KR101646728B1 - 디제너러시 리프로그래밍을 통한 비천연 단백질 합성 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 디제너러시 리프로그래밍(degenercy reprogramming)을 통한 비천연 아미노산을 포함하는 단백질의 합성 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 1) 천연 아미노산을 암호화하는 코돈 중 일부에 대한 tRNA를 제거하여 해당 코돈들의 암호화 기능을 제거한 후 다시 2) 정상적인 단백질 합성에 필요한 tRNA와 비천연 아미노산 도입에 사용되는 tRNA를 외부에서 도입함으로써, 여러 개의 코돈이 하나의 아미노산을 지정하는 생명체의 디제너러시(degenercy)를 재프로그램하여 두 가지 이상의 아미노산을 지정하도록 만드는 디제너러시 리프로그래밍하여 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

디제너러시 리프로그래밍을 통한 비천연 단백질 합성 방법{A METHOD OF SYNTHESIZING UNNATURAL PROTEIN USING DEGENERCY REPROGRAMMING}

본 발명은 비천연 단백질의 합성 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 단백질 합성 시스템에서 특정 tRNA를 제거하여 천연 아미노산을 암호화하던 일부 코돈을 비어있는(empty) 상태로 만든 후 비어있는 코돈들을 이용하여 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입함으로써 비천연 아미노산을 포함한 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

단백질 내에 비천연 아미노산을 위치특이적으로 도입하는 것은 단백질의 기능을 연구하거나 단백질에 새로운 기능을 부여하는 방법의 하나로 최근 관심이 증폭되고 있다. 일반적으로 생명체 혹은 생명체로부터 유래된 단백질 합성시스템에서는 20가지의 아미노산이 DNA로부터 전사된 유전정보에 따라 단백질로 합성된다. 이때 유전정보는 3개의 뉴클레오티드 조합으로 이루어진 유전암호(코돈)으로 구성되어 있다. 뉴클레오티드는 4가지로, 코돈은 총 64가지의 가능한 조합을 보이고, 이중 61가지의 코돈이 아미노산을 암호화하는데 사용되며 3가지의 코돈은 단백질 합성 중단을 암호화하는데 사용된다. 따라서 20가지의 천연 아미노산이 아닌 비천연 아미노산을 위치특이적으로 단백질 합성에 사용하기 위해서는 61가지의 코돈이 아닌 3가지의 단백질 합성 중단 코돈(스톱 코돈) 중 하나를 새로이 비천연 아미노산을 암호화하는 코돈으로 재지정(reassignment)해야 한다.

지금까지 3가지 스톱 코돈 중 특히 UAG 스톱 코돈은 대장균에서 가장 사용 빈도가 낮은 코돈으로 비천연 아미노산을 암호화하는 코돈으로 가장 널리 사용되어 왔다. 하지만 일반적으로 스톱 코돈을 비천연 아미노산으로 번역하는 과정은 스톱 코돈을 단백질 합성 중단으로 번역하는 과정과 경쟁적으로 발생하게 되어 그 효율이 낮은 단점이 있다. 또한, 스톱 코돈은 단백질의 정상적인 합성을 위해 반드시 하나는 필요한 바, 비천연 아미노산을 3-뉴클레오티드 코돈으로 암호화할 경우 스톱 코돈으로부터 최대 2가지만을 사용할 수 있다는 한계가 존재한다. 따라서 스톱 코돈이 아닌 천연 아미노산을 암호화하는 코돈 중 일부를 비천연 아미노산을 암호화하는 코돈으로 재프로그래밍하는 기법이 필요하다.

이에, 본 발명자들은 천연 아미노산을 암호화하는 3-뉴클레오티드 코돈을 온전히 비천연 아미노산을 암호화하는 코돈으로 변경하기 위해서는 단백질 합성 시스템에서 해당 코돈을 해독(decode)하는 안티-코돈을 갖는 tRNA를 제거한 후 다시 외부에서 해당 코돈을 해독하는 tRNA와 상기 tRNA에 비천연 아미노산을 결합하는 요소들, 또는 비천연 아미노산이 이미 결합된 tRNA를 첨가할 수 있는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 1) 천연 아미노산을 암호화하는 코돈 중 일부에 대한 tRNA를 제거하여 해당 코돈들의 암호화 기능을 제거한 후 다시 2) 정상적인 단백질 합성에 필요한 tRNA와 비천연 아미노산 도입에 사용되는 tRNA를 외부에서 도입함으로써, 여러 개의 코돈이 하나의 아미노산을 지정하는 생명체의 디제너러시(degenercy)를 재프로그램하여 두 가지 이상의 아미노산을 지정하도록 만드는 디제너러시 리프로그래밍(degenercy reprogramming)을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

1) 목적 단백질을 생산하는 무세포 단백질 합성 시스템에서, 비천연 아미노산으로 치환하고자 하는 표적 천연 아미노산을 암호화하는 코돈을 해독하는 표적 tRNA를 선택적으로 분해하는 박테리오신(Bacteriocin)을 처리하여 표적 tRNA를 제거하여 상기 코돈이 비어있는(empty) 상태로 제조하는 단계; 및

2) 상기 단계 1)에서 표적 tRNA가 제거된 무세포 단백질 합성 시스템에 상기 표적 tRNA가 암호화하는 코돈을 해독하는 tRNA 및 비천연 아미노산과 결합된 아미노아실화 tRNA(aminoacyl tRNA)를 도입하여 단백질 합성 시스템을 회복시키는 단계;를 포함하는 비천연 아미노산을 포함하는 단백질의 합성 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 목적 단백질을 생산하는 무세포 단백질 합성 시스템에 표적 tRNA를 선택적으로 분해하는 박테리오신을 처리하는 단계를 포함하는, 무세포 단백질 합성 시스템에서의 표적 tRNA 제거 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은

1) 무세포 단백질 생산 시스템에서 목적 단백질을 생산하는 대장균 추출액에 콜리신를 처리하여 아르기닌에 대한 코돈을 해독하는 tRNA(arginyl-tRNA)를 제거하는 단계; 및

2) 외부에서 합성한 아르기닌에 대한 코돈을 해독하는 tRNA, 및 상기 tRNA에 표적 비천연 아미노산을 결합시킨 tRNA를 도입하는 단계;를 포함하는 비천연 아미노산을 포함하는 EGFP 변이체의 제조방법을 제공한다.

