CN115992103A - 酶突变体及类蛇毒三肽的制备方法 - Google Patents

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CN115992103A CN202211641442.5A CN202211641442A CN115992103A CN 115992103 A CN115992103 A CN 115992103A CN 202211641442 A CN202211641442 A CN 202211641442A CN 115992103 A CN115992103 A CN 115992103A
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丁小妹
申威
张敏敏
于铁妹
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及酶突变体及类蛇毒三肽的制备方法。本发明提供了氨基酸连接酶的突变体，包括PDLigA或APDLigB，以及两者的融合蛋白APDLigAB；还提供了所述突变体或融合蛋白在制备类蛇毒三肽中的应用，以及类蛇毒三肽的制备方法。该方法在生产成本、能耗、产品品质以及绿色指数方面都表现出突出的优势。

Description

酶突变体及类蛇毒三肽的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及酶突变体及类蛇毒三肽的制备方法。
背景技术
类蛇毒三肽(Tripeptide-3)是化妆品领域常用的高效祛皱美容肽。其序列是β-Ala-Pro-Dab-NHBn，又被叫做二肽二氨基丁酸苄基盐或SYN-AKE；类蛇毒三肽是一种模拟剧毒的瓦氏蝮蛇(Tropidolaemus wagleri)毒液毒素中Waglerin I活性的小肽，它可作用于突触后膜，并且是乙酰胆碱受体的可逆拮抗剂；研究结果表明当使用4％类蛇毒三肽溶液28天后能减少52％的面部皱纹，因此类蛇毒三肽是及时的或长期的细皱纹和粗皱纹消除解决方案。与此同时，类蛇毒三肽还有对血管内皮细胞氧化应激损伤和炎性损伤的保护作用。
类蛇毒肽制备方法：
目前类蛇毒三肽制备方法都是化学合成法，而其化学法又分为固相合成法以及液相合成法。
该类方法需要用到保护的氨基酸作为原料，然后进行逐个缩合，最后进行C-端修饰苄胺。在具体使用过程中需要不断偶联、脱保护，步骤繁琐，整体收率低，产品纯度也低。特别需要指出的是在化学缩合过程中容易产生Dab的消旋，该消旋杂质对最终产品质量有较大影响。在化学偶联及脱保护过程中不可避免的会使用大量有机溶剂甚至是重金属，这对环境以及产品的使用造成一定的安全隐患。
如上面所述，现今类蛇毒三肽的工业生产方式主要是化学合成。但由于化学合成法需要用保护氨基酸以及化学偶联的方式，整体的制备路线长、收率低，同时生产过程中需要用到有机溶剂/重金属、因此环境污染大，化学制备过程中偶联导致的氨基酸消旋问题也大大的影响了类蛇毒三肽产品的品质。
发明内容
有鉴于此，本发明提供酶突变体及类蛇毒三肽的制备方法，开拓性地利用生物酶作为催化剂，在水溶液中高收率的将三个原料氨基酸连接，反应条件温和，操作简便且无其他杂质生成。本发明所展示的类蛇毒三肽制备方法具有显著的优势。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了氨基酸连接酶的突变体，包括：
(I)、突变体1，包括将Uniprot ID为A0A1H0FZL2的氨基酸连接酶的第13位天冬氨酸突变为组氨酸、第81位谷氨酰胺突变为天冬氨酸、第83位脯氨酸突变为半胱氨酸、第85位缬氨酸突变为亮氨酸、第238位异亮氨酸突变为丙氨酸、第240位天冬氨酸突变为谷氨酸、第241位脯氨酸突变为苏氨酸、第288位苏氨酸突变为苯丙氨酸、第290位甘氨酸突变为谷氨酰胺、第292位缬氨酸突变为异亮氨酸、第336位缬氨酸突变为甘氨酸；
或
(II)、突变体2，包括将Uniprot ID为A0A2N7GIY4的氨基酸连接酶的第10位脯氨酸突变为甘氨酸、第78位丝氨酸突变为组氨酸、第80位酪氨酸突变为异亮氨酸、第82位亮氨酸突变为丙氨酸、第237位缬氨酸突变为甲硫氨酸、第240位天冬氨酸突变为苏氨酸、第241位缬氨酸突变为异亮氨酸、第284位甘氨酸突变为苏氨酸、第286位丙氨酸突变为谷氨酸、第288位缬氨酸突变为酪氨酸、第332位甘氨酸突变为天冬酰胺；
或
(III)、所述突变体1和所述突变体2的融合蛋白；
所述融合蛋白包括以一个或若干个连接肽连接所述突变体1和所述突变体2；
所述若干个为2个至10个。
在本发明的一些具体实施方案中，上述突变体包括：
所述突变体1具有：
(1)、如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；或
