CN114438060B - 一种重组改性ulp1蛋白酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组改性ULP1蛋白酶及其制备方法，所述蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述蛋白酶的制备方法包括如下步骤：构建所述蛋白酶的载体；构建基因工程菌并进行培养得所述蛋白酶；进行所述蛋白酶的纯化。本发明公开的这种重组改性ULP1蛋白酶可以有效地进行切除SUMOstar标签。

Description

一种重组改性ULP1蛋白酶及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言属于一种重组改性ULP1蛋白酶及其制备方法。

背景技术

近年来，重组蛋白表达技术日新月异，蛋白融合表达技术的优势越发突显，SUMO标签由于其具有良好的促融促表达效果，已经广泛运用于现在重组蛋白的表达，但融合蛋白的表达，最终需要切除融合标签，目前原核表达系统常用的是基于酵母的SUMO-ULP1体系，但由于真核宿主本身会表达ULP1的同源蛋白酶，会造成融合蛋白在真核系统使用时，表达过程中就会将融合标签切除，针对这个问题，已有研究者开发出了相应的SUMO标签的突变体SUMOstar，但该突变体不能用ULP1蛋白酶切除，因此亟需一种可以切除所述突变标签的蛋白酶。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种重组改性ULP1蛋白酶，所述蛋白酶是通过在现有的ULP1蛋白酶基础上通过某些位点的突变而得到的，其可以用于SUMOstar标签的切除。

本发明的第二目的在于提供上述重组改性ULP1蛋白酶的制备方法，提供的本方法用于制备上述蛋白酶，该方法操作简单，成本低廉，可以有效的制备上述蛋白酶，适用于推广应用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明公开的重组改性ULP1蛋白酶氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。其中相较于原ULP1蛋白酶，本发明的蛋白酶氨基酸序列为第54号氨基酸突变为Arg氨基酸。

并且本发明还提供了一种试剂盒，其包含了上述重组改性ULP1蛋白酶。

本发明还提供了编码该蛋白酶的核酸。

本发明还提供了核酸的载体。

本发明提供的蛋白酶的制备方法包括如下步骤：

首先构建所述重组改性ULP1蛋白酶。也即是运用定点突变技术对ULP1蛋白酶表达载体进行突变，并筛选突变成功的重组转化子，进行测序验证其序列是否符合要求。

构建所述重组改性ULP1蛋白酶的基因工程菌，并对所述基因工程菌进行克隆培养可得所述蛋白酶。

培养结束后进行所述蛋白酶的纯化。

其中构建基因工程菌包括如下步骤：

首先转化感受态细胞BL21(DE3)，转化成功后挑选含有重组质粒的转化后细胞进行接种至培养基培养，在37℃，220rpm的条件下进行初步培养，初步培养结束后，将细胞进行1：100的放大培养，培养条件依然是37℃，220rpm。

放大培养至一定条件后，降温至10℃-25℃，优选为16℃，降温持续时间为0.5-2h，优选为1h；使用IPTG进行诱导，诱导时间为18h-22h，优选为20h；而后，在8000rpm转速下离心5min-10min，优选为8min，收集菌体，并放置于-80℃保存。

所述蛋白酶的纯化包括如下步骤：

对所述基因工程菌依次进行重悬、菌体破碎和离心后，过滤得粗酶液，使用亲和层析和离子交换层析对所述粗酶液进行纯化。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)可以有效的切除SUMO标签的突变体SUMOstar标签。

(2)制备方法简单便捷，利于操作，成本低。

具体实施方式

下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。

本发明中用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点。

本发明中涉及浓度数值，其含义包括在一定范围内的波动。比如，可以在相应的精度范围内波动，比如2％，可以允许±0.1％范围内波动。对于数值较大或无需过于精细控制的数值，还允许其含义包括更大波动，比如100mM，可以允许±1％、±2％、±5％等范围内的波动。涉及分子量，允许其含义包括±10％的波动。

本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本发明中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：

图1为本发明实施例提供的亲和层析纯化电泳示意图；其中图1中1为Pellet ofcell lysate破菌离心后沉淀；2为Supernatant of cell lysate破菌离心后上清液；3为Flow through Ni柱纯化后流穿组分；4为Wash fraction with 20mM imidazole使用20mM咪唑洗脱后组分；5、6、7分别为Elute fraction with 30mM imidazole、Elute fractionwith 50mM imidazole、Elute fraction with 250mM imidazole也即是使用30mM、50mM、250mM咪唑洗脱后组分；M为Marker；