본 방법을 이용하여 비천연 아미노산을 효율적으로 단백질 내로 도입할 수 있으며, 3-뉴클레오티드 코돈에 의거하여 23가지의 아미노산으로 이루어진 단백질을 합성하는 것이 가능하다. 이러한 비천연 아미노산을 포함한 단백질은 기초 혹은 의약용 연구, 치료용 단백질 생산, 진단용 단백질 생산 등에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 디제너러시 리프로그래밍의 개념도를 보여주는 그림으로서, 구체적으로 특정 아미노산에 대한 tRNA를 박테리오신으로 전부 제거한 후, 단백질 합성에 있어 천연 아미노산의 암호화에 사용할 코돈과 비천연 아미노산의 암호화에 사용할 코돈을 구분한 다음, 각각에 대한 tRNA와 비천연 아미노산-tRNA를 단백질 합성 시스템에 첨가하여 수행하는 디제너러시 리프로그래밍의 과정을 보여주는 그림이다.
도 2는 본 발명의 한가지 실시예에 따라 콜리신D를 처리하여 Arginyl-tRNA가 제거된 대장균 추출액과 여기에 tRNAccu를 첨가한 대장균 추출액에서 각각 목적 단백질인 EGFP의 발현 여부를 웨스턴 블랏으로 분석한 결과를 보여주는 그림이다.
도 3은 본 발명의 한가지 실시예에 따라 목적 단백질인 EGFP에 콜리신D를 처리하여 Arginyl-tRNA가 제거된 대장균 추출액을 사용하는 무세포 단백질 합성 시스템에서 비천연 아미노산인 아세틸리신과 외부에서 결합한 아미노아실 tRNA를 도입한 후 단백질 합성을 웨스턴 블랏으로 분석한 결과를 보여주는 그림이다.
도 4는 본 발명의 한가지 실시예에 따라 목적 단백질인 모노메틸리신, 디메틸리신, 트리메틸리신에 각각 콜리신D를 처리하여 Arginyl-tRNA가 제거된 대장균 추출액을 사용하는 무세포 단백질 합성 시스템에서 비천연 아미노산인 아세틸리신과 외부에서 결합한 아미노아실 tRNA의 47, 159, 190번 아미노산 위치에의 도입을 웨스턴 블랏으로 분석한 결과를 보여주는 그림이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 천연 아미노산을 암호화하는 코돈 중 일부에 대한 tRNA를 제거하여 해당 코돈들의 암호화 기능을 제거한 후, 다시 정상적인 단백질 합성에 필요한 tRNA와 비천연 아미노산 도입에 사용되는 tRNA를 외부에서 도입함으로써, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 제조하는 디제너러시 리프로그래밍(degenercy reprogramming) 방법을 제공한다.

상기 방법은

1) 목적 단백질을 생산하는 무세포 단백질 합성 시스템에서, 비천연 아미노산으로 치환하고자 하는 표적 천연 아미노산을 암호화하는 코돈을 해독하는 표적 tRNA를 선택적으로 분해하는 박테리오신(Bacteriocin) 또는 이의 변형체를 처리하여 표적 tRNA를 제거하여 상기 코돈이 비어있는(empty) 상태로 제조하는 단계; 및

2) 상기 단계 1)에서 표적 tRNA가 제거된 무세포 단백질 합성 시스템에 상기 표적 tRNA가 암호화하는 코돈을 해독하는 tRNA 및 비천연 아미노산과 결합된 아미노아실화 tRNA(aminoacyl tRNA)를 도입하여 단백질 합성 시스템을 회복시키는 단계;를 포함할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 무세포 단백질 합성 시스템은 목적 단백질을 생산할 수 있는 대장균 추출액, 또는 대장균 유래 전 tRNA 혼합물(whole tRNA mixture)을 포함할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 박테리오신 또는 이의 변형체는 콜리신D, 콜리신E5 또는 PrrC, 또는 이들의 절단체 또는 단백질공학 변형체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 단계 1) 이후 단백질 합성에 있어 천연 아미노산의 암호화에 사용할 코돈과 비천연 아미노산의 암호화에 사용할 코돈을 구분하는 단계를 더 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 방법의 각 공정을 상세히 설명한다.

1) 특정 tRNA 제거

미생물들은 혹독한 환경에서 생존하기 위해 독소를 생산하여 경쟁관계에 있는 다른 미생물들의 생장을 방해하거나 혹은 죽인다. 이 중 박테리오신(bacteriocin)들은 여러 형태의 기작으로 다른 미생물들의 생장을 방해하는 단백질성의 독소이다. 특히 특정 대장균이 생산하는 콜리신D는 다른 대장균 내로 들어가 세포 내 arginyl-tRNA를 특정적으로 분해하여 생장을 방해하는 박테리오신의 일종이다. 콜리신D 혹은 이에 해당하는 다른 박테리아 유래의 박테리오신을 분리하여 무세포 단백질 생산을 위한 대장균 추출액에 첨가하여 대장균 추출액 내의 arginyl-tRNA를 분해한다. 또한 한시적으로 콜리신D를 대장균에서 발현하여 대장균 내에서 arginyl-tRNA 분해가 일어나도록 한 후 이 대장균으로부터 추출액을 제조할 수도 있으며, 혹은 한시적으로 단백질 합성이 중단된 대장균 균체 자체를 얻을 수도 있다. 또한, 콜리신D는 안티-코돈에 특이적인 tRNA 분해 효소이므로 이 설명은 단지 대장균에 국한되지 않는다. 대장균은 아르기닌을 암호화하는 6가지의 코돈을 사용하며 이는 CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG 등이다. 또한 이들 6가지의 코돈을 해독하기 위해 4가지의 안티-코돈을 포함하는 tRNA가 존재한다. 콜리신D는 이러한 4가지의 tRNA 모두를 분해한다. Arginyl-tRNA의 분해가 완료된 시점에서 이후의 단백질 합성 반응을 저해하는 콜리신D를 제거한다. 이를 위해 콜리신D는 아미노- 혹은 카르복시-말단에 히스티딘 태그를 포함하는 분리 태그를 포함할 수 있다. 더욱 편리하게는 태그가 포함된 콜리신D를 먼저 비드에 결합하고 콜리신D-비드를 대장균 추출액과 반응한 후 비드를 원심분리 등으로 제거한다. 반응은 0~42℃ 사이에서 시간을 달리하며 진행할 수 있으며 교반의 유무에 따라 필요한 반응 시간이 변할 수 있다.

이러한 접근 방식은 arginyl-tRNA에 선택적인 콜리신D 혹은 그와 동등한 활성을 갖는 박테리오신 외에 다른 tRNA에 선택성을 갖는 모든 박테리오신의 활용에도 적용될 수 있다. 즉, 티로신, 히스티딘, 아스파라긴, 아스파르트산에 대한 tRNA에 선택적으로 작용하는 콜리신E5와 리신에 대한 tRNA에 선택성을 보이는 PrrC 등의 콜리신, 또는 그 외에 Pseudomonas aeruginosa 유래의 박테리오신인 pyocin S4과 같이 다른 박테리아 유래의 tRNA 분해 효소 활성이 있는 박테리오신이 사용될 수 있다.

