CN114774452B - 一种用于吸附溶液汞离子的工程大肠杆菌构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于吸附溶液汞离子的工程大肠杆菌的构建方法及应用；通过将汞结合蛋白MerR在大肠杆菌表面展示的方式构建胞外汞吸附菌株M1；在此基础上通过基因编辑技术构建胞内汞吸附菌株M2；并通过对M1的汞结合蛋白基因MerR进行大肠杆菌密码子优化对汞吸附菌株进行优化得到M’1，对M2的汞结合蛋白基因MerR进行大肠杆菌密码子优化对汞吸附菌株进行优化得到M’2。以大肠杆菌BL21为宿主构建了重金属修复目标菌株，实现对污染环境水的重金属生物修复。本发明的吸附菌株培养简单，易于获得，无二次污染，可以实现特定金属的特异性吸附，将成为重金属修复领域的研究热点，本发明也为未来重金属修复提供了新思路。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及一种用于吸附溶液汞离子的工程大肠杆菌构建方法及应用，和两种提高工程菌性能的优化方法。
背景技术
如今世界经济的快速发展，使工业化进程推进过程中的排污问题越来越严重，也使重金属污染问题越来越受到全球关注。重金属汞是一种系统性毒物，通过被污染的食物或水接触到人，即使在较低的摄入量下也能对人体的多个器官造成损害并导致癌症。利用传统的物理化学方法治理重金属污染过程虽取得一定成效，但对设备的要求极高，造成的修复成本也高，且修复工艺复杂，还要求投入大量的人力和物力，对重金属的选择缺乏特异性。而微生物吸附技术是近些年来发展应用的一种绿色、便捷、低成本的重金属离子吸附策略，兼具去除效率高、价格低廉、操纵简单、吸附效率高、对环境影响作用小等优势。近年来，表面展示技术的出现提供了微生物胞外吸附策略，在重金属吸附与去除领域得到广泛应用。
细菌等天然微生物已经进化出操作子一类的抵抗机制，以应对环境中重金属离子的存在。操作子通过编码参与感知、运输和解毒这些毒物的蛋白质来赋予细菌对重金属的抗性。操作子编码的转录因子属于重金属结合蛋白(HMBP)，能够通过构象变化与重金属离子协调和结合功能团。mer操作子广泛分布在细菌中，具有复杂的组成，而且，操纵子内的全部相关基因(merTRPABC)的表达均受到一种汞离子结合蛋白MerR的调控。但天然微生物的结构并不适应对污染废水的吸附，即使它们能够进行一些吸附，也需要进一步改造，如过量表达重金属结合蛋白，才能发挥微生物吸附的潜力。基因工程技术的发展，使有目的地改造菌种成为一种达到定向目标的手段。大肠杆菌(Escherichia coli)作为典型的的实验室模式菌株，代谢途径清楚，无内生质粒，可用作基因工程改造的优良底盘细胞，构建工程化菌株，作为微生物细胞吸附剂用于重金属汞的去除。
发明内容
为实现对污水中汞离子的高容量吸附和特异性选择性能，本发明提供了一种用于吸附溶液汞离子的工程大肠杆菌构建方法。
本发明通过将汞结合蛋白MerR在大肠杆菌表面展示的方式构建胞外汞吸附菌株M1。在此基础上通过基因编辑技术构建胞内汞吸附菌株M2，并通过对汞结合蛋白基因MerR进行大肠杆菌密码子优化对汞吸附菌株进行优化得到M’1、M’2。
本发明是以质粒pET28a为载体，利用汞结合蛋白MerR、密码子优化汞结合蛋白Meropt、表面展示锚定蛋白INPN以及柔性连接肽FL，得到汞吸附菌株。
本发明所用的宿主菌为大肠杆菌E.coliBL21，通过对吸附菌株的吸附能力进行检测，评价其吸附性能。
以大肠杆菌BL21为宿主构建了重金属修复目标菌株，实现对污染环境水的重金属生物修复。本发明的吸附菌株培养简单，易于获得，无二次污染，可以实现特定金属的特异性吸附，将成为重金属修复领域的研究热点，本发明也为未来重金属修复提供了新思路。
本发明的技术方案如下：
用于吸附溶液汞离子的工程大肠杆菌构建方法；通过将汞结合蛋白MerR在大肠杆菌表面展示的方式构建胞外汞吸附菌株M1，核苷酸序列如SEQ ID No.4；在此基础上通过基因编辑技术构建胞内汞吸附菌株M2，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；并通过对M1的汞结合蛋白基因MerR进行大肠杆菌密码子优化对汞吸附菌株进行优化得到M’1；对M2的汞结合蛋白基因MerR进行大肠杆菌密码子优化对汞吸附菌株进行优化得到M’2；M’1核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；M’2核苷酸序列如SEQ ID No 8所示。
用于吸附溶液汞离子的工程大肠杆菌构建方法；包括如下步骤：
(1)通过PCR扩增编码锚定蛋白INPN的核苷酸序列，在其上下端分别引入HindIII和NotI酶切位点，并在扩增时去除锚定蛋白INPN末端的终止密码子，引入柔性连接肽FL(GGGGS)，得到INPN-FL核苷酸序列；
(2)通过PCR扩增编码汞结合蛋白MerR的核苷酸序列，在其上游引入EcoRI和NotI酶切位点，下游引入XhoI酶切位点；
(3)以酶切连接的方式将INPN-FL和MerR通过NotI酶切位点连接，得到得到MerR融合模块INPN-FL-MerR，并插入到pET28a质粒HindIII和XhoI酶切位点之间，得到质粒M1；
(4)以EcoRI、XhoI双酶切的方式将质粒M1中的INPN-FL-MerR切下，并将MerR插入到EcoRI和XhoI酶切位点之间，得到质粒M2；
(5)以大肠杆菌E.coli BL21为宿主，将重组质粒转入宿主，通过菌落PCR筛选带有目的筛选质粒的阳性克隆菌株，即为汞结合蛋白吸附菌株。
所述步骤(1)中INPN-FL的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述步骤(2)中MerR的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，pET28a质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
本发明的用于吸附溶液汞离子的工程大肠杆菌构建方法；包括如下步骤：
(1)通过PCR扩增编码汞结合蛋白MerRopt的核苷酸序列，在其上游引入EcoRI和NotI酶切位点，下游引入XhoI酶切位点；
(2)以NotI、XhoI双酶切的方式将质粒M1中的MerR切下，替换为大肠杆菌密码子优化的汞结合蛋白MerRopt，得到质粒M’1；以NotI、XhoI双酶切的方式将质粒M2中的MerR切下，替换为大肠杆菌密码子优化的汞结合蛋白MerRopt，得到质M’2；
(3)以大肠杆菌E.coli BL21为宿主，将重组质粒转入宿主，通过菌落PCR筛选带有目的筛选质粒的阳性克隆菌株，即为特异性汞结合蛋白吸附优化菌株。
