CN111304232B - 基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法及其应用 - Google Patents

基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法，通过基因工程构建两种工程菌，使SUMO标签N端与一种菌的膜锚定蛋白融合，SUMO标签C端与目的蛋白融合，同时将Ulp1蛋白酶融合到另外一种菌的膜锚定蛋白上，再将两种工程菌诱导表达后离心，重悬到缓冲液并混合孵育，Ulp1蛋白酶会将目的蛋白从SUMO标签上切割下来并溶于缓冲液中，菌体及其表面锚定的SUMO和Ulp1可通过离心去除，而上清中即为纯化的目的蛋白。该纯化方法不需要破碎菌体以及层析步骤，仅通过“菌体孵育‑离心”两步就可以达到提纯蛋白的目的，该方法具有快速、简便的特点，还能得到不含任何冗余序列的天然蛋白分子，具有广泛的推广价值和应用前景。

Description

基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法及其应用
技术领域
本发明涉及基因和蛋白工程领域，特别是涉及一种基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法及其应用。
背景技术
利用基因工程和蛋白质工程技术在表达宿主体内制备和获取重组蛋白是目前应用十分广泛的技术。其中，蛋白质的纯化是一项较为耗时且繁琐的步骤，例如：最常用的大肠杆菌原核表达系统，蛋白质在细菌体内大量诱导表达后，首先需要将菌体破碎，然后通过离心收集上清液或者包涵体沉淀，再进行下一步的提纯；提纯步骤往往涉及盐析、离子交换、分子筛或亲和层析等方法。亲和层析虽然能够一次纯化得到目的蛋白，但需要在目的蛋白中加入“亲和标签”，所以要得到天然序列的蛋白，还需要将标签切除并再次纯化。
目前已有一系列快速简便的蛋白纯化方法被报道。比如：给目的蛋白加上信号肽，蛋白表达后可以分泌到细胞外面，可以省去菌体破碎的步骤，但后续仍需将目的蛋白从培养基中提纯；还有将目的蛋白与“自聚合标签”融合，融合蛋白表达后首先形成沉淀，再通过对沉淀进行酶切，将目的蛋白与沉淀标签分离后得到纯化蛋白。此方法虽然无需层析步骤，但仍需要先将菌体破碎。
SUMO标签是一种小分子的类泛素化蛋白，分子量大小只有11kD左右，常被融合在目的蛋白的N末端来提高蛋白的表达量和溶解度。此外，SUMO标签可以被蛋白酶Ulp1识别、切除，并且不会在目的蛋白中留下任何冗余的氨基酸残基。这样使得SUMO标签比其他蛋白标签的移除更加有效便捷，是一种理想的蛋白融合标签。而目前没有利用SUMO标签与标签酶Ulp1相互间的作用关系进行蛋白纯化的相关报道，而为了改进现有纯化蛋白技术中所存在的缺陷，利用SUMO标签与标签酶Ulp1相互作用的优势发明一种新的纯化蛋白的方法，将对解决现有技术问题产生极其重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法，改变现有的纯化蛋白方法繁琐过程，不需要破碎菌体以及层析步骤，仅仅通过“菌体孵育-离心”两步就可以达到提纯蛋白的目的，该方法具有快速、简便的特点，具有广泛的应用前景。
本发明还有一个目的是提供一种基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法在蛋白纯化方法的应用，具体应用于红色荧光蛋白的纯化中，验证了该方法纯化提纯过程的快速简便方式，以及所得到的目的蛋白不带有任何标签，纯化度高。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法，通过基因工程构建两种工程菌，使SUMO标签N端与一种菌的膜锚定蛋白融合，而SUMO标签C端与目的蛋白融合，同时将Ulp1蛋白酶融合到另外一种菌的膜锚定蛋白上，再将两种所述工程菌诱导表达后离心，重悬到缓冲液并混合孵育，离心后上清中即可得到目的蛋白。
优选的是，具体包括以下步骤：
步骤1：合成表达大肠杆菌前脂蛋白信号肽Lpp、跨膜蛋白OmpA、SUMO标签序列的融合蛋白序列的编码基因lpp-ompA-sumo，并将所述lpp-ompA-sumo克隆到pET-28b线性载体，连接产物转入感受态细胞，经双酶切鉴定后挑取阳性克隆，测序验证并构建得到SUMO融合蛋白膜表面表达载体pET-LO-SUMO；
步骤2：合成表达大肠杆菌自转运蛋白YfaL的第1-28位氨基酸、酿酒酵母Ulp1蛋白酶的第327-545位氨基酸和YfaL的第786-1250位氨基酸的融合蛋白序列的编码基因yfal-ulp1，并将所述yfal-ulp1克隆到pET-28b线性载体，连接产物转入感受态细胞，经双酶切鉴定后挑取阳性克隆，测序验证并构建得到Ulp1融合蛋白膜表面表达载体pET-YfaL-Ulp1；
步骤3：合成表达目的蛋白M的编码基因m，并将所述编码基因m克隆到pET-LO-SUMO线性载体，连接产物转入感受态细胞，经双酶切鉴定后挑取阳性克隆，测序验证并构建得到SUMO融合M蛋白膜表面表达载体pET-LO-SUMO-M；
步骤4：将所述pET-LO-SUMO-M、pET-YfaL-Ulp1分别转入BL21感受态细胞，获得pET-LO-SUMO-M/BL21菌株和pET-YfaL-Ulp1/BL21菌株；
步骤5：将pET-LO-SUMO-M/BL21菌株和pET-YfaL-Ulp1/BL21菌株分别诱导培养，离心后重悬到缓冲液，再混合孵育，离心收集上清，获得目的蛋白M。
优选的是，步骤1中扩增引物为：
Lpp-1：
CTTTAAGAAGGAGATATACCATGAAGGCGACCAAACTGGTGCTGG
SUMO-2：
GGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCATATGACCTCCAATCTGTTCGCGGTGAGC
扩增条件为：95℃预变性5min，95℃40s、50℃40s、72℃3min，共35个循环，最后72℃延伸10min。
优选的是，步骤2中扩增引物为：
YfaL-Ulp1-1：
CTTTAAGAAGGAGATATACCATGCGTATCATTTTCCTGCGTAAGGAG
YfaL-Ulp1-2：
TGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTACCATTTCACGGTCATGCTCAGAAAAC
扩增条件为：95℃预变性5min，95℃40s、50℃40s、72℃4min，共35个循环，最后72℃延伸10min。
优选的是，步骤1所述的pET-28b线性载体是经NcoI和XhoI双酶切得到的，步骤2中所述的pET-28b线性载体是经NcoI和HindIII双酶切得到的，步骤3中所述的pET-LO-SUMO线性载体是经NdeI双酶切得到的。
优选的是，步骤3中所述目的蛋白M为红色荧光蛋白mCherry，所述红色荧光蛋白mCherry的编码基因为mcherry。
优选的是，编码基因为mcherry克隆到pET-LO-SUMO线性载体，经阳性克隆筛选以及转染感受态细胞，得到pET-LO-SUMO-mCherry/BL21菌株。
所得pET-LO-SUMO-mCherry/BL21菌株和pET-YfaL-Ulp1/BL21菌株诱导培养过程具体为：将pET-LO-SUMO-mCherry/BL21菌株和pET-YfaL-Ulp1/BL21菌株分别转入LB液体培养基中，使得起始菌液OD600为0.02，并分别加入卡那霉素，在37℃、250r/min条件下振荡培养至OD600为0.8，之后向菌液中分别加入IPTG，并于16℃条件下诱导24h。
优选的是，所述pET-LO-SUMO-mCherry/BL21和pET-YfaL-Ulp1/BL21菌株诱导后离心，再重悬到缓冲液中混合孵育，在37℃、100r/min恒温振荡孵育30min，离心，收集上清得到纯化的红色荧光蛋白。
优选的是，所述缓冲液包含以下组分：20mM Tri-HCl,150mM NaCl,2mM DTT,pH8.0；