또한 이들 tRNA 분해 효소의 사용은 무세포 단백질 생산을 위한 추출액의 전처리 뿐만 아니라 무세포 단백질 생산을 위해 첨가하는 대장균 유래 tRNA 혼합물들을 전처리하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 단백질 합성에 필요한 모든 단백질 구성물들을 분리하고 다시 재조합하여 구성한 PURE(Protein synthesis Using Recombinant Elements) 시스템의 필수 구성요소는 이러한 대장균 유래의 전 tRNA 혼합물(whole tRNA mixture)인 바, 본 발명의 방법을 이용하여 특정 아미노산에 대한 디제너러시를 리프로그램할 수 있다.

2) 단백질 합성 시스템 회복

콜리신D는 대장균 추출액에 존재하는 모든 arginyl-tRNA를 제거할 수 있으며, 이에 따라 콜리신D로 처리한 추출액으로는 아르기닌을 포함하는 단백질을 합성할 수 없다. 따라서 콜리신D로 처리한 추출액에 하나 혹은 그 이상의 arginyl-tRNA를 외부에서 합성한 후 첨가한다. 목적 단백질에서 아르기닌에 대한 코돈은 하나로 통일한 후 이에 대한 arginyl-tRNA를 외부에서 합성한 후 첨가할 경우 단백질 합성에는 전혀 문제가 없다. 대신 외부에서 합성하여 첨가한 arginyl-tRNA로 해독되지 않는 아르기닌 코돈은 해당 안티-코돈을 갖는 tRNA가 없으므로 더 이상 코돈으로 작용하지 못한다. 따라서 이들 아르기닌 코돈들을 비천연 아미노산을 암호화하는 목적으로 사용할 수 있게 된다.

또한, 본 발명은 본 발명은 단백질 합성 시스템에서 특정 tRNA를 제거하여 천연 아미노산을 암호화하던 일부 코돈을 비어있는(empty) 상태로 만드는 방법을 제공한다.

상기 방법은 목적 단백질을 생산하는 무세포 단백질 합성 시스템에 표적 tRNA를 선택적으로 분해하는 박테리오신을 처리하는 단계로 수행할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 무세포 단백질 합성 시스템은 목적 단백질을 생산할 수 있는 대장균 추출액 내에 추출액 제조 과정에서 자연적으로 함유된 형태로, 혹은 외부에서 따로 분리한 후 무세포 단백질 합성시스템에 혼합되는 형태로 대장균 유래 전 tRNA 혼합물(whole tRNA mixture)을 포함할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 박테리오신은 콜리신D, 콜리신E5, PrrC 또는 pyocin S4, 또는 그 외에 다양한 박테리아 유래의 tRNA 분해 효소 활성이 있는 박테리오신일 수 있다.

아울러, 본 발명은

1) 무세포 단백질 생산 시스템에서 목적 단백질을 생산하는 대장균 추출액에 콜리신 또는 이의 변형체를 처리하여 아르기닌에 대한 코돈을 해독하는 tRNA(arginyl-tRNA)를 제거하는 단계; 및

2) 외부에서 합성한 아르기닌에 대한 코돈을 해독하는 tRNA, 및 상기 tRNA에 표적 비천연 아미노산을 결합시킨 tRNA를 도입하는 단계;를 포함하는 비천연 아미노산을 포함하는 EGFP 변이체의 제조방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 상기 콜리신 또는 이의 변형체는 콜리신D, 콜리신E5 또는 PrrC, 또는 이들의 절단체 또는 단백질공학 변형체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 아세틸리신일 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

Arginyl - tRNA 제거된 시스템의 구성

대장균이 선호하는 코돈으로 구성된 콜리신D와 콜리신D해독단백질(Immunity protein D)의 유전자는 ㈜바이오니아(한국)에서 주문 제작하였다. 두 단백질의 아미노산 서열과 염기 서열을 서열 정보에 나타내었다(콜리신D의 아미노산 서열: 서열번호 1; 콜리신D의 염기 서열: 서열번호 2; 콜리신D해독단백질의 아미노산 서열: 서열번호 3; 콜리신D해독단백질의 염기서열: 서열번호 4). 콜리신D를 대장균에서 발현할 경우 대장균의 생장이 억제되므로 콜리신D해독단백질을 함께 발현한 후 콜리신D를 분리하였다. 두 단백질의 동시 발현을 위해 콜리신D해독단백질의 유전정보와 콜리신D의 유전정보를 pETDuet-1(노바젠, 미국)에 순차적으로 클로닝하였다. 두 유전정보는 독립된 T7 프로모터 하에 클로닝되어 동시 발현이 가능하였으며 콜리신D는 그 아미노 말단에 6개의 히스티딘으로 이루어진 히스티딘 태그가 존재한다. 단백질의 과발현 및 분리는 통상의 방법을 사용하였다. 구체적으로, 콜리신D해독단백질과 콜리신D가 클로닝된 pETDuet-1으로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)를 배양한 후 IPTG를 이용하여 12시간 동안 과발현을 유도하였다. 100 mL의 배지에서 얻어진 세포를 버퍼1 (10 mM Tris-acetate (pH 8.2), 14 mM MgCl₂, 60 mM K(OAc), 1 mM dithiothreitol)으로 현탁한 후 초음파 파쇄법을 이용하여 파쇄하였다. 원심분리 후 얻어진 상등액에서 히스티딘 태그를 포함하는 콜리신D를 250 ㎕의 Ni-NTA 비드 (Merck, 미국)을 이용하여 분리하였다. 이 과정에서 콜리신D와 강력하게 결합하여 세포 사멸을 방해하는 콜리신D해독단백질이 함께 분리되므로 콜리신D가 결합한 Ni-NTA 비드를 버퍼1로 씻은 후 6 M guanidinium hydrochloride를 이용하여 단백질-단백질 결합을 제거함으로써 콜리신D해독단백질을 비드에서 제거하였다. 이 비드를 다시 버퍼1로 수차례 씻은 후 글리세롤을 포함한 버퍼1에 보관하였다가 사용하였다. 또는 콜리신D를 Ni-NTA 비드에서 용출한 후 보관하고 사용할 수도 있다.