图2为本发明实施例提供的离子交换层析纯化电泳示意图；其中图2中1为Beforeloaded onto HiTrap Q 10ml纯化前样品；8-18、27-28、40-41、52、62分别为Elutefraction of Peak 1、Elute fraction of Peak 2、Elute fraction of Peak 3、Elutefraction of Peak 4、Elute fraction of Peak 5，均为洗脱样品；

图3为本发明实施例提供的离子交换层析纯化色谱图；

图4为本发明实施例提供的蛋白酶酶切电泳示意图；其中图4中1为稀释3倍后SUMOstar标签融合蛋白；2、3、4、5、6分别为1：50、1：100、1：200、1：500和1：1000的比例下进行的酶切实验；7为Marker。

为了更加清晰的对本发明中的技术方案进行阐述，下面以具体实施例的形式进行说明。

实施例1

本实施例提供了一种重组改性ULP1蛋白酶，所述蛋白酶的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示，其中相较于原ULP1蛋白酶，本发明的蛋白酶氨基酸序列为第54号氨基酸突变为Arg氨基酸。

本实施例还提供编码该氨基酸的核酸。

该蛋白酶是通过在野生的ULP1蛋白酶基础上经过某些位点的突变所得到的突变体蛋白酶，并且本发明的重组改性ULP1蛋白酶可以做到原有的ULP1蛋白酶所无法实现的切除SUMOstar标签的效果。

本申请所请求保护的重组改性ULP1蛋白酶可以为与所述重组改性ULP1蛋白酶实质上相似的酶。

“实质上相似”意指给定核酸或氨基酸序列与参比序列共有至少约80％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性或至少约99.5％同一性的序列的酶，保留ULP1蛋白酶活性，并且其具有相似或更强的效果。

实质上相似的酶通常较参比序列发生保守性的氨基酸置换，通常视为保守置换的置换是在脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile中的彼此置换、羟基残基Ser和Thr的互换、酸性残基Asp和Glu的交换、酰胺残基Asn和Gln之间的置换、碱性残基Lys和Arg的交换以及芳香残基Phe、Tyr间的置换。

另外，实质上相似的酶还包括通过天然过程(诸如加工和其他翻译后修饰)，或通过化学修饰技术所得到衍生物，例如通过添加一个或多个聚乙二醇分子、糖、磷酸酯和/或其他这样的分子来进行化学修饰，其中一个或多个分子不是天然地附着到蛋白质，衍生物包括盐。这样的化学修饰在基础教科书和更详细的专论中以及在大量研究文献中有详细描述，并且它们是本领域技术人员熟知的。应当理解，相同类型的修饰可以以相同或不同程度存在于给定蛋白质或多肽中的几个位点。此外，给定的蛋白质或多肽可以含有许多类型的修饰。修饰可发生在蛋白质或多肽中的任何位置，包括肽骨架，氨基酸侧链以及氨基或羧基末端。修饰包括例如乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价连接黄素、共价连接血红素部分、共价连接核苷酸或核苷酸衍生物、共价连接脂质或脂质衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、交联、环化、形成二硫键、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲基化、γ-羧化、糖基化、形成GPI锚接、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白质酶解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、烃基化和ADP-核糖基化、硒化、硫酸化、蛋白质的氨基酸的传递RNA介导加成(诸如精氨酰化)以及泛素化。它们还可以结合至维生素，例如生物素、叶酸或维生素B12。参见例如Proteins--Structure And Molecular Properties,2nd Ed.,T.E.Creighton,W.H.Freeman andCompany,New York(1993)和Wold,F.,“Posttranslational Protein Modifications：Perspectives and Prospects,”pgs.1-12in Posttranslational CovalentModification Of Proteins,B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York(1983)；Seifter等人.,MetH.Enzymol.182：626-646(1990)和Rattan等人,“Protein Synthesis：Posttranslational Modifications and Aging,”Ann.N.Y.Acad.Sci.663：48-62 1992)。术语“衍生物”包括导致蛋白质或多肽在支链化或不支链化的情况下变成支链的或环状的化学修饰。环状、支链和支链圆形蛋白质或多肽可以从翻译后自然加工得来并且还可以完全由合成方法制成。在一些实施方式中，化合物可以共价连接至载体蛋白质，诸如血清白蛋白或其他血浆蛋白质。

