JP2011500077A - 方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、Ｎ^ε−アセチルリシンを結合可能なｔＲＮＡシンテターゼに関する。詳細には、本発明は、Ｎ^ε−アセチルリシンを結合可能なｔＲＮＡシンテターゼであって、ＭｂＰｙｌＲＳのアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むｔＲＮＡシンテターゼに関する。また、本発明は、Ｎ^ε−アセチルリシンを含むポリペプチドを作製する方法であって、前記ポリペプチドをコードするＲＮＡの翻訳を調節するステップを含み、前記ＲＮＡがアンバーコドンを含み、前記翻訳がクレーム１〜１１のいずれかに記載のポリペプチドの存在下で、Ｎ^ε−アセチルリシンをチャージすることができるｔＲＮＡの存在下で、及びＮ^ε−アセチルリシンの存在下で行われる方法にも関する。

Description

本発明は、生物学的に重要なアセチル化された高分子（macromolecules）の製造分野に関する。詳細には、本発明は、Ｎ^ε−アセチルリシンをポリペプチドに取り込む分野に関する。

アンバー終止コドンに応答して、２０種超の設計された非天然アミノ酸を部位特異的にインビボで取り込むことが可能となるように、原核生物及び真核生物の遺伝コードが拡張されている。この合成遺伝コードの拡張は、アンバーコドンに応答して非天然アミノ酸の部位特異的取込みを指示する、進化した（evolved）直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ対を生物に与えることによって達成される。直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（synthetase）は、同族の直交性ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化するが、他の細胞性ｔＲＮＡはアミノアシル化せず、直交性ｔＲＮＡは直交性シンテターゼの基質であるが、いかなる内因性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによっても実質的にアミノアシル化されない。

メタノコッカス・ヤンナシイ（Methanococcus jannaschii）の直交性チロシル−ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ対の進化した変種を用いた、大腸菌（E. coli）における遺伝コードの拡張は、非天然アミノ酸含有タンパク質の収率を大きく増大させるが、これは、化学量論的に予めアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡの、細胞又はインビトロ翻訳反応物への添加に依存した方法とは対照的に、直交性ｔＲＮＡ_ＣＵＡは、その同族のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ酵素の触媒によって再アシル化され、したがって、アミノアシル化が翻訳効率を制限する必要がないためである。

アセチル化など、タンパク質の複数部位に存在する翻訳後修飾に対応するアミノ酸の翻訳取込みを含む非天然アミノ酸突然変異誘発の多くの可能な適用は、タンパク質の有効な量を作製するために、それより効率的な取込み方法を必要とする。さらに、タンパク質への、それらの天然な細胞状況での生物物理学プローブ及び化学的に正確な撹乱の導入は、以前には不可能であった方法で細胞機能を理解及び制御するという心躍る可能性を提供する。

リシンのＮ^ε−アセチル化は、真核細胞におけるリン酸化反応に匹敵する、調節的役割を有する可逆的な翻訳後修飾である（Shogren-Knaak, M.et al. Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions. Science 311, 844-847 (2006).、Jenuwein, T. & Allis, C.D. Translating the histone code, Science 293, 1074-1080 (2001). 、Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell 128, 693-705 (2007).、Gu, W. & Roeder, R.G. Activation of p53 sequence-specific DNA binding by acetylation of the p53 C-terminal domain. Cell 90, 595-606 (1997).、Groth, A., Rocha, W., Verreault, A. & Almouzni, G. Chromatin challenges during DNA replication and repair. Cell 128, 721-733 (2007).、Peterson, C.L. & Cote, J. Cellular machineries for chromosomal DNA repair. Genes Dev 18, 602-616 (2004).、Hubbert, C. et al. HDAC6 is a microtubule-associated deacetylase. Nature 417, 455-458 (2002).、Serrador, J.M. et al. HDAC6 deacetylase activity links the tubulin cytoskeleton with immune synapse organization. Immunity 20, 417-428 (2004).、Yang, X.J. & Gregoire, S. Metabolism, cytoskeleton and cellular signalling in the grip of protein Nepsilon- and O-acetylation. EMBO Rep 8, 556-562 (2007).、Scroggins, B. T. et al. An acetylation site in the middle domain of Hsp90 regulates chaperone function. Mol Cell 25, 151-159 (2007).、Bannister, A. J., Miska, E.A., Gorlich, D. & Kouzarides, T. Acetylation of importin-alpha nuclear import factors by CBP/p300. Curr Biol 10, 467-470 (2000).、Yuan, Z. L., Guan, Y. J., Chatterjee, D. & Chin, Y. E. Stat3 dimerization redulated by reversible acetylation of a single lysine residue. Science 307, 269-273 (2005).、Cohen, H. Y. et al. Acetylation of the C terminusof Ku70 by CBP and PCAF controls Bax-mediated apotosis. Mol Cell 13, 627-638 (2004).、Kouzarides, T. Acetylation: a regulartory modification to rival phosphorylation? Embo J 19, 1176-1179 (2000).）。Ｎ^ε−アセチルリシンを含有するタンパク質を規定部位で合成する一般的な方法は存在していない。

リシンのＮ^ε−アセチル化が初めて記載されたのはヒストンに関してであった（Allfrey, V. G., Faulkner, R. & Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. Proc Natl Acad Sci USA 51, 786-794 (1964).）。リシンのアセチル化及び脱アセチル化は、それぞれ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴｓ）及びヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣｓ）を媒介して行われる。近年、２０％超のミトコンドリアタンパク質を含む（ヒストンを超える）数百もの真核生物のタンパク質がアセチル化によって調節されていることが明らかになっている（Kim, S. C. et al. Substrate and functional diversity of lysine acetylation revealed by a proteomics survey. Mol Cell 23, 607-618 (2006).）。

リシンのアセチル化が極めて重要であるにもかかわらず、Ｎ^ε−アセチルリシンを含有するホモジニアスな組換えタンパク質を規定部位で産生する一般的な方法はない。クロマチンのデコンパクションにおけるＨ４ Ｋ１６の役割を示すため、天然型化学ライゲーションによるＮ^ε−アセチルリシンを取り込むための半合成方法が採用されていた（Shogren-Knaak, M.et al. Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions. Science 311, 844-847 (2006).）。かかる研究は、ホモジニアスにアセチル化されたタンパク質を産生する一般的な方法が、生物学におけるアセチル化に分子が果たす役割を理解する上で、いくばくかの衝撃を与えるものである。

現行の化学に基づくアセチル化の方法は、大量の修飾ペプチドチオエステルの合成を必要とするという欠点を有している。さらに、かかる既知の方法は、Ｎ末端残基に制限されるという問題点も有している。

組換えタンパク質をアセチル化するために、精製ＨＡＴ複合体を使用する研究者もいたが、これは、i）特定の修飾のためのＨＡＴは未知の場合がある、ii）活性なＨＡＴ複合体を調製するためには大変な努力が要求されることが多い、iii）ＨＡＴが媒介する反応は達成することが困難な場合が多く、ヘテロジニアスなサンプルとなってしまう、及びiv）ＨＡＴは数箇所の部位をアセチル化することがあり、任意の１つの部位の分子の帰結を特定して調べることが困難である、という理由から、満足のいく解決策とならないことが多い。