무세포 단백질 생산을 위한 대장균 추출액의 다양한 제조 방법은 이미 잘 알려져 있으며 김 등이 논문(Kim et al. 2006, Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology 126, 554-561)으로 발표한 것과 같은 방법을 사용하였다. 대장균 추출액의 제조 방법은 서로 대동소이하여 본 실시예에서 사용한 대장균 추출액이나 시판되는 무세포 단백질 생산을 위한 키트에 포함된 추출액을 이용하는 경우에도 arginyl-tRNA가 제거된 시스템의 구성 방법에는 차이가 없다. 대장균 추출액 100 ㎕당 15 ㎕의 콜리신D-비드를 첨가한 후 이를 4℃, 16℃, 37℃에서 처리하였다. 처리 온도에 따라 처리 시간을 각각 24시간, 16시간, 1시간으로 하였다. 아래 실시예는 대표적으로 37℃에서 1시간 처리한 예를 기술하나 근본적으로 나머지 경우에도 같은 결과를 얻을 수 있다. 콜리신D-비드로 처리한 대장균 추출액에서 비드를 제거한 후 이를 무세포 단백질 합성 반응에 사용하였다. 무세포 합성 반응의 조건은 기본적으로 김 등이 논문(Kim et al. 2006, Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology 126, 554-561)으로 발표한 것과 같아, 그 조성은 다음과 같다; 57 mM HEPES (pH 7.5), 1.2 mM ATP, 0.85 mM GTP, UTP, and CTP, 2 mM DTT, 90 mM potassium glutamate, 80 mM ammonium acetate, 20 mM magnesium acetate, 34 μg/mL folinic acid, 2.5 mM 아미노산 (20 종류), 2 % polyethylene glycol 8000, 67 mM creatine phosphate, 3.2 μg/mL creatine kinase, DNA, 대장균 추출액 4μL.

Arginyl-tRNA가 제거된 시스템의 구성을 확인하기 위해 EGFP(enhanced green fluorescent protein)(EGFP의 아미노산 서열: 서열번호 5; EGFP의 염기 서열: 서열번호 6)를 무세포 단백질 합성 시스템에서 발현하였다. 사용한 단백질의 아미노산 서열과 염기서열은 서열정보에 나타내었다. 본 단백질은 아미노 말단과 카르복시 말단에 각각 히스티딘 태그와 FLAG 태그가 결합되어 있으며, 총 6개의 아르기닌을 포함하고 있다. 이 6개의 아르기닌에 대한 코돈은 모두 AGG로 통일하여 유전자를 합성하고 (㈜바이오니아, 한국), pET28b (노바젠, 미국)에 클로닝한 후 T7 프로모터와 터미네이터를 포함하는 부분을 PCR(polymerase chain reaction) 방법으로 증폭하여 무세포 단백질 합성 반응의 주형으로 사용하였다. 본 PCR 반응의 프라이머는 다음의 서열로 제작되었다; 5′GAGGATCGAGATCTCGATCC 3′(서열번호 7), 5′ATCCGGATATAGTTCCTCCTT 3'(서열번호 8). 발현된 단백질은 카르복시 말단에 있는 FLAG 서열에 대한 항체를 이용하는 웨스턴블랏으로 확인하였다.

그 결과, 콜리신D로 처리하지 않은 대장균 추출액을 사용한 경우 EGFP가 잘 발현되었으나 콜리신D로 처리한 대장균 추출액을 사용한 경우에는 단백질이 전혀 발현되지 않았다(도 2). 이는 콜리신D로 처리한 대장균 추출액에는 AGG 코돈을 해독할 수 있는 tRNAccu가 없기 때문이므로, 다시 콜리신D로 처리한 대장균 추출액에 외부에서 합성한 tRNAccu를 첨가한 결과, EGFP가 정상적으로 발현되었다(도 2).

비천연 아미노산의 도입

목적 단백질로 사용한 EGFP의 47번째 아미노산인 티로신을 비천연 아미노산으로 치환한 예를 설명한다. 이를 위해서는 본 실시예에서 상술하는 단백질의 47번째 아미노산에 대한 유전 암호를 비어있는(empty) 상태가 되도록 해야 한다. 따라서 티로신에 대한 유전 암호인 TAC(서열번호 6의 139-141)를 유전자 돌연변이 기법을 사용하여 CGA, CGC, CGG, CGT, TAG(amber)으로 변형하였다. 유전 암호의 치환을 위해 목적 단백질이 클로닝된 pET28b 벡터를 아래의 프라이머 짝을 이용하여 PCR하였다:

1) CGA

5′GAGGGCGATGCCACCCGAGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGC 3′(서열번호 9)

5′CTCGGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCG 3′(서열번호 10)

2) CGC

5′GAGGGCGATGCCACCCGCGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGC 3′(서열번호 11)

5′CGCGGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCG 3′(서열번호 12)

3) CGG

5′GAGGGCGATGCCACCCGGGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGC 3′(서열번호 13)

5′CCCGGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCG 3′(서열번호 14)

4) CGT

5′GAGGGCGATGCCACCCGTGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGC 3′(서열번호 15)

5′CACGGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCG 3′(서열번호 16)

5) TAG

5′GAGGGCGATGCCACCTAGGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGC 3′(서열번호 17)

5′CCTAGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCG 3′(서열번호 18)

유전 암호가 치환된 부분을 밑줄로 나타내었다. PCR로 증폭한 유전정보를 대장균에 형질전환한 후 얻어진 단일 군락으로부터 플라스미드 DNA를 얻어 염기 서열을 확인하였다. 변이가 도입된 플라스미드로부터 T7 프로모터와 터미네이터가 포함되도록 PCR하여 무세포 단백질에 사용하였다. 이때 다음의 프라이머 짝을 사용하였다: 5′GAGGATCGAGATCTCGATCC 3′(서열번호 19), 5′ATCCGGATATAGTTCCTCCTT 3′(서열번호 20).

콜리신D로 처리한 대장균 추출액에는 상기 유전암호에 대한 tRNA가 없으므로 단백질 합성이 효과적으로 일어나지 않을 것이다. 이들 코돈을 비천연 아미노산 도입에 사용하기 위해서는 상기 유전암호들에 대한 안티-코돈을 갖는 tRNA를 외부에서 합성해야 한다. 본 실시예에서는 대장균 asparaginyl-tRNA 유래의 서열을 변형하여 사용하였다(Lee et al. 2012, Comparative evaluation of two cell-free protein synthesis systems derived from Escherichia coli for genetic code reprogramming. Journal of biotechnology 164, 330-335). 이 외에도 다른 여러 유래의 tRNA 서열 정보를 변형하여 사용할 수 있다. 서열 정보에 CGA, CGC, CGG, CGT, TAG 코돈에 대한 안티-코돈을 포함하는 tRNA 합성에 사용한 DNA 서열을 나타내었다.