实质上相似的酶可以不具有切除SUMOstar标签的效果，或者具有减弱的切除效果。

可以通过众所周知的方法例如定点诱变来制备这些突变体。

本领域技术人员在本申请的基础上容易对上述效果进行验证，这不需要付出创造性劳动，因而在上述重组改性ULP1蛋白酶基础上进行突变得到的重组改性ULP1蛋白酶突变体也在本申请的保护范围内。

并且本实施例还提供了一种试剂盒，该试剂盒包括上述重组改性ULP1蛋白酶。

所述试剂盒优选用于执行SUMOstar标签的切除。

术语“试剂盒”是指包括至少一个设备的任何制品，例如包装或容器，可进一步包括在本文中描述的方法或其步骤中使用的使用说明书、补充试剂和/或组分或组件。

优选的，试剂盒中的核酸组分和蛋白组分，例如引物和重组改性ULP1蛋白酶以干粉形式存放于试剂盒中。各组分也可以以冻干形式，例如以一种或多种所谓的冻干珠的形式实现。冻干珠通常可以被理解为是指在制造后(在所述制造后物质通常作为粉末存在)被压制成球形的冻干物。

根据本发明的再一方面，还涉及一种组合物，其包含如上所述的重组改性ULP1蛋白酶。

在一些实施方式中，所述组合物，其由如上所述的试剂盒中的各成分混合得到。

核酸通常是RNA或DNA。核酸可以是单链或双链的。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。当其连入载体时优选采用DNA核酸。核酸可以经过密码子优化以在期望的宿主细胞中获得更为高效的表达。

根据本实施例的再一方面，还涉及包含如上所述核酸的载体。

术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌粒、柯斯质粒或人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。

本发明还涉及宿主细胞，其基因组中如上所述的核酸，或被如上所述的载体所转化。

术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。宿主细胞优选为真核细胞。

本实施例还提供了所述蛋白酶的制备方法，其包括如下步骤：

运用定点突变技术对ULP1蛋白酶表达载体进行突变，筛选重组转化子，测序验证，突变后序列如SEQ ID NO：1所示；

构建基因工程菌并进行培养得到所述蛋白酶，具体为：转化感受态细胞BL21(DE3)，挑取含有重组质粒的转化后细胞克隆接种至5ml的LB培养基，在37℃，220rpm条件下，培养到一定标准后，按1：100转接到500L的LB培养基进行放大培养，放大培养的条件为37℃，220rpm，培养至OD600达到0.5～0.6的标准后，降温至16℃，其中降温温度可以为10℃-25℃；降温持续1h，降温持续时间可以为0.5h-2h，待培养至OD600达到0.8标准时加入0.5mM IPTG诱导，诱导20h后，在8000rpm条件下，离心5min收集菌体，其中离心时间可以为5min-10min，后置于-80℃条件下保存，其中所述诱导时间可以为18h-22h，所述离心时间可以为5min-10min。

进行所述蛋白酶的纯化，具体为：将上述培养得到的蛋白酶菌泥以20％菌浓进行重悬，菌体破碎，破碎结束后进行离心电泳得1.Pellet of cell lysate，之后过0.45um尺寸滤膜后获得粗酶液电泳得2.Supernatant of cell lysate，然后采用亲和层析和离子交换层析技术进行纯化。

其中，亲和层析如图1所示，使用的是AKTA系统装配5mL HisTrap HP，具体包括如下步骤：滤膜过滤后的样品以5mL/min流速上样电泳得3.Flow through，然后采用结合缓冲液(50mM Tris，300mM NaCl，10％Glycerol，pH8.0)冲洗直至未结合蛋白完全洗脱，接着采用20mM咪唑洗脱杂蛋白4个柱体积，进行电泳得4.Wash fraction with 20mM imidazole，然后再分别使用30、50和250mM咪唑分别进行洗脱目标蛋白，每次洗脱结束后也进行电泳，分别得：5.Elute fraction with 30mM imidazole、6.Elute fraction with 50mMimidazole、7.Elute fraction with 250mM imidazole。