本発明は、先行技術に関連する問題を克服しようとするものである。

Shogren-Knaak, M.et al. Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions. Science 311, 844-847 (2006). Jenuwein, T. & Allis, C.D. Translating the histone code, Science 293, 1074-1080 (2001). Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell 128, 693-705 (2007). Gu, W. & Roeder, R.G. Activation of p53 sequence-specific DNA binding by acetylation of the p53 C-terminal domain. Cell 90, 595-606 (1997). Groth, A., Rocha, W., Verreault, A. & Almouzni, G. Chromatin challenges during DNA replication and repair. Cell 128, 721-733 (2007). Peterson, C.L. & Cote, J. Cellular machineries for chromosomal DNA repair. Genes Dev 18, 602-616 (2004). Hubbert, C. et al. HDAC6 is a microtubule-associated deacetylase. Nature 417, 455-458 (2002). Serrador, J.M. et al. HDAC6 deacetylase activity links the tubulin cytoskeleton with immune synapse organization. Immunity 20, 417-428 (2004). Yang, X.J. & Gregoire, S. Metabolism, cytoskeleton and cellular signalling in the grip of protein Nepsilon-and O-acetylation. EMBO Rep 8, 556-562 (2007). Scroggins, B. T. et al. An acetylation site in the middle domain of Hsp90 regulates chaperone function. Mol Cell 25, 151-159 (2007). Bannister, A. J., Miska, E.A., Gorlich, D. & Kouzarides, T. Acetylation of importin-alpha nuclear import factors by CBP/p300. Curr Biol 10, 467-470 (2000). Yuan, Z. L., Guan, Y. J., Chatterjee, D. & Chin, Y. E. Stat3 dimerization redulated by reversible acetylation of a single lysine residue. Science 307, 269-273 (2005). Cohen, H. Y. et al. Acetylation of the C terminusof Ku70 by CBP and PCAF controls Bax-mediated apotosis. Mol Cell 13, 627-638 (2004). Kouzarides, T. Acetylation: a regulartory modification to rival phosphorylation? Embo J 19, 1176-1179 (2000). Hao, B. et al. A new UAG-encoded residue in the structure of a methanogen methyltransferase. Science 296, 1462-1466 (2002). Srinivasan, G., James, C. M. & Krzycki, J. A. Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: charging of a UAG-decoding specialized tRNA. Science 296, 1459-1462 (2002). Blight, S. K. et al. Direct charging of tRNA (CUA) with pyrrolysine in vitro and in vivo. Nature 431, 333-335 (2004). Ambrogelly, A. et al. Pyrrolysine is not hardwired for cotranslational insertion at UAG codons. Proc Natl Acad Sci USA104, 3141-3146 (2007). Polycarpo, C. R. et al. Pyrrolysine analogues as substrates for pyrrolysyl-tRNA synthetase. FEBS Lett 580, 6695-6700 (2006). Kim, S. C. et al. Substrate and functional diversity of lysine acetylation revealed by a proteomics survey. Mol Cell 23, 607-618 (2006). Allfrey, V. G., Faulkner, R. & Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. Proc Natl Acad Sci USA 51, 786-794 (1964). Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L. & Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Proc Natl Acad Sci USA 99, 11020-11024 (2002). Kavran, J. M. et al. Structure of pyrrolysyl-tRNA synthetase, an archaeal enzyme for genetic code innovation. Proc Natl Acad Sci USA104, 11268-11273 (2007). Blander, G. & Guarente, L. The Sir2 family of protein deacetylases. Annu Rev Biochem 73, 417-435 (2004). Schwer, B., Bunkenborg, J., Verdin, R. O., Andersen, J. S. & Verdin, E. Reversible lysine acetylation controls the activity of the mitochondrial enzyme acetyl-CoA synthetase 2. Proc Natl Acad Sci USA103, 10224-10229 (2006). Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F. & Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature 389, 251-260 (1997). Wang, K., Neumann, H., Peak-Chew, S. Y. & Chin, J. W. Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic code expansion. Nat Biotechnol 25, 770-777 (2007). Santoro, S. W., Wang, L., Herberich, B., King, D.S. & Schultz, P. G. An efficient system for the evolution of aminoacyl-tRNA synthetase specificity. Nat Biotechnol 20, 1044-1048 (2002). Rackham, O. & Chin, J. W. A network of orthogonalribosome x mRNA pairs. Nat Biol 1, 159-166 (2005). Christ. D., Famm, K. & Winter, G. Tapping diversity lost in transformations-in vitro amplification of ligation reactions. Nucleic Acids Res 34, e108 (2006).

リシンのＮ^ε−アセチル化は、実質的な、生物学的重要性を有する翻訳後修飾である。先行技術におけるＮ^ε−アセチル化の研究は、極めて困難である。Ｎ^ε−アセチル化タンパク質を産生するための先行技術の技法は、Ｎ^ε−アセチルリシンを対象となるポリペプチドに取り込むという、化学的方法又は半合成方法に依存してきた。かかるプロセスのなかには技術的な要求が極めて厳しいものがあるが、一方、他の方法によっても、Ｎ末端残基の修飾に制限されるなど、厳しい制限がある。先行技術においては、Ｎ^ε−アセチルリシンを含むホモジニアスな組換えタンパク質を産生する一般的な方法がない。

[発明を解決するための手段]
本発明者らは、正確な規定場所でＮ^ε−アセチルリシンをポリペプチドに確実に取り込むために、細胞における天然ポリペプチド合成機構（翻訳機構）を利用する方法を考え出した。具体的には、本発明者らは、Ｎ^ε−アセチルリシンを受け入れ、その転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）への取込みを触媒するように修飾されたｔＲＮＡシンテターゼを開発した。したがって、本発明者らは、従来では本来未知であった新規な酵素活性を創出したのであった。また、本発明者らは、かかる新規な酵素を進化させて、合成点及び操作者が選択する位置でＮ^ε−アセチルリシンを特異的にタンパク質に取り込むために使用できる、適切なｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ対とした。

したがって、本発明者らが初めて新規なｔＲＮＡシンテターゼ及びこれに対応するＮ^ε−アセチルリシンを取り込んだポリペプチドの産生のための新規なアプローチを提供する。これらの新規な材料及び技法は、その各々が所望の翻訳後修飾を含むポリペプチドのホモジニアスなサンプルの産生を可能にする。このことは、先行技術において知られる既存の化学に基づく技法によっては、全く不可能であった。

本発明は、上記の顕著な知見に基づくものである。

したがって、１つの態様では、本発明は、Ｎ^ε−アセチルリシンを結合可能なｔＲＮＡシンテターゼを提供するものである。

他の態様では、本発明は、上記のｔＲＮＡシンテターゼに関し、前記シンテターゼは、ＭｂＰｙｌＲＳのアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。適切には、前記同一性は、少なくとも５０の連続するアミノ酸にわたって評価される。適切には、前記同一性は、ＭｂＰｙｌＲＳのＬ２６６〜Ｃ３１３に対応するアミノ酸を含む領域にわたって評価される。

他の態様では、本発明は、上記のｔＲＮＡシンテターゼに関し、前記ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドは、ＭｂＰｙｌＲＳの少なくともＬ２６６〜Ｃ３１３に対応するアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。