1) CGA에 대한 안티-코돈을 갖는 tRNA 합성용 DNA 서열

GGCGTAATACGACTCACTATAGGCTCTGTAGTTCAGTCGGTAGAACGGCGGACTTCGAATCCGTATGTCACTGGTTCGAGTCCAGTCAGAGCCGCCA (서열번호 21)

2) CGA에 대한 안티-코돈을 갖는 tRNA 서열

GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGACUUCGAAUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGCCA (서열번호 22)

3) CGC에 대한 안티-코돈을 갖는 tRNA 합성용 DNA 서열

GGCGTAATACGACTCACTATAGGCTCTGTAGTTCAGTCGGTAGAACGGCGGACTGCGAATCCGTATGTCACTGGTTCGAGTCCAGTCAGAGCCGCCA (서열번호 23)

4) CGC에 대한 안티-코돈을 갖는 tRNA 서열

GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGACUGCGAAUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGCCA (서열번호 24)

5) CGG에 대한 안티-코돈을 갖는 tRNA 합성 용 DNA 서열

GGCGTAATACGACTCACTATAGGCTCTGTAGTTCAGTCGGTAGAACGGCGGACTCCGAATCCGTATGTCACTGGTTCGAGTCCAGTCAGAGCCGCCA (서열번호 25)

6) CGG에 대한 안티-코돈을 갖는 tRNA 서열

GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGACUCCGAAUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGCCA (서열번호 26)

7) CGT에 대한 안티-코돈을 갖는 tRNA 합성용 DNA 서열

GGCGTAATACGACTCACTATAGGCTCTGTAGTTCAGTCGGTAGAACGGCGGACTACGAATCCGTATGTCACTGGTTCGAGTCCAGTCAGAGCCGCCA (서열번호 27)

8) CGT에 대한 안티-코돈을 갖는 tRNA 서열

GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGACUACGAAUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGCCA (서열번호 28)

9) TAG에 대한 안티-코돈을 갖는 tRNA 합성용 DNA 서열

GGCGTAATACGACTCACTATAGGCTCTGTAGTTCAGTCGGTAGAACGGCGGACTCTAAATCCGTATGTCACTGGTTCGAGTCCAGTCAGAGCCGCCA (서열번호 29)

10) TAG에 대한 안티-코돈을 갖는 tRNA 서열

GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGACUCUAAAUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGCCA (서열번호 30)

이들은 공통적으로 T7 프로모터 부위를 포함하고 있어 T7 RNA polymerase를 이용한 in vitro transcription을 통해 별도의 서열로 표시한 tRNA로 전사하여 사용하였다. In vitro transcription은 Promega사의 키트를 사용하였으나 분리 정제한 T7 RNA polymerase를 사용하는 것은 해당 연구자들에게는 기본적인 반응이다. 이들 합성된 tRNA를 무세포 단백질 시스템에 첨가한 경우에도 이 tRNA들은 비록 각 코돈에 대한 안티-코돈을 포함하나 아미노아실화효소에 인지되지 못하므로 제대로 단백질을 합성하지 못하였다(- Aminoacyl tRNA 샘플들)(도 3).

본 발명에서 기술하는 바와 같이 비어있는 코돈에 대한 tRNA에 인위적으로 아미노산을 연결하여 디저너리시 리프로그래밍을 완성하고자 하였다. 본 실시예에서는 이 등이 논문(Lee et al. 2012, Comparative evaluation of two cell-free protein synthesis systems derived from Escherichia coli for genetic code reprogramming. Journal of biotechnology 164, 330-335)으로 발표한 바와 같이 리보자임을 이용한 tRNA의 아미노아실화 반응을 이용하였다.

구체적으로, 각 tRNA와 아미노아실화 리보자임인 dFx를 0.1 M Tris-HCl (pH 7.4), 0.3 M MgCl₂, 5 mM acetyllysine-3’,5’dinitrobenzyl ester 조건에서 반응하여 tRNA를 아세틸리신으로 아미노아실화 하였다. 리보자임 dFx의 서열은 5′ GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGGU 3′(서열번호 31)으로 해당하는 DNA 주형으로부터 in vitro transcription을 통해 합성하였다. 리보자임을 이용하지 않고, 변이 아미노아실화 효소를 사용하거나, 화학적인 방법으로 tRNA를 아미노아실화하는 방법도 사용 가능하다. 아세틸리신으로 아미노아실화된 tRNA를 콜리신D로 처리한 대장균 추출액을 사용하는 무세포 단백질 합성 시스템에 도입한 결과, CGT 코돈을 사용하는 경우를 제외한 모든 경우에서 자연형과 같은 크기의 단백질로 효과적으로 합성됨을 목적단백질의 카르복시 말단에 포함된 FLAG 서열에 대한 웨스턴블랏으로 확인할 수 있다(도 3).

이는 의도한 바와 같이 위치 특이적으로 비천연 아미노산을 도입하는데 있어 디제너러시 리프로그래밍을 사용할 수 있음을 보여주는 것이다.

다양한 비천연 아미노산에의 적용

이상과 같이 상술한 예를 아세틸리신 외의 다른 비천연 아미노산에 적용하였다. 적용한 아미노산은 mono-, di-, trimethyllysine들로 이는 본 발명이 기술하는 방법이 단백질 합성에 사용될 수 있는 기타 비천연 아미노산의 도입에도 적용될 수 있음을 보인다. 또한 47번 위치 외에 159번과 190번 위치를 포함하는 위치에 순차적으로 이들 비천연 아미노산이 도입될 수 있음을 보인다. 상술한 바와 같이 47번 위치 티로신 유전암호를 CGA 코돈으로 치환한 플라스미드로부터 프라이머 짝(5′AACAGCCACAACGTCCGAATCATGGCCGACAAGCAGAAGA 3′(서열번호 32), 5′ TTCGGACGTTGTGGCTGTTGTAGTTGTAC 3′(서열번호 33))을 이용한 돌연변이로 47, 159번 아미노산인 티로신의 유전암호가 CGA 코돈으로 치환된 플라스미드를 얻었다. 유전자 돌연변이에 대한 실험 방법은 전술한 바 있다. 다시 이로부터 프라이머 짝(5′CAGCTCGCCGACCACCGACAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGC 3′(서열번호 34), 5′ GTCGGTGGTCGGCGAGCTGCACGCTGCCG 3′(서열번호 35))을 이용한 돌연변이로 47, 159, 190번 아미노산인 티로신의 유전암호가 CGA 코돈으로 치환된 플라스미드를 얻었다. 이들 플라스미드로부터 목적단백질의 유전정보를 T7 프로모터와 터미네이터를 포함하도록 PCR로 증폭해 내었다. 증폭한 DNA를 모노메틸리신, 디메틸리신, 트리메틸리신으로 아미노아실화된 tRNAucg와 함께 콜리신D로 처리한 추출액을 사용하는 무세포 단백질 시스템에 첨가하였다. tRNA의 아미노아실화 과정은 전술한 바 있다. 그 결과 단백질 합성에 매우 낮은 효율로 사용되는 트리메틸리신을 포함한 모든 비천연 아미노산을 목적 단백질의 여러 위치에 그것도 동시에 3군데까지 높은 효율로 도입할 수 있음을 알 수 있다(도 4).

