcag cgcccagaac ctggagaagg tgcgcgccaa cgcgaacgtc 360

gcctacgtcg agcaggacgg catgatgtac gcctccgcca cgcagtcgag cgccacctgg 420

ggcctggacc gcatcgacca gcgcaacctg cccctgaacg gcacctacgt ctacaacaag 480

accggctcgg gcgtgaaggc gttcatcatc gacacgggca tcaacacctc gcacaccagc 540

ttcggcgggc gcgcggtctg gggcacgaac accacgggtg acggccgcaa caccgactgc 600

cagggccacg gcacccacgt cgccggcacg gtcgggtcct cgacctgggg cgtcgccaag 660

agcaccagcc tgatcgccgt gaaggtgctg gactgcaacg gatcgggcag caactccggg 720

gtcatcagcg gcatcaactg ggcgctgaac aacaagggca gtgccaccgc cgtcgccaac 780

atgagcttgg gcggcccggc cagctcggcc gtggacgacg ccgtgaacaa cgcgggcagc 840

cgcggcctcg tgatggtggt cgccgccggc aacgagaacc aggacgcctg caacgtcagc 900

ccggcgcgtg ccagcggcag cggcgtgatc acggtggggg ccaccacccg cagcgacgtg 960

cgcgccagct acagcaacta cggctcgtgc gtggacctct tcgcgcccgg cagcgacatc 1020

acgagcgcct ggatcggcag cacgaccgcc accaacacca tcagcggcac cagcatggcg 1080

accccgcacg tggccggcgc ggtggccctg ctgctccagg gcaacccctc ctacacgacg 1140

gctcaggtca ccagcgctct gctgaataac gccacgaccg gcaaggtcac ctccgcgggc 1200

agcggcagcc ccaaccgcct gctctacacc ctgaacttct ga 1242

<210> 6

<211> 1239

<212> DNA

<213> 戈壁异常球菌(Deinococcus gobiensis)

<400> 6

atgaacggac gtcttaccct cggtgttctg gccctttccc tcgccctcgc ggcctgcgga 60

acctcgacta cccccatggc ccagacgccg gcccagggca gcgccccggc cgccgacagc 120

ggtctggccc ccctgcgcgg caccgacaac cccagcgcca tcgccgggca gtacatcgtg 180

gtcctcaagg aaggcaccca gagcgccctg agcgcccaga gcgccggcgg cctgatcggc 240

agcctgggtc tggacccgca gggcatcacg gtcctgagcg tgtacggtca ggccattgag 300

ggcttcgccg ccaagctcag cgcccagaac ctggagaagg tgcgcgccaa cgcgaacgtc 360

gcctacgtcg agcaggacgg catgatgtac gcctccgcca cgcagtcgag cgccacctgg 420

ggcctggacc gcatcgacca gcgcaacctg cccctgaacg gcacctacgt ctacaacaag 480

accggctcgg gcgtgaaggc gttcatcatc gacacgggca tcaacacctc gcacaccagc 540

ttcggcgggc gcgcggtctg gggcacgaac accacgggtg acggccgcaa caccgactgc 600

cagggccacg gcacccacgt cgccggcacg gtcgggtcct cgacctgggg cgtcgccaag 660

agcaccagcc tgatcgccgt gaaggtgctg gactgcaacg gatcgggcag caactccggg 720

gtcatcagcg gcatcaactg ggcgctgaac aacaagggca gtgccaccgc cgtcgccaac 780

atgagcttgg gcggcccggc cagctcggcc gtggacgacg ccgtgaacaa cgcgggcagc 840

cgcggcctcg tgatggtggt cgccgccggc aacgagaacc aggacgcctg caacgtcagc 900

ccggcgcgtg ccagcggcag cggcgtgatc acggtggggg ccaccacccg cagcgacgtg 960

cgcgccagct acagcaacta cggctcgtgc gtggacctct tcgcgcccgg cagcgacatc 1020

acgagcgcct ggatcggcag cacgaccgcc accaacacca tcagcggcac cagcatggcg 1080

accccgcacg tggccggcgc ggtggccctg ctgctccagg gcaacaccgg catcagcgcc 1140

agcaccgccc gctcgacggt cctgaacaac accaccaacg gcgtggtgag cagcgagaac 1200

ggcagccccg acaagctgct gtacaccctg aacttctga 1239

<210> 7

<211> 1224

<212> DNA

<213> 嗜热异常球菌(Deinococcus geothermalis)

