CN116769756B - Pg2-lc蛋白作为snap-25的水解酶的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了PG2‑LC蛋白作为SNAP‑25的水解酶的应用。PG2‑LC蛋白的酶切位点位于SNAP‑25氨基酸序列的第191位的精氨酸与192位的赖氨酸之间，以及SNAP‑25氨基酸序列的第209位的谷氨酰胺与210位的亮氨酸之间。本发明首次给出了PG2‑LC蛋白作为SNAP‑25的水解酶，PG2‑LC蛋白在胞内能够水解大鼠和果蝇的SNAP‑25，由于大鼠SNAP‑25与人类SNAP‑25高度相似，因此可推知PG2‑LC蛋白能够水解人类SNAP‑25，为PG2‑LC蛋白在面部除皱、SNARE复合体功能障碍相关疾病的治疗等方面奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学与生物化学技术领域，涉及蛋白功能，具体涉及PG2-LC蛋白作为SNAP-25的水解酶的应用。
背景技术
戈氏类梭菌(Paeniclostridium ghonii)是一类菌体呈杆状，嗜温性的革兰氏阳性菌。这类菌可游动，以二元分裂的方式进行增殖，属于专性厌氧菌，能利用多种有机物质进行生长。在逆境环境下，这类菌能产生内生孢子，从而能够抵御高温及脱水环境。戈氏类梭菌之前很长一段时间被称为戈氏梭菌(Clostridium ghonii)，通过对其16S RNA测序并进行系统进化分析后将其与同属的双酶梭状芽胞杆菌(Clostridium sordellii)合并归为类梭菌属(Paeniclostridium)。戈氏类梭菌属于非致病菌，之前有研究表明这类菌在实体瘤癌症的治疗过程中具有积极的作用。这主要是因为实体瘤内部的血管畸形限制了氧的供应从而形成局部缺氧环境，为戈氏类梭菌的生长提供了适宜的环境。一方面，戈氏类梭菌在实体瘤内的萌发与生长能有效的激发免疫反应，从而有利于抗肿瘤的治疗；另一方面，戈氏类梭菌能够分泌胶原蛋白酶Ⅳ以及磷脂酶C，从而促进肿瘤细胞的凋亡与坏死。
戈氏类梭菌的生物安全级别被列为一类，未见有毒素基因及毒力蛋白的报道。2022年，加拿大某课题组通过生物信息学的手段在戈氏类梭菌的菌株DSM 15049中发现了一个可能的毒力蛋白，将其命名为PG-toxin2-LC(即本发明中记载的PG2-LC)，目前关于PG-toxin2-LC的功能未见报道，其潜在应用价值也有待开发。
链裂解突触相关膜蛋白25(synaptosomal-associated protein 25，SNAP-25)，是SNARE复合体的一个重要成员，在人类、大鼠、果蝇、非洲爪蟾等生物中均存在其同源基因，SNARE复合体在钙触发的突触囊泡融合和神经递质释放到突触裂隙的过程中起到关键作用，若SNARE复合体无法形成或被水解破坏，则会阻断乙酰胆碱的释放，使得组织无法接受信号，利用上述原理可以治疗某些肌肉功能亢进性疾病，或弱化面部肌肉的亢进状态，实现改善或消除皱纹。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于，提供PG2-LC蛋白作为SNAP-25的水解酶的应用，解决现有技术中的PG-toxin2-LC蛋白的功能未知，其应用受限的技术问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案予以实现：
PG2-LC蛋白作为SNAP-25的水解酶的应用。
本发明还具有如下技术特征：
具体的，PG2-LC蛋白的酶切位点包括：SNAP-25氨基酸序列的第191位的精氨酸与192位的赖氨酸之间，以及SNAP-25氨基酸序列的第209位的谷氨酰胺与210位的亮氨酸之间。
具体的，所述的PG2-LC蛋白的氨基酸序列为：MAPITIKDFKYNTLPNGND VVLVKNEKGTADKGFFVADNILVVPERYGEIQGEEGGTAPKEATEVRDKQYLQSEEHKDEFLKMITVLLKRINSKPEGSEFLNIMTKAEPLYDINNGEFKERCTSRYVETTTGQRRVNVIITGPGTNLTEGITIPYITENTRALESNGFGSASTISITPFYELGYIKDHKNPEEKYCADPAMSLYHELVHAFHNLYGINFNHTKIEETSLEEYVTFGRYNEKSCVEMNKVGMYAGTSLLKSFDEINTLKEADKSKINNIFENKLTLLFGEKTSANNESDIAKIALKIDKKIHAFTECEFAKAFNTKTGGIYVRDDYNYTSATPLKFEKLLDNYHPQDGFIKYGKPMYEGQHIKNKYIATNPAITSKKARFRFLLKK。