所述pET-LO-SUMO-mCherry/BL21和pET-YfaL-Ulp1/BL21两种菌液，混合前菌密度OD600调整一致，再按体积比1:1混合孵育。
本发明公开了以下技术效果：
本发明通过将目的蛋白融合到SUMO的C端，SUMO的N端再与膜锚定蛋白融合，同时将Ulp1蛋白也融合到膜锚定蛋白上，由此构建出两种工程菌：一种将目的蛋白和SUMO融合表达并固定在细胞膜表面，另一种将Ulp1固定在膜表面。再将获得的两种工程菌诱导表达，离心后重悬到缓冲液，并混合孵育半小时，膜外的Ulp1会在SUMO标签末端处将目的蛋白酶切下来留在缓冲液上清中，而菌体以及固定其上面的SUMO和Ulp1可通过离心去除。相比现有技术纯化蛋白的方法，本发明公开的该纯化方法不需要破碎菌体和层析步骤，仅通过“菌体孵育—离心”两步就可以达到提纯蛋白的目的，并且得到的目的蛋白不带有任何标签。本发明公开的该纯化方法具备快速、简便的特点，并且可以实现目的蛋白的高纯度纯化，在蛋白纯化领域将具有广泛的推广价值和应用前景。
附图说明
图1为本发明SUMO融合蛋白膜表面表达载体pET-LO-SUMO的图谱(a)和Ulp1膜表面表达载体pET-YfaL-Ulp1的图谱(b)；
图2为本发明SUMO-mCherry和Ulp1膜表面表达菌株的诱导表达及胰蛋白酶消化实验的SDS-PAGE电泳鉴定结果；
图3为本发明膜外Ulp1蛋白对膜表面SUMO-mCherry融合蛋白的酶切和mCherry的纯化的SDS-PAGE电泳和Western-Blot结果；泳道1-6分别表示为：1.pET-LO-SUMO-mCherry/BL21菌株和pET-/BL21菌株混合孵育0min样品；2.pET-LO-SUMO-mCherry/BL21菌株和pET-/BL21菌株混合孵育30min，离心后菌体沉淀；3.pET-LO-SUMO-mCherry/BL21菌株和pET-/BL21菌株混合孵育30min，离心后上清；4.pET-LO-SUMO-mCherry/BL21菌株和pET-YfaL-Ulp1/BL21菌株混合孵育0min样品；5.pET-LO-SUMO-mCherry/BL21菌株和pET-YfaL-Ulp1/BL21菌株混合孵育30min，离心后菌体沉淀；6.pET-LO-SUMO-mCherry/BL21菌株和pET-YfaL-Ulp1/BL21菌株混合孵育30min，离心后上清；
图4为本发明Ulp1蛋白对膜表面SUMO-mCherry融合蛋白在不同条件酶切后的上清样品的SDS-PAGE电泳图；
图5为超滤法对纯化的mCheery蛋白进行再次提纯的结果；泳道1是pET-LO-SUMO-mCherry/BL21菌株和pET-YfaL-Ulp1/BL21菌株混合孵育后的上清样品，mCherry的纯度大概在80％以上；泳道2是将上清样品经过30kDa超滤管过滤后的样品；
图6为本发明基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法的流程图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
1、SUMO融合蛋白膜表面表达载体和Ulp1膜表面表达载体的构建
1.1SUMO融合蛋白膜表面表达载体的构建
1)根据大肠杆菌前脂蛋白信号肽Lpp、跨膜蛋白OmpA以及SUMO标签序列的融合蛋白序列(即Lpp第1-9位氨基酸，OmpA第46-159位氨基酸和SUMO中100个氨基酸按顺序串联)，由南京金斯瑞生物科技公司按照大肠杆菌密码子偏好性，直接合成此融合序列的编码基因lpp-ompA-sumo，并将编码基因lpp-ompA-sumo克隆到pUC57载体中，获得质粒pUC57-lpp-ompA-sumo。
2)以pUC57-lpp-ompA-sumo质粒为模板，用引物Lpp-1和SUMO-2进行PCR扩增lpp-ompA-sumo基因片段；上述引物序列分别为：
Lpp-1：
CTTTAAGAAGGAGATATACCATGAAGGCGACCAAACTGGTGCTGG
SUMO-2：
GGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCATATGACCTCCAATCTGTTCGCGGTGAGCPCR反应条件：95℃预变性5min，95℃40s、50℃40s、72℃3min，共35个循环，最后72℃延伸10min。
3)电泳进行扩增产物验证，其验证扩增成功后，将lpp-ompA-sumo基因片段进行胶回收，并按照无缝克隆试剂盒说明书的操作，与经NcoI和XhoI双酶切后的pET-28b线性载体进行无缝克隆，连接产物转化入感受态细胞，经双酶切鉴定后挑取阳性克隆，测序验证并构建得到SUMO融合蛋白膜表面表达载体pET-LO-SUMO(图谱如图1a所示，DNA序列如SEQ IDNO：1所示)。
1.2Ulp1膜表面表达载体的构建
1)根据大肠杆菌自转运蛋白YfaL的第1-28位氨基酸、酿酒酵母Ulp1蛋白酶的第327-545位氨基酸和YfaL的第786-1250位氨基酸的融合蛋白序列，由南京金斯瑞生物科技公司按照大肠杆菌密码子偏好性，直接合成此融合序列的编码基因yfal-ulp1，再将编码基因yfal-ulp1克隆到pUC57载体中，获得质粒pUC57-yfal-ulp1。
2)以pUC57-yfal-ulp1质粒为模板，用引物YfaL-Ulp1-1和YfaL-Ulp1-2进行PCR扩增yfal-ulp1基因片段；上述引物序列分别为：
YfaL-Ulp1-1：
CTTTAAGAAGGAGATATACCATGCGTATCATTTTCCTGCGTAAGGAG
YfaL-Ulp1-2：
TGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTACCATTTCACGGTCATGCTCAGAAAACPCR反应条件：95℃预变性5min，95℃40s、50℃40s、72℃4min，共35个循环，最后72℃延伸10min。
3)电泳进行扩增产物验证，其验证扩增成功后，将yfal-ulp1基因片段进行胶回收，并按照无缝克隆试剂盒说明书的操作，与经NcoI和HindIII双酶切后的pET-28b线性载体进行无缝克隆，连接产物转化入感受态细胞，经双酶切鉴定后挑取阳性克隆，测序验证并构建得到Ulp1膜表面表达载体pET-YfaL-Ulp1(图谱如图1b所示，DNA序列如SEQ ID NO：2所示)。
2、红色荧光蛋白mCherry的SUMO融合蛋白膜表面表达载体的构建
为了验证本发明公开的基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法纯化蛋白的过程，以红色荧光蛋白mCherry为例，进行纯化过程的示踪。
1)根据红色荧光蛋白的mCherry的蛋白序列，由南京金斯瑞生物科技公司按照大肠杆菌密码子偏好性，直接合成此融合序列的编码基因mcherry(如SEQ ID NO：3所示)，并将编码基因mcherry克隆到pUC57载体上，获得质粒pUC57-mcherry。
以质粒pUC57-mcherry为模板，用引物mCherry-1和mCherry-2进行PCR扩增mcherry基因片段；上述引物序列分别为：
mCherry-1：
CCGCGAACAGATTGGAGGTATGGTTAGCAAGGGCGAGGAAGAC
mCherry-2：
GGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTATACAGTTCATCCATGCCACCGGTG
PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃40s、50℃40s、72℃2min，共35个循环，最后72℃延伸10min。
2)电泳验证扩增片段成功后，将mcherry基因片段进行胶回收，并按照无缝克隆试剂盒说明书的操作，与经NdeI单酶切后的pET-LO-SUMO线性载体进行无缝克隆，连接产物转化入感受态细胞，经双酶切鉴定后挑取阳性克隆，测序验证并构建得到红色荧光蛋白mCherry的SUMO融合蛋白膜表面表达载体pET-LO-SUMO-mCherry(DNA序列如SEQ ID NO：4)。