<400> 7

atgaactcac gtcttgcgct tggtcttctc ggcctcacgc tcctgctcgc ggcctgcgga 60

cagcaggcga atacgccggc ggacacggcc caggccagca cgccggatcg cagcagccac 120

acggcgcccc tgctgggcac gagcaatccc gaggcgattc ccggccagta catcgtggtg 180

ttcagcgacg gcgcgctggg agcgaatctg ggcgcgcagg atgccggaag cctgatccgc 240

acgctcggac tggatcccca gggcatcagc gtgcagcaca tctacacgca ggcccttagc 300

ggcttcgcgg ccaagctcag cgcgcagaac ctcgccaaac ttcaggcgga ccggcgggtc 360

aagtacatcg agcaggacgc gacggtccac gccaccgcca cccagagcgg tgccacctgg 420

ggcctggacc gcatcgacca acgcaacctg cccctcgatg gcaactacag ctacagcacg 480

acggccagca acgtcaccgc ctacatcatc gacactggga tcaacacggc gcatacggat 540

ttcggcggac gggcggtgtg gggcaccaac accaccgggg acggcaacaa cagtgactgc 600

caggggcacg gaacgcacgt ggcgggcacg gtgggcagca gcacctgggg cgtggccaag 660

ggcgtgaagc tcgtcgccgt gaaggtgctg ggctgtgacg gcagcggcac aaactccggc 720

gtgatcgcgg gcgtcaactg ggccgtgagc aacaagagcg gtcccgcggt ggcgaacatg 780

agcctgggcg gtggcgtcag ccaggcgctc gacgacgcgg tgaacaacgc cgccagcaag 840

aatctggtga tggcggtcgc gggcgggaac gacaatgtgg acgcctgcac cagcagcccg 900

gcgcgcgccg cgaacgccat caccgtcggc gcgaccgacc ggaacgatgc ccgcgccagc 960

ttcagcaact atggctcttg cctcgatctc ttcgcccccg gcgtaaacat caccagcacc 1020

tggatcggct ccaccaccgc caccaacacc atcagcggca ccagcatggc gacgccccac 1080

gtgaccggcg cggcggccct gatcctggcg gccaacccct cctacacgac ggctcaggtc 1140

accagcgctc tgctgaataa cgccacgacc ggcaaggtca cctccgcggg cagcggcagc 1200

cccaaccgcc tgctctacac ctga 1224

<210> 8

<211> 105

<212> DNA

<213> 嗜热异常球菌(Deinococcus geothermalis)

<400> 8

aacccctcct acacgacggc tcaggtcacc agcgctctgc tgaataacgc cacgaccggc 60

aaggtcacct ccgcgggcag cggcagcccc aaccgcctgc tctac 105

<210> 9

<211> 6533

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040

ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgggcagca gccatcatca tcatcatcac 5100

agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat atgaacggac gtcttaccct cggtgttctg 5160

gccctttccc tcgccctcgc ggcctgcgga acctcgacta cccccatggc ccagacgccg 5220

gcccagggca gcgccccggc cgccgacagc ggtctggccc ccctgcgcgg caccgacaac 5280

cccagcgcca tcgccgggca gtacatcgtg gtcctcaagg aaggcaccca gagcgccctg 5340

agcgcccaga gcgccggcgg cctgatcggc agcctgggtc tggacccgca gggcatcacg 5400

gtcctgagcg tgtacggtca ggccattgag ggcttcgccg ccaagctcag cgcccagaac 5460

ctggagaagg tgcgcgccaa cgcgaacgtc gcctacgtcg agcaggacgg catgatgtac 5520

gcctccgcca cgcagtcgag cgccacctgg ggcctggacc gcatcgacca gcgcaacctg 5580

cccctgaacg gcacctacgt ctacaacaag accggctcgg gcgtgaaggc gttcatcatc 5640

gacacgggca tcaacacctc gcacaccagc ttcggcgggc gcgcggtctg gggcacgaac 5700

accacgggtg acggccgcaa caccgactgc cagggccacg gcacccacgt cgccggcacg 5760

gtcgggtcct cgacctgggg cgtcgccaag agcaccagcc tgatcgccgt gaaggtgctg 5820

gactgcaacg gatcgggcag caactccggg gtcatcagcg gcatcaactg ggcgctgaac 5880

aacaagggca gtgccaccgc cgtcgccaac atgagcttgg gcggcccggc cagctcggcc 5940

gtggacgacg ccgtgaacaa cgcgggcagc cgcggcctcg tgatggtggt cgccgccggc 6000

aacgagaacc aggacgcctg caacgtcagc ccggcgcgtg ccagcggcag cggcgtgatc 6060

acggtggggg ccaccacccg cagcgacgtg cgcgccagct acagcaacta cggctcgtgc 6120

gtggacctct tcgcgcccgg cagcgacatc acgagcgcct ggatcggcag cacgaccgcc 6180

accaacacca tcagcggcac cagcatggcg accccgcacg tggccggcgc ggtggccctg 6240

ctgctccagg gcaacccctc ctacacgacg gctcaggtca ccagcgctct gctgaataac 6300

gccacgaccg gcaaggtcac ctccgcgggc agcggcagcc ccaaccgcct gctctacacc 6360

ctgaacttca ctcgagcacc accaccacca ccactgagat ccggctgcta acaaagcccg 6420

aaaggaagct gagttggctg ctgccaccgc tgagcaataa ctagcataac cccttggggc 6480

ctctaaacgg gtcttgaggg gttttttgct gaaaggagga actatatccg gat 6533

<210> 10

<211> 6515

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040

ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgggcagca gccatcatca tcatcatcac 5100

agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat atgaactcac gtcttgcgct tggtcttctc 5160

ggcctcacgc tcctgctcgc ggcctgcgga cagcaggcga atacgccggc ggacacggcc 5220

caggccagca cgccggatcg cagcagccac acggcgcccc tgctgggcac gagcaatccc 5280

gaggcgattc ccggccagta catcgtggtg ttcagcgacg gcgcgctggg agcgaatctg 5340

ggcgcgcagg atgccggaag cctgatccgc acgctcggac tggatcccca gggcatcagc 5400

gtgcagcaca tctacacgca ggcccttagc ggcttcgcgg ccaagctcag cgcgcagaac 5460

ctcgccaaac ttcaggcgga ccggcgggtc aagtacatcg agcaggacgc gacggtccac 5520

gccaccgcca cccagagcgg tgccacctgg ggcctggacc gcatcgacca acgcaacctg 5580

cccctcgatg gcaactacag ctacagcacg acggccagca acgtcaccgc ctacatcatc 5640

gacactggga tcaacacggc gcatacggat ttcggcggac gggcggtgtg gggcaccaac 5700

accaccgggg acggcaacaa cagtgactgc caggggcacg gaacgcacgt ggcgggcacg 5760

gtgggcagca gcacctgggg cgtggccaag ggcgtgaagc tcgtcgccgt gaaggtgctg 5820

ggctgtgacg gcagcggcac aaactccggc gtgatcgcgg gcgtcaactg ggccgtgagc 5880

aacaagagcg gtcccgcggt ggcgaacatg agcctgggcg gtggcgtcag ccaggcgctc 5940

gacgacgcgg tgaacaacgc cgccagcaag aatctggtga tggcggtcgc gggcgggaac 6000

gacaatgtgg acgcctgcac cagcagcccg gcgcgcgccg cgaacgccat caccgtcggc 6060

gcgaccgacc ggaacgatgc ccgcgccagc ttcagcaact atggctcttg cctcgatctc 6120

ttcgcccccg gcgtaaacat caccagcacc tggatcggct ccaccaccgc caccaacacc 6180

atcagcggca ccagcatggc gacgccccac gtgaccggcg cggcggccct gatcctggcg 6240

gccaacccct cctacacgac ggctcaggtc accagcgctc tgctgaataa cgccacgacc 6300

ggcaaggtca cctccgcggg cagcggcagc cccaaccgcc tgctctacac cactcgagca 6360

ccaccaccac caccactgag atccggctgc taacaaagcc cgaaaggaag ctgagttggc 6420

tgctgccacc gctgagcaat aactagcata accccttggg gcctctaaac gggtcttgag 6480

gggttttttg ctgaaaggag gaactatatc cggat 6515

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acccatatga actcacgtct tgcgcttg 28

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

accctcgagt ggtgtagagc aggcggttgg g 31

Claims

1.一种具有耐高温稳定性的人工改造的角蛋白酶，其特征在于，所述角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种分离的或人工合成的核酸，该核酸编码权利要求1所述的角蛋白酶。

3.根据权利要求2所述的核酸，其中，所述核酸是核苷酸序列为SEQ ID NO. 5所示的DNA分子。

4.一种重组载体，其中，所述重组载体插入有权利要求2和3所述的核酸。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其中，所述重组载体是重组表达载体，且所述重组表达载体是核苷酸序列为SEQ ID NO. 9所示的DNA分子。

6.一种转化体，其中，所述转化体的宿主为基因工程菌；所述转化体导入的核酸包括权利要求2所述的核酸，或者，所述转化体中导入的重组载体包括权利要求4所述的重组载体。

7.一种提高角蛋白酶的耐高温稳定性的方法，其中，所述方法包括：对戈壁异常球菌的角蛋白酶进行重组改造，所述重组改造包括：将戈壁异常球菌的角蛋白酶的KerDG1同源结构Asn243-Tyr276片段的同源片段替换为嗜热异常球菌的角蛋白酶的DgeKer功能域Asn240-Tyr274片段；

所述戈壁异常球菌的角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述嗜热异常球菌的角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

8.一种降解羽毛的方法，其中，该方法包括，将羽毛与角蛋白酶接触进行酶解；

所述角蛋白酶为权利要求1所述的角蛋白酶，或者为权利要求7所述的方法得到的角蛋白酶。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述酶解的温度为60-80℃，时间为1-200min。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述酶解的温度为65-75℃，时间为10-120min。