CN113755460B

CN113755460B - 一种用于制备二氢槲皮素的黄酮还原酶

Info

Publication number: CN113755460B
Application number: CN202111060438.5A
Authority: CN
Inventors: 范文超; 刘映淼; 高书良; 施鑫磊
Original assignee: Zhejiang Huarui Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Huarui Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-09-10
Filing date: 2021-09-10
Publication date: 2023-04-14
Anticipated expiration: 2041-09-10
Also published as: CN113755460A

Abstract

本发明公开了一种黄酮还原酶SEQ ID NO:1，其能够催化槲皮素发生还原反应来制备二氢槲皮素，具有研究开发应用潜力。

Description

一种用于制备二氢槲皮素的黄酮还原酶

技术领域

本发明属于酶催化领域，具体地说，涉及一种黄酮还原酶及其在制备二氢槲皮素中的用途。

背景技术

二氢槲皮素是从落叶松、花旗松等松科植物中提取出来的一种天然活性物质，属于生物黄酮类拟维生素P，学名二氢槲皮素，英文名有Dihydroquercetin、Taxifolin等，分子式为C15H12O7，分子量304.25，具有重要的抗酪氨酸酶活性、抗纤维化、抗氧化能力和胶原酶活性抑制能力等。

目前二氢槲皮素主要的制备方法有植物提取法和发酵法，尚未见酶催化方法的报道。2020年，江南大学高松等在《生物工程学报》报道了来源于水飞蓟转录组中鉴定得到一个黄酮3-羟化酶SmF3H(Flavone 3-hydroxylase，F3H)，组合SmF3’H(Flavone 3’-hydroxylase，F3’H)和cytochrome P450 reductases(CPR)，以柚皮素为底物制备二氢槲皮素，在摇瓶中产量达到695.90mg/L；在5-L发酵罐上以柚皮素为底物发酵得到3.54g/L二氢槲皮素。同年，江南大学李广建等在“Journal of Agricultural and Food Chemistry”中报道了以葡萄糖或者柚皮素制备二氢杨梅素，通过多拷贝整合可以获得菌株以2.5g/Lnaringenin为底物可产709.6mg/L二氢杨梅素和670.68mg/L二氢槲皮素，以葡萄糖为底物可产246.4mg/L二氢杨梅素和114.1mg/L二氢槲皮素。

发明内容

2021年，中国科学院分子植物科学卓越创新中心杨高华等在naturecommunication上报道了一种来源于肠道菌的Flavonifractor plautii ATCC 49531的新型黄酮还原酶(flavone reductase，FLR)(NCBI：WP_009257602.1)，在严格厌氧条件下可以还原黄酮或黄酮醇生成二氢黄酮和二氢黄酮醇。受此启发，我们尝试使用该酶用于还原槲皮素来制备二氢槲皮素，但在有氧条件下，未能合成出二氢槲皮素。作为一种尝试方案，我们考虑对此酶进行定向进化，探索在有氧条件下催化槲皮素还原的可能性，并意外地取得了突破，奠定了本发明及后续改进的基础。

因此，本发明的第一个方面提供了一种多肽，所述的多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的多肽：

MKILGISGGMRNGSNDGMCIEALMGAKEMGAEVEFIQLQNLHIEHCTGCTACVQSVLGGRGGKCVLKDDFDWLLDKMLDADGIVFSTPIFKKGATGLFHTITDRFGPRMDRGNNIIGTKIAEETSGTAPDPRILKDKVISFMSVGGSDWVTRTQCDAGMLALTPMWKVIDNEVFPWALSILVEDERVARAHQIGRTIAEAAKDIEHAQYQGDAGVCPHCHSRNFHLQDGKAICCLCGLEGEIHNEGGKYSFTFPAEQLEHAHDTLSGKFIHGNDIKENTGKKIANMQTEKYKARQAAYRAFITATVPEKG(SEQ ID NO:1)；

(b)将SEQ ID NO:1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽，所述功能是指催化槲皮素还原为二氢槲皮素的功能；

(c)与(a)限定的多肽序列有95％以上同源性，优选地98％以上同源性，更优地99％以上同源性，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或

(d)序列中含有(a)或(b)或(c)中所述多肽序列的衍生多肽。

本发明的第二个方面提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸选自：

(A)编码权利要求1所述多肽的多核苷酸；

(B)编码如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

(C)核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸；

(D)核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的同源性≥95％，优选地≥98％，更优地≥99％的多核苷酸；