適切には、前記ポリペプチドは、野生型ＭｂＰｙｌＲＳ配列のＬ２６６、Ｌ２７０、Ｙ２７１、Ｌ２７４又はＣ３１３の1又は２以上において変異を含む。

適切には、前記少なくとも１つの変異（すなわち、前記1又は２以上の変異）は、Ｌ２７０、Ｙ２７１、Ｌ２７４又はＣ３１３にある。

適切には、前記少なくとも１つの変異は、Ｌ２７０、Ｌ２７４又はＣ３１３にある。

適切には、前記ｔＲＮＡシンテターゼは、Ｙ２７１Ｌを含む。

適切には、前記ｔＲＮＡシンテターゼは、Ｙ２７１Ｆを含む。

適切には、前記ｔＲＮＡシンテターゼは、Ｌ２６６Ｖを含む。

適切には、前記ｔＲＮＡシンテターゼは、Ｌ２７０Ｉ、Ｙ２７１Ｌ，Ｌ２７４Ａ及びＣ３１３Ｆを含む。

適切には、前記ｔＲＮＡシンテターゼは、Ｌ２６６Ｖ、Ｌ２７０Ｉ，Ｙ２７１Ｆ、Ｌ２７４Ａ及びＣ３１３Ｆを含む。

他の態様では、本発明は、上記のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。

他の態様では、本発明は、ｔＲＮＡにＮ^ε−アセチルリシンをチャージするための上記のポリペプチドの使用に関する。適切には、前記ｔＲＮＡは、ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡ（すなわち、適切には、前記ｔＲＮＡは、ＭｂＰｙｌＴ遺伝子にコードされる一般に入手可能な野生型メタノサルシナ・バルケリ(Methanosarchina barkeri)ｔＲＮＡＣＵＡ配列）を含む。

他の態様では、本発明は、前記ポリペプチドをコードするＲＮＡの翻訳をアレンジ（arrange for）するステップを含む、Ｎ^ε−アセチルリシンを含むポリペプチドを作製する方法であって、前記ＲＮＡがアンバーコドンを含み、前記翻訳が上記のポリペプチドの存在下で、Ｎ^ε−アセチルリシンをチャージすることができるｔＲＮＡの存在下で、及びＮ^ε−アセチルリシンの存在下で行われる方法に関する。

適切には、前記翻訳は、脱アセチル化阻害剤の存在下で行われる。

適切には、前記阻害剤は、ニコチンアミド（ＮＡＭ）を含む。

他の態様では、本発明は、Ｎ^ε−アセチルリシンを含むポリペプチドを作製する方法であって、Ｎ^ε−アセチルリシンを取り込むのに望ましい前記ポリペプチドにおける位置に対応する1又は２以上の位置でアンバーコドンを提供するために、前記ポリペプチドをコードする核酸を修飾するステップを含む方法に関する。適切には、前記核酸を修飾するステップは、リシンのコドンをアンバーコドン（ＴＡＧ）で変異させるステップを含む。

他の態様では、本発明は、Ｎ^ε−アセチルリシンを含むホモジニアスな組換えタンパク質に関する。先行技術のタンパク質は、そのＮ^ε−アセチルリシン含有量に関してヘテロジニアスであった。適切には、前記タンパク質は上記の方法で作製される。

他の態様では、本発明は、上記の核酸を含むベクターに関する。適切には、前記ベクターは、前記ｔＲＮＡシンテターゼのｔＲＮＡ基質をコードする核酸配列をさらに含む。適切には、前記ｔＲＮＡ基質は、ＭｂＰｙｌＴ遺伝子（上記参照）にコードされる。

他の態様では、本発明は、上記の核酸又は上記のベクターを含む細胞に関する。

他の態様では、本発明は、不活性化されたデアセチラーゼ遺伝子をさらに含む上記の細胞に関する。適切には、前記不活性化されたデアセチラーゼ遺伝子は、ＣｏｂＢの欠失又は破壊を含む。

他の態様では、本発明は、上記ベクター又は上記細胞、及びニコチンアミドを一定量含むキットに関する。

他の態様では、本発明は、Ｎ^ε−アセチルリシンを結合可能なｔＲＮＡシンテターゼを作製する方法であって、親ｔＲＮＡシンテターゼ配列をコードする核酸を1又は２以上のＬ２６６、Ｌ２７０、Ｙ２７１、Ｌ２７４又はＣ３１３で変異させるステップと、Ｎ^ε−アセチルリシンを結合可能な1又は２以上の変異体を選択するステップとを含む方法に関する。

（発明の詳細な説明）
アセチル化されたタンパク質を合成する方法における先行技術の欠点を解決するために、本発明者らは、直交性Ｎ^ε−アセチル−リシル−ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ対の生成を介する、Ｎ^ε−アセチルリシンのタンパク質へのアンバーコドン応答性の取込みを高い翻訳忠実性と効率性で遺伝学的にコードすることを考えた。ここで、本発明者らは、部位特異的にアセチル化された組換えタンパク質を作製するために、大腸菌（E.coli）においてアンバーコドンに応答してＮ^ε−アセチルリシンを遺伝学的に取り込む方法と材料を記載する。さらに、本発明者らは、先行技術に基づく技法では不可能であった、かかるタンパク質をホモジニアスに作製することを可能にする。本発明者らは、メタノサルシナ・バルケリ・ピロリシル−ｔＲＮＡシンテターゼ(ＭｂＰｙｌＲＳ)／ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡ対（Hao, B. et al. A new UAG-encoded residue in the structure of a methanogen methyltransferase. Science 296, 1462-1466 (2002).、Srinivasan, G., James, C. M. & Krzycki, J. A. Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: charging of a UAG-decoding specialized tRNA. Science 296, 1459-1462 (2002).、Blight, S. K. et al. Direct charging of tRNA (CUA) with pyrrolysine in vitro and in vivo. Nature 431, 333-335 (2004).、Ambrogelly, A. et al. Pyrrolysine is not hardwired for cotranslational insertion at UAG codons. Proc Natl Acad Sci USA104, 3141-3146 (2007).、Polycarpo, C. R. et al. Pyrrolysine analogues as substrates for pyrrolysyl-tRNA synthetase. FEBS Lett 580, 6695-6700 (2006).）が大腸菌において直交性であること、及び以前に報告された有用な対に匹敵する効率性を有することを示す。本発明者らは、高い翻訳忠実性と効率性でＮ^ε−アセチルリシンの部位特異的な、アンバーコドン応答性の取込みを行うために、かかる対を進化させる。さらに、本発明者らは、当初観察された翻訳後の脱アセチル化を成功裡に全滅させた。かかる戦略により、クロマチン修飾のために提案された後成的コードにおけるアセチル化の役割を解読するうえで（Jenuwein, T. & Allis, C.D. Translating the histone code, Science 293, 1074-1080 (2001).、Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell 128, 693-705 (2007).）、及びＮ^ε−アセチル化に細胞が果たす役割をより広汎に理解するうえで（Kim, S. C. et al. Substrate and functional diversity of lysine acetylation revealed by a proteomics survey. Mol Cell 23, 607-618 (2006).）、多様な用途が見い出されるにいたった。

定義
「含む（comprise, comprising）」という用語は、当業界において通常意味する内容にて理解されるべきである。すなわち、かかる用語には、記載された特徴又は特徴群が包含されるが、現に存在するその他のいかなる記載された特徴又は特徴群をも排除するものではない。