所述步骤(1)中MerRopt的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
具体说明如下：
1.汞结合蛋白吸附菌株的构建：
(1)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增编码锚定蛋白INPN的核苷酸序列，在其上下端分别引入HindIII和NotI酶切位点，并在扩增时去除锚定蛋白INPN末端的终止密码子，引入柔性连接肽FL(GGGGS)，得到INPN-FL核苷酸序列；
(2)通过PCR扩增编码汞结合蛋白MerR的核苷酸序列，在其上游引入EcoRI和NotI酶切位点，下游引入XhoI酶切位点；
(3)以酶切连接的方式将INPN-FL和MerR通过NotI酶切位点连接，得到得到MerR融合模块INPN-FL-MerR，并插入到pET28a质粒HindIII和XhoI酶切位点之间，得到质粒M1；
(4)以EcoRI、XhoI双酶切的方式将质粒M1中的INPN-FL-MerR切下，并将MerR插入到EcoRI和XhoI酶切位点之间，得到质粒M2；
(5)以大肠杆菌E.coli BL21为宿主，将重组质粒转入宿主，通过菌落PCR筛选带有目的筛选质粒的阳性克隆菌株，即为汞结合蛋白吸附菌株。
所述步骤(1)中INPN-FL的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述步骤(2)中MerR的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，pET28a质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。重组质粒M1的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，含有该质粒的工程化菌株即为汞结合蛋白吸附菌株BL21(M1)；重组质粒M2的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，含有该质粒的工程化菌株即为汞结合蛋白吸附菌株BL21(M2)。所有重组质粒图谱如图2所示。
2.本发明还提供了所述汞结合蛋白吸附菌株的优化方法，所述优化方法如下：
(1)通过PCR扩增编码汞结合蛋白MerRopt的核苷酸序列，在其上游引入EcoRI和NotI酶切位点，下游引入XhoI酶切位点；
(2)以NotI、XhoI双酶切的方式将质粒M1中的MerR切下，替换为大肠杆菌密码子优化的汞结合蛋白MerRopt，得到质粒M’1；
(3)以NotI、XhoI双酶切的方式将质粒M2中的MerR切下，替换为大肠杆菌密码子优化的汞结合蛋白MerRopt，得到质粒M’2；
(4)以大肠杆菌E.coli BL21为宿主，将重组质粒转入宿主，通过菌落PCR筛选带有目的筛选质粒的阳性克隆菌株，即为特异性汞结合蛋白吸附优化菌株。
所述步骤(1)中MerRopt的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。重组质粒M’2，核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，含有该质粒的工程化菌株即为汞结合蛋白吸附菌株BL21(M’2)；重组质粒M’1，核苷酸序列如SEQ ID No 8所示，含有该质粒的工程化菌株即为汞结合蛋白吸附菌株BL21(M’1)。所有重组质粒图谱如图2所示。
本发明还提供了所述汞结合蛋白吸附菌株在含汞环境中的应用，所述应用方法如下：
(1)底盘细胞的活化：挑取汞结合蛋白吸附菌株单一菌落，接种至5mL含Kan抗性的LB摇管中，37℃220rpm培养过夜；
(2)转接：测量过夜培养菌液的吸光度，并利用LB培养基稀释至OD600为1，取100μL菌液接种至250mL摇瓶中，摇瓶含100mL无抗性的培养基，37℃220rpm培养至OD600为0.6-0.8；
(3)加IPTG和重金属离子培养：向摇瓶中加入IPTG至终浓度为1.0mM，同时向各个摇瓶中分别添加终浓度为50、100、300、500、1000和1500μM的Hg2+，于26℃220rpm培养22h；
(4)菌体的收集：菌液培养后，将菌液置于50mL离心管中，6000rpm离心5min，将收集到的菌体用蒸馏水洗涤三次，然后将菌体置于60℃烘箱中24h，充分烘干菌体后对菌体干重进行称量(CDW)；
(5)金属含量测定：用微波消解硝化细菌，去除杂质后利用原子吸收光谱法或电感耦合等离子体质谱法对金属含量进行测定；
(6)菌体吸附能力评价：吸附能力(μmol/g CDW)＝金属总含量(μmol)/菌体干重(g)
本发明中用于菌株培养的LB培养基成分为(以1L的培养基计)：10g NaCl、10g胰蛋白胨和5g酵母粉，全部溶解后调节培养基pH至7.2～7.4。并在121℃条件下高压蒸汽灭菌20min。
本发明的优点表现为：利用汞结合蛋白MerR对汞离子的高选择性专一吸附，通过基因重组技术设计构建了M1、M2、M’1、M’2共4种汞结合蛋白吸附菌株。并通过细胞表面展示技术，即通过INPN将汞结合蛋白展示在大肠杆菌细胞表面，以及大肠杆菌密码子优化对设计的汞结合蛋白吸附菌株进行了优化。不仅具有极高的汞离子吸附性能，还能够在众多金属混合溶液中实现对汞离子的特异性选择，通过菌体去除即可实现溶液中重金属汞的去除，对重金属污染环境的原位修复具有重要意义。
附图说明
图1为M1、M’1、M2及M’2模块构建流程；
图2为重组质粒M1、M’1、M2及M’2图谱；
图3为工程菌在不同浓度的单一汞离子溶液中的吸附效果；
图4为工程菌在不同浓度的混合重金属溶液中的吸附效果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：
本发明的实施例中涉及的质粒提取、PCR产物纯化、琼脂糖凝胶回收等操作均按照博迈德生物技术有限公司提供的对应试剂盒进行；所有使用的限制性内切酶和T4 DNA连接酶均购自Thermo Fisher公司。
实施例1汞结合蛋白吸附菌株的构建
(1)PCR扩增基因片段：设计扩增片段的特异性引物，利用高保真聚合酶分别扩增得到SEQ ID No.1所示的INPN-FL(引物N-F和N-R)、SEQ ID No.2所示的汞结合蛋白元件MerR(引物2-F和2-R)、，并在MerR上游引入EcoRI和NotI酶切位点，下游引入XhoI酶切位点，在INPN-FL的上下游分别引入HindIII和NotI酶切位点；
目的片段扩增用到的引物序列如下所示，其中标有下划线的部分为酶切位点：
N-F：CCCAAGCTTATGACTCTCGACAAGGCGTTGGTGCTGCGTAC