此外，还构建大肠杆菌IscA胞内表达载体作为对照，用mCherry-3和mCherry-4引物扩增出mcherry片段，按照相似方法将其克隆到pET-28b的NcoI和XhoI双酶切位点，得到pET-mCheery。上述引物序列分别为：
mCherry-3：
CTTTAAGAAGGAGATATACCATGGTTAGCAAGGGCGAGGAAGAC
mCherry-4：
GGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTATACAGTTCATCCATGCCACCGGTG
3、SUMO-mCherry和Ulp1蛋白在细菌表面的诱导表达和鉴定
将所得pET-LO-SUMO-mCherry、pET-YfaL-Ulp1和pET-mCherry质粒分别转化入BL21感受态细胞，得到pET-LO-SUMO-mCherry/BL21、pET-YfaL-Ulp1/BL21和pET-mCherry/BL21菌株。
吸取适量过夜生长的上述菌液加入到10mL新鲜LB液体培养基中，使起始菌液OD600值为0.02左右，并分别加入卡那霉素，在37℃恒温250r/min振荡培养，监测其OD600至0.8左右，吸取2-3mL的菌液留作SDS-PAGE电泳鉴定，其余菌液加入终浓度为200μmol/L的IPTG，16℃条件下诱导24h。之后8000r/min，4℃离心10min收集菌体，用Tris缓冲液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0)重悬，使细菌密度OD600为10左右。每种菌液样品吸取10μL进行SDS-PAGE电泳鉴定蛋白表达情况。
此外，分别吸取50μL已重悬到Tris缓冲液中的诱导后菌液(OD600为10)，加入终浓度为100μg/mL的胰蛋白酶，37℃消化2h，洗涤3次后再重悬到缓冲液中，吸取相同的菌量与其余样品同时电泳鉴定。
如图2所示，为SUMO-mCherry和Ulp1膜表面表达菌株的诱导表达及胰蛋白酶消化实验的SDS-PAGE电泳鉴定。结果显示：样品经IPTG诱导后，在27kDa、54kDa和80kDa位置分别可见一条显著增粗的蛋白条带，且条带分别与胞内游离mCherry蛋白、膜表面表达的LO-SUMO-mCherry和YfaL-Ulp1融合蛋白的预计分子量大小一致，表明融合蛋白已经成功表达。
由于Lpp-OmpA和YfaL是膜锚定蛋白，为了进一步鉴定LO-SUMO-mCherry和YfaL-Ulp1融合蛋白中的SUMO-mCherry和Ulp1片段是暴露于膜外面，而不是位于胞内，通过用胰蛋白酶对已经表达成功的菌株进行酶切消化。由于胰蛋白酶不能进入细胞膜内，所以只能将膜外的蛋白或者肽段消化降解。如图2所示，表达有LO-SUMO-mCherry和YfaL-Ulp1融合蛋白的全细胞菌体和胰蛋白酶孵育后，54kDa和80kDa位置的蛋白条带几乎消失，而pET-mCherry/BL21作为对照菌株，胞内的mCherry不能直接与胰蛋白酶接触，所以没有被降解。这表明SUMO-mCherry和Ulp1已经成功表达于细菌的表面。
4、膜外Ulp1蛋白对膜表面SUMO-mCherry融合蛋白的酶切和mCherry的纯化
将诱导成功的pET-LO-SUMO-mCherry/BL21菌株和pET-YfaL-Ulp1/BL21菌株离心后，重悬到酶切缓冲液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0)，调整细菌密度OD600为25左右。
之后将两种菌液按1:1体积混合，再向混合菌液中加入终浓度为2mM的DTT(Dithiothreitol，二硫苏糖醇)，置于37℃、100r/min恒温振荡培养箱缓慢振荡孵育，分别在0、30min时刻取出适量的混合菌液，12000r/min高速离心2min。离心完毕将上清溶液转移至新的管子，并将沉淀重悬到原来体积。分别将0min的混合菌液，孵育30min后的上清和沉淀重悬菌液进行SDS-PAGE电泳鉴定。
另外，同时设立对照组，即将诱导成功的pET-LO-SUMO-mCherry/BL21菌株和pET/BL21菌株也进行上述同样的处理和电泳鉴定。此外，由于诱导的mCherry的C末端加上了his组氨酸标签，所以在SDS-PAGE鉴定的同时也用抗his抗体对上述样品进行mCherry蛋白的蛋白免疫印迹实验(Western-Blot)，以便于定位跟踪。
如图3所示，为膜外Ulp1蛋白对膜表面SUMO-mCherry融合蛋白的酶切和mCherry的纯化的SDS-PAGE电泳和Western-Blot结果。结果显示：诱导成功的pET-LO-SUMO-mCherry/BL21菌株经过与pET-YfaL-Ulp1/BL21菌株同孵育30min后，其位于54kDa位置的LO-SUMO-mCherry融合蛋白条带显著减弱变细；与此同时，上清液中出现一条27kDa左右的条带，肉眼可见红色，证明此条带即为被Ulp1切下的mCherry蛋白，样品中mCherry蛋白纯度在80％以上。
另外，沉淀中的全细胞菌体也在27kDa显现一条较为明显的条带，根据分子量大小可推知此条带应该为LO-SUMO-mCherry被切除后剩余的LO-SUMO部分，由于此剩余部分仍锚定于膜表面，所以随菌体一同离心下来；此外，也设立了阴性对照，即将pET-LO-SUMO-mCherry/BL21菌株和阴性菌株pET-/BL21按照同样的实验条件进行孵育，30min后上清液并未出现红色且无对应的mCherry蛋白条带。这证明膜外表达的Ulp1蛋白能够将膜表面的SUMO-mCherry融合蛋白进行酶切，mCherry被切除下来后留在溶液中，与菌体分离，离心后可达到纯化的效果。
mCherry蛋白的蛋白免疫印迹实验进一步证明了上述结果，并且显示膜表面的SUMO-mCherry融合蛋白大约有60％被膜外Ulp1蛋白成功酶切。
5、膜外Ulp1蛋白对膜表面SUMO-mCherry融合蛋白的酶切条件优化
由于Ulp1蛋白酶对SUMO标签的酶切效率可能受到多种因素的影响。因此，发明人分别在酶切缓冲液，酶切时间和酶切温度等方面进行了条件摸索和优化。具体方法如下：
(1)酶切缓冲液：
将诱导好的pET-LO-SUMO-mCherry/BL21菌株和pET-YfaL-Ulp1/BL21菌株离心后，分别重悬到NaCl终浓度为0、150、500mM的酶切缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0)，调整细菌密度OD600为25左右。之后将两种菌液按1:1体积混合，再将混合菌液中加入终浓度为2mM的DTT，置于37℃、100r/min恒温振荡培养箱缓慢振荡孵育，30min后取出适量的混合菌液，12000r/min高速离心2min。离心完毕，将上清溶液转移至新的管子，进行SDS-PAGE电泳鉴定。
(2)酶切时间：
将诱导好的pET-LO-SUMO-mCherry/BL21菌株和pET-YfaL-Ulp1/BL21菌株离心后，分别重悬到酶切缓冲液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0)，调整细菌密度OD600为25左右。之后将两种菌液按1:1体积混合，再将混合菌液中加入终浓度为2mM的DTT，置于37℃、100r/min恒温振荡培养箱缓慢振荡孵育，分别在0、5、15、30min后取出适量的混合菌液，12000r/min高速离心2min。离心完毕，将上清溶液转移至新的管子，进行SDS-PAGE电泳鉴定。
(3)酶切温度