生物における分子の相互作用のネットワークは、先祖遺伝子(progenitor gene)の複製の後に、かかる複製されたコピーが新規な機能を獲得することを通して進化してきた。本明細書に記載されているのは、直交性分子、すなわち先祖遺伝子と複製された分子との間のクロストークなしで、かかる先祖遺伝子と並行して情報処理が可能な分子を産生するために、天然のプロセスを人為的に模倣するプロセスである。かかるプロセスを使用すると、今や、多くの自然の運命の中からの複製された分子対の進化の結果を調整して、複製された分子と、かかる分子が由来する先祖遺伝子との関係性を予定することが可能である。このことは、野生型ｔＲＮＡシンテターゼ及びｔＲＮＡと並行して情報を処理できるが、野生型分子と直交性分子との間のクロストークには関与しない直交性ｔＲＮＡシンテターゼ直交性ｔＲＮＡ対の生成によって、本明細書に例示されている。いくつかの実施形態では、ｔＲＮＡそのものは、その野生型配列を保持していてもよい。かかる実施形態では、適切には、その野生型配列を保持する前記存在は、異質な設定、すなわち、その野生型天然宿主細胞とは相違するバックグラウンド又は宿主細胞において使用される。このようにして、かかる野生型の存在は、構造的に変化させる必要なく、機能的な意味合いにおいて直交性であってもよい。直交性及びそのために受容されてきた基準については、以下でより詳細に述べる。

メタノサルシナ・バルケリ・ＰｙｌＳ遺伝子は、ＭｂＰｙｌＲＳ ｔＲＮＡシンテターゼタンパク質をコードする。かかるメタノサルシナ・バルケリ・ＰｙｌＳ遺伝子は、ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡｔＲＮＡをコードする。

配列相同性／同一性
配列相同性は、機能上の類似性の観点（すなわち、類似する化学的な性質／機能を有するアミノ酸残基）からも考慮され得るにもかかわらず、本明細書の文脈では、配列同一性の観点から相同性を表すことが好ましい。

配列の比較は、肉眼で行うことができ、又はより日常的には、容易に入手可能な配列比較プログラムの補助によって行うことができる。これらの一般に入手可能かつ市販のコンピュータープログラムは、２又は３以上の配列間において（百分率表示の同一性など）百分率表示の相同性を計算することができる。

百分率表示の同一性は、連続する配列にわたって計算されてもよい。すなわち、１つの配列を他の配列とアラインメントし、１つの配列における各アミノ酸を別の配列中の対応するアミノ酸と一残基ずつ、直接比較する。これは「ギャップのない」アラインメントと呼ばれる。典型的には、かかるギャップのないアラインメントは、比較的少数の残基（例えば連続する５０未満のアミノ酸など）に対してのみ行われる。

かかる方法は極めて簡単で一貫性があるが、この方法では、例えば、１つの挿入又は欠失以外は同一の配列対において、かかる１つの挿入又は欠失の後に続くアミノ酸残基がアラインメントからずれることにより、グローバルアラインメント（配列全体にわたるアラインメント）を行うときの相同性（百分率表示の同一性）が大幅に低下する結果となり得るということを考慮に入れていない。その結果、殆どの配列比較法は、全体的な相同性（同一性）スコアが不当に過小とならないように起こり得る挿入や欠失を考慮した最適なアラインメントを生み出すよう設計されている。このことは、部分的な相同性／同一性を最大限にするために、配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することによって達成される。

これらの、より複雑な方法は、「ギャップペナルティー」をアラインメントで生じ得るギャップの各々に割り当てて、同数の同一アミノ酸に対して、できるだけ少数のギャップを有する配列アラインメントが、２つの比較された配列間のより高い関連性を反映して、多くのギャップを有する配列アラインメントよりも高いスコアを達成できるようにする。「アフィンギャップコスト(affine gap costs)」は、ギャップの存在に対して比較的高いコストを、ギャップの後続の各残基に対しては比較的低いペナルティーを課すものであり、通常に使用されている。これが最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。ギャップに対するペナルティーを高くすると、当然ながら、より少数のギャップを有する最適化されたアラインメントとなるであろう。殆どのアラインメントプログラムによって、ギャップペナルティーを修正することが可能である。しかしながら、配列比較の目的でかかるソフトウェアを使用する際には、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧウィスコンシン・ベストフィット・パッケージ（以下を参照）を使用する場合、アミノ酸配列のデフォルトギャップペナルティーは、ギャップ１個に対して−１２であり、１個延長するごとに−４である。
したがって、百分率表示で相同性の最大値を計算するためには、ギャップペナルティーを考慮に入れた最適なアラインメントの作製を第１に必要とする。かかるアラインメントを実行するための適切なコンピュータープログラムは、ＧＣＧウィスコンシン・ベストフィット・パッケージ（米国、ウィスコンシン大学；Devereux et al., 1984, Nucleic Acid Research 12:387）である。配列比較が可能なその他のソフトウェアの例として、ＢＬＡＳＴパッケージ、ＦＡＳＴＡ（Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410）及びＧＥＮＥＷＯＲＫＳの比較ツール一式が含まれるが、これらに限られない。

同一性に関して、最終的な百分率表示の相同性が測定可能であるにもかかわらず、アラインメントプロセスそのものは、通常は全か無か(all-or-nothing)という対の比較に基づくものではない。その代わりに、化学類似性又は進化距離に基づいて各対ごとの比較に対してスコアを割り当てる測定類似性のスコアマトリックスが一般的に使用される。よく使用されるかかるマトリックスの例として、ＢＬＡＳＴプログラム一式のデフォルトマトリックスであるＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスがある。ＧＣＧウィスコンシンプログラムは、一般的に、公的なデフォルト値又はカスタムシンボル比較表がある場合は、これらのうちのいずれかを使用する。ＧＣＧパッケージ用に、公的なデフォルト値、又は、その他のソフトウェアの場合は、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルトマトリックスを使用することが好ましい。かかるソフトウェアがひとたび最適なアラインメントを作製すると、百分率表示の相同性、好ましくは百分率表示の配列同一性を計算することが可能である。通常、かかるソフトウェアは、配列比較の一部としてこの計算を行い、数値結果を出す。

本明細書の文脈において、相同なアミノ酸配列は、アミノ酸レベルで少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％又は９８％の同一性があるアミノ酸配列を含む。適切には、この同一性は、本明細書で開示される関連するポリペプチド配列、最も適切には完全長の前駆体（親）ｔＲＮＡシンテターゼ配列を用い、少なくとも５０又は１００、好ましくは、２００、３００又はそれを超えるアミノ酸について評価される。適切には、相同性は、タンパク質の機能に必須ではない隣接配列よりも、タンパク質の機能に必須であることが知られる配列の1又は２以上の領域に関して考慮されるべきである。このことは、距離的に関連がある生物の相同な配列を考慮する場合に特に重要である。

最も適切には、配列の同一性は、ＭｂＰｙｌＲＳのアミノ酸配列の少なくともＬ２６６〜Ｃ３１３までの連続する領域にわたって、又は代替するｔＲＮＡシンテターゼにおける対応領域にわたって判断されるべきである。

