JP5497295B2 - マイクロギニン産生タンパク質、及びマイクロギニン遺伝子クラスターをコードする核酸、並びにマイクロギニンの製造方法 - Google Patents
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Description
シアノバクテリアはグラム陰性細菌である。光合成を行なう能力のため、植物界に属すると長らく考えられており、そして以前は藍藻(blue-green algae)に分類されていた。シアノバクテリアはほぼ全ての生態的地位に順応してきた。今日までに知られている多くの種は、淡水湖及び海で見つかっている。ここ数年の間に、シアノバクテリアは、生物学的に活性な天然化合物のソースとして認識されてきた。
ACEは、哺乳動物レニン-アンジオテンシン系で、アンジオテンシンIのアンジオテンシンIIへの変換を触媒し、動脈狭窄を導き、動脈狭窄は次に血圧の増加を引き起こす。ACE阻害剤はこのプロセスに反対に作用し、そしてその結果、血圧降下薬としてヒト医薬の役割を果たす。マイクロギニンは、ACE阻害剤についての重要な薬剤候補である。これまでにマイクロギニンの30の構造バリアントしか知られておらず、臨床開発が難しい。
アデニル化ドメイン(A*)、ここで当該アデニル化ドメインは配列番号1に記載されるペプチド配列を含む、
アシルキャリアタンパク質(ACP)、
以下の活性:(i)ケトアシルシンターゼ(KS)、(ii)アシルトランスフェラーゼ(AT)(iii)アシルキャリアタンパク質(ACP2)を含む、ポリケチド合成酵素(PKS)の伸張モジュール(EM)、
アミノトランスフェラーゼ(AMT)、
以下の活性(i)縮合ドメイン(C)、(ii)アデニル化ドメイン(A)、(iii)チオール化ドメイン(T)を含む、非リボソームペプチド合成酵素(NRPS)の3〜5の伸張モジュール(EM)及び、
チオエステラーゼ(TE)
を有するマイクロギニン合成酵素複合体をコードする1以上の核酸に関する。
アデニル化ドメイン(A*)、ここで、当該アデニル化ドメインは、配列番号1に記載されるペプチド配列を含む、
アシルキャリアタンパク質(ACP)、
以下の活性:(i)ケトアシルシンターゼ(KS)、(ii)アシルトランスフェラーゼ(AT)、(iii)アシルキャリアタンパク質(ACP2)を含むポリケチド合成酵素(PKS)の伸張モジュール(EM)、
アミノトランスフェラーゼ(AMT)、
以下の活性:(i)縮合ドメイン(C)、(ii)アデニル化ドメイン(A)、(iii)チオール化ドメイン(T)を含む、非リボソームペプチド合成酵素(NRPS)の3〜5の伸張モジュール(EM)、及び
チオエステラーゼ(TE)
を有するマイクロギニン合成酵素複合体をコードする1以上の核酸に関する。
ここで、アデニル化ドメイン(A*)は、アシルアデニレートとしてオクタン酸を活性化することが理解され、そしてアシルキャリアタンパク質(ACP)は、チオエステルとしてオクタン酸アデニレートに結合することが理解される。
配列番号1に示されるこのアデニル化ドメイン(A*)、及び
少なくともACP、ここで当該ACPは別の既知の非リボソーム酵素複合体に由来してもよく、
PKSの少なくとも1のEM、ここで当該EMは、以下の活性:(i)KS、(ii)AT、(iii)ACPを含む既知の非リボソーム酵素複合体に由来してもよく、
AMT、ここで当該AMTは、別の既知の非リボソーム酵素複合体に由来してもよく、
少なくとも以下の活性:(i)C、(ii)A、(iii)Tを含む3〜5のEM、ここでこれらのEMは、別の既知の非リボソーム酵素複合体に由来してもよく、そして
TE、ここでこのTEは別の既知の非リボソーム酵素複合体に由来してもよい、
を有しうる。上記パーツが1以上のベクター上にあるか、及び/又は染色体に組み込まれているキメラは、全ての成分が1の細胞内に存在する限り、本発明により等しく包含される。
アデニル化ドメイン(A*)、ここで当該アデニル化ドメインは、配列番号1に記載されたペプチド配列を含み、
アシルキャリアタンパク質(ACP)、