N-R：ATTTGCGGCCGCGGAACCACCACCACCG
2-F：CCGGAATTCGCGGCCGCATGGAAAACAATTTGGAGAACCTGAC
2-R：CCGCTCGAGCTAAGGCATAGCCGAACCTGCCAAGC
序列扩增的PCR体系为50μL，包括ddH20 18μL，2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTPMix1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶1μL，上游引物及下游引物各2μL、模板1μL；
序列扩增的PCR条件为95℃预变性30s，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，进行35个循环以后在72℃彻底延伸10min结束。
(2)人工质粒的构建：以上PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证后，得到INPN-FL(552bp)和MerR(435bp)对应的凝胶条带，按照凝胶回收试剂盒说明对目的条带进行回收。之后将上述凝胶回收后的基因片段用NotI进行酶切。将INPN-FL和MerR按照1：1的比例配制T4连接酶连接体系进行连接。连接反应程序为：22℃，30min；70℃，5min。将所得DNA产物再次跑胶并回收融合基因片段，得到MerR融合模块INPN-FL-MerR。
将质粒pET-28a(+)与纯化回收后的INPN-FL-MerR片段通过限制性内切酶HindIII和XhoI进行酶切，经PCR产物纯化回收后的线性质粒与目的基因按照1：5的比例配制T4连接酶连接体系进行连接，得到质粒M1，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
将质粒M1与纯化回收后的MerR片段通过限制性内切酶EcoRI和XhoI进行酶切，经PCR产物纯化回收并验证正确的线性质粒与目的基因按照1：5的比例配制T4连接酶连接体系进行连接，得到质粒M2，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
将质粒M1和M2转化至感受态细胞E.coli BL21(DE3)，通过菌落PCR筛选阳性克隆，提取重组质粒送至北京金唯智生物科技有限公司进行测序。得到无任何突变发生的汞结合蛋白重组质粒表达载体(图2)，包括含有汞结合蛋白元件MerR和INPN-FL的重组质粒M1，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，和只含有汞结合蛋白元件MerR的重组质粒M2，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。得到的阳性克隆菌株即为汞结合蛋白吸附菌株BL21(M1)和BL21(M2)。
实施例2汞结合蛋白吸附优化菌株的构建
(1)PCR扩增基因片段：设计扩增片段的特异性引物，利用高保真聚合酶扩增得到SEQ ID No.6所示的大肠杆菌密码子优化的汞结合蛋白元件MerRopt(引物2’-F和2’-R)，并在MerRopt编码基因的上游引入EcoRI和NotI酶切位点，下游引入XhoI酶切位点。
目的片段扩增用到的引物序列如下所示，其中标有下划线的部分为酶切位点：
2’-F：CCGGAATTC ATGGAAAATAACCTGGAAAACCTGA；
2’-R：CCGCTCGAGTTACGGCATAGCAGAACCAGCCAGTGAAG；
序列扩增的PCR体系为50μL，包括ddH20 18μL，2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTPMix 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶1μL，上游引物及下游引物各2μL、模板1μL；
序列扩增的PCR条件为95℃预变性30s，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，进行35个循环以后在72℃彻底延伸10min结束。
(2)人工质粒的构建：以上PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证后，MerRopt(435bp)对应的凝胶条带，按照凝胶回收试剂盒说明对目的条带进行回收。将质粒M1、M2与纯化回收后的MerRopt片段通过限制性内切酶EcoRI和XhoI进行酶切，经PCR产物纯化回收并验证正确的线性质粒与目的基因按照1：5的比例配制T4连接酶连接体系进行连接。线性质粒M1与MerRopt连接得到质粒M’1，核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。线性质粒M2与MerRopt连接得到质粒M’2，核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
将连接产物转化至感受态细胞E.coli BL21(DE3)，通过菌落PCR筛选阳性克隆，提取重组质粒送至北京金唯智生物科技有限公司进行测序。得到无任何突变发生的汞结合蛋白重组质粒表达载体(图2)，包括含有汞结合蛋白元件MerRopt和INPN-FL的重组质粒M’1，核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，和只含有汞结合蛋白元件MerRopt的重组质粒M’2，核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。得到的阳性克隆菌株即为汞结合蛋白吸附菌株BL21(M’1)和BL21(M’2)。
实施例3汞结合蛋白吸附菌株(M’1)对汞离子的吸附
(1)底盘细胞的活化：挑取汞结合蛋白吸附菌株BL21(M’1)单一菌落，接种至5mL含Kan抗性的LB摇管中，37℃220rpm培养过夜；
(2)转接：测量过夜培养菌液的吸光度，并利用LB培养基稀释至OD600为1，取100μL菌液接种至250mL摇瓶中，摇瓶含100mL无抗性的培养基，37℃220rpm培养至OD600为0.6-0.8；
(3)加IPTG和重金属离子培养：向摇瓶中加入IPTG至终浓度为1.0mM，同时向各个摇瓶中分别添加终浓度为50、100、300、500、1000和1500μM的Hg2+，于26℃220rpm培养22h；
(4)菌体的收集：菌液培养后，将菌液置于50mL离心管中，6000rpm离心5min，将收集到的菌体用蒸馏水洗涤三次，然后将菌体置于60℃烘箱中24h，充分烘干菌体后对菌体干重进行称量(CDW)；