同様の考え方が、ｔＲＮＡ配列などの核酸ヌクレオチド配列にも当てはまる。

基準配列
特定のアミノ酸残基について数値アドレスを用いて言及するときに、かかる番号化は、ＭｂＰｙｌＲＳ（メタノサルシナ・バルケリ・ピロリシル−ｔＲＮＡシンテターゼ）アミノ酸配列を基準配列（すなわち、一般に入手可能な野生型メタノサルシナ・バルケリＰｙｌＳ遺伝子にコードされる）として用いて行う。これは、当技術分野で十分理解されているように、対象となる残基の位置を決定するために使用される。これは、必ずしも厳密な計算を要しないが、状況理解のためには注意が必要である。例えば、対象となるタンパク質の長さが若干異なる場合、その配列中の（例えば）Ｙ２７１に対応する正しい残基の位置決めには、単に対象となる配列の第２７１番目の残基を選択するのではなく、それら配列をアラインメントし、相当する又は対応する残基を選択する必要があるかもしれない。このことは、熟練した読者であれば十分にその知識範囲内にある。

変異は、当技術分野では通常の意味を有し、言及される残基、モチーフ又はドメインの置換、切断又は欠失を指すことがある。変異は、例えば、変異配列を有するポリペプチドの合成によってポリペプチドレベルで、又は、例えば、変異配列をコードする核酸を作製することによってヌクレオチドレベルで生じることがあり、この後、核酸が翻訳されて変異ポリペプチドを作製する。所与の変異部位に置換アミノ酸としてのアミノ酸が特定されていない場合は、適切には、例えば、本発明のｔＲＮＡシンテターゼの進化及び適応に関連して本明細書に記載されているように、かかる部位のランダム化が使用される。デフォルト変異として、アラニン（Ａ）を使用することもできる。適切には、特定部位で使用される変異は、本明細書に記載されている。

フラグメントは、適切には、少なくとも１０アミノ酸長、適切には、少なくとも２５アミノ酸長、適切には、少なくとも５０アミノ酸長、適切には、少なくとも１００アミノ酸長、適切には、少なくとも２００アミノ酸長、適切には、少なくとも２５０アミノ酸長、適切には、少なくとも３００アミノ酸長、適切には、少なくとも３１３アミノ酸長、又は適切には、対象となるｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドの大多数である。

本発明のポリペプチド
適切には、Ｎ^ε−アセチルリシンを含むポリペプチドは、ヌクレオソーム又はヌクレオソームポリペプチドである。

適切には、Ｎ^ε−アセチルリシンを含むポリペプチドは、クロマチン又はクロマチン会合性ポリペプチドである。

本発明のポリヌクレオチドは、組換え複製可能型ベクターに取り込まれることができる。かかるベクターは、適合する宿主細胞における核酸を複製するために使用されてもよい。このようにして、さらなる実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを複製可能型ベクターに導入することによって、かかるベクターを適合する宿主細胞に導入することによって、及びかかる宿主細胞をベクターの複製をもたらす条件下で生育することによって、本発明のポリペプチドを作製する方法を提供する。かかるベクターは、宿主細胞から回復されてもよい。適切な宿主細胞は、大腸菌などの細菌を含む。

好ましくは、ベクター内の本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞によってコード配列を発現させることができる制御配列に操作可能（operably）に連結される。すなわち、かかるベクターは発現ベクターである。「操作可能に連結される」という用語は、記載の構成要素同士が、それらが意図どおりに機能できる関係にあることを意味する。コード配列に「操作可能に連結される」調節配列は、コード配列の発現が制御配列と適合する条件下で達成される方法でライゲーションされる。

本発明のベクターは、上記のように、本発明のタンパク質の発現をもたらすために、適切な宿主細胞へ形質転換又はトランスフェクトされる。このプロセスは、上記のように、タンパク質をコードするコード配列のベクターによって発現をもたらす条件下で発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を培養するステップと、任意で、発現されたタンパク質を回収するステップとを含んでいてもよい。

ベクターは、例えば、複製起点を備えたプラスミドベクター又はウイルスベクターであってもよく、任意で前記ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター及び任意でかかるプロモーターのレギュレーターである。かかるベクターは、例えば細菌プラスミドの場合のアンピシリン耐性遺伝子のように、1又は２以上の選択可能なマーカー遺伝子を含有してもよい。ベクターは例えば、宿主細胞をトランスフェクト又は変換するために使用されてもよい。

本発明のタンパク質をコードする配列に操作可能に連結された制御配列は、プロモーター／エンハンサー及びその他の発現調節シグナルを含む。

これらのコントロール配列は、発現ベクターがその中で使用されるよう設計されている宿主細胞と適合するように選択されてもよい。プロモーターの用語は、当業界では周知であり、極小のプロモーターからアップストリームエレメント及びエンハンサーを含むプロモーターまで大きさ及び複雑さに幅がある核酸領域を包含する。

タンパク質の発現及び精製
本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、本発明のタンパク質を発現するために使用されてもよい。宿主細胞は、本発明のタンパク質の発現を可能にする適切な状況下で、培養されてもよい。本発明のタンパク質の発現は、かかるタンパク質が連続的に作製されるような構成的なものであってもよく、又は発現を開始するために刺激を必要とするような誘導性であってもよい。誘導性発現の場合は、例えばデキサメタソン又はＩＰＴＧなどの培地への誘導物質の追加等の要請に応じてタンパク質の産生を開始することができる。

本発明のタンパク質は、酵素的、化学的及び／又は浸透圧溶解及び物理的破壊など、当技術分野で知られた種々の技法によって、宿主細胞から抽出されることができる。

最適化
インビトロ翻訳反応での非天然アミノ酸の取込みは、ＲＦ−１の熱不活性化された変異体を含有するＳ３０抽出物を用いることによって増大させることができる。ＲＦ−１の温度感受性変異体は、インビボにおける全体的なアンバー抑制の一時的増大を可能にする。ｔＲＮＡ_ＣＵＡ遺伝子のコピー数の増加及び最小培地から富栄養培地への移行は、大腸菌における非天然アミノ酸を取り込むタンパク質の収率の改善をも提供する可能性がある。