(2)、如(1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或
(3)、与如(1)或(2)所示的氨基酸序列至少有70％同源性的氨基酸序列；
或
所述突变体2具有：
(4)、如SEQ ID No.7所示的氨基酸序列；或
(5)、如(4)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(4)的相同或相似；或
(6)、与如(4)或(5)所示的氨基酸序列至少有70％同源性的氨基酸序列；
或
所述融合蛋白具有：
(7)、如SEQ ID No.8所示的氨基酸序列；或
(8)、如(7)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(7)的相同或相似；或
(9)、与如(7)或(8)所示的氨基酸序列至少有70％同源性的氨基酸序列；
所述多个为2个至250个；
或
所述连接肽具有：
(10)、如SEQ ID No.13所示的氨基酸序列；或
(11)、如(10)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或若干个残基获得的氨基酸序列，且功能与(10)的相同或相似；或
(12)、与如(10)或(11)所示的氨基酸序列至少有70％同源性的氨基酸序列；
所述若干个为2个至10个。
本发明还提供了核酸分子，编码上述突变体；
或
所述核酸分子具有：
(13)、如SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.12任一所示的核苷酸序列；或
(14)、如(13)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(13)的相同或相似；或
(15)、与如(13)或(14)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；
所述多个为2个至700个。
本发明还提供了表达载体，包括上述核酸分子，以及可接受的基因元件。
本发明还提供了宿主细胞，包括上述核酸分子或上述表达载体。
本发明还提供了组合物，包括上述突变体和三磷酸腺苷。
在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物还包括多聚磷酸激酶或多聚磷酸；
所述多聚磷酸包括偏六磷酸。
在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物的所述多聚磷酸激酶具有：
(16)、如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或
(17)、如(16)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(16)的相同或相似；或
(18)、与如(16)或(17)所示的氨基酸序列至少有70％同源性的氨基酸序列；
所述多个为2个至80个。
本发明还提供了上述突变体中的所述突变体1在制备Pro-Dab-Bn中的应用。
本发明还提供了如下任一项在合成类蛇毒三肽中的应用：
(i)、上述突变体；
(ii)、上述核酸分子；
(iii)、上述表达载体；
(iv)、上述宿主细胞；
(v)、上述组合物。
本发明还提供了类蛇毒三肽的制备方法，包括：
(a)、将氨基酸和上述突变体中的所述突变体1、所述突变体2混合，获得类蛇毒三肽；或
(b)、将氨基酸、Pro-Dab-Bn和上述突变体中的所述突变体2混合，获得类蛇毒三肽；或
(c)、将氨基酸和上述突变体中的所述融合蛋白混合，获得类蛇毒三肽；或
(d)、表达上述核酸分子，获得的蛋白产物与氨基酸混合，获得类蛇毒三肽；或
(e)、表达上述表达载体，获得的蛋白产物与氨基酸混合，获得类蛇毒三肽；或
(f)、培养上述宿主细胞，获得的蛋白产物与氨基酸混合，获得类蛇毒三肽；或
(g)、将氨基酸和上述组合物混合，获得类蛇毒三肽；
所述氨基酸包括β-ala、L-Pro和/或Dab-Bn。
本发明酶突变体及类蛇毒三肽的制备方法有如下效果：
本发明发现柿树放线动孢菌氨基酸连接酶具有连接L-脯氨酸与1,4-二氨基丁酸苄酯形成Pro-Dab-Bn二肽以及与慢弧菌体内的氨基酸连接酶将Pro-Dab-Bn与β-丙氨酸结合成类蛇毒三肽的特性。通过对该两个酶进行改造后显著提高其催化活性从而得以高浓度、高收率的将三个氨基酸连接成类蛇毒三肽。相比于市面上化学合成工艺，该方法生产成本、能耗、产品品质以及绿色指数方面都表现出突出的优势。因此该方法的规模化生产将是上述类蛇毒三肽生产的最佳选择。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示Pro-Dab-Bn核磁谱图；其数据为：1H NMR(400MHz,D2O)δ7.55–7.06(m,5H),4.50–4.32(m,4H),3.61(t,J＝6.7Hz,2H),3.17–3.05(m,2H),2.33-2.13(m,3H),2.01-1.85(m,3H).；MS(ESI):m/z:305.2[M+H]+；