可选且具体的，所述的SNAP-25为果蝇SNAP-25和大鼠SNAP-25；PG2-LC蛋白作为胞内水解酶的应用的方法包括如下步骤：
步骤一，构建哺乳动物细胞表达载体；
步骤二，PG2-LC蛋白和SNAP-25共表达：
将步骤一获得的PG2-LC蛋白和SNAP-25的哺乳动物细胞表达载体一同转染进哺乳动物细胞中，培养24～72小时后，收集细胞并提取蛋白，获得SNAP-25的水解产物。
可选且具体的，所述的SNAP-25为果蝇SNAP-25；PG2-LC蛋白作为体外水解酶的应用的方法包括如下步骤：
步骤一，构建体外表达载体；
步骤二，制备PG2-LC蛋白和SNAP-25；
步骤三，进行酶切反应：
将步骤二获得的PG2-LC蛋白和SNAP-25一同加入反应缓冲液中混合均匀，获得酶切反应液，然后将酶切反应液于37℃的温度下进行酶切反应0.5～6h后，获得SNAP-25的水解产物。
优选的，步骤三中，酶切反应液中PG2-LC蛋白的终浓度为0.1μM，SNAP-25的终浓度为0.3mg/mL。
本发明与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明首次给出了PG2-LC蛋白作为SNAP-25的水解酶，PG2-LC蛋白在胞内能够水解大鼠和果蝇的SNAP-25，由于大鼠SNAP-25与人类SNAP-25高度相似，因此可推知PG2-LC蛋白能够水解人类SNAP-25，为PG2-LC蛋白在面部除皱、SNARE复合体功能障碍相关疾病的治疗等方面奠定了基础。
附图说明
图1为实施例1和对比例1中SNAP-25水解产物的蛋白免疫印迹图。图1中：“-”表示阴性对照组(即转染了SNAP-25表达载体的HEK293T细胞的总蛋白)，“A”表示对照蛋白A组，“B”表示对照蛋白B组，“PG1”表示PG1-LC蛋白组，“PG2”表示PG2-LC蛋白组；“HA-SNAP25(rat)”表示采用HA抗体的检测结果，“FLAG”表示采用FLAG标签抗体的检测结果，“β-actin”表示采用肌动蛋白抗体的检测结果。
图2为实施例2中SNAP-25水解产物的蛋白免疫印迹图。图1中：“-”表示阴性对照组(即转染了SNAP-25表达载体的HEK293T细胞的总蛋白)，“A”表示对照蛋白A组，“B”表示对照蛋白B组，“PG1”表示PG1-LC蛋白组，“PG2”表示PG2-LC蛋白组；“HA-SNAP25(fly)”表示采用HA抗体的检测结果，“FLAG”表示采用FLAG标签抗体的检测结果，“β-actin”表示采用肌动蛋白抗体的检测结果。
图3为实施例3中SNAP-25水解产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图3中：“M”表示蛋白Marker，“SNAP25(fly)”表示未水解的果蝇SNAP-25，“Hydrolysate”表示SNAP-25的水解产物。
图4为实施例3中SNAP-25水解产物的质谱图。
图5为实施例3中PG2-LC蛋白的酶切位点位置示意图。
以下结合实施例对本发明的具体内容作进一步详细解释说明。
具体实施方式
需要说明的是，本发明中的所有用到的试剂、培养基、载体和感受态，在没有特殊说明的情况下，均采用本领域已知的试剂、培养基、载体和感受态，例如：
大肠杆菌感受态细胞采用北京全式金生物技术有限公司生产的Transetta(DE3)Chemically Competent Cell。
以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。
实施例1：
本实施例给出将PG2-LC蛋白作为大鼠SNAP-25的胞内水解酶的应用。
PG2-LC蛋白的氨基酸序列如下：MAPITIKDFKYNTLPNGNDVVLVKNEK GTADKGFFVADNILVVPERYGEIQGEEGGTAPKEATEVRDKQYLQSEEHKDEFLKMITVLLKRINSKPEGSEFLNIMTKAEPLYDINNGEFKERCTSRYVETTTGQRRVNVIITGPGTNLTEGITIPYITENTRALESNGFGSASTISITPFYELGYIKDHKNPEEKYCADPAMSLYHELVHAFHNLYGINFNHTKIEETSLEEYVTFGRYNEKSCVEMNKVGMYAGTSLLKSFDEINTLKEADKSKINNIFENKLTLLFGEKTSANNESDIAKIALKIDKKIHAFTECEFAKAFNTKTGGIYVRDDYNYTSATPLKFEKLLDNYHPQDGFIKYGKPMYEGQHIKNKYIATNPAITSKKARFRFLLKK。