(5)金属含量测定：用微波消解硝化细菌，去除杂质后利用原子吸收光谱法或电感耦合等离子体质谱法对金属含量进行测定；
(6)菌体吸附能力评价：吸附能力(μmol/g CDW)＝金属总含量(μmol)/菌体干重(g)
实施例4汞结合蛋白吸附菌株(M’2)对汞离子的吸附
(1)底盘细胞的活化：挑取汞结合蛋白吸附菌株BL21(M’2)单一菌落，接种至5mL含Kan抗性的LB摇管中，37℃220rpm培养过夜；
(2)转接：同实施例3(2)；
(3)加IPTG和重金属离子培养：同实施例3(3)；
(4)菌体的收集：同实施例3(4)；
(5)金属含量测定：同实施例3(5)；
(6)菌体吸附能力评价：吸附能力(μmol/g CDW)＝金属总含量(μmol)/菌体干重(g)
实施例3和4的吸附结果如附图3所示，重组菌株对汞离子的吸附能力均优于野生型出发菌株BL21。当汞离子浓度不高时，菌株的吸附能力与汞浓度的增加趋势相同。但过高的重金属浓度会抑制细菌的生长和蛋白质表达，从而使菌株吸附汞离子能力显著降低。当培养基中的Hg2+浓度为300μM时，菌株BL21(M’1)达到最大汞离子吸附量为581.59μmol/gCDW，是野生型菌株BL21吸附量的3.5倍，BL21(M’2)的最大吸附值为537.14μmol/g CDW，达到对照组的3.2倍。证明本研究构建的汞结合蛋白吸附菌株对汞离子具有显著的吸附效果，并且表面展示优化策略能够有效提高菌株吸附性能。
实施例5汞结合蛋白吸附菌株(M’1)对汞离子的选择特异性吸附
(1)底盘细胞的活化：挑取汞结合蛋白吸附菌株BL21(M’1)单一菌落，接种至5mL含Kan抗性的LB摇管中，37℃220rpm培养过夜；
(2)转接：测量过夜培养菌液的吸光度，并利用LB培养基稀释至OD600为1，取100μL菌液接种至250mL摇瓶中，摇瓶含100mL无抗性的培养基，37℃220rpm培养至OD600为0.6-0.8；
(3)目标菌株在混合金属溶液中的吸附能力：添加IPTG至终浓度为1.0mM，同时向各个摇瓶中分别添加终浓度为160μM，400μM和800μM的混合金属溶液，包含Cd2+，Cr6+，As3+和Hg2+，于26℃220rpm的恒温摇床中培养22h；
(4)菌体的收集：菌液培养后，将菌液置于50mL离心管中，6000rpm离心5min，将收集到的菌体用蒸馏水洗涤三次，然后将菌体置于60℃烘箱中24h，充分烘干菌体后对菌体干重进行称量(CDW)；
(5)金属含量测定：用微波消解硝化细菌，去除杂质后利用原子吸收光谱法或电感耦合等离子体质谱法对金属含量进行测定；
(6)菌体吸附能力评价：吸附能力(μmol/g CDW)＝金属总含量(μmol)/菌体干重(g)
实施例6汞结合蛋白吸附菌株(M’2)对汞离子的选择特异性吸附
(1)底盘细胞的活化：挑取汞结合蛋白吸附菌株BL21(M’2)单一菌落，接种至5mL含Kan抗性的LB摇管中，37℃220rpm培养过夜；
(2)转接：同实施例5(2)；
(3)目标菌株在混合金属溶液中的吸附能力：同实施例5(3)；
(4)菌体的收集：同实施例5(4)；
(5)金属含量测定：同实施例5(5)；
(6)菌体吸附能力评价：吸附能力(μmol/g CDW)＝金属总含量(μmol)/菌体干重(g)
实施例5和6的吸附结果如附图4所示，在不同浓度的混合金属离子共存的溶液中，都只有显著量的Hg2+被工程菌所吸附，而其他金属离子的存在不影响三种靶蛋白表面展示工程菌对汞的吸附能力，这表明本研究构建的汞结合蛋白吸附菌株对Hg2+都具备较高的选择特异性。当混合金属离子浓度为800μM时，BL21(M’1)对的Hg2+的吸附选择性分别是Cr6+、Cd2+和As2+的16.2倍、12.8倍和28倍，BL21(M’2)对的Hg2+的吸附选择性分别是Cr6+、Cd2+和As2 +的14.8倍、14倍和26倍。吸附菌株具有较高的Hg2+吸附能力和良好的选择特异性，具有很好的应用价值。
上述六组实施例应用试验结果表明，以本发明提供的构建方法得到的汞结合蛋白表面展示工程菌能够将目的蛋白以融合蛋白的形式锚定在大肠杆菌细胞外膜表面，并且于26℃诱导表达22h后，不论是在含有单一重金属离子Hg存在条件下还是在包含有其它重金属离子的混合溶液中，工程菌BL21(M1)、BL21(M’1)、BL21(M2)或BL21(M’2)对50-1000μM的Hg2+都具有较高的吸附能力和良好的选择特异性，具有很好的应用价值，为重金属污染环境的生物修复提供了新思路和新技术。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 天津大学
<120> 一种用于吸附溶液汞离子的工程大肠杆菌构建方法及应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 552
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
atgactctcg acaaggcgtt ggtgctgcgt acctgtgcaa ataacatggc cgatcactgc 60
ggccttatat ggcccgcgtc cggcacggtg gaatccagat actggcagtc aaccaggcgg 120
catgagaatg gtctggtcgg tttactgtgg ggcgctggaa ccagcgcttt tctaagcgtg 180
catgccgatg ctcgatggat tgtctgtgaa gttgccgttg cagacatcat cagtctggaa 240
gagccgggaa tggtcaagtt tccgcgggcc gaggtggttc atgtcggcga caggatcagc 300
gcgtcacact tcatttcggc acgtcaggcc gaccctgcgt caacgtcaac gtcaacgtca 360
acgtcaacgt taacgccaat gcctacggcc atacccacgc ccatgcctgc ggtagcaagt 420
gtcacgttac cggtggccga acaggcccgt catgaagtgt tcgatgtcgc gtcggtcagc 480
gcggctgccg ccccagtaaa caccctgccg gtgacgacgc cgcagaattt gcagaccggt 540
ggtggtggtt cc 552
<210> 2
<211> 435
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
atggaaaaca atttggagaa cctgaccatt ggcgttttcg ccaaggcggc cggggtcaat 60