图2示实施例2反应后液相检测产物的生成；
图3示实施例2产物的HPLC纯度检测；
图4示实施例2产物的质谱检测；
图5示β-Ala-Pro-Dab-Bn核磁谱图；其数据为：1H NMR(400MHz,D2O)δ7.52–7.08(m,5H),4.52–4.36(m,4H),3.63(t,J＝6.7Hz,2H),3.21(t,J＝6.5Hz,2H),3.16–3.05(m,2H),2.85(t,J＝6.5Hz,2H),2.31-2.13(m,3H),2.02-1.83(m,3H).；
图6示专利中使用的蛋白质的胶图；其中，左端泳道为Marker。
具体实施方式
本发明公开了酶突变体及类蛇毒三肽的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
文献报道丁香假单胞菌体内的一个氨基酸连接酶(Uniprot:Q842E2)能将多种多样的氨基酸进行连接，并且通过简单的突变就能实现含L-脯氨酸二肽的合成。以此为线索，通过对NCBI基因库分析检索及实验验证我们找到柿树放线动孢菌(Actinokineosporaalba)体内Q842E2同源蛋白A0A1H0FZL2具有能催化连接Pro-Dab-Bn的微弱活性。与此同时，我们还发现了慢弧菌(Vibrio lentus)体内的一个连接酶(Uniprot:A0A2N7GIY4)能将含脯氨酸的二肽与β-丙氨酸结合。在此基础上，通过对以上两个酶系统的突变改造最终获得高活性的连接酶(PDLigA&APDLigB)，利用此酶可以将三个氨基酸(β-ala，L-Pro，Dab-Bn)高收率的转化成类蛇毒三肽。
本专利氨基酸连接酶法制备类蛇毒三肽路线如下所示：
Figure BDA0004009169090000051
该路线利用廉价的、官能团未保护的氨基酸作为起始原料，在等当量的三磷酸腺苷(ATP)以及对应的氨基酸连接酶作用下高收率的转化成相应的类蛇毒三肽。为进一步降低生产成本，反应体系中的ATP可以利用循环再生体系降低其使用量；同时也可以通过构建融合酶或固定化酶的方式来进一步降低具体生产所需酶的用量。因此相对于类蛇毒三肽化学合成工艺，本专利制备路线精简、高效、产品品质好，生产过程中绿色指数高且易于规模化生产。
本发明利用相应的连接酶在缓冲液中可一步直接将两个或三个目标氨基酸原料连接转化成相应的二肽/三肽产品。反应过程中所需要的三磷酸腺苷(ATP)可以是等当量的，或者催化剂量的(通过配上ATP再生体系，采用的是多聚磷酸激酶PPK与偏六磷酸)，所用酶可以是粗酶液或固定化酶。
本发明中所用酶的SDS-PAGE结果见图6。
本发明涉及的酶相关信息如下：
连接酶PDLigA0：母体来源于柿树放线动孢菌(Actinokineospora alba,UniprotID:A0A1H0FZL2)，没有突变。
连接酶PDLigA5：突变体第5个。催化效果没有达到预想要求。突变位点为：D13H，P83C，V85L，I238A，P241T，T288F，G290Q，V292I。
连接酶PDLigA：母体来源于柿树放线动孢菌(Actinokineospora alba,UniprotID:A0A1H0FZL2)，突变位点为：D13H，Q81D，P83C，V85L，I238A，D240E，P241T，T288F，G290Q，V292I，V336G。
连接酶APDLigB0：母体来源于慢弧菌(Vibrio lentus,Uniprot ID:A0A2N7GIY4)；没有突变。
连接酶APDLigB13：突变体第13个。催化效果没有达到预想要求。突变位点为：P10G，S78H，Y80I，V237M，G284T，A286E。
连接酶APDLigB：母体来源于慢弧菌(Vibrio lentus,Uniprot ID:A0A2N7GIY4)；突变位点为：P10G，S78H，Y80I，L82A，V237M，D240T，V241I，G284T，A286E，V288Y，G332N。
连接酶APDLigAB:通过基因层面的构建，将PDLigA与APDLigB连接起来，连接肽序列为：GGGGS EAAAK EAAAK GGGGS(SEQ ID No.13)。
多聚磷酸激酶(PPK)：来源于沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas palustris(Uniprot ID:Q6N140)
本发明涉及的序列信息：
表1
Figure BDA0004009169090000061
Figure BDA0004009169090000071
表2