离子交换层析如图2-3所示，离子交换层析包括如下步骤：将上述亲和层析得到的洗脱蛋白稀释3倍后电泳得1.Before loaded onto HiTrap Q 10ml，将样品以5mL/min流速上样HiTrap Q，然后采用平衡缓冲液A(50mM Tris，100mM NaCl，10％Glycerol，pH 8.0)冲洗直至未结合蛋白完全洗脱，接着梯度洗脱20个柱体积至50％缓冲液B(50mM Tris，1000mMNaCl，10％Glycerol，pH 8.0)洗脱目标蛋白，洗脱过程中电泳得8-18.Elute fraction ofPeak 1、27-28.Elute fraction of Peak 2、40-41.Elute fraction of Peak 3、52.Elutefraction of Peak 4、62.Elute fraction of Peak 5。

实验例1

在50mM Tris，500mM NaCl，10％Glycerol，1mM TCEP，pH值为8.0，温度为4℃条件下，分别对四组SUMOstar标签蛋白酶进行持续16小时的酶切实验，四组酶切实验中，SUMOstar标签蛋白酶和重组改性ULP1蛋白酶的比例以质量份数计分别为，1：50、1：100、1：200、1：500和1：1000，酶切实验结束后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，电泳结果如图4所示。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 嘉兴维亚生物科技有限公司

<120> 一种重组改性ULP1蛋白酶及其制备方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 228

<212> PRT

<213> Artificial synthesis

<400> 1

Met Leu Val Pro Glu Leu Asn Glu Lys Asp Asp Asp Gln Val Gln Lys

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ser Arg Glu Asn Thr Gln Leu Met Asn Arg Asp Asn Ile

20 25 30

Glu Ile Thr Val Arg Asp Phe Lys Thr Leu Ala Pro Arg Arg Trp Leu

35 40 45

Asn Asp Thr Ile Ile Arg Phe Phe Met Lys Tyr Ile Glu Lys Ser Thr

50 55 60

Pro Asn Thr Val Ala Phe Asn Ser Phe Phe Tyr Thr Asn Leu Ser Glu

65 70 75 80

Arg Gly Tyr Gln Gly Val Arg Arg Trp Met Lys Arg Lys Lys Thr Gln

85 90 95

Ile Asp Lys Leu Asp Lys Ile Phe Thr Pro Ile Asn Leu Asn Gln Ser

100 105 110

His Trp Ala Leu Gly Ile Ile Asp Leu Lys Lys Lys Thr Ile Gly Tyr

115 120 125

Val Asp Ser Leu Ser Asn Gly Pro Asn Ala Met Ser Phe Ala Ile Leu

130 135 140

Thr Asp Leu Gln Lys Tyr Val Met Glu Glu Ser Lys His Thr Ile Gly

145 150 155 160

Glu Asp Phe Asp Leu Ile His Leu Asp Cys Pro Gln Gln Pro Asn Gly

165 170 175

Tyr Asp Cys Gly Ile Tyr Val Cys Met Asn Thr Leu Tyr Gly Ser Ala

180 185 190

Asp Ala Pro Leu Asp Phe Asp Tyr Lys Asp Ala Ile Arg Met Arg Arg

195 200 205

Phe Ile Ala His Leu Ile Leu Thr Asp Ala Leu Lys Leu Glu His His

210 215 220

His His His His

225

Claims (11)

1.一种重组改性ULP1蛋白酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的重组改性ULP1蛋白酶。

3.编码权利要求1所述蛋白酶的核酸。

4.包含权利要求3所述核酸的载体。

5.权利要求1所述的蛋白酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

构建所述蛋白酶的载体；

构建基因工程菌并进行培养得所述蛋白酶；

进行所述蛋白酶的纯化。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，构建基因工程菌包括如下步骤：

转化感受态细胞；

将转换后细胞进行培养；

进行降温并诱导、离心收集菌体。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶的纯化包括如下步骤：

对所述基因工程菌依次进行重悬、菌体破碎和离心后，过滤得粗酶液，使用亲和层析和离子交换层析对所述粗酶液进行纯化。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述降温温度为10℃-25℃，降温持续时间为0.5h-2h。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述降温温度为16℃，降温持续时间为1h。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述诱导时间为18h-22h，所述离心时间为5min-10min。

11.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述诱导时间为20h；所述离心时间为8min。