以下の活性:(i)ケトアシルシンターゼ(KS)、(ii)アシルトランスフェラーゼ(AT)、(iii)アシルキャリアタンパク質(ACP2)を含むポリケチドシンターゼ(PKS)の伸張モジュール(EM)、
アミノトランスフェラーゼ(AMT)、
以下の活性(i)縮合ドメイン(C)、(ii)アデニル化ドメイン(A)、(iii)チオール化ドメイン(T)を含む非リボソームペプチド合成酵素(NRPS)の3〜5の伸張モジュール(EM)、及び
チオエステラーゼ(TE)
を有するマイクロギニン合成酵素タンパク質複合体にも関する。
モノオキシゲナーゼ(MO)、
NRPSの1以上の伸張モジュール(EM)内の組み込み型N−メチルトランスフェラーゼドメイン(MT)、
非組み込み型N−メチルトランスレフェラーゼ(MT)、
改変活性(MA)、ここで当該MAは、以下の活性:ハロゲナーゼ、サルファターゼ、グリコシラーゼ、ラセマーゼ、O−メチルトランスフェラーゼ、及びC−メチルトランスフェラーゼを含む群から選ばれ、
上記MO及び/又は他のMAの上流及び下流に隣接して位置するグリシンリッチ又はプロリン及びロイシンリッチのいずれかである1以上の繰り返しからなる2以上のペプチド繰り返しスペーサー配列(SP)
をさらに、そして場合により含む。
配列番号1に記載されるアデニル化ドメイン(A*)、
配列番号2に記載されるアシルキャリアタンパク質(ACP)、
マロニル-CoAの活性化と縮合に寄与するポリケチド合成酵素の伸張モジュール: (i)配列番号3に記載されるケトアシル合成酵素ドメイン(KS)、
(ii)配列番号4に記載されるアシルトランスフェラーゼドメイン(AT)、
配列番号5に記載されるアシルキャリアタンパク質ドメイン(ACP2)、
配列番号6に記載されるアミノトランスフェラーゼ(AMT)、
アラニンの活性化及び縮合に寄与する非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール:
(i)配列番号7に記載される縮合ドメイン(C)、
(ii)配列番号8に記載されるアデニル化ドメイン(A)、
(iii)配列番号9に記載されるチオール化ドメイン(T)、
ロイシンの活性化及び縮合に寄与する非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール:
(i)配列番号10に記載される縮合ドメイン(C2)、
(ii)配列番号11に記載されるアデニル化ドメイン(A2)、
(iii)配列番号12に記載されるチオール化ドメイン(T2)、
チロシン1の活性化及び縮合に寄与する非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール:
(i)配列番号13に記載される縮合ドメイン(C3)、
(ii)配列番号14に記載されるアデニル化ドメイン(A3)、
(iii)配列番号15に記載されるチオール化ドメイン(T3)、
チロシン2の活性化及び縮合に寄与する非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール:
(i)配列番号16に記載される縮合ドメイン(C4)、
(ii)配列番号17に記載されるアデニル化ドメイン(A4)、
(iii)配列番号18に記載されるチオール化ドメイン(T4)、
配列番号19に記載されるチオエステラーゼ(TE)、
配列番号20に記載されるモノオキシゲナーゼ(MO)、
配列番号21及び22に記載される2以上のペプチド繰り返しスペーサー配列(SP1/SP2)、
配列番号23に記載されるロイシンの活性化及び縮合に寄与するNRPSの伸張モジュール内の組み込み型N-メチルトランスフェラーゼドメイン(MT)、及び
配列番号24に記載された非組み込み型N-メチルトランスフェラーゼ(MT2)
を場合により含む。
アデニル化ドメイン(A*)、ここで当該アデニル化ドメインは、配列番号1に記載されるペプチド配列を含み、
配列番号2に記載されるACP、
以下の活性:
(i)配列番号3に記載されるケトアシルシンターゼ(KS)、
(ii)配列番号4に記載されるアシルトランスフェラーゼ(AT)、