Figure BDA0004009169090000072
Figure BDA0004009169090000081
Figure BDA0004009169090000091
本发明涉及的酶的发酵生产方法：
本专利所需的酶都是通过服务公司合成相应基因后构建在特定的表达质粒上再通过大肠杆菌发酵生产制得；其具体包含以下步骤：将以上酶所对应的基因进行序列优化后在下单到通用生物公司合成(安徽滁州)，再引进NdeI/XhoI酶切位点并亚克隆到pET28a表达载体上。确认序列正确的质粒转入E.coli(BL21)感受态细胞进行平板培养(擎科生物)以及单克隆小量液体培养，蛋白表达正确的菌最终进行逐级放大液体培养。其具体包含单菌落转入5mL含50μM卡那霉素的LB培养液中(37℃)进行培养，当细胞生长至对数期后接种到250mL含同样抗菌素的LB培养液中，同样生长到对数期时转入5L培养发酵罐里进行培养并进行最终的蛋白表达。在5L发酵罐培养中，当细胞OD～20时加入0.5mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)25℃诱导蛋白表达6小时，最后高速离心收集细胞(4000rpm，20min)获得酶过量表达湿细胞25～50g。取少量细胞先与三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)缓冲液(50mM，pH 8.0)在冰盆上混合均匀，然后利用冻融法破碎细胞、高速离心除细胞壁后清液跑SDS-PAGE凝胶电泳(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)确定蛋白表达。蛋白表达正确的菌体细胞用以进行下一步催化实验，具体来说，将剩余细胞与Tris.HCl缓冲液(50mM，pH8.0)在低温混合均匀(以～10克湿细胞：200mL缓冲液混合)，然后进行低温高压破碎细胞壁，高速离心(16000rpm，45min)除细胞壁后获得含酶清液备用(得到的酶活力在400～700U/mL，U是室温一分钟转化1μmol的底物所需酶量)。LB培养基构成为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉，1％NaCl，1％磷酸氢二钾、1％磷酸氢二钾以及5％的甘油。
本发明涉及的酶的固定化方法：
往上述收集的粗酶清液中缓慢加入硫酸铵固体至蛋白固体析出(20～50％w/v硫酸铵:缓冲液)，该蛋白固体通过高速离心(10000rpm，10分钟)收集后缓慢溶解到25mM pH8.0的Tris缓冲液中(缓冲液A)，然后在50倍体积的缓冲液A中透析(两次，每次间隔4小时)除去酶溶液里的含硫酸铵，最后透析液上样DEAE Seplite FF(西安蓝晓公司)阴离子交换柱(NaCl在缓冲液梯度洗脱：0～1N NaCl)得到初纯化的APDLigAB与PPK酶液；然后APDLigAB与PPK酶利用LX-1000EP环氧树脂(西安蓝晓公司)按活性单位1:(2～3)以下面的方法一次性混合固定化：2000U纯化混合酶溶解在1L 50mM pH 8.0的磷酸钾(缓冲液B)溶液中，随后加入30～50mM苯氧乙酸以及500克LX-1000EP环氧树脂至，室温搅拌10小时后过滤出固定化酶，最后用清水及缓冲液B各洗两次后低温保存待用，固定化酶具有70～92％的初始活力。
如无特殊说明，本发明涉及的原料、试剂、耗材以及仪器皆为普通市售品，均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：利用连接酶PDLigA制备Pro-Dab-Bn
Figure BDA0004009169090000101
在1L 100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入20.7克1,4-二氨基苄酯Dab-Bn(100mM)，12.1克L-脯氨酸(105mM)，58.2克三磷酸腺苷单钠盐(ATP，110mM)，然后通过NaOH水溶液将反应体系pH值到8.0后，加入连接酶PDLigA1500U启动反应，在室温(25℃)轻微搅拌并维持反应体系pH在7.0～9.0之间，3小时后通过HPLC检测到原料基本反应完全。然后用HCl水溶液调节pH到1.0将反应体系中的酶变性沉淀并离心除去，再将反应溶液pH调至7.0后直接上样D201阴离子交换树脂除二磷酸腺苷及游离磷酸杂质，最后粗产品利用反渗透膜除盐、浓缩并结晶(乙醇:水，2:1，v:v)得24.9克Pro-Dab-Bn二肽(收率82％)，进行核磁测试确认结构，见图1。数据为：1H NMR(400MHz,D2O)δ7.55–7.06(m,5H),4.50–4.32(m,4H),3.61(t,J＝6.7Hz,2H),3.17–3.05(m,2H),2.33-2.13(m,3H),2.01-1.85(m,3H).