将诱导好的pET-LO-SUMO-mCherry/BL21菌株和pET-YfaL-Ulp1/BL21菌株离心后，分别重悬到酶切缓冲液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0)，调整细菌密度OD600为25左右。之后将两种菌液按1:1体积混合，再将混合菌液中加入终浓度为2mM的DTT，分别置于4℃、16℃、30℃、37℃恒温100r/min缓慢振荡孵育，30min后取出适量的混合菌液，12000r/min高速离心2min。离心完毕，将上清溶液转移至新的管子，进行SDS-PAGE电泳鉴定。
如图4所示，为Ulp1蛋白对膜表面SUMO-mCherry融合蛋白在不同条件酶切后的上清样品的SDS-PAGE电泳图。结果显示：酶切缓冲液方面：适度的盐离子浓度(150mM NaCl)能够提高酶切效率，但是过高的盐离子浓度(500mM NaCl)反而完全抑制酶切反应。
酶切时间方面：酶切下来的mCherry蛋白量随着时间而逐渐增加，但是在30min后增加很少并逐渐趋于饱和，而且30min后菌体分泌的杂蛋白也会明显增多(结果未显示)，所以选用30min作为优化时间。
酶切温度方面：在不同实验温度条件下面，37℃的酶切效率最高，这符合酶切效率和温度的常规关系。
综上，在37℃条件下，在含有150mM NaCl的酶切缓冲液中孵育30min，酶切效率相对最佳。
6、超滤法对纯化的mCheery蛋白进行再次提纯
由于细菌存在多种外分泌机制，会通过膜通道向膜外分泌各种蛋白质和小分子物质，所以用以上方法得到的上清中，除了有纯化得到的目的蛋白外，还存在少量的杂蛋白(蛋白纯度80％以上，且大部分杂蛋白分子量大于30kDa)。为进一步提高蛋白纯度，可以用蛋白超滤法进行过滤纯化。
mCheery蛋白的分子量约为27kDa，所以用30kDa的超滤管对样品进行离心过滤后，大于30kDa的杂蛋白会被滤膜阻挡，mCheery蛋白会被过滤离心下来，蛋白的纯度会进一步提高。
如图5所示，结果显示样品中大于30kDa的杂带消失，mCherry的纯度可提高到90％以上。
综上所述，本发明构建了两个蛋白表达载体，即pET-LO-SUMO和pET-YfaL-Ulp1，对于表达目的蛋白，只需要将目的蛋白的编码基因序列克隆到pET-LO-SUMO的NdeI位点即可，并且不保留此酶切位点序列，使得表达的融合蛋白中的SUMO标签和目的蛋白序列之间没有多余氨基酸残基，这样经Ulp1酶切后能够得到无冗余序列的天然蛋白分子，具体的诱导和酶切方法如上所述(流程图如图6所示)。该方法简便易实现，并且可以快速得到天然蛋白分子，在蛋白纯化方面具有广泛的推广价值和应用前景。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 温州医科大学
<120> 基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5992
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960
aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140
taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320
tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380
cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440
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agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680
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agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400
ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520
gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580
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catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240
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gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420
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ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720
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cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900
gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960
tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020
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gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140
ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200
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tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320
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ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500
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cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680
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gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980
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ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgaaggcga ccaaactggt gctgggcgcg 5100
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<210> 2
<211> 7420
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
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ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
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agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960