産業上の利用可能性
Ｎ^ε−アセチル化は、多種多様な細胞プロセスを調節する。いくつかのヒストン上のリシン残基のアセチル化は、クロマチン濃度を調節し（Shogren-Knaak, M.et al. Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions. Science 311, 844-847 (2006).）、ヒストンコードの一部として後成的な基準となることができ（Jenuwein, T. & Allis, C.D. Translating the histone code, Science 293, 1074-1080 (2001).）、転写、ＤＮＡ複製、ＤＮＡリペア、組換え及びゲノム安定性の調節に関与する因子の動員を、解明され始めた方法で組織化する（Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell 128, 693-705 (2007).）。腫瘍抑制遺伝子ｐ５３を含む（Gu, W. & Roeder, R.G. Activation of p53 sequence-specific DNA binding by acetylation of the p53 C-terminal domain. Cell 90, 595-606 (1997).）、６０超の転写因子と、補因子とがアセチル化され、転写、ＤＮＡ複製、ＤＮＡリペア、遺伝子組換え機構の構成要素間の相互作用が、アセチル化によって調節される（Groth, A., Rocha, W., Verreault, A. & Almouzni, G. Chromatin challenges during DNA replication and repair. Cell 128, 721-733 (2007).、Peterson, C.L. & Cote, J. Cellular machineries for chromosomal DNA repair. Genes Dev 18, 602-616 (2004).）。アセチル化は、細胞骨格の動態を調節し、免疫学的シナプスを組織化し、キネシン輸送を刺激するうえで重要である（Hubbert, C. et al. HDAC6 is a microtubule-associated deacetylase. Nature 417, 455-458 (2002).、Serrador, J.M. et al. HDAC6 deacetylase activity links the tubulin cytoskeleton with immune synapse organization. Immunity 20, 417-428 (2004).）。また、アセチル化は、ブドウ糖、アミノ酸及びエネルギー代謝の重要な調節因子であり、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、アセチルＣｏＡシンターゼ、キナーゼ、フォスフォターゼ及びユビキチンリガーゼＭＤＭ（murine double minute）を含むいくつかの主要酵素の活性が、アセチル化によって直接的に調節される（Yang, X.J. & Gregoire, S. Metabolism, cytoskeleton and cellular signalling in the grip of protein Nepsilon-and O-acetylation. EMBO Rep 8, 556-562 (2007).）。アセチル化は、シャペロン機能（Scroggins, B. T. et al. An acetylation site in the middle domain of Hsp90 regulates chaperone function. Mol Cell 25, 151-159 (2007).）、タンパク質輸送及び折畳み（Bannister, A. J., Miska, E.A., Gorlich, D. & Kouzarides, T. Acetylation of importin-alpha nuclear import factors by CBP/p300. Curr Biol 10, 467-470 (2000).）、stat３が媒介するシグナル変換（Yuan, Z. L., Guan, Y. J., Chatterjee, D. & Chin, Y. E. Stat3 dimerization redulated by reversible acetylation of a single lysine residue. Science 307, 269-273 (2005).）及びアポトーシス（Cohen, H. Y. et al. Acetylation of the C terminusof Ku70 by CBP and PCAF controls Bax-mediated apotosis. Mol Cell 13, 627-638 (2004).）の主要な調節因子である。全体的にみて、Ｎ^ε−アセチル化は、多種多様な役割を有する修飾であり、リン酸化反応に匹敵するほどの重要性を有することが明らかになっている（Kouzarides, T. Acetylation: a regulartory modification to rival phosphorylation? Embo J 19, 1176-1179 (2000).）。したがって、販売可能な製品の製造及び上記のような極めて本質的な生物学的プロセスに関する研究の容易化の双方において、本明細書中に開示された方法及び材料に有用性や産業上の利用可能性があることは明らかである。

さらなる利用可能性
デアセチラーゼの阻害は、当業者に知られる任意の適切な方法によることができる。適切には、かかる阻害は、内因性デアセチラーゼにおける遺伝子欠失又は破壊による。適切には、かかる破壊された／欠失したアセチラーゼはＣｏｂＢである。適切には、抑制は、内因性デアセチラーゼの翻訳の抑制など、発現抑制による。適切には、阻害は、ニコチンアミドなどの外因性阻害剤を加えることによる。

１つの態様では、本発明は大腸菌などの生物の遺伝子コードにＮ^ε−アセチルリシンを加えることに関する。

本発明は、特定のヒストン上の所定部位に、Ｎε−アセチルリシンを担持するヌクレオソーム及び／又はクロマチンの合成において特別な適用を有する。かかる適用の１例は、ヌクレオソーム及びクロマチンの構造及び機能に及ぼされる所定の修飾の効果を調べるためのものである（Shogren-Knaak, M.et al. Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions. Science 311, 844-847 (2006).、Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F. & Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature 389, 251-160 (1997).）。

ＭｂＰｙｌＲＳ／ＭｂｔＲＮＡＣＵＡ対は、ヒストン構造及び機能上の修飾の役割及び／又は後成的なコードにおけるそれらの役割を探索するために、モノ−、ジ−及び／又はトリ−メチルリシンを遺伝子学的に取り込むようにさらに進化させてもよい（Kouzarides, T. Acetylation: a regulartory modification to rival phosphorylation? Embo J 19, 1176-1179 (2000).）。さらに本明細書に記載された方法は、多様な官能基及び／又は生物物理学的プローブで誘導体化させたリシン残基を遺伝子学的に大腸菌に取り込むために適用されてもよい。

ＭｂＰｙｌＲＳは、ＭｂｔＲＮＡＣＵＡのアンチコドンを認識しないため（Ambrogelly, A. et al. Pyrrolysine is not hardwired for cotranslational insertion at UAG codons. Proc Natl Acad Sci USA 104, 3141-3146 (2007).）、進化したＭｂＰｙｌＲＳ／ＭｂｔＲＮＡ対と、その他の進化した直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡＣＵＡ対及び／又は進化したデコーディング性を有する直交性リボソーム（Wang, K., Neumann, H., Peak-Chew, S. Y. & Chin, J. W. Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic code expansion. Nat Biotechnol 25, 770-777 (2007).）とを組合せ、単一のタンパク質への複数の独特で有用な非天然アミノ酸の効率的な取込みを指示することがさらに可能である。

図１は、ＭｂＰｙｌＲＳ／ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡ対が、ミオグロビン遺伝子中のアンバー終止コドンに応答して、効率的かつ特異的にＮ^ε−シクロペンチルオキシカルボニル−Ｌ−リシン(Ｃｙｃ)を取り込むことを示す写真及びグラフを示す。Ａ．Ｍｙｏ４ＴＡＧ−ＰｙｌＴからのミオグロビンの産生は、増殖培地内のＣｙｃの存在に依存する。ＭｊＴｙｒＲＳ／ＭｊｔＲＮＡ_ＣＵＡの存在下（レーン１）又は１ｍＭ Ｃｙｃの存在下又は不在下でのＭｂＰｙｌＲＳ／ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡの存在下（レーン２及び３）で発現されたミオグロビンを、Ｎｉ^２＋−アフィニティクロマトグラフィーで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、クーマシーで染色した。Ｂ．ＭｊＴｙｒＲＳ／ＭｊｔＲＮＡ_ＣＵＡ（Ｔｙｒ）によって産生されたミオグロビンのＥＳＩ−ＭＳ分析は、１８４３３．２Ｄａの質量を示した（予想では１８４３１．２Ｄａ）一方で、ＭｂＰｙｌＲＳ／ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡ（Ｃｙｃ）によって産生されたミオグロビンの質量は、１８５１０．７Ｄａであった。期待質量差（ｍ（Ｃｙｃ）−ｍ（Ｔｙｒ）＝２５８．３Ｄａ−１８１．２Ｄａ＝７７．１Ｄａ）は、観察された質量差（７７．５Ｄａ）とよく合致していた。 図２は、Ｎ^ε−アセチルリシンの遺伝学的取込みのためのＭｂＰｙｌＲＳの構造を例示する分子構造を示す。Ａ．リシン（１）、ピロリシン（２）及びＮ^ε−アセチルリシン（３）の構造。Ｂ．ピロリシンに結合したＭｂＰｙｌＲＳの活性部位の構造。ピロリシンの疎水性結合ポケットを形成し、ライブラリー内で共通の２０アミノ酸の各々に対して変異導入されるアミノ酸残基が示されている。画像は、Pymol v0.99（http://www.pymol.org）及びＰＤＢ ＩＤ ２Ｑ７Ｈを用いて作成した。 図３は、進化したアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼが、アンバーコドンに応答して、Ｎ^ε−アセチルリシンを効率的にタンパク質に取り込むことを例示する顕微鏡写真及びグラフを示す。Ａ．ＭｊＴｙｒＲＳ／ＭｊｔＲＮＡ_ＣＵＡの存在下で(レーン１)、１ｍＭのＮ^ε−アセチルリシンの存在下又は不在下でのＡｃＫＲＳ−２の存在下で（ＡｃＫ、レーン２及び３）、又は１ｍＭのアセチルリシン及び５０ｍＭのニコチンアミド(ＮＡＭ、レーン４)の存在下で、それぞれ産生されたミオグロビン。タンパク質をＮｉ^２＋−アフィニティクロマトグラフィーで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クーマシーで染色するか、又はニトロセルロース上に移して、抗体を用いてヘキサヒスチジンタグ又はアセチルリシンに検出した。Ｂ．精製し、アセチル化したミオグロビンのＥＳＩ−ＭＳ分析。ニコチンアミド（緑色、−ＮＡＭ）の不在下で発現されたミオグロビンは、脱アセチル化ミオグロビン及びアセチル化ミオグロビン（予測質量：１８３９６．２Ｄａ及び１８４３８．２Ｄａ）に対応する１８３９７．６ Ｄａ（ｂ）及び１８４３９．２ Ｄａ（ａ）という２つの質量ピークを示した。ミオグロビンが５０ｍＭのニコチンアミド（青色、＋ＮＡＭ）存在下で発現された場合は、アセチル化タンパク質のピークのみが観察された（ｃ）。