实施例2：利用连接酶APDLigB制备类蛇毒三肽
Figure BDA0004009169090000111
与上述Pro-Dab-Bn制备方法类似，在1L 100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入30.4克Pro-Dab-Bn二肽(100mM)，9.8克β-丙氨酸(110mM)，58.2克三磷酸腺苷单钠盐(ATP，110mM)，然后通过NaOH水溶液将反应体系pH值到8.0后，加入连接酶APDLigB 2000U启动反应，在30℃轻微搅拌并维持反应体系pH在7.0～9.0之间，2小时后通过HPLC检测到原料基本反应完全，液相分析见图2。然后用HCl水溶液调节pH到1.0将反应体系中的酶变性沉淀并离心除去，再将反应溶液pH调至7.0后直接上样D201阴离子交换树脂除二磷酸腺苷及游离磷酸杂质，最后粗产品利用反渗透膜除盐、浓缩并结晶(乙醇:水，1:1，v:v)得32.6克类蛇毒三肽(β-Ala-Pro-Dab-Bn，收率87％)，HPLC纯度100％(图3)，质谱检测确认MS：376.2(图4)。并送样核磁确认结构(图5)：1H NMR(400MHz,D2O)δ7.52–7.08(m,5H),4.52–4.36(m,4H),3.63(t,J＝6.7Hz,2H),3.21(t,J＝6.5Hz,2H),3.16–3.05(m,2H),2.85(t,J＝6.5Hz,2H),2.31-2.13(m,3H),2.02-1.83(m,3H).
实施例3：利用连接酶APDLigAB一步生成类蛇毒三肽
Figure BDA0004009169090000112
同样在1L 100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入20.7克1,4-二氨基苄酯Dab-Bn(100mM)，12.1克L-脯氨酸(105mM)，9.8克β-丙氨酸(110mM)，116.4克三磷酸腺苷单钠盐(ATP，220mM)，然后通过NaOH水溶液将反应体系pH值到8.0后，加入连接酶APDLigAB 3000U启动反应，在30℃轻微搅拌并维持反应体系pH在7.0～9.0之间，4小时后通过HPLC检测到原料基本反应完全。然后用HCl水溶液调节pH到1.0将反应体系中的酶变性沉淀并离心除去，再将反应溶液pH调至7.0后直接上样D201阴离子交换树脂除二磷酸腺苷及游离磷酸杂质，最后粗产品利用反渗透膜除盐、浓缩并结晶(乙醇:水，1:1，v:v)得27.3克类蛇毒三肽(收率73％)。
实施例4：利用连接酶APDLigAB以及ATP再生体系一步生成类蛇毒三肽
Figure BDA0004009169090000121
同样在1L 100mM pH 7.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入20.7克1,4-二氨基苄酯Dab-Bn(100mM)，12.1克L-脯氨酸(105mM)，9.8克β-丙氨酸(110mM)，5.4克三磷酸腺苷单钠盐(ATP，10mM)，32.2克偏六磷酸钠(52.6mM)，调节溶液pH值到7.5后加入APDLigAB 2000U，多聚磷酸激酶PPK酶3000U启动反应。在30℃轻微搅拌并维持反应体系pH在7.0～9.0之间，3小时后通过HPLC检测到原料基本反应完全。然后用HCl水溶液调节pH到1.0将反应体系中的酶变性沉淀并离心除去，再将反应溶液pH调至7.0后直接上样D201阴离子交换树脂除二磷酸腺苷及游离磷酸杂质，最后粗产品利用反渗透膜除盐、浓缩并结晶(乙醇:水，1:1，v:v)得29.6克类蛇毒肽(收率79％)。
实施例5：利用固定化的APDLigAB与PPK一步生成类蛇毒三肽
Figure BDA0004009169090000122
反应与上述实施例4类似，在1L 100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入20.7克1,4-二氨基苄酯Dab-Bn(100mM)，12.1克L-脯氨酸(105mM)，9.8克β-丙氨酸(110mM)，5.4克三磷酸腺苷单钠盐(ATP，10mM)，32.2克偏六磷酸钠(52.6mM)，调节溶液pH值到8.0后加入混合固定的APDLigAB/PPK总活力4000U。在30℃下轻微搅拌并维持反应体系pH在7.0～9.0之间，4小时后通过HPLC检测到原料基本反应完全。然后直接过滤回收固定化的APDLigAB/PPK酶，该固体用25mM Tris pH 8.0缓冲液冲洗三次备用；反应液用HCl水溶液调节pH到1.0沉淀蛋白并离心除去，然后再将反应溶液pH调至7.0后直接上样D201阴离子交换树脂除二磷酸腺苷及游离磷酸杂质，最后粗产品利用反渗透膜除盐、浓缩并结晶(乙醇:水，1:1，v:v)得32.6克类蛇毒三肽(收率87％)，回收后的固定化的APDLigAB/PPK酶具有91％的初始活力。