(iii)配列番号5に記載されるアシルキャリアタンパク質(ACP2)
を含むポリケチドシンターゼ(PKS)の伸張モジュール(EM)、
配列番号6に記載されるアミノトランスフェラーゼ(AMT)、
以下の活性:
(i)配列番号7に記載される縮合ドメイン(C)、
(ii)配列番号8に記載されるアデニル化ドメイン(A)、
(iii)配列番号9に記載されるチオール化ドメイン(T)、
を含む非リボソームペプチド合成酵素(NRPS)の3〜5の伸張モジュール(EM)、及び
配列番号10に記載されるチオエステラーゼ(TE)
を有するマイクロギニン合成酵素複合体をコードする核酸である。
必要とされる酵素活性を維持しながらアミノ酸が交換され得るといことが当業者に明らかである。こうして、本発明はまた、上に概説された分子と同一ではないが、所望される酵素活性が保持されるかぎりにおいて変更された配列を有する分子にも関する。
配列番号25に記載のアデニル化ドメイン(A*)、
配列番号26に記載されるアシルキャリアタンパク質(ACP)、
マロニル-CoAの活性化及び縮合をコードするポリケチド合成酵素の伸張モジュール:
(i)配列番号27に記載されるケトアシル合成酵素ドメイン(KS)
(ii)配列番号28に記載されるアシルトランスフェラーゼドメイン(AT)、
(iii)配列番号29に記載されるアシルキャリアタンパク質ドメイン(ACP2)、
配列番号30に記載されるアミノトランスフェラーゼ(AMT)、
アラニンの活性化及び縮合をコードする非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール:
(i)配列番号31に記載される縮合ドメイン(C)、
(ii)配列番号32に記載されるアデニル化ドメイン、
(iii)配列番号33に記載されるチオール化ドメイン、
ロイシンの活性化及び縮合をコードする非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール:
(i)配列番号34に記載される縮合ドメイン(C2)、
(ii)配列番号35に記載されるアデニル化ドメイン(A2)、
(iii)配列番号36に記載されるチオール化ドメイン(T2)、
チロシン1の活性化及び縮合をコードする非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール:
(i)配列番号37に記載される縮合ドメイン(C3)、
(ii)配列番号38に記載されるアデニル化ドメイン(A3)、
(iii)配列番号39に記載されるチオール化ドメイン(T3)、
チロシン2の活性化及び縮合をコードする非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール:
(i)配列番号40に記載される縮合ドメイン(C4)、
(ii)配列番号41に記載されるアデニル化ドメイン(A4)、
(iii)配列番号42に記載されるチオール化ドメイン(T4)、
配列番号43に記載されるチオエステラーゼ(TE)、
配列番号44に記載されるモノオキシゲナーゼ(MO)、
配列番号45及び46に記載される2以上のペプチド繰り返しスペーサー配列(SP1/2)、
配列番号47に記載されるロイシンの活性化及び縮合をコードするNRPSの伸張モジュール(EM)内の組み込み型N-メチルトランスフェラーゼドメイン(MT)、及び
配列番号48に記載される非組み込み型N-メチルトランスフェラーゼ(MT2)
を含む群から選ばれる核酸を含みうる。
アデニル化ドメイン(A*)、ここで当該アデニル化ドメインは配列番号25に記載される核酸配列であり、
配列番号26に記載される核酸配列を有するACP、
以下の活性:
(i)配列番号27に記載される核酸配列を有するケトアシルシンターゼ(KS)、
(ii)配列番号28に記載される核酸配列を有するアシルトランスフェラーゼ(AT)、
(iii)配列番号29に記載される核酸を有するアシルキャリアタンパク質(ACP2)
を含むポリケチド・シンターゼ(PKS)の伸張モジュール(EM)、
配列番号30に記載される核酸配列を有するアミノトランスフェラーゼ(AMT)、