gtggagacca tccgtttcta tcagcgcaag ggcttgttgc tggagcctga caagccctat 120
ggcagcatcc gccgctatgg cgaggcggat gtaacgcggg tgcgcttcgt gaaatcagcc 180
cagcggctgg gcttcagcct ggatgagatc gccgagctgc tgcggctgga ggatggcacc 240
cattgcgagg aagccagcag tctggccgag cacaagctca aggacgtgcg cgagaaaatg 300
gctgacctgg cgcgcatgga ggccgtgctg tctgagttgg tgtgcgcctg ccatgcgcga 360
agggggaacg tttcctgccc gctgatcgcg tcactacagg gtggagcaag cttggcaggt 420
tcggctatgc cttag 435
<210> 3
<211> 5558
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960
aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140
taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320
tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380
cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400
ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520
gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580
gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640
aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700
ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760
acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820
ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880
tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940
tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000
cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060
gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120
ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480
atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600
tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660
ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780
atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840
cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900
gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960
tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020
agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080
gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140
ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200
catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260
tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320
tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380
gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440
ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500
tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560
catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620
cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680
tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740
ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860
cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920
gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980
aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040
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<400> 7
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cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960
aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140
taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320
tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380
cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400
ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520
gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580
gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640
aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700
ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760
acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820
ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880
tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940
tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000
cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060
gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120
ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480
atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600
tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660
ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780
atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840
cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900
gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960
tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020
agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080
gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140
ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200
catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260
tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320
tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380
gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440
ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500
tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560
catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620
cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680
tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740
ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860
cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920
gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980
aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040
ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgcccagca gccatcatca tcatcatcac 5100
agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat atggaagaag aagaagatcc tgatttaaaa 5160
gctgctatcc aggaatctct gcgtgaagct gccgcagcgg cggctgccgc tgaagacgaa 5220
gaagaactga tccgtaaagc tatcgaactg tctctgaaag aatctgcggc ggctgcagcc 5280
gcggccgagg acgaggagga gctgatccgc aaggccatcg agctgagcct gaaggagtgc 5340
cgtaactctg cttgaggatc cgaattcgag ctccgtcgac aagcttatga ctctcgacaa 5400
ggcgttggtg ctgcgtacct gtgcaaataa catggccgat cactgcggcc ttatatggcc 5460