大鼠SNAP-25的氨基酸序列如下：MAEDADMRNELEEMQRRADQLADES LESTRRMLQLVEESKDAGIRTLVMLDEQGEQLERIEEGMDQINKDMKEAEKNLTDLGKFCGLCVCPCNKLKSSDAYKKAWGNNQDGVVASQPARVVDEREQMAISGGFIRRVTNDARENEMDENLEQVSGIIGNLRHMALDMGNEIDTQNRQIDRIMEKADSNKTRIDEANQRATKMLGSG。
该应用的方法具体包括如下步骤：
步骤一，构建哺乳动物细胞表达载体：
根据PG2-LC蛋白和大鼠SNAP-25的核苷酸序列设计PCR引物，PCR引物如表1所示。然后进行PCR，获得PG2-LC蛋白和SNAP-25的基因片段。将基因片段和表达载体pcDNA3.1-myc/His进行酶切连接，经转化、筛选和鉴定后，获得PG2-LC蛋白和大鼠SNAP-25的哺乳动物细胞表达载体。在PG2-LC的N端融合有FLAG标签，大鼠SNAP-25的N端融合有HA标签，以便于后期蛋白的免疫印迹检测。
PG2-LC蛋白的核苷酸序列如下：5’-atggcaccgatcacgatcaaggattttaagtataatacctt accgaatgggaatgacgttgtccttgttaagaatgagaaggggacggctgacaaaggattctttgtggccgataatatcttggtcgttcctgaacgctatggggagattcaaggggaagaaggaggaacggcacccaaggaagcgaccgaagtacgtgacaaacagtacttacagtccgaagagcataaagacgagttcttaaaaatgattacggtgcttttaaaacgtatcaatagtaagcctgagggttcggagtttttaaatatcatgactaaagctgaacccttgtatgatattaataacggcgagttcaaggagcgttgtacctcacgctatgtagaaactacaacaggtcagcgccgtgttaacgtaatcattacggggccaggaacgaaccttactgaaggtattacgattccctatatcacagaaaatacgcgcgctttggagtctaatggcttcggttccgcttccacgatctcaatcacccctttttacgagctgggatatatcaaagatcataaaaatccagaagaaaaatactgcgccgaccccgcaatgagcctgtatcacgaacttgttcatgccttccacaacctttacggcattaacttcaaccacactaagatcgaagagacttcgctggaggagtatgtcacgtttggtcgttataatgagaaaagttgtgtcgaaatgaataaagttggaatgtatgctggtacatctttattgaagtccttcgacgaaatcaatacgctgaaggaggcggataagagtaaaatcaacaatatctttgagaataaattgacgttgttgtttggcgaaaagacctcagcgaataacgagtcggatattgctaagattgcattaaagattgacaagaaaatccatgcctttacggaatgcgagttcgctaaagcgttcaacaccaaaactggagggatctatgtacgcgacgactacaattacacgtccgccacccctttgaagtttgagaaacttttagataattatcacccccaagacggatttattaagtacggaaaaccgatgtacgagggtcaacacattaaaaacaaatatatcgccactaatccagccatcacgtctaagaaggcacgctttcgtttcttattatgcaagaaa-3’。