以下の活性:
(i)配列番号31に記載される核酸配列を有する縮合ドメイン(C)、
(ii)配列番号32に記載される核酸配列を有するアデニル化ドメイン(A)、
(iii)配列番号33に記載される核酸配列を有するチオール化ドメイン
を含む、非リボソームペプチド合成酵素(NRPS)の3〜5の伸張モジュール(EM)、及び
配列番号43に記載される核酸配列を有するチオエステラーゼ(TE)
を有するマイクロギニン合成酵素をコードする核酸である。上記配列を含む分子は本明細書に好ましい。
核酸分子は、ベクターのパーツであってもよい。このようなベクターは、特に、細菌人工染色体(BAC)、コスミド又はホスミド、及びラムダベクターである。シアノバクテリアにおいて自立的に複製できる好ましいプラスミドベクターは、pVZベクターから派生される。シアノバクテリアにおいて自立的に複製できる好ましいホスミドベクターは、pCC1FOSTM及びpCC2FOSTMベクター(Epicentre Biotechnologies)から派生される。本発明に記載される核酸のベクターへの組み込みは、当業者に知られている方法である(Molecular Cloning: A Laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbour Labaratory Press)か又は、ゲノムライブラリーの作成用のキット(Epicenter Biotechnologies)の製品マニュアルに記載されている。
培地:Bg11(シアノバクテリアの培養用)
通気:0.3〜3.0%二酸化炭素を含む空気
光度:40〜100μE/m2*s(照射された光バイオリアクターの培養管の直径d=4〜12cm)
回収時の細胞密度:OD750nm1〜2
及び宿主がマイクロシスチス・アエルギノーサである場合:
光性質:回収前24〜48時間において25μE/m2の追加赤色光の照射
で培養する。
a)存在する1以上のMTを不活性化し、
b)存在する1以上のMTを、ハロゲナーゼ、スルファターゼ、グリコシラーゼ、ラセマーゼ、O-メチルトランスフェラーゼ又はC-メチルトランスフェラーゼで置換し、
c)MOを不活性化し、
d)MOをハロゲナーゼ、スルファターゼ、グリコシラーゼ、ラセマーゼ、O-メチルトランスフェラーゼ又はC-メチルトランスフェラーゼでMOを置換し、
e)AMTを不活性化し、
f)AMTをハロゲナーゼ、スルファターゼ、グリコシラーゼ、ラセマーゼ、O-メチルトランスフェラーゼ又はC-メチルトランスフェラーゼで置換し、
g)PKSモジュールを不活性化し、
h)全PKSモジュールを代わりのPKSモジュールで置換するか、及び/又は1以上のドメイン(KS、AT、ACP)を置換し、
i)A*ドメインを不活性化し、j)A*ドメインを代わりのAドメインで置換し、
k)1以上のNRPSモジュールを不活性化し、そして
l)1以上のNRPSモジュールを代わりのNRPSモジュールで置換するか、及び/又は1以上のドメイン(C、A、T)を置換する
の群から選ばれる操作でありうる。
当該不活性化及び/又は置換が、多くの方法で行われるということに留意することは重要である。例えば不活性化は、完全な活性又はドメインの欠失を意味することがあり、又は1のヌクレオチド交換による不活性化を意味することもある。
当該方法は、当業者に知られており、そして基本的な分子生物学的方法、例えばDNA単離、制限酵素切断、ライゲーション、トランスフォーメーション、増幅などを含む。
マイクロギニン合成酵素複合体をコードする遺伝子を有する株を、MgCl2を含んだRedTaq ReadyMix PCR Reaction Mix及びプライマー対及び請求項11〜12に記載されるアニーリング温度を使用するPCR反応を行なうことにより、このような遺伝子クラスターなどを有する株を区別することができる。特に、PCR条件は、以下の通りである:95℃で1分間の初期変性、続いて30秒間95℃の変性、当該アニール温度で30秒の伸張、そして1kbの産物サイズにつき72℃の伸張を30サイクル行なった。
培地:Bg11(シアノバクテリアの培養用)