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tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080
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taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200
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agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860
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tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340
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gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520
gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580
gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640
aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700
ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760
acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820
ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880
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tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000
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ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180
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gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360
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ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780
atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840
cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900
gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960
tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020
agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080
gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140
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catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260
tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320
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gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440
ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500
tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560
catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620
cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680
tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740
ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860
cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920
gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980
aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040
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ctggacaaga tctttacccc gattaacctg aaccagagcc actgggcgct gggtatcatt 5520
gatctgaaga aaaagaccat cggctacgtg gacagcctga gcaacggtcc gaacgcgatg 5580
agcttcgcga ttctgaccga tctgcaaaaa tatgttatgg aggaaagcaa gcacaccatc 5640
ggcgaagatt ttgacctgat tcacctggat tgcccgcagc aaccgaacgg ctacgactgc 5700
ggtatctatg tttgcatgaa caccctgtat ggtagcgcgg atgcgccgct ggatttcgac 5760
tataaggacg cgattcgtat gcgtcgtttt atcgcgcacc tgattctgac cgacgcgctg 5820
aaagaattcg ggccaacgac cgaactgagc aacgtgaccg ttaacggtaa cctgaccaac 5880
accagcggcg ctgtgagcct gcaaaacggt gttgcgggcg acaccctgac cgttaacggc 5940
gattataccg gtggcggtac cctgctgctg gatagcgagc tgaacggtga cgatagcgtg 6000
agcgaccagc tggttatgaa cggcaacacc gcgggtaaca ccaccgttgt ggttaacagc 6060
attaccggta tcggcgaacc gaccagcacc ggcatcaagg tggttgactt cgcggcggat 6120
ccgacccaat tccagaacaa cgcgcaattt agcctggcgg gtagcggcta cgtgaacatg 6180
ggtgcgtacg attataccct ggttgaggac aacaacgatt ggtatctgcg tagccaggaa 6240