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 균등범위 내로서 이용가능한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

<110> Dongguk University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> A METHOD OF SYNTHESIZING UNNATURAL PROTEIN USING DEGENERCY REPROGRAMMING <130> NP14-1157 <160> 35 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 697 <212> PRT <213> Amino acid sequence of colicin D <400> 1 Met Ser Asp Tyr Glu Gly Ser Gly Pro Thr Glu Gly Ile Asp Tyr Gly 1 5 10 15 His Ser Met Val Val Trp Pro Ser Thr Gly Leu Ile Ser Gly Gly Asp 20 25 30 Val Lys Pro Gly Gly Ser Ser Gly Ile Ala Pro Ser Met Pro Pro Gly 35 40 45 Trp Gly Asp Tyr Ser Pro Gln Gly Ile Ala Leu Val Gln Ser Val Leu 50 55 60 Phe Pro Gly Ile Ile Arg Arg Ile Ile Leu Asp Lys Glu Leu Glu Glu 65 70 75 80 Gly Asp Trp Ser Gly Trp Ser Val Ser Val His Ser Pro Trp Gly Asn 85 90 95 Glu Lys Val Ser Ala Ala Arg Thr Val Leu Glu Asn Gly Leu Arg Gly 100 105 110 Gly Leu Pro Glu Pro Ser Arg Pro Ala Ala Val Ser Phe Ala Arg Leu 115 120 125 Glu Pro Ala Ser Gly Asn Glu Gln Lys Ile Ile Arg Leu Met Val Thr 130 135 140 Gln Gln Leu Glu Gln Val Thr Asp Ile Pro Ala Ser Gln Leu Pro Ala 145 150 155 160 Ala Gly Asn Asn Val Pro Val Lys Tyr Arg Leu Met Asp Leu Met Gln 165 170 175 Asn Gly Thr Gln Tyr Met Ala Ile Ile Gly Gly Ile Pro Met Thr Val 180 185 190 Pro Val Val Asp Ala Val Pro Val Pro Asp Arg Ser Arg Pro Gly Thr 195 200 205 Asn Ile Lys Asp Val Tyr Ser Ala Pro Val Ser Pro Asn Leu Pro Asp 210 215 220 Leu Val Leu Ser Val Gly Gln Met Asn Thr Pro Val Leu Ser Asn Pro 225 230 235 240 Glu Ile Gln Glu Glu Gly Val Ile Ala Glu Thr Gly Asn Tyr Val Glu 245 250 255 Ala Gly Tyr Thr Met Ser Ser Asn Asn His Asp Val Ile Val Arg Phe 260 265 270 Pro Glu Gly Ser Asp Val Ser Pro Leu Tyr Ile Ser Thr Val Glu Ile 275 280 285 Leu Asp Ser Asn Gly Leu Ser Gln Arg Gln Glu Ala Glu Asn Lys Ala 290 295 300 Lys Asp Asp Phe Arg Val Lys Lys Glu Glu Ala Val Ala Arg Ala Glu 305 310 315 320 Ala Glu Lys Ala Lys Ala Glu Leu Phe Ser Lys Ala Gly Val Asn Gln 325 330 335 Pro Pro Val Tyr Thr Gln Glu Met Met Glu Arg Ala Asn Ser Val Met 340 345 350 Asn Glu Gln Gly Ala Leu Val Leu Asn Asn Thr Ala Ser Ser Val Gln 355 360 365 Leu Ala Met Thr Gly Thr Gly Val Trp Thr Ala Ala Gly Asp Ile Ala 370 375 380 Gly Asn Ile Ser Lys Phe Phe Ser Asn Ala Leu Glu Lys Val Thr Ile 385 390 395 400 Pro Glu Val Ser Pro Leu Leu Met Arg Ile Ser Leu Gly Ala Leu Trp 405 410 415 Phe His Ser Glu Glu Ala Gly Ala Gly Ser Asp Ile Val Pro Gly Arg 420 425 430 Asn Leu Glu Ala Met Phe Ser Leu Ser Ala Gln Met Leu Ala Gly Gln 435 440 445 Gly Val Val Ile Glu Pro Gly Ala Thr Ser Val Asn Leu Pro Val Arg 450 455 460 Gly Gln Leu Ile Asn Ser Asn Gly Gln Leu Ala Leu Asp Leu Leu Lys 465 470 475 480 Thr Gly Asn Glu Ser Ile Pro Ala Ala Val Pro Val Leu Asn Ala Val 485 490 495 Arg Asp Thr Ala Thr Gly Leu Asp Lys Ile Thr Leu Pro Ala Val Val 500 505 510 Gly Ala Pro Ser Arg Thr Ile Leu Val Asn Pro Val Pro Gln Pro Ser 515 520 525 Val Pro Thr Asp Thr Gly Asn His Gln Pro Val Pro Val Thr Pro Val 530 535 540 His Thr Gly Thr Glu Val Lys Ser Val Glu Met Pro Val Thr Thr Ile 545 550 555 560 Thr Pro Val Ser Asp Val Gly Gly Leu Arg Asp Phe Ile Tyr Trp Arg 565 570 575 Pro Asp Ala Ala Gly Thr Gly Val Glu Ala Val Tyr Val Met Leu Asn 580 585 590 Asp Pro Leu Asp Ser Gly Arg Phe Ser Arg Lys Gln Leu Asp Lys Lys 595 600 605 Tyr Lys His Ala Gly Asp Phe Gly Ile Ser Asp Thr Lys Lys Asn Arg 610 615 620 Glu Thr Leu Thr Lys Phe Arg Asp Ala Ile Glu Glu His Leu Ser Asp 625 630 635 640 Lys Asp Thr Val Glu Lys Gly Thr Tyr Arg Arg Glu Lys Gly Ser Lys 645 650 655 Val Tyr Phe Asn Pro Asn Thr Met Asn Val Val Ile Ile Lys Ser Asn 660 665 670 Gly Glu Phe Leu Ser Gly Trp Lys Ile Asn Pro Asp Ala Asp Asn Gly 675 680 685 Arg Ile Tyr Leu Glu Thr Gly Glu Leu 690 695 <210> 2 <211> 2091 <212> DNA <213> Nucleic acid sequence of colicin D <400> 2 atgtctgact acgaaggttc tggtccgacc gaaggtatcg actacggtca ctctatggtt 60 gtttggccgt ctaccggtct gatctctggt ggtgacgtta aaccgggtgg ttcttctggt 120 atcgctccgt ctatgccgcc gggttggggt gactactctc cgcagggtat cgctctggtt 180 cagtctgttc tgttcccggg tatcatccgt cgtatcatcc tggacaaaga actggaagaa 240 ggtgactggt ctggttggtc tgtttctgtt cactctccgt ggggtaacga aaaagtttct 300 gctgctcgta ccgttctgga aaacggtctg cgtggtggtc tgccggaacc gtctcgtccg 360 gctgctgttt ctttcgctcg tctggaaccg gcttctggta acgaacagaa aatcatccgt 420 ctgatggtta cccagcagct ggaacaggtt accgacatcc cggcttctca gctgccggct 480 gctggtaaca acgttccggt taaataccgt ctgatggacc tgatgcagaa cggtacccag 540 tacatggcta tcatcggtgg tatcccgatg accgttccgg ttgttgacgc tgttccggtt 600 ccggaccgtt ctcgtccggg taccaacatc aaagacgttt actctgctcc ggtttctccg 660 aacctgccgg acctggttct gtctgttggt cagatgaaca ccccggttct gtctaacccg 720 gaaatccagg aagaaggtgt tatcgctgaa accggtaact acgttgaagc tggttacacc 780 atgtcttcta acaaccacga cgttatcgtt cgtttcccgg aaggttctga cgtttctccg 840 ctgtacatct ctaccgttga aatcctggac tctaacggtc tgtctcagcg tcaggaagct 900 gaaaacaaag ctaaagacga cttccgtgtt aaaaaagaag aagctgttgc tcgtgctgaa 960 gctgaaaaag ctaaagctga actgttctct aaagctggtg ttaaccagcc gccggtttac 1020 acccaggaaa tgatggaacg tgctaactct gttatgaacg aacagggtgc tctggttctg 1080 aacaacaccg cttcttctgt tcagctggct atgaccggta ccggtgtttg gaccgctgct 1140 ggtgacatcg ctggtaacat ctctaaattc ttctctaacg ctctggaaaa agttaccatc 1200 ccggaagttt ctccgctgct gatgcgtatc tctctgggtg ctctgtggtt ccactctgaa 1260 gaagctggtg ctggttctga catcgttccg ggtcgtaacc tggaagctat gttctctctg 1320 tctgctcaga tgctggctgg tcagggtgtt gttatcgaac cgggtgctac ctctgttaac 1380 ctgccggttc gtggtcagct gatcaactct aacggtcagc tggctctgga cctgctgaaa 1440 accggtaacg aatctatccc ggctgctgtt ccggttctga acgctgttcg tgacaccgct 1500 accggtctgg acaaaatcac cctgccggct gttgttggtg ctccgtctcg taccatcctg 1560 gttaacccgg ttccgcagcc gtctgttccg accgacaccg gtaaccacca gccggttccg 1620 gttaccccgg ttcacaccgg taccgaagtt aaatctgttg aaatgccggt taccaccatc 1680 accccggttt ctgacgttgg tggtctgcgt gacttcatct actggcgtcc ggacgctgct 1740 ggtaccggtg ttgaagctgt ttacgttatg ctgaacgacc cgctggactc tggtcgtttc 1800 tctcgtaaac agctggacaa aaaatacaaa cacgctggtg acttcggtat ctctgacacc 1860 aaaaaaaacc gtgaaaccct gaccaaattc cgtgacgcta tcgaagaaca cctgtctgac 1920 aaagacaccg ttgaaaaagg tacctaccgt cgtgaaaaag gttctaaagt ttacttcaac 1980 ccgaacacca tgaacgttgt tatcatcaaa tctaacggtg aattcctgtc tggttggaaa 2040 atcaacccgg acgctgacaa cggtcgtatc tacctggaaa ccggtgaact g 2091 <210> 3 <211> 87 <212> PRT <213> Amino acid sequence of Immunity protein D <400> 3 Met Asn Lys Met Ala Met Ile Asp Leu Ala Lys Leu Phe Leu Ala Ser 1 5 10 15 Lys Ile Thr Ala Ile Glu Phe Ser Glu Arg Ile Cys Val Glu Arg Arg 20 25 30 Arg Leu Tyr Gly Val Lys Asp Leu Ser Pro Asn Ile Leu Asn Cys Gly 35 40 45 Glu Glu Leu Phe Met Ala Ala Glu Arg Phe Glu Pro Asp Ala Asp Arg 50 55 60 Ala Asn Tyr Glu Ile Asp Asp Asn Gly Leu Lys Val Glu Val Arg Ser 65 70 75 80 Ile Leu Glu Lys Phe Lys Leu 85 <210> 4 <211> 261 <212> DNA <213> Nucleic acid sequence of Immunity protein D <400> 4 atgaacaaaa