对比例1：利用连接酶PDLigA0制备Pro-Dab-Bn
Figure BDA0004009169090000123
在1L 100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入20.7克1,4-二氨基苄酯Dab-Bn(100mM)，12.1克L-脯氨酸(105mM)，58.2克三磷酸腺苷单钠盐(ATP，110mM)，然后通过NaOH水溶液将反应体系pH值到8.0后，加入连接酶PDLigA0 1500U启动反应，在室温(25℃)轻微搅拌并维持反应体系pH在7.0～9.0之间，3小时后通过HPLC检测到原料只转化了20％。
对比例2：利用连接酶PDLigA5制备Pro-Dab-Bn
Figure BDA0004009169090000131
在1L 100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入20.7克1,4-二氨基苄酯Dab-Bn(100mM)，12.1克L-脯氨酸(105mM)，58.2克三磷酸腺苷单钠盐(ATP，110mM)，然后通过NaOH水溶液将反应体系pH值到8.0后，加入连接酶PDLigA0 1500U启动反应，在室温(25℃)轻微搅拌并维持反应体系pH在7.0～9.0之间，3小时后通过HPLC检测到原料约转化了50％。
对比例3：利用连接酶APDLigB0制备类蛇毒三肽
Figure BDA0004009169090000132
与上述对比例1中制备方法类似，在1L 100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入30.4克Pro-Dab-Bn二肽(100mM)，9.8克β-丙氨酸(110mM)，58.2克三磷酸腺苷单钠盐(ATP，110mM)，然后通过NaOH水溶液将反应体系pH值到8.0后，加入连接酶APDLigB 2000U启动反应，在30℃轻微搅拌并维持反应体系pH在7.0～9.0之间，2小时后通过HPLC检测到原料约35％转化成产品。
对比例4：利用连接酶APDLigB13制备类蛇毒三肽
Figure BDA0004009169090000133
与上述对比例3中制备方法类似，在1L 100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入30.4克Pro-Dab-Bn二肽(100mM)，9.8克β-丙氨酸(110mM)，58.2克三磷酸腺苷单钠盐(ATP，110mM)，然后通过NaOH水溶液将反应体系pH值到8.0后，加入连接酶APDLigB 2000U启动反应，在30℃轻微搅拌并维持反应体系pH在7.0～9.0之间，2小时后通过HPLC检测到原料约68％转化成产品。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (11)

1.氨基酸连接酶的突变体，其特征在于，包括：
(I)、突变体1，包括将Uniprot ID为A0A1H0FZL2的氨基酸连接酶的第13位天冬氨酸突变为组氨酸、第81位谷氨酰胺突变为天冬氨酸、第83位脯氨酸突变为半胱氨酸、第85位缬氨酸突变为亮氨酸、第238位异亮氨酸突变为丙氨酸、第240位天冬氨酸突变为谷氨酸、第241位脯氨酸突变为苏氨酸、第288位苏氨酸突变为苯丙氨酸、第290位甘氨酸突变为谷氨酰胺、第292位缬氨酸突变为异亮氨酸、第336位缬氨酸突变为甘氨酸；
或
(II)、突变体2，包括将Uniprot ID为A0A2N7GIY4的氨基酸连接酶的第10位脯氨酸突变为甘氨酸、第78位丝氨酸突变为组氨酸、第80位酪氨酸突变为异亮氨酸、第82位亮氨酸突变为丙氨酸、第237位缬氨酸突变为甲硫氨酸、第240位天冬氨酸突变为苏氨酸、第241位缬氨酸突变为异亮氨酸、第284位甘氨酸突变为苏氨酸、第286位丙氨酸突变为谷氨酸、第288位缬氨酸突变为酪氨酸、第332位甘氨酸突变为天冬酰胺；
或
(III)、所述突变体1和所述突变体2的融合蛋白；
所述融合蛋白包括以一个或若干个连接肽连接所述突变体1和所述突变体2；
所述若干个为2个至10个。
2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，包括：