gtgaccccgc cgagcccgcc ggacccggat ccgaccccgg atccggaccc gaccccggat 6300
ccggatccga ccccggaccc ggagccgacc ccggcgtacc agccggtgct gaacgcgaaa 6360
gttggcggtt atctgaacaa cctgcgtgcg gcgaaccaag cgttcatgat ggaacgtcgt 6420
gaccacgcgg gcggtgatgg tcagaccctg aacctgcgtg tgattggcgg tgactaccac 6480
tataccgcgg cgggtcaact ggcgcagcat gaggacacca gcaccgttca actgagcggt 6540
gacctgttca gcggtcgttg gggcaccgac ggtgaatgga tgctgggtat cgtgggcggt 6600
tacagcgaca accagggtga tagccgtagc aacatgaccg gcacccgtgc ggacaaccaa 6660
aaccacggct atgcggttgg tctgaccagc agctggttcc agcacggcaa ccaaaaacag 6720
ggtgcgtggc tggatagctg gctgcaatac gcgtggttta gcaacgacgt gagcgagcag 6780
gaagacggta ccgatcacta ccacagcagc ggcatcattg cgagcctgga ggcgggttat 6840
caatggctgc cgggtcgtgg cgtggttatt gaaccgcaag cgcaggtgat ctatcagggt 6900
gttcagcaag acgatttcac cgcggcgaac cgtgcgcgtg ttagccaaag ccagggcgac 6960
gatattcaga cccgtctggg tctgcacagc gaatggcgta ccgcggtgca cgttatcccg 7020
accctggacc tgaactacta tcacgatccg cacagcaccg agattgagga agacggcagc 7080
accatcagcg acgatgcggt taagcaacgt ggtgaaatta aagtgggcgt taccggtaac 7140
atcagccagc gtgtgagcct gcgtggtagc gttgcgtggc aaaaaggtag cgatgatttt 7200
gcgcagaccg cgggttttct gagcatgacc gtgaaatggt aaaagcttgc ggccgcactc 7260
gagcaccacc accaccacca ctgagatccg gctgctaaca aagcccgaaa ggaagctgag 7320
ttggctgctg ccaccgctga gcaataacta gcataacccc ttggggcctc taaacgggtc 7380
ttgaggggtt ttttgctgaa aggaggaact atatccggat 7420
<210> 3
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggttagca agggcgagga agacaacatg gcgatcatta aggagttcat gcgttttaaa 60
gtgcacatgg aaggcagcgt taacggtcac gagttcgaaa tcgagggtga aggcgagggt 120
cgtccgtacg agggtaccca gaccgcgaag ctgaaagtga ccaaaggtgg cccgctgccg 180
tttgcgtggg acatcctgag cccgcaattt atgtacggca gcaaggcgta tgttaaacac 240
ccggcggaca ttccggatta tctgaagctg agcttcccgg agggttttaa atgggaacgt 300
gtgatgaact ttgaggatgg tggcgtggtt accgttaccc aggacagcag cctgcaagat 360
ggcgaattca tctacaaggt gaaactgcgt ggcaccaact ttccgagcga cggtccggtt 420
atgcaaaaga aaaccatggg ttgggaggcg agcagcgaac gtatgtatcc ggaggatggc 480
gcgctgaagg gtgaaattaa acagcgtctg aagctgaaag acggtggcca ctacgatgcg 540
gaagtgaaga ccacctataa agcgaagaaa ccggtgcaac tgccgggcgc gtacaacgtt 600
aacatcaagc tggacattac cagccacaac gaggattaca ccattgttga acagtatgag 660
cgtgcggaag gtcgtcacag caccggtggc atggatgaac tgtataaatg a 711
<210> 4
<211> 6694
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960
aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140
taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320
tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380
cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400
ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520
gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580
gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640
aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700
ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760
acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820
ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880
tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940
tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000
cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060
gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120
ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480
atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600
tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660
ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780
atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840
cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900
gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960
tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020
agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080
gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140
ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200
catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260
tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320
tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380
gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440
ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500
tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560
catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620
cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680
tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740
ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860
cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920
gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980
aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040
ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgaaggcga ccaaactggt gctgggcgcg 5100
gttatcctgg gtagcaccct gctggcgggt tgcagcagca acgcgaagat cgaccagggc 5160
attaacaaca acggtccgac ccacgaaaac caactgggtg cgggtgcgtt tggtggctac 5220
caagtgaacc cgtatgttgg ctttgaaatg ggttacgatt ggctgggtcg tatgccgtat 5280
aaaggcagcg tggagaacgg tgcgtacaag gcgcagggcg ttcaactgac cgcgaaactg 5340
ggttacccga tcaccgacga tctggacatt tatacccgtc tgggtggcat ggtgtggcgt 5400
gcggacacca aaagcaacgt ttacggcaag aaccacgata ccggtgtgag cccggttttt 5460
gcgggtggcg tggaatatgc gatcaccccg gagattgcga cccgtggtat tccgggtaag 5520
cttgggtccc tgcaggactc agaagtcaat caagaagcta agccagaggt caagccagaa 5580
gtcaagcctg agactcacat caatttaaag gtgtccgatg gatcttcaga gatcttcttc 5640
aagatcaaaa agaccactcc tttaagaagg ctgatggaag cgttcgctaa aagacagggt 5700
aaggaaatgg actccttaag attcttgtac gacggtatta gaattcaagc tgatcaggcc 5760
cctgaagatt tggacatgga ggataacgat attattgagg ctcaccgcga acagattgga 5820
ggtatggtta gcaagggcga ggaagacaac atggcgatca ttaaggagtt catgcgtttt 5880
aaagtgcaca tggaaggcag cgttaacggt cacgagttcg aaatcgaggg tgaaggcgag 5940
ggtcgtccgt acgagggtac ccagaccgcg aagctgaaag tgaccaaagg tggcccgctg 6000
ccgtttgcgt gggacatcct gagcccgcaa tttatgtacg gcagcaaggc gtatgttaaa 6060
cacccggcgg acattccgga ttatctgaag ctgagcttcc cggagggttt taaatgggaa 6120
cgtgtgatga actttgagga tggtggcgtg gttaccgtta cccaggacag cagcctgcaa 6180
gatggcgaat tcatctacaa ggtgaaactg cgtggcacca actttccgag cgacggtccg 6240
gttatgcaaa agaaaaccat gggttgggag gcgagcagcg aacgtatgta tccggaggat 6300
ggcgcgctga agggtgaaat taaacagcgt ctgaagctga aagacggtgg ccactacgat 6360
gcggaagtga agaccaccta taaagcgaag aaaccggtgc aactgccggg cgcgtacaac 6420
gttaacatca agctggacat taccagccac aacgaggatt acaccattgt tgaacagtat 6480
gagcgtgcgg aaggtcgtca cagcaccggt ggcatggatg aactgtataa actcgagcac 6540
caccaccacc accactgaga tccggctgct aacaaagccc gaaaggaagc tgagttggct 6600
gctgccaccg ctgagcaata actagcataa ccccttgggg cctctaaacg ggtcttgagg 6660
ggttttttgc tgaaaggagg aactatatcc ggat 6694

Claims (8)

1.一种基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法，其特征在于，通过基因工程构建两种工程菌，使SUMO标签N端与一种菌的膜锚定蛋白融合，而SUMO标签C端与目的蛋白融合，同时将Ulp1蛋白酶融合到另外一种菌的膜锚定蛋白上，再将两种所述工程菌诱导表达后离心，重悬到缓冲液并混合孵育，离心后上清中即可得到目的蛋白；
具体包括以下步骤：
步骤1：合成表达大肠杆菌前脂蛋白信号肽Lpp第1-9位氨基酸、跨膜蛋白OmpA第46-159位氨基酸、SUMO标签序列中100个氨基酸的融合蛋白序列的编码基因lpp-ompA-sumo，并将所述lpp-ompA-sumo克隆到pET-28b线性载体，连接产物转入感受态细胞，经双酶切鉴定后挑取阳性克隆，测序验证并构建得到SUMO融合蛋白膜表面表达载体pET-LO-SUMO；