tggctatgat cgacctggct aaactgttcc tggcttctaa aatcaccgct 60 atcgaattct ctgaacgtat ctgcgttgaa cgtcgtcgtc tgtacggtgt taaagacctg 120 tctccgaaca tcctgaactg cggtgaagaa ctgttcatgg ctgctgaacg tttcgaaccg 180 gacgctgacc gtgctaacta cgaaatcgac gacaacggtc tgaaagttga agttcgttct 240 atcctggaaa aattcaaact g 261 <210> 5 <211> 254 <212> PRT <213> Amino acid sequence of EGFP <400> 5 Met His His His His His His Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe 1 5 10 15 Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly 20 25 30 His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly 35 40 45 Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro 50 55 60 Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser 65 70 75 80 Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met 85 90 95 Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly 100 105 110 Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val 115 120 125 Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile 130 135 140 Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile 145 150 155 160 Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg 165 170 175 His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln 180 185 190 Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr 195 200 205 Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp 210 215 220 His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly 225 230 235 240 Met Asp Glu Leu Tyr Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 245 250 <210> 6 <211> 762 <212> DNA <213> Nucleic acid sequence of EGFP <400> 6 atgcaccacc accaccacca catggtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg 60 cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag 120 ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag 180 ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc 240 aggtaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac 300 gtccaggaga ggaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagaccag ggccgaggtg 360 aagttcgagg gcgacaccct ggtgaacagg atcgagctga agggcatcga cttcaaggag 420 gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc 480 atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatcaggca caacatcgag 540 gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc 600 gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac 660 gagaagaggg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc 720 atggacgagc tgtacaagga ctacaaagac gacgacgaca aa 762 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR <400> 7 gaggatcgag atctcgatcc 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR <400> 8 atccggatat agttcctcct t 21 <210> 9 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for CGA <400> 9 gagggcgatg ccacccgagg caagctgacc ctgaagttca tctgc 45 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for CGA <400> 10 ctcgggtggc atcgccctcg ccctcg 26 <210> 11 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for CGC <400> 11 gagggcgatg ccacccgcgg caagctgacc ctgaagttca tctgc 45 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for CGC <400> 12 cgcgggtggc atcgccctcg ccctcg 26 <210> 13 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for CGG <400> 13 gagggcgatg ccacccgggg caagctgacc ctgaagttca tctgc 45 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for CGG <400> 14 cccgggtggc atcgccctcg ccctcg 26 <210> 15 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for CGT <400> 15 gagggcgatg ccacccgtgg caagctgacc ctgaagttca tctgc 45 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for CGT <400> 16 cacgggtggc atcgccctcg ccctcg 26 <210> 17 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for TAG <400> 17 gagggcgatg ccacctaggg caagctgacc ctgaagttca tctgc 45 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for TAG <400> 18 cctaggtggc atcgccctcg ccctcg 26 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR <400> 19 gaggatcgag atctcgatcc 20 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR <400> 20 atccggatat agttcctcct t 21 <210> 21 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence for synthesis of tRNA having anti-codon for CGA <400> 21 ggcgtaatac gactcactat aggctctgta gttcagtcgg tagaacggcg gacttcgaat 60 ccgtatgtca ctggttcgag tccagtcaga gccgcca 97 <210> 22 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tRNA sequence having anti-codon for CGA <400> 22 ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg acuucgaauc cguaugucac ugguucgagu 60 ccagucagag ccgcca 76 <210> 23 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence for synthesis of tRNA having anti-codon for CGC <400> 23 ggcgtaatac gactcactat aggctctgta gttcagtcgg tagaacggcg gactgcgaat 60 ccgtatgtca ctggttcgag tccagtcaga gccgcca 97 <210> 24 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tRNA sequence having anti-codon for CGC <400> 24 ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg acugcgaauc cguaugucac ugguucgagu 60 ccagucagag ccgcca 76 <210> 25 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence for synthesis of tRNA having anti-codon for CGG <400> 25 ggcgtaatac gactcactat aggctctgta gttcagtcgg tagaacggcg gactccgaat 60 ccgtatgtca ctggttcgag tccagtcaga gccgcca 97 <210> 26 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tRNA sequence having anti-codon for CGG <400> 26 ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg acuccgaauc cguaugucac ugguucgagu 60 ccagucagag ccgcca 76 <210> 27 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence for synthesis of tRNA having anti-codon for CGT <400> 27 ggcgtaatac gactcactat aggctctgta gttcagtcgg tagaacggcg gactacgaat 60 ccgtatgtca ctggttcgag tccagtcaga gccgcca 97 <210> 28 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tRNA sequence having anti-codon for CGT <400> 28 ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg acuacgaauc cguaugucac ugguucgagu 60 ccagucagag ccgcca 76 <210> 29 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence for synthesis of tRNA having anti-codon for TAG <400> 29 ggcgtaatac gactcactat aggctctgta gttcagtcgg tagaacggcg gactctaaat 60 ccgtatgtca ctggttcgag tccagtcaga gccgcca 97 <210> 30 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tRNA sequence having anti-codon for TAG <400> 30 ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg acucuaaauc cguaugucac ugguucgagu 60 ccagucagag ccgcca 76 <210> 31 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA template for ribozyme dFx <400> 31 ggaucgaaag auuuccgcau ccccgaaagg guacauggcg uuaggu 46 <210> 32 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 32 aacagccaca acgtccgaat catggccgac aagcagaaga 40 <210> 33 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 33 ttcggacgtt gtggctgttg tagttgtac 29 <210> 34 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 34 cagctcgccg accaccgaca gcagaacacc cccatcggcg acggc 45 <210> 35 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 35 gtcggtggtc ggcgagctgc acgctgccg 29