cgcgtccggc acggtggaat ccagatactg gcagtcaacc aggcggcatg agaatggtct 5520
ggtcggttta ctgtggggcg ctggaaccag cgcttttcta agcgtgcatg ccgatgctcg 5580
atggattgtc tgtgaagttg ccgttgcaga catcatcagt ctggaagagc cgggaatggt 5640
caagtttccg cgggccgagg tggttcatgt cggcgacagg atcagcgcgt cacacttcat 5700
ttcggcacgt caggccgacc ctgcgtcaac gtcaacgtca acgtcaacgt caacgttaac 5760
gccaatgcct acggccatac ccacgcccat gcctgcggta gcaagtgtca cgttaccggt 5820
ggccgaacag gcccgtcatg aagtgttcga tgtcgcgtcg gtcagcgcgg ctgccgcccc 5880
agtaaacacc ctgccggtga cgacgccgca gaatttgcag accggtggtg gtggttccgc 5940
ggccgcatgg aaaataacct ggaaaacctg acgattggtg tcttcgctaa ggctgccggt 6000
gtgaatgtgg aaacgatccg cttctatcaa cgcaaaggcc tgctgctgga accggataag 6060
ccgtatggct ctattcgtcg ctacggtgaa gcagacgtga cccgtgttcg ctttgtcaaa 6120
agtgctcagc gtctgggctt ctccctggat gaaatcgcag aactgctgcg cctggaagac 6180
ggtacgcatt gcgaagaagc gagctctctg gccgaacaca aactgaagga tgtccgtgaa 6240
aagatggcag acctggcacg tatggaagca gtgctgtcag aactggtttg cgcatgtcat 6300
gctcgtcgcg gtaacgtgtc gtgtccgctg atcgcttcgc tgcaaggtgg tgcttcactg 6360
gctggttctg ctatgccgta actcgagcac caccaccacc accactgaga tccggctgct 6420
aacaaagccc gaaaggaagc tgagttggct gctgccaccg ctgagcaata actagcataa 6480
ccccttgggg cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttgc tgaaaggagg aactatatcc 6540
ggat 6544
<210> 8
<211> 6045
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 8
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840
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cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960
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tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080
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taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320
tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380
cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440
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ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520
gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580
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aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700
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aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780
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tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020
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gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140
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tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380
gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440
ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500
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cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680
tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740
ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860
cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920
gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980
aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040
ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgcccagca gccatcatca tcatcatcac 5100
agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat atggaagaag aagaagatcc tgatttaaaa 5160
gctgctatcc aggaatctct gcgtgaagct gccgcagcgg cggctgccgc tgaagacgaa 5220
gaagaactga tccgtaaagc tatcgaactg tctctgaaag aatctgcggc ggctgcagcc 5280
gcggccgagg acgaggagga gctgatccgc aaggccatcg agctgagcct gaaggagtgc 5340
cgtaactctg cttgaggatc cgaagcgctt gtcctttcga attgaaattg gatagcgtaa 5400
ccttacttcc gtactcatgt acggagtcaa gcgatatgga aaataacctg gaaaacctga 5460
cgattggtgt cttcgctaag gctgccggtg tgaatgtgga aacgatccgc ttctatcaac 5520
gcaaaggcct gctgctggaa ccggataagc cgtatggctc tattcgtcgc tacggtgaag 5580
cagacgtgac ccgtgttcgc tttgtcaaaa gtgctcagcg tctgggcttc tccctggatg 5640
aaatcgcaga actgctgcgc ctggaagacg gtacgcattg cgaagaagcg agctctctgg 5700
ccgaacacaa actgaaggat gtccgtgaaa agatggcaga cctggcacgt atggaagcag 5760
tgctgtcaga actggtttgc gcatgtcatg ctcgtcgcgg taacgtgtcg tgtccgctga 5820
tcgcttcgct gcaaggtggt gcttcactgg ctggttctgc tatgccgtaa cttgcggccg 5880
cactcgagca ccaccaccac caccactgag atccggctgc taacaaagcc cgaaaggaag 5940
ctgagttggc tgctgccacc gctgagcaat aactagcata accccttggg gcctctaaac 6000
gggtcttgag gggttttttg ctgaaaggag gaactatatc cggat 6045
Claims (3)
1.用于吸附溶液汞离子的工程大肠杆菌构建方法；其特征是，通过将汞结合蛋白MerR在大肠杆菌表面展示的方式构建胞外汞吸附菌株M1，在此基础上通过基因编辑技术构建胞内汞吸附菌株M2，并通过对M1的汞结合蛋白基因MerR进行大肠杆菌密码子优化对汞吸附菌株进行优化得到M’1，对M2的汞结合蛋白基因MerR进行大肠杆菌密码子优化对汞吸附菌株进行优化得到M’2；
构建方法包括如下步骤：
（1）通过PCR扩增编码锚定蛋白INPN的核苷酸序列，在其上下端分别引入HindIII和NotI酶切位点，并在扩增时去除锚定蛋白INPN末端的终止密码子，引入柔性连接肽FL（GGGGS），得到INPN-FL核苷酸序列；
（2）通过PCR扩增编码汞结合蛋白MerR的核苷酸序列，在其上游引入EcoRI和NotI酶切位点，下游引入XhoI酶切位点；
（3）以酶切连接的方式将INPN-FL和MerR通过NotI酶切位点连接，得到得到MerR融合模块INPN-FL-MerR，并插入到pET28a质粒HindIII和XhoI酶切位点之间，得到质粒M1，核苷酸序列如SEQ ID No .4；
（4）以EcoRI、XhoI双酶切的方式将质粒M1中的INPN-FL-MerR切下，并将MerR插入到EcoRI和XhoI酶切位点之间，得到质粒M2，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
（5）以大肠杆菌E. coli BL21为宿主，将重组质粒转入宿主，通过菌落PCR筛选带有目的筛选质粒的阳性克隆菌株，即为汞结合蛋白吸附菌株；
（6）通过PCR扩增编码汞结合蛋白MerRopt的核苷酸序列，在其上游引入EcoRI和NotI酶切位点，下游引入XhoI酶切位点；
（7）以NotI、XhoI双酶切的方式将质粒M1中的MerR切下，替换为大肠杆菌密码子优化的汞结合蛋白MerRopt，得到质粒M’1，M’1核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；以NotI、XhoI双酶切的方式将质粒M2中的MerR切下，替换为大肠杆菌密码子优化的汞结合蛋白MerRopt，得到质粒M’2，M’2核苷酸序列如SEQ ID No 8所示；
（8）以大肠杆菌E. coli BL21为宿主，将重组质粒转入宿主，通过菌落PCR筛选带有目的筛选质粒的阳性克隆菌株，即为特异性汞结合蛋白吸附优化菌株。
2.如权利要求1的用于吸附溶液汞离子的工程大肠杆菌构建方法；其特征是，所述步骤（1）中MerRopt的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
3.如权利要求1的用于吸附溶液汞离子的工程大肠杆菌构建方法；其特征是，所述步骤（1）中INPN-FL的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述步骤（2）中MerR的核苷酸序列如SEQID No.2所示，pET28a质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
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