本発明を、以下実施例によって説明する。かかる実施例は例示的であることを意図しており、添付した特許請求の範囲の限定を意図するものではない。

［実施例］
概観
メタノサルシナ・バルケリ (Ｍｂ)を含むいくつかのメタン生成細菌は、いくつかのメチルトランスフェラーゼ遺伝子に存在するＵＡＧコドンに応答してピロリシンを取り込む（Hao, B. et al. A new UAG-encoded residue in the structure of a methanogen methyltransferase. Science 296, 1462-1466 (2002).、Srinivasan, G., James, C. M. & Krzycki, J. A. Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: charging of a UAG-decoding specialized tRNA. Science 296, 1459-1462 (2002).）。ピロリシンのメタノサルシナ・バルケリへの取込みは、アンバーコドンに応答して、ピロリシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＭｂＰｙｌＲＳ）及びその同族アンバーサプレッサーであるＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡによって指示される（Blight, S. K. et al. Direct charging of tRNA (CUA) with pyrrolysine in vitro and in vivo. Nature 431, 333-335 (2004).）。かかるＭｂＰｙｌＲＳ／ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡ対は、大腸菌において機能し、ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡは、大腸菌における内因性アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの効率的な基質ではない（Srinivasan, G., James, C. M. & Krzycki, J. A. Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: charging of a UAG-decoding specialized tRNA. Science 296, 1459-1462 (2002).、Ambrogelly, A. et al. Pyrrolysine is not hardwired for cotranslational insertion at UAG codons. Proc Natl Acad Sci USA 104, 3141-3146 (2007).）。したがって、かかるＭｂＰｙｌＲＳ／ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡは、内因性アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ及びｔＲＮＡに関して、直交性の３基準のうち２つを満たすようである（Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L. & Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Proc Natl Acad Sci USA 99, 11020-11024 (2002).）。

上記の観察された事項と、アセチルリシンがピロリシンのサブストラクチャーであるとの洞察とから、発明者らは、アセチルリシンを大腸菌で発現されたタンパク質に遺伝子学的に取り込むためには、ＭｂＰｙｌＲＳ／ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡのＮ^ε−アセチル−リシル−ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ対への進化を調査すべきとの結論に至った。

一般的方法
プラスミドの構築
プラスミドｐＭｙｏ４ＴＡＧ−ＰｙｌＴは、コドン４がアンバーコドンに置換され、アラビノースプロモーターの制御下で、ミオグロビン遺伝子をコードする。かかるプラスミドは、ｌｐｐプロモーター及びｒｒｎＣターミネーターを有するＰｙｌＴ遺伝子も含有する。ｐＭｙｏ４ＴＡＧ−ＰｙｌＴは、２つのＰＣＲ産物のライゲーションによって生成された。１つのＰＣＲ産物を、ＭｊｔＲＮＡ_ＣＵＡ遺伝子を除き、総ベクターを増幅したＰＣＲ反応におけるテンプレートとしてｐＢＡＤＪＹＡＭＢ４ＴＡＧ（Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L. & Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Proc Natl Acad Sci USA 99, 11020-11024 (2002).）を使用して作出した。かかるＰＣＲでは、プライマーｐＭｙｏＮｏｔＦ（5’-CAA GCG GCC GCG AAT TCA GCG TTA CAA GTA TTA CA-3’）及びｐＭｙｏＰｓｔＲ(5’-GAC CAC TGC AGA TCC TTA GCG AAA GCT-3’)を使用した。第２のＰＣＲ産物を、プライマーＰＹＬＴＰＳＴ１３（5’-GCG ACG CTG CAG TGG CGG AAA CCC CGG GAA TC-3’）及びＰＹＬＴＮＯＴ１５（5’-GGA AAC CGC GCG GCC GCG GGA ACC TGA TCA TGT AGA TCG-3’）を使用してＰｙｌＴ遺伝を増幅することによってｐＲＥＰ−ＰｙｌＴから作出した。かかる２つのＰＣＲ産物をNotI及びPstIを用いて消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションして、ｐＭｙｏ４ＴＡＧ−ＰｙｌＴを形成した。

ｐＲＥＰ−ＰｙｌＴは、ｐＲＥＰ（２）ＹＣ−ＪＹＣＵＡに由来していた（Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L. & Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Proc Natl Acad Sci USA 99, 11020-11024 (2002). 、Santoro, S. W., Wang, L., Herberich, B., King, D.S. & Schultz, P. G. An efficient system for the evolution of aminoacyl-tRNA synthetase specificity. Nat Biotechnol 25, 770-777 (2007).）。ｐＲＥＰ（２）ＹＣ−ＪＹＣＵＡにおけるＭｊｔＲＮＡ_ＣＵＡ遺伝子は、ｌｐｐプロモーターのダウンストリームにユニークなBglII及びSpeＩ部位を作製するQuickchange mutagenesis（Stratagene社製）を用いて削除した。これは、プライマーｐＲＥＰＤｔｆ(5’-CTAGATCTATGACTAGTATCCTTAGCGAAAGCTAA-3’)及びｐＲＥＰＤｔｒ(5’-ATACTAGTCATAGATCTAGCGTTACAAGTATTACA-3’)を使用して行った。ＰｙｌＴ遺伝子を、プライマーｐｙｌＴｂｅｇｆ（5’-GCT AGA TCT GGG AAC CTG ATC ATG TAG ATC GAA TGG ACT CTA AAT CCG TTC AGC C-3’）及びｐｙｌＴｅｎｄｒ(5’-GAT ACT AGT TGG CGG AAA CCC CGG GAA TCT AAC CCG GCT GAA CGG ATT TAG AGT C-3’）からＰＣＲによって作製し、中間ベクターにおいてBglIIとSpeＩとの間でクローニングした。