大鼠SNAP-25的核苷酸序列如下：5’-atggccgaggacgcagacatgcgtaatgaactggaggagatgcagaggagggctgaccagctggctgatgagtccctggaaagcacccgtcgcatgctgcagctggtcgaagagagtaaagatgctggcatcaggactttggttatgttggatgagcaaggcgaacaactggaacgcattgaggaagggatggaccaaatcaataaggatatgaaagaagcagaaaagaatttgacggacctaggaaaattctgcgggctttgtgtgtgtccctgtaacaagcttaaatccagtgatgcttacaaaaaagcctggggcaataatcaggatggagtagtggccagccagcctgcccgtgtggtggatgaacgggagcagatggccatcagtggtggcttcatccgcagggtaacaaacgatgcccgggaaaatgaaatggatgaaaacctagagcaggtgagcggcatcatcggaaacctccgtcatatggccctagacatgggcaatgagattgacacccagaatcgccagattgacaggatcatggagaaggctgactccaacaaaaccagaattgatgaagccaaccaacgtgcaacaaagatgctgggaagtggt-3’。
本实施例中，还构建了对照蛋白A和对照蛋白B的哺乳动物细胞表达载体作为后续的对照，对照蛋白A和对照蛋白B为两种现有技术中已知的与SNARE复合体水解相关的蛋白。
步骤二，PG2-LC蛋白和SNAP-25共表达：
将步骤一获得的PG2-LC蛋白和大鼠SNAP-25的哺乳动物细胞表达载体一同转染进HEK293T细胞中，培养24小时后，收集细胞并提取蛋白，然后采用Western-blot进行鉴定，结果如图1所示。由图1可知，将PG2-LC蛋白和大鼠SNAP-25在细胞内共表达后，PG2-LC蛋白能够水解大鼠的SNAP-25。
实施例2：
本实施例给出将PG2-LC蛋白作为果蝇SNAP-25的胞内水解酶的应用。
果蝇SNAP-25的氨基酸序列如下：MPADPSEEVAPQVPKTELEELQINAQG VADESLESTRRMLALCEESKEAGIRTLVALDDQGEQLDRIEEGMDQINADMREAEKNLSGMEKCCGICVLPCNKSQSFKEDDGTWKGNDDGKVVNNQPQRVMDDRNGMMAQAGYIGRITNDAREDEMEENMGQVNTMIGNLRNMALDMGSELENQNRQIDRINRKGESNEARIAVANQRAHQLLK。
该应用的方法具体包括如下步骤：
步骤一，构建哺乳动物细胞表达载体：
根据PG2-LC蛋白和果蝇SNAP-25的核苷酸序列设计PCR引物，PCR引物如表1所示。然后进行PCR，获得PG2-LC蛋白和SNAP-25的基因片段。将基因片段和表达载体pcDNA3.1-myc/His进行酶切连接，经转化、筛选和鉴定后，获得PG2-LC蛋白和果蝇SNAP-25的哺乳动物细胞表达载体。在PG2-LC的N端融合有FLAG标签，果蝇SNAP-25的N端融合有HA标签，以便于后期蛋白的免疫印迹检测。
果蝇SNAP-25的核苷酸序列如下：ATGCCAGCGGATCCATCTGAAGAAGT TGCCCCTCAGGTCCCGAAGACCGAGCTAGAAGAGCTGCAAATTAATGCGCAAGGAGTAGCCGATGAGTCCCTGGAAAGTACGCGACGTATGCTTGCTCTGTGTGAGGAGAGCAAGGAGGCAGGGATTCGAACACTTGTAGCCCTTGATGATCAAGGAGAACAACTGGATCGTATTGAAGAAGGAATGGATCAAATTAATGCAGACATGAGAGAAGCAGAAAAAAATTTAAGTGGAATGGAAAAATGTTGCGGCATTTGTGTTCTTCCGTGCAATAAAAGTCAATCATTCAAAGAAGATGATGGGACCTGGAAAGGAAATGATGACGGAAAAGTTGTAAATAATCAGCCACAGAGAGTGATGGATGATAGAAATGGCATGATGGCGCAAGCGGGTTATATTGGCAGGATAACGAACGACGCTAGAGAAGATGAAATGGAAGAAAATATGGGCCAGGTAAACACTATGATAGGCAATCTCCGAAATATGGCATTGGATATGGGCTCTGAGCTGGAAAATCAAAATCGTCAAATTGATAGAATAAACCGAAAGGGTGAATCTAATGAAGCGCGGATAGCAGTTGCTAATCAAAGGGCACATCAACTATTAAAG。
本实施例中，还构建了对照蛋白A和对照蛋白B的哺乳动物细胞表达载体，作为后续的对照，对照蛋白A和对照蛋白B为两种现有技术中已知的能够水解SNARE复合体的蛋白。
步骤二，PG2-LC蛋白和SNAP-25共表达：