步骤2：合成表达大肠杆菌自转运蛋白YfaL的第1-28位氨基酸、酿酒酵母Ulp1蛋白酶的第327-545位氨基酸和YfaL的第786-1250位氨基酸的融合蛋白序列的编码基因yfal-ulp1，并将所述yfal-ulp1克隆到pET-28b线性载体，连接产物转入感受态细胞，经双酶切鉴定后挑取阳性克隆，测序验证并构建得到Ulp1融合蛋白膜表面表达载体pET-YfaL-Ulp1；
步骤3：合成表达目的蛋白M的编码基因m，并将所述编码基因m克隆到pET-LO-SUMO线性载体，连接产物转入感受态细胞，经双酶切鉴定后挑取阳性克隆，测序验证并构建得到SUMO融合M蛋白膜表面表达载体pET-LO-SUMO-M；
步骤4：将所述pET-LO-SUMO-M、pET-YfaL-Ulp1分别转入BL21感受态细胞，获得pET-LO-SUMO-M/BL21菌株和pET-YfaL-Ulp1/BL21菌株；
步骤5：将pET-LO-SUMO-M/BL21菌株和pET-YfaL-Ulp1/BL21菌株分别诱导培养，离心后重悬到缓冲液，再混合孵育，离心收集上清，获得目的蛋白M。
2.如权利要求1所述的基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法，其特征在于，步骤1中扩增引物为：
Lpp-1：
CTTTAAGAAGGAGATATACCATGAAGGCGACCAAACTGGTGCTGG
SUMO-2：
GGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCATATGACCTCCAATCTGTTCGCGGTGAGC
扩增条件为：95℃预变性5min，95℃40s、50℃40s、72℃3min，共35个循环，最后72℃延伸10min。
3.如权利要求1所述的基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法，其特征在于，步骤2中扩增引物为：
YfaL-Ulp1-1：
CTTTAAGAAGGAGATATACCATGCGTATCATTTTCCTGCGTAAGGAGYfaL-Ulp1-2：
TGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTACCATTTCACGGTCATGCTCAGAAAAC
扩增条件为：95℃预变性5min，95℃40s、50℃40s、72℃4min，共35个循环，最后72℃延伸10min。
4.如权利要求1所述的基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法，其特征在于，步骤1所述的pET-28b线性载体是经NcoI和XhoI双酶切得到的，步骤2中所述的pET-28b线性载体是经NcoI和HindIII双酶切得到的，步骤3中所述的pET-LO-SUMO线性载体是经NdeI双酶切得到的。
5.如权利要求1所述的基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法，其特征在于，步骤3中所述目的蛋白M为红色荧光蛋白mCherry，所述红色荧光蛋白mCherry的编码基因为mcherry。
6.如权利要求5所述的基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法，其特征在于，编码基因为mcherry克隆到pET-LO-SUMO线性载体，经阳性克隆筛选以及转染感受态细胞，得到pET-LO-SUMO-mCherry/BL21菌株；
所得pET-LO-SUMO-mCherry/BL21菌株和pET-YfaL-Ulp1/BL21菌株诱导培养过程具体为：将pET-LO-SUMO-mCherry/BL21菌株和pET-YfaL-Ulp1/BL21菌株分别转入LB液体培养基中，使得起始菌液OD600为0.02，并分别加入卡那霉素，在37℃、250r/min条件下振荡培养至OD600为0.8，之后向菌液中分别加入IPTG，并于16℃条件下诱导24h。
7.如权利要求6所述的基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法，其特征在于，所述pET-LO-SUMO-mCherry/BL21和pET-YfaL-Ulp1/BL21菌株诱导后离心，再重悬到缓冲液中混合孵育，在37℃、100r/min恒温振荡孵育30min，离心，收集上清得到纯化的红色荧光蛋白。
8.如权利要求7所述的基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法，其特征在于，所述缓冲液包含以下组分：20mM Tri-HCl,150mM NaCl,2mM DTT,pH 8.0；
所述pET-LO-SUMO-mCherry/BL21和pET-YfaL-Ulp1/BL21两种菌液，混合前菌密度OD600调整一致，再按体积比1:1混合孵育。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112210019A (zh) * 2020-10-15 2021-01-12 广东省科学院生物工程研究所 一种含单跨膜区的膜蛋白其跨膜区的纯化方法
CN113025675B (zh) * 2021-05-21 2021-08-20 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 多肽的制备方法
CN113493779A (zh) * 2021-08-19 2021-10-12 深圳先进技术研究院 冠状病毒主蛋白酶的表达纯化方法
CN113881616B (zh) * 2021-10-12 2022-08-02 江南大学 一种细菌纤维素基生物传感器及其应用
CN114438060B (zh) * 2022-02-18 2023-07-21 嘉兴维亚生物科技有限公司 一种重组改性ulp1蛋白酶及其制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101679989A (zh) * 2006-12-29 2010-03-24 生命感应器公司 增强蛋白表达和纯化的方法和组合物

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101679989A (zh) * 2006-12-29 2010-03-24 生命感应器公司 增强蛋白表达和纯化的方法和组合物

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Engineering E.coli cell surface in order to develop a one-step purification method;Fasehee等;《AMB Express》;20180630(第8期);1-10 *
Functional cell surface display and controlled secretion of diverse Agarolytic enzymes by Escherichia coli with a novel ligation-independent cloning vector based on the autotransporter YfaL;，Hyeok-Jin Ko等;《Appl Environ Microbiol》;20120217;第78卷(第9期);3051-3058 *
SUMO蛋白酶Ulp1的高效表达纯化并通过His-SUMO标签制备scFv;李诗洁等;《中国生物工程杂志》;20180118;第38卷(第3期);51-61 *

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