(E)与(A)-(D)任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

优选地，上述多核苷酸为SEQ ID NO:2。

本发明的另一个方面提供了包含上述多核苷酸的载体、以及转化了所述载体的微生物。

上述微生物可以选自大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、解脂耶氏酵母、枯草杆菌。优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的第四个方面提供了上述多肽、或者上述微生物在制备二氢槲皮素中的用途。

在制备二氢槲皮素时，例如以槲皮素为底物原料，在上述多肽或者微生物催化下通过还原反应来制备二氢槲皮素。

优选地，反应体系中还可以添加有NADH特异性FMN氧化还原酶(CAS:9079-67-8)，用于将FMN还原为FMNH2，为槲皮素提供还原力生成二氢槲皮素。

上述反应体系中还可以添加有NADH和FMN(黄素单核苷酸)作为NADH特异性FMN氧化还原酶底物，生成的FMNH2可作为黄酮还原酶辅酶促进对槲皮素的选择性还原反应。其中NADH用于为FMN还原提供还原力，将FMN还原为FMNH2。

可选地，上述反应体系中还可以添加有DMSO作为槲皮素的助溶剂，以便提高还原反应速度。

本发明公开的多肽SEQ ID NO:1是野生黄酮还原酶(NCBI：WP_009257602.1)的突变体，但是改变了野生酶原有的功能，能够催化槲皮素还原为二氢槲皮素，从而开辟出酶催化法制备二氢槲皮素的新方法。尤其是在有氧条件下也能进行体外催化槲皮素还原，这给二氢槲皮素的合成工艺带来了极大便利，值得进一步深入研究进化。

附图说明

图1是表达野生黄酮还原酶的质粒pET24a-FLR结构图谱，其核苷酸序列为SEQ IDNO:5。

具体实施方式

本发明通过对野生黄酮还原酶(SEQ ID NO:3)进行突变，实现了其催化功能的改变，获得的E91K/G125S/N196T突变体能够将槲皮素作为底物进行还原反应并得到预期的产物二氢槲皮素。

在本文中，术语“野生(型)”、“野生酶”、“野生型酶”表示相同的意义，都是指氨基酸序列为SEQ ID NO:3的来源于肠道菌Flavonifractor plautii ATCC 49531的黄酮还原酶(NCBI：WP_009257602.1)。

MKILGISGGMRNGSNDGMCIEALMGAKEMGAEVEFIQLQNLHIEHCTGCTACVQSVLGGRGGKCVLKDDFDWLLDKMLDADGIVFSTPIFEKGATGLFHTITDRFGPRMDRGNNIIGTKIAEETGGTAPDPRILKDKVISFMSVGGSDWVTRTQCDAGMLALTPMWKVIDNEVFPWALSILVEDERVARAHQIGRNIAEAAKDIEHAQYQGDAGVCPHCHSRNFHLQDGKAICCLCGLEGEIHNEGGKYSFTFPAEQLEHAHDTLSGKFIHGNDIKENTGKKIANMQTEKYKARQAAYRAFITATVPEKG(SEQ ID NO:3)。

为了表述方便起见，在本文中可以将野生型黄酮还原酶SEQ ID NO:3与(简称为FLR)其突变体包括(E91K、G125S、N196T)突变体SEQ ID NO:1统称为“黄酮还原酶”。

应理解，本发明目的在于提供具有催化槲皮素还原为二氢槲皮素的功能的酶，尤其是黄酮还原酶的突变体，但其突变不仅仅限于E91、G125和N196这三个位点氨基酸的突变，更不仅仅限于E91K/G125S和/或N196T突变，该突变体还可以是在野生型黄酮还原酶SEQID NO:3和其突变体SEQ ID NO:1基础上进行其他突变所形成的多肽，只要其具有催化底物槲皮素还原为二氢槲皮素的功能，优选具有更高的催化活性。

氨基酸的突变包括取代、缺失或添加。其中，氨基酸的取代包括保守取代和非保守取代，“保守取代”是指具有相似侧链的残基的可互换性，并因此通常包括用相同或相似的氨基酸定义类别中的氨基酸取代多肽中的氨基酸。例如但不限于，具有脂肪族侧链的氨基酸可以用另一种脂肪族氨基酸例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸取代；具有羟基侧链的氨基酸用另一种具有羟基侧链的氨基酸例如丝氨酸和苏氨酸取代；具有芳香族侧链的氨基酸用另一种具有芳香族侧链的氨基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸取代；具有碱性侧链的氨基酸用另一种具有碱性侧链的氨基酸例如赖氨酸和精氨酸取代；具有酸性侧链的氨基酸用另一种具有酸性侧链的氨基酸例如天冬氨酸或谷氨酸取代；并且疏水性氨基酸或亲水性氨基酸分别用另一种疏水性氨基酸或亲水性氨基酸取代。以下提供了示例性的保守取代：