将步骤一获得的PG2-LC蛋白和果蝇SNAP-25的哺乳动物细胞表达载体一同转染进HEK293T细胞中，培养24小时后，收集细胞并提取蛋白，然后采用Western-blot进行鉴定，结果如图2所示。由图2可知，将PG2-LC蛋白和果蝇SNAP-25在细胞内共表达后，PG2-LC蛋白能够水解果蝇的SNAP-25。
实施例3：
本实施例给出将PG2-LC蛋白作为果蝇SNAP-25的体外水解酶的应用，该应用的方法具体包括如下步骤：
步骤一，构建体外表达载体：
根据PG2-LC蛋白和果蝇SNAP-25的核苷酸序列设计PCR引物，PCR引物如表1所示。然后进行PCR，获得PG2-LC蛋白和SNAP-25的基因片段。将基因片段和表达载体pET28a进行酶切连接，基因片段直接置于编码6×His的DNA序列之后并在同一阅读框内，经转化、筛选和鉴定后，获得PG2-LC蛋白和果蝇SNAP-25的体外表达载体。
步骤二，制备PG2-LC蛋白和SNAP-25：
将步骤一获得的PG2-LC蛋白和果蝇SNAP-25的表达载体分别转化进大肠杆菌感受态细胞中，经培养、筛选和鉴定后，获得能够表达PG2-LC蛋白和果蝇SNAP-25的阳性克隆，将阳性克隆在20℃培养16小时后，收集菌体，裂解细胞后离心收获上清并利用镍柱和脱盐柱纯化蛋白。
步骤三，进行酶切反应：
将步骤二中纯化后的PG2-LC蛋白和SNAP-25一同加入反应缓冲液(50mM Tris，150mM NaCl，0.1mM ZnCl2；pH 7.5)中混合均匀，获得酶切反应液，然后将酶切反应液分为六组，其中一组留作空白对照，剩余五组分别于37℃的温度下进行酶切反应0.5、1、2、3、4和6h后，采用SDS-PAGE鉴定酶切反应产物，结果如图3所示。由图3可知，PG2-LC蛋白在体外能够将部分果蝇SNAP-25水解。
本实施例中，为了鉴定PG2-LC在果蝇SNAP-25中的酶切位点，利用质谱对水解后的产物进行了分析，分析所采用的方法为：将水解后的小肽进行富集后，利用shotgun方法和PRM方法对肽段进行分析，结果如图4所示。由图4可知，在PG2-LC对果蝇SNAP-25的水解产物中，能够检测到的数量较多的肽段为KGESNEARIAVANQRAHQ，此外还检测到了VANQRAHQLLK、QRAHQLLK、NQRAHQLLK等肽段(图中未示出)。
如图5所示，推断PG2-LC蛋白对果蝇SNAP-25的酶切位点位于果蝇SNAP-25氨基酸序列第191位的R和192位的K之间，以及第209位的Q与210位的L之间。
对比例1：
本对比例给出将PG1-LC蛋白作为大鼠SNAP-25的胞内水解酶的应用，该应用的方法具体包括如下步骤：
步骤一，构建哺乳动物细胞表达载体：
根据PG1-LC蛋白和大鼠SNAP-25的核苷酸序列设计PCR引物，PCR引物如表1所示。然后进行PCR，获得PG1-LC蛋白和SNAP-25的基因片段。将基因片段和表达载体pcDNA3.1-myc/His进行酶切连接，经转化、筛选和鉴定后，获得PG1-LC蛋白和大鼠SNAP-25的哺乳动物细胞表达载体。在PG1-LC的N端融合有FLAG标签，大鼠SNAP-25的N端融合有HA标签，以便于后期蛋白的免疫印迹检测。
步骤二，PG1-LC蛋白和大鼠SNAP-25共表达：
将步骤一获得的PG1-LC蛋白和大鼠SNAP-25的表达载体一同转染进HEK293T细胞中，培养24小时后，收集细胞并提取蛋白，然后采用Western-blot进行鉴定，结果如图1所示。由图1可知，将PG1-LC蛋白和大鼠SNAP-25在细胞内共表达后，PG1-LC蛋白无法水解大鼠的SNAP-25。
表1、引物序列
Claims (5)
1.PG2-LC蛋白作为SNAP-25的水解酶的应用，其特征在于，所述的水解酶为胞内水解酶，且所述的SNAP-25为大鼠SNAP-25和果蝇SNAP-25；
所述的PG2-LC蛋白的氨基酸序列为：MAPITIKDFKYNTLPNGNDVVLVKNEKGTADKGFFVADNILVVPERYGEIQGEEGGTAPKEATEVRDKQYLQSEEHKDEFLKMITVLLKRINSKPEGSEFLNIMTKAEPLYDINNGEFKERCTSRYVETTTGQRRVNVIITGPGTNLTEGITIPYITENTRALESNGFGSASTISITPFYELGYIKDHKNPEEKYCADPAMSLYHELVHAFHNLYGINFNHTKIEETSLEEYVTFGRYNEKSCVEMNKVGMYAGTSLLKSFDEINTLKEADKSKINNIFENKLTLLFGEKTSANNESDIAKIALKIDKKIHAFTECEFAKAFNTKTGGIYVRDDYNYTSATPLKFEKLLDNYHPQDGFIKYGKPMYEGQHIKNKYIATNPAITSKKARFRFLLKK；