Claims (9)

1) 목적 단백질을 생산하는 대장균 유래 전 tRNA 혼합물(whole tRNA mixture)에서, 비천연 아미노산으로 치환하고자 하는 표적 천연 아미노산을 암호화하는 코돈을 해독하는 표적 tRNA를 선택적으로 분해하는 콜리신 또는 이의 변형체를 처리하여 아르기닌에 대한 코돈을 해독하는 tRNA(arginyl-tRNA)를 제거하여 상기 코돈이 비어있는(empty) 상태로 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)에서 아르기닌에 대한 코돈을 해독하는 tRNA(arginyl-tRNA)가 제거된 대장균 유래 전 tRNA 혼합물에 상기 외부에서 합성한 아르기닌에 대한 코돈을 해독하는 tRNA 및 외부에서 비천연 아미노산과 결합된 아미노아실화 tRNA(aminoacyl tRNA)를 도입하여 단백질 합성 시스템을 회복시키는 단계;를 포함하는 비천연 아미노산을 포함하는 단백질의 합성 방법.

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제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 콜리신 또는 이의 변형체는 콜리신D, 콜리신E5, PrrC, 및 이들의 절단체 및 이들의 단백질공학 변형체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 1) 이후 단백질 합성에 있어 천연 아미노산의 암호화에 사용할 코돈과 비천연 아미노산의 암호화에 사용할 코돈을 구분하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

목적 단백질을 생산하는 대장균 유래 전 tRNA 혼합물(whole tRNA mixture)에 표적 tRNA를 선택적으로 분해하는 콜리신 또는 이의 변형체를 처리하는 단계를 포함하는, 대장균 유래 전 tRNA 혼합물에서의 아르기닌에 대한 코돈을 해독하는 tRNA(arginyl-tRNA)의 제거 방법.

삭제

제 5항에 있어서, 상기 단계 1)의 콜리신 또는 이의 변형체는 콜리신D, 콜리신E5 및 PrrC로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.

1) 무세포 단백질 생산 시스템에서 목적 단백질을 생산하는 대장균 추출액에 콜리신 또는 이의 변형체를 처리하여 아르기닌에 대한 코돈을 해독하는 tRNA(arginyl-tRNA)를 제거하는 단계; 및
2) 외부에서 합성한 아르기닌에 대한 코돈을 해독하는 tRNA, 및 상기 tRNA에 표적 비천연 아미노산을 결합시킨 tRNA를 도입하는 단계;를 포함하는 비천연 아미노산을 포함하는 EGFP 변이체의 제조방법.

제 8항에 있어서, 상기 단계 2)의 비천연 아미노산은 아세틸리신인 것을 특징으로 하는 방법.

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