“非保守取代”是指用具有显著差别的侧链特性的氨基酸取代多肽中的氨基酸。非保守取代可以利用限定组之间而不是它们之内的氨基酸，并且影响：(a)取代区域(例如，脯氨酸取代甘氨酸)中的肽骨架的结构，(b)电荷或疏水性，或(c)侧链体积。例如但不限于，示例性非保守取代可以是用碱性或脂肪族氨基酸取代酸性氨基酸；用小氨基酸取代芳香族氨基酸；和用疏水性氨基酸取代亲水性氨基酸。

为了使该黄酮还原酶SEQ ID NO:1能够大量应用于二氢槲皮素制备，通过微生物表达该多肽是制备该酶的最好方法。

本发明的黄酮还原酶SEQ ID NO:1由于氨基酸序列明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。

上述转化体宿主可以是任何适合表达黄酮还原酶SEQ ID NO:1的微生物，括细菌和真菌。优选微生物选自大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、解脂耶氏酵母、枯草杆菌。更优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

本领域公知，同样一种核苷酸序列，在不同的微生物宿主中的表达结果往往有很大差异。为了在基因工程中最常用的大肠杆菌中最佳地表达黄酮还原酶或其突变体，可以对这些酶的表达基因进行了密码子优化。

密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以用用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。

为了在大肠杆菌中表达黄酮还原酶，经密码子优化的野生黄酮还原酶SEQ ID NO:3的编码基因可以是SEQ ID NO:4；黄酮还原酶突变体SEQ ID NO:1的编码基因可以是SEQID NO:2。

当作为生物催化剂用于催化槲皮素还原生成二氢槲皮素时，本发明的黄酮还原酶SEQ ID NO:1可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体。

本发明的黄酮还原酶SEQ ID NO:1的分离纯化、包括固定化酶制备技术也是本领域技术人员所熟知的。

还需说明的是，黄酮还原酶SEQ ID NO:1依然具有催化类似槲皮素C2＝C3双键还原为饱和的单键、从而用于制备与二氢槲皮素分子结构类似的其他二氢黄酮类物质的可能性。这是发明人下一步要进行的研究课题之一。

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

本文的实施例中，如果对于反应温度或操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温(15-30℃)。

实施例

材料和方法

实施例中全基因合成、引物合成及测序皆委托苏州金唯智生物技术有限公司完成。

实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，pH7.2。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K₂HPO₄.3H₂O、2.31g/LKH₂PO₄、5g/L甘油，pH7.0-7.5。(TB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

以下实施例中，使用含卡那霉素(kan)培养基时，所述抗生素在培养基中的终浓度为50μg/ml。

二氢槲皮素的HPLC测定条件：

实施例1：野生黄酮还原酶表达菌株的构建

根据野生黄酮还原酶(FLR)的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，进行大肠杆菌偏好性的密码子优化，得到其编码基因序列SEQ ID NO:4，进行全基因合成，并在基因两端设计限制性内切酶位点Nde I和XhoI，亚克隆到载体pET24a(Novagen)的相应位点，获得重组质粒pET24a-FLR，其结构如图1所示。将重组质粒pET24a-FLR转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达野生黄酮还原酶的重组大肠杆菌BL21(DE3)/FLR。

根据在后所述的菌体催化槲皮素还原试验，发现重组大肠杆菌BL21(DE3)/FLR进行催化，未能检测出二氢槲皮素生成。

为了进一步尝试槲皮素发生还原反应可能性，对野生黄酮还原酶进行突变试验。

实施例2：易错PCR法构建FLR随机突变体库

以pET24a-FLR为模板，设计引物对FLP-EP-F/FLP-EP-R，进行error prone PCR。

正向引物FLP-EP-F：aattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgaaaattttgggtatttccggcg，

反向引物FLP-EP-R：ctttcgggctttgttagcagccggatcctcgagtcagcccttctcgggcacggtgg。

50μL易错PCR反应体系包括：50ng pET24a-FLR质粒模板，30pmol FLP-EP-F和FLP-EP-R引物对，1×Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mM MgCl2，(0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM)MnCl2，2.5个单位的Taq酶(fermentas)。

PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min/kbp；30个循环；72℃10min。

PCR扩增产物用限制性内切酶DpnI 1μl 50℃消化1小时，胶回收0.95kb突变片段，与NdeI和XhoI双酶切pET24a线性化载体进行同源重组，然后用氯化钙法转化入大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)感受态细胞中，得到超过10⁴个克隆的随机突变库。

实施例3：FLR突变体库的高通量筛选

选取突变体库中的转化子，分别接种到含700μL LB培养基的96孔深孔培养板中，培养基中含50μg/mL卡纳霉素，37℃培养2.5-3h后，加入终浓度0.1mM IPTG，降温至25℃，培养过夜。5000rpm离心10min，弃上清，置于-70℃冷冻1h，室温融化30min。加入200μL含0.1MTris-HCl(pH7.0)缓冲液，重悬菌体，用于催化还原反应测定。

将上述悬浮菌体加入终浓度为100μg/ml溶菌酶30℃处理30min，然后加入5％DMSO，0.8mM FMN，8mM NADH，0.1mM槲皮素，5μM NADH特异性FMN氧化还原酶(CAS:9079-67-8)，37℃反应6h，取样进行HPLC检测。

实施例4：正向进化酶的获得

通过对突变体库中5000多个菌株进行筛选考察，终于发现其中一个菌体的催化反应液中产生了二氢槲皮素。对此突变体进行活化培养，抽提质粒(Axygen AP-MN-P-50质粒小量提取试剂盒)，送苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，通过与野生酶FLR基因进行序列对比，确认FLR基因发生三个氨基酸突变E91K/G125S/N196T，该突变体编码基因为SEQID NO:2，对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

对于该突变酶SEQ ID NO:1，将会进一步进行酶3D结构和酶活力提高研究。

序列表

<110> 浙江华睿生物技术有限公司

<120> 一种用于制备二氢槲皮素的黄酮还原酶

<130> SHPI2110307

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 310

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Met Lys Ile Leu Gly Ile Ser Gly Gly Met Arg Asn Gly Ser Asn Asp