通気:0.3〜3.0%二酸化炭素を含む空気
光度:40〜100μE/m2*s(照射された光バイオリアクターの培養管の直径d=4〜12cm)
光性質:回収前24〜48時間において25μE/m2*sでの追加赤色光の照射
回収時の細胞密度:OD750nm1〜2
Claims (10)
- 以下の:
a)アデニル化ドメイン(A*)、ここで当該アデニル化ドメインは配列番号1に示されるペプチド配列又は配列番号1に少なくとも90%同一であるペプチド配列を含み、
b)アシルキャリアタンパク質(ACP)、
c)以下の:
i.ケトアシルシンターゼ(KS)、
ii.アシルトランスフェラーゼ(AT)、
iii.アシルキャリアタンパク質(ACP2)
を含むポリケチド合成酵素(PKS)の伸張モジュール(EM)、
d)アミノトランスフェラーゼ、
e)以下の:
i.縮合ドメイン(C)、
ii.アデニル化ドメイン(A)、
iii.チオール化ドメイン(T)
を含む非リボソームペプチド合成酵素(NRPS)の3〜5の伸張モジュール(EM)、
f)チオエステラーゼ(TE)
を有するマイクロギニン合成酵素複合体をコードする核酸。 - 以下の:
a)モノオキシゲナーゼ(MO)、
b)NRPSの1以上の伸張モジュール(EM)内の組込み型N-メチルトランスフェラーゼドメイン(MT)、
c)非組み込み型N-メチルトランスフェラーゼ(MT)、
d)改変活性(MA)を有するタンパク質、ここで当該タンパク質は、ハロゲナーゼ、スルファターゼ、グリコシラーゼ、ラセマーゼ、O-メチルトランスフェラーゼ、及びC-メチルトランスフェラーゼを含む群から選ばれ、
e)MO及び/又は別のMAの上流及び下流に隣接して位置するグリシンリッチ又はプロリンとロイシンリッチのいずれかである1以上の繰り返しからなる2以上のペプチド繰り返しスペーサードメイン(SP)、
をコードする配列をさらに含む、請求項1に記載の核酸。 - 前記核酸が、以下のタンパク質配列:
a.配列番号1に示されるアデニル化ドメイン(A*)、
b.配列番号2に示されるアシルキャリアタンパク質(ACP)、
c.ポリケチド合成の伸張モジュール:
i.配列番号3に示されるケトアシルシンターゼドメイン(KS)、
ii.配列番号4に示されるアシルトランスフェラーゼドメイン(AT)、
iii.配列番号5に示されるアシルキャリアタンパク質ドメイン(ACP2)
d.配列番号6に示されるアミノトランスフェラーゼ(AMT)、
e.非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール:
i.配列番号7に示される縮合ドメイン(C)、
ii.配列番号8に示されるアデニル化ドメイン(A)、
iii.配列番号9に示されるチオール化ドメイン(T)
f.ロイシンの活性化及び縮合に寄与する非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール:
i.配列番号10に示される縮合ドメイン(C2)、
ii.配列番号11に示されるアデニル化ドメイン(A2)、
iii.配列番号12に示されるチオール化ドメイン(T2)
g.チロシン2の活性化及び縮合に寄与する非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール:
i.配列番号13に示される縮合ドメイン(C3)、
ii.配列番号14に示されるアデニル化ドメイン(A3)、
iii.配列番号15に示されるチオール化ドメイン(T3)
h.チロシン2の活性化及び縮合に寄与する非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール:
i.配列番号16に示される縮合ドメイン(C4)、
ii.配列番号17に示されるアデニル化ドメイン(A4)、
iii.配列番号18に示されるチオール化ドメイン(T4)
i.配列番号19に示されるチオエステラーゼ(TE)、
j.配列番号20に示されるモノオキシゲナーゼ(MO)、
k.配列番号21と22に示される2以上のペプチド繰り返しスペーサー配列(SP1/SP2)、