所述突变体1具有：
(1)、如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；或
(2)、如(1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或
(3)、与如(1)或(2)所示的氨基酸序列至少有70％同源性的氨基酸序列；
或
所述突变体2具有：
(4)、如SEQ ID No.7所示的氨基酸序列；或
(5)、如(4)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(4)的相同或相似；或
(6)、与如(4)或(5)所示的氨基酸序列至少有70％同源性的氨基酸序列；
或
所述融合蛋白具有：
(7)、如SEQ ID No.8所示的氨基酸序列；或
(8)、如(7)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(7)的相同或相似；或
(9)、与如(7)或(8)所示的氨基酸序列至少有70％同源性的氨基酸序列；
所述多个为2个至250个；
或
所述连接肽具有：
(10)、如SEQ ID No.13所示的氨基酸序列；或
(11)、如(10)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或若干个残基获得的氨基酸序列，且功能与(10)的相同或相似；或
(12)、与如(10)或(11)所示的氨基酸序列至少有70％同源性的氨基酸序列；
所述若干个为2个至10个。
3.核酸分子，其特征在于，编码如权利要求1或2所述的突变体；
或
所述核酸分子具有：
(13)、如SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.12任一所示的核苷酸序列；或
(14)、如(13)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(13)的相同或相似；或
(15)、与如(13)或(14)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；
所述多个为2个至700个。
4.表达载体，其特征在于，包括如权利要求3所述的核酸分子，以及可接受的基因元件。
5.宿主细胞，其特征在于，包括如权利要求3所述的核酸分子或如权利要求4所述的表达载体。
6.组合物，其特征在于，包括如权利要求1或2任一项所述的突变体和三磷酸腺苷。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，还包括多聚磷酸激酶或多聚磷酸；
所述多聚磷酸包括偏六磷酸。
8.如权利要求6或7所述的组合物，其特征在于，所述多聚磷酸激酶具有：
(16)、如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或
(17)、如(16)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(16)的相同或相似；或
(18)、与如(16)或(17)所示的氨基酸序列至少有70％同源性的氨基酸序列；
所述多个为2个至80个。
9.如权利要求1或2所述的突变体中的所述突变体1在制备Pro-Dab-Bn中的应用。
10.如下任一项在合成类蛇毒三肽中的应用：
(i)、如权利要求1或2所述的突变体；
(ii)、如权利要求3所述的核酸分子；
(iii)、如权利要求4所述的表达载体；
(iv)、如权利要求5所述的宿主细胞；
(v)、如权利要求6至8任一项所述的组合物。
11.类蛇毒三肽的制备方法，其特征在于，包括：
(a)、将氨基酸和如权利要求1或2所述的突变体中的所述突变体1、所述突变体2混合，获得类蛇毒三肽；或
(b)、将氨基酸、Pro-Dab-Bn和如权利要求1或2所述的突变体中的所述突变体2混合，获得类蛇毒三肽；或
(c)、将氨基酸和如权利要求1或2所述的突变体中的所述融合蛋白混合，获得类蛇毒三肽；或
(d)、表达如权利要求3所述的核酸分子，获得的蛋白产物与氨基酸混合，获得类蛇毒三肽；或
(e)、表达如权利要求4所述的表达载体，获得的蛋白产物与氨基酸混合，获得类蛇毒三肽；或
(f)、培养如权利要求5所述的宿主细胞，获得的蛋白产物与氨基酸混合，获得类蛇毒三肽；或
(g)、将氨基酸和如权利要求6至8任一项所述的组合物混合，获得类蛇毒三肽；
所述氨基酸包括β-ala、L-Pro和/或Dab-Bn。
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