1 5 10 15

Gly Met Cys Ile Glu Ala Leu Met Gly Ala Lys Glu Met Gly Ala Glu

20 25 30

Val Glu Phe Ile Gln Leu Gln Asn Leu His Ile Glu His Cys Thr Gly

35 40 45

Cys Thr Ala Cys Val Gln Ser Val Leu Gly Gly Arg Gly Gly Lys Cys

50 55 60

Val Leu Lys Asp Asp Phe Asp Trp Leu Leu Asp Lys Met Leu Asp Ala

65 70 75 80

Asp Gly Ile Val Phe Ser Thr Pro Ile Phe Lys Lys Gly Ala Thr Gly

85 90 95

Leu Phe His Thr Ile Thr Asp Arg Phe Gly Pro Arg Met Asp Arg Gly

100 105 110

Asn Asn Ile Ile Gly Thr Lys Ile Ala Glu Glu Thr Ser Gly Thr Ala

115 120 125

Pro Asp Pro Arg Ile Leu Lys Asp Lys Val Ile Ser Phe Met Ser Val

130 135 140

Gly Gly Ser Asp Trp Val Thr Arg Thr Gln Cys Asp Ala Gly Met Leu

145 150 155 160

Ala Leu Thr Pro Met Trp Lys Val Ile Asp Asn Glu Val Phe Pro Trp

165 170 175

Ala Leu Ser Ile Leu Val Glu Asp Glu Arg Val Ala Arg Ala His Gln

180 185 190

Ile Gly Arg Thr Ile Ala Glu Ala Ala Lys Asp Ile Glu His Ala Gln

195 200 205

Tyr Gln Gly Asp Ala Gly Val Cys Pro His Cys His Ser Arg Asn Phe

210 215 220

His Leu Gln Asp Gly Lys Ala Ile Cys Cys Leu Cys Gly Leu Glu Gly

225 230 235 240

Glu Ile His Asn Glu Gly Gly Lys Tyr Ser Phe Thr Phe Pro Ala Glu

245 250 255

Gln Leu Glu His Ala His Asp Thr Leu Ser Gly Lys Phe Ile His Gly

260 265 270

Asn Asp Ile Lys Glu Asn Thr Gly Lys Lys Ile Ala Asn Met Gln Thr

275 280 285

Glu Lys Tyr Lys Ala Arg Gln Ala Ala Tyr Arg Ala Phe Ile Thr Ala

290 295 300

Thr Val Pro Glu Lys Gly

305 310

<210> 2

<211> 933

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

atgaaaattt tgggtatttc cggcggtatg cgcaacggca gcaacgacgg tatgtgcatc 60

gaggccctga tgggggccaa ggagatgggc gccgaggtgg agttcatcca gctgcagaac 120

ctgcacatcg agcactgcac cggctgcacc gcctgcgtgc agagcgtgct gggcggccgc 180

ggcggcaagt gcgtgctgaa ggacgacttt gactggctgc tggacaagat gctggacgcc 240

gacggcattg tcttctccac ccccatcttt aagaagggcg ccaccggcct cttccacacg 300

attaccgacc gctttggccc ccgcatggac cgcggcaaca acatcatcgg caccaagatc 360

gccgaggaga ccagcggcac cgcccccgat ccccgcatcc tgaaggacaa ggtcatctcc 420

ttcatgtccg tgggcggctc cgactgggtg acccgcaccc agtgcgacgc cggcatgctg 480

gccctgaccc ccatgtggaa ggtcattgac aacgaggtgt tcccttgggc gctgtccatc 540

ctggtggagg acgagcgggt ggcccgcgcc caccagatcg gccgcaccat cgccgaggcc 600

gccaaggaca tcgagcacgc ccagtaccag ggcgacgccg gcgtgtgccc ccactgccac 660

agccgcaact tccacctgca ggacggcaag gccatctgct gcctgtgcgg cctggagggc 720

gagatccaca acgagggcgg caagtactcc ttcaccttcc ccgccgagca gctggagcac 780

gcccacgaca ccctgtccgg caagttcatc cacggcaacg acatcaagga gaataccggc 840

aagaagatcg ccaacatgca gaccgagaag tacaaggccc gccaggccgc gtaccgcgcc 900

tttatcaccg ccaccgtgcc cgagaagggc tga 933

<210> 3

<211> 310

<212> PRT

<213> Flavonifractor plautii ATCC 49531

<400> 3

Met Lys Ile Leu Gly Ile Ser Gly Gly Met Arg Asn Gly Ser Asn Asp

1 5 10 15

Gly Met Cys Ile Glu Ala Leu Met Gly Ala Lys Glu Met Gly Ala Glu

20 25 30

Val Glu Phe Ile Gln Leu Gln Asn Leu His Ile Glu His Cys Thr Gly

35 40 45

Cys Thr Ala Cys Val Gln Ser Val Leu Gly Gly Arg Gly Gly Lys Cys

50 55 60

Val Leu Lys Asp Asp Phe Asp Trp Leu Leu Asp Lys Met Leu Asp Ala

65 70 75 80

Asp Gly Ile Val Phe Ser Thr Pro Ile Phe Glu Lys Gly Ala Thr Gly

85 90 95

Leu Phe His Thr Ile Thr Asp Arg Phe Gly Pro Arg Met Asp Arg Gly

100 105 110

Asn Asn Ile Ile Gly Thr Lys Ile Ala Glu Glu Thr Gly Gly Thr Ala

115 120 125

Pro Asp Pro Arg Ile Leu Lys Asp Lys Val Ile Ser Phe Met Ser Val

130 135 140

Gly Gly Ser Asp Trp Val Thr Arg Thr Gln Cys Asp Ala Gly Met Leu

145 150 155 160

Ala Leu Thr Pro Met Trp Lys Val Ile Asp Asn Glu Val Phe Pro Trp

165 170 175

Ala Leu Ser Ile Leu Val Glu Asp Glu Arg Val Ala Arg Ala His Gln

180 185 190

Ile Gly Arg Asn Ile Ala Glu Ala Ala Lys Asp Ile Glu His Ala Gln

195 200 205

Tyr Gln Gly Asp Ala Gly Val Cys Pro His Cys His Ser Arg Asn Phe

210 215 220

His Leu Gln Asp Gly Lys Ala Ile Cys Cys Leu Cys Gly Leu Glu Gly

225 230 235 240

Glu Ile His Asn Glu Gly Gly Lys Tyr Ser Phe Thr Phe Pro Ala Glu

245 250 255

Gln Leu Glu His Ala His Asp Thr Leu Ser Gly Lys Phe Ile His Gly

260 265 270

Asn Asp Ile Lys Glu Asn Thr Gly Lys Lys Ile Ala Asn Met Gln Thr

275 280 285

Glu Lys Tyr Lys Ala Arg Gln Ala Ala Tyr Arg Ala Phe Ile Thr Ala

290 295 300

Thr Val Pro Glu Lys Gly

305 310

<210> 4

<211> 933

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

atgaaaattt tgggtatttc cggcggtatg cgcaacggca gcaacgacgg tatgtgcatc 60

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ctgcacatcg agcactgcac cggctgcacc gcctgcgtgc agagcgtgct gggcggccgc 180