l.配列番号23に示されるロイシンの活性化及び縮合に寄与するNRPSの伸張モジュール(EM)内の組み込み型N-メチルトランスフェラーゼドメイン(MT)、及び
m.配列番号24に示される非組み込み型N-メチルトランスフェラーゼ(MT2)
をコードする核酸配列を含む、請求項1又は2に記載の核酸。 - 以下の:
a)配列番号25に示されるアデニル化ドメイン(A*)、
b)配列番号26に示されるアシルキャリアタンパク質(ACP)、
c)アセテートの縮合をコードするポリケチド合成酵素の伸張モジュール:
i.配列番号27に示されるケトアシルシンターゼドメイン(KS)、
ii.配列番号28に示されるアシルトランスフェラーゼドメイン(AT)、
iii.配列番号29に示されるアシルキャリアタンパク質ドメイン(ACP2)
d)配列番号30に示されるアミノトランスフェラーゼ(AMT)、
e)アラニンの活性化及び縮合をコードする非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール:
i.配列番号31に示される縮合ドメイン(C)、
ii.配列番号32に示されるアデニル化ドメイン(A)、
iii.配列番号33に示されるチオール化ドメイン(T)
f)ロイシンの活性化及び縮合をコードする非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール:
i.配列番号34に示される縮合ドメイン(C2)、
ii.配列番号35に示されるアデニル化ドメイン(A2)、
iii.配列番号36に示されるチオール化ドメイン(T2)
g)チロシン1の活性化及び縮合をコードする非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール:
i.配列番号37に示される縮合ドメイン(C3)、
ii.配列番号38に示されるアデニル化ドメイン(A3)、
iii.配列番号39に示されるチオール化ドメイン(T3)
h)チロシン2の活性化及び縮合をコードする非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール:
i.配列番号40に示される縮合ドメイン(C4)、
ii.配列番号41に示されるアデニル化ドメイン(A4)、
iii.配列番号42に示されるチオール化ドメイン(T4)
i)配列番号43に示されるチオエステラーゼ(TE)、
j)配列番号44に示されるモノオキシゲナーゼ(MO)、
k)配列番号45と46に示される2以上のペプチド繰り返しスペーサー配列(SP1/SP2)、
l)配列番号47に示されるロイシンの活性化及び縮合をコードするNRPSの伸張モジュール(EM)内の組み込み型N-メチルトランスフェラーゼドメイン(MT)、及び
m)配列番号48に示される非組み込み型N-メチルトランスフェラーゼ(MT2)
を含む群から選ばれる核酸を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の核酸。 - 前記マイクロギニン合成酵素複合体をコードする核酸の配列パーツが、上流から下流にかけて反応順に配置される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載される核酸を含むベクター。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載される核酸又は請求項6に記載されるベクターで形質転換された微生物。
- 前記ベクターが、自立的に複製することができる、請求項7に記載の微生物。
- 請求項7又は8に記載の微生物がマイクロギニンを産生する条件下で、当該微生物を培養することを含むマイクロギニン産生方法であって、ここで当該微生物が、請求項1〜5のいずれか一項に記載のマイクロギニン合成酵素複合体をコードする核酸を含み、そして当該微生物が当該核酸が存在しない状態ではマイクロギニンを産生しない、前記方法。
- 配列番号1に示されるアミノ酸配列を含むアデニル化ドメイン(A*)に対する抗体。
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