所述的大鼠SNAP-25的氨基酸序列为：MAEDADMRNELEEMQRRADQLADESLESTRRMLQLVEESKDAGIRTLVMLDEQGEQLERIEEGMDQINKDMKEAEKNLTDLGKFCGLCVCPCNKLKSSDAYKKAWGNNQDGVVASQPARVVDEREQMAISGGFIRRVTNDARENEMDENLEQVSGIIGNLRHMALDMGNEIDTQNRQIDRIMEKADSNKTRIDEANQRATKMLGSG；
所述的果蝇SNAP-25的氨基酸序列为：MPADPSEEVAPQVPKTELEELQINAQGVADESLESTRRMLALCEESKEAGIRTLVALDDQGEQLDRIEEGMDQINADMREAEKNLSGMEKCCGICVLPCNKSQSFKEDDGTWKGNDDGKVVNNQPQRVMDDRNGMMAQAGYIGRITNDAREDEMEENMGQVNTMIGNLRNMALDMGSELENQNRQIDRINRKGESNEARIAVANQRAHQLLK；
所述的应用为非治疗目的的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，该应用的方法包括如下步骤：
步骤一，构建哺乳动物细胞表达载体；
步骤二，PG2-LC蛋白和SNAP-25共表达：
将步骤一获得的PG2-LC蛋白和SNAP-25的哺乳动物细胞表达载体一同转染进哺乳动物细胞中，培养24～72小时后，收集细胞并提取蛋白，获得SNAP-25的水解产物。
3.PG2-LC蛋白作为SNAP-25的水解酶的应用，其特征在于，所述的水解酶为体外水解酶，且所述的SNAP-25为果蝇SNAP-25；
所述的PG2-LC蛋白的氨基酸序列为：MAPITIKDFKYNTLPNGNDVVLVKNEKGTADKGFFVADNILVVPERYGEIQGEEGGTAPKEATEVRDKQYLQSEEHKDEFLKMITVLLKRINSKPEGSEFLNIMTKAEPLYDINNGEFKERCTSRYVETTTGQRRVNVIITGPGTNLTEGITIPYITENTRALESNGFGSASTISITPFYELGYIKDHKNPEEKYCADPAMSLYHELVHAFHNLYGINFNHTKIEETSLEEYVTFGRYNEKSCVEMNKVGMYAGTSLLKSFDEINTLKEADKSKINNIFENKLTLLFGEKTSANNESDIAKIALKIDKKIHAFTECEFAKAFNTKTGGIYVRDDYNYTSATPLKFEKLLDNYHPQDGFIKYGKPMYEGQHIKNKYIATNPAITSKKARFRFLLKK；
所述的果蝇SNAP-25的氨基酸序列为：MPADPSEEVAPQVPKTELEELQINAQGVADESLESTRRMLALCEESKEAGIRTLVALDDQGEQLDRIEEGMDQINADMREAEKNLSGMEKCCGICVLPCNKSQSFKEDDGTWKGNDDGKVVNNQPQRVMDDRNGMMAQAGYIGRITNDAREDEMEENMGQVNTMIGNLRNMALDMGSELENQNRQIDRINRKGESNEARIAVANQRAHQLLK；
所述的应用为非治疗目的的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，PG2-LC蛋白的酶切位点为：果蝇SNAP-25氨基酸序列的第191位的精氨酸与192位的赖氨酸之间，以及果蝇SNAP-25氨基酸序列的第209位的谷氨酰胺与210位的亮氨酸之间。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，该应用的方法包括如下步骤：
步骤一，构建体外表达载体；
步骤二，制备PG2-LC蛋白和SNAP-25；
步骤三，进行酶切反应：
将步骤二获得的PG2-LC蛋白和SNAP-25一同加入反应缓冲液中混合均匀，获得酶切反应液，然后将酶切反应液于37℃的温度下进行酶切反应0.5～6 h后，获得SNAP-25的水解产物；酶切反应液中PG2-LC蛋白的终浓度为0.1 μM，SNAP-25的终浓度为0.3 mg/mL。
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