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gacggcattg tcttctccac ccccatcttt gagaagggcg ccaccggcct cttccacacg 300

attaccgacc gctttggccc ccgcatggac cgcggcaaca acatcatcgg caccaagatc 360

gccgaggaga ccggcggcac cgcccccgat ccccgcatcc tgaaggacaa ggtcatctcc 420

ttcatgtccg tgggcggctc cgactgggtg acccgcaccc agtgcgacgc cggcatgctg 480

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ctggtggagg acgagcgggt ggcccgcgcc caccagatcg gccgcaacat cgccgaggcc 600

gccaaggaca tcgagcacgc ccagtaccag ggcgacgccg gcgtgtgccc ccactgccac 660

agccgcaact tccacctgca ggacggcaag gccatctgct gcctgtgcgg cctggagggc 720

gagatccaca acgagggcgg caagtactcc ttcaccttcc ccgccgagca gctggagcac 780

gcccacgaca ccctgtccgg caagttcatc cacggcaacg acatcaagga gaataccggc 840

aagaagatcg ccaacatgca gaccgagaag tacaaggccc gccaggccgc gtaccgcgcc 900

tttatcaccg ccaccgtgcc cgagaagggc tga 933

<210> 5

<211> 6152

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatcta agcttcgatc 4980

ccgcgaaatt aatacgactc actatagggg aattgtgagc ggataacaat tcccctctag 5040

aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga tatacatatg aaaattttgg gtatttccgg 5100

cggtatgcgc aacggcagca acgacggtat gtgcatcgag gccctgatgg gggccaagga 5160

gatgggcgcc gaggtggagt tcatccagct gcagaacctg cacatcgagc actgcaccgg 5220

ctgcaccgcc tgcgtgcaga gcgtgctggg cggccgcggc ggcaagtgcg tgctgaagga 5280

cgactttgac tggctgctgg acaagatgct ggacgccgac ggcattgtct tctccacccc 5340

catctttgag aagggcgcca ccggcctctt ccacacgatt accgaccgct ttggcccccg 5400

catggaccgc ggcaacaaca tcatcggcac caagatcgcc gaggagaccg gcggcaccgc 5460

ccccgatccc cgcatcctga aggacaaggt catctccttc atgtccgtgg gcggctccga 5520

ctgggtgacc cgcacccagt gcgacgccgg catgctggcc ctgaccccca tgtggaaggt 5580

cattgacaac gaggtgttcc cttgggcgct gtccatcctg gtggaggacg agcgggtggc 5640

ccgcgcccac cagatcggcc gcaacatcgc cgaggccgcc aaggacatcg agcacgccca 5700

gtaccagggc gacgccggcg tgtgccccca ctgccacagc cgcaacttcc acctgcagga 5760

cggcaaggcc atctgctgcc tgtgcggcct ggagggcgag atccacaacg agggcggcaa 5820

gtactccttc accttccccg ccgagcagct ggagcacgcc cacgacaccc tgtccggcaa 5880

gttcatccac ggcaacgaca tcaaggagaa taccggcaag aagatcgcca acatgcagac 5940

cgagaagtac aaggcccgcc aggccgcgta ccgcgccttt atcaccgcca ccgtgcccga 6000

gaagggctga ctcgaggatc cggctgctaa caaagcccga aaggaagctg agttggctgc 6060

tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg 6120

ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg at 6152

Claims

1.一种多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.一种多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.包含如权利要求2所述多核苷酸的载体。

4.转化了如权利要求3所述载体的微生物。

5.如权利要求4所述的微生物，其特征在于，为大肠杆菌BL21(DE3)。

6.如权利要求1所述多肽或者如权利要求5所述微生物在制备二氢槲皮素中的用途。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，以槲皮素为底物原料，在如权利要求1所述多肽或者如权利要求5所述微生物催化下通过还原反应来制备二氢槲皮素。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，反应体系中添加有NADH特异性FMN氧化还原酶。

9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，反应体系中还添加作为NADH特异性FMN氧化还原酶底物的NADH和FMN。