ｐＢＡＲ−ＰｙｌＴ（アラビノースプロモーターの制御下でＱ２及びＤ４４の位置にアンバーコドンを有する有毒性のセイヨウナタネ遺伝子、及びｌｐｐプロモーター上のＰｙｌＴを含有する）は、ｐＲＥＰ（２）ＹＣ−ＪＹＣＵＡからｐＲＥＰ−ＰｙｌＴを作製するために使用したものと同じ戦略及びプライマーを使用して、ｐＹＯＢＢ２に由来した。

ライブラリーの構築
ＭｂＰｙｌｓ遺伝子の大腸菌コドン最適化バージョンを合成した（Geneart社製）。かかるＯＲＦを、ＭｊＴｙｒＲＳ遺伝子と置き換えるためにｐＢＫ−ＪＹＲＳのNdeI部位とPstI部位との間でクローニングし（Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L. & Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Proc Natl Acad Sci USA 99, 11020-11024 (2002).）、ｐＢＫ−ＰｙｌＳを作製した。このテンプレート上でインバースＰＣＲを３ラウンド実施し、Ｌ２６６、Ｌ２７０、Ｙ２７１、Ｌ２７４、Ｃ３１３及びＷ３８３のコドンを次回のラウンドのテンプレートの役割を有する１ラウンドの産物とともにランダム化した。下記のプライマーを、ＰＣＲ反応の各ラウンドで使用した。：（ラウンド１）PylsC313f(5’-GCG CAG GAA AGG TCT CAA ACT TTN NKC AAA TGG GCA GCG GCT GCA CCC GTG AAA AC-3’)、及びPylsC313r(5’-GCG CAG AGT AGG TCT CAA GTT AAC CAT GGT GAA TTC TTC CAG GTG TTC TTT G-3’)；（ラウンド２）PylSL266f(5’-GCG CAG GTC TCA CCG ATG NNK GCC CCG ACC NNK NNK AAC TAT NNK CGT AAA CTG GAT CGT ATT CTG CCG GGT C-3’)、及びPylSL266r(5’-GCG CAG AGT AGG TCT CAT CGG ACG CAG GCA CAG GTT TTT ATC CAC GCG GAA AAT TTG-3’) ；（ラウンド３）PylSW383f2(5’-GCG CAG GAA AGG TCT CAA AAC CGN NKA TTG GCG CGG GTT TTG GCC TGG AAC GTC TGC TG-3’)、及びPylSW383r2(5’-GCG CAG AGT AGG TCT CAG TTT ATC AAT GCC CCA TTC ACG ATC CAG GCT AAC CGG AC-3’)。酵素的なインバースＰＣＲ反応物をＭｇＣｌ_２入りの１×ＰＣＲ緩衝液 (Roche社製)、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．８μＭの各プライマー、１００ｎｇのテンプレート及び７Ｕの拡張高信頼性ポリメラーゼ（Roche社製）を含有する１００μＬの各アリコート内で調製した。下記の温度プログラムを使用して、５０μＬのアリコート内でＰＣＲ反応を行った：９５℃にて２分間、９×（９５℃にて２０秒間、６５℃にて２０秒間[−１℃／サイクル]、６８℃にて４分間）、３１×（９５℃にて２０秒間、５８℃にて２０秒間、６８℃にて４分間）、６８℃にて９分間。

精製されたＰＣＲ反応物をDpnI及びBsaIで消化し、ライゲーションし、沈降させ、文献記載（Rackham, O. & Chin, J. W. A network of orthogonalribosome x mRNA pairs. Nat Biol 1, 159-166 (2005).）のようにエレクトロコンピテントなＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換させるために使用した。酵素的なインバースＰＣＲの最終ラウンド後に独立の形質転換細胞の数を増加させるために、文献記載（Christ. D., Famm, K. & Winter, G. Tapping diversity lost in transformations-in vitro amplification of ligation reactions. Nucleic Acids Res 34, e108 (2006).）のように沈降したライゲーション産物をＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼによって５００μｌの反応液中で増幅した。最終的な形質転換により、約１０^８個の変異体のライブラリーを産生した。かかるライブラリーの質を１２のランダムに選択したクローンの配列決定を行うことにより確認したところ、ヌクレオチド中、ランダムな部位で取り込まれたヌクレオチドに偏りがないことがわかった。

Ｎ^ε−アセチルリシン特異的アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの選択 プラスミドｐＲＥＰ−ＰｙｌＴをハーバリングするＤＨ１０Ｂ大腸菌を変異シンテターゼクローンのライブラリーで形質転換し、１０^９個の形質転換細胞を産生した。１２．５μｇ／ｍｌ^−１のテトラサイクリンと２５μｇ／ｍｌ^−１のカナマイシンを添加した１００ｍＬのＬＢ（ＬＢ−ＫＴ）中で細胞をインキュベートした（１６時間、３７℃、２５０ｒｐｍ）。この培養物２ｍＬを、１ｍＭのＮ^ε−アセチルリシン（Bachem社製）を含有する新鮮なＬＢ−ＫＴ中で１：５０に希釈し、インキュベートした（３〜４時間、３７℃、２５０ｒｐｍ）。この培養物の０．５ｍｌを１ｍＭのアセチルリシンと５０μｇ／ｍｌ^−１のクロラムフェニコールを添加したＬＢ−ＫＴプレート（２４ｃｍ×２４ｃｍ）上に載せた。インキュベーション（４８時間、３７℃）後、かかるプレートを細胞から剥がし、プラスミドを単離した。アガロースゲル電気泳動によってシンテターゼプラスミドをレポータープラスミドから分離し、キアジェンゲル精製キットを用いて抽出した。

アンバーコドンに応答して天然アミノ酸の取込みを指示するシンテターゼを選択するために、この正の選択において単離されたプラスミドを用いてＤＨ１０Ｂを含有するプラスミドｐＢａｒ−ＰｙｌＴを形質転換した。エレクトロポレーション後、細胞をＳＯＢ培地に回収した（３時間、３７℃、２５０ｒｐｍ）。約１０⁷個の細胞を、０．２％アラビノース、２５μｇ／ｍｌ^−１のカナマイシン及び２５μｇ／ｍｌ^−１のクロラムフェニコールを添加したＬＢ寒天プレート（２４ｃｍ×２４ｃｍ）上に載せた。このプレートを３７℃で２４時間インキュベートした。結果生じたコロニーから細胞を採取し、前述のように、シンテターゼプラスミドを単離した。

シンテターゼプラスミドのプールを採取する代わりに独立のコロニーを採取して、これらと並行して１ｍＬのＬＢ−ＫＴ中で生育したこと以外は、第１ラウンドと同様の方法で、第３ラウンドの選択を行った。一晩生育後、２００μＬの各培養物を新鮮なＬＢ−ＫＴ中で１：１０に希釈し、単一コロニーに由来した２つの同一の１ｍＬの培養物に分割した。１つの培養物には、１ｍＭのＮ^ε−アセチルリシンを加えたが、残りの培養物には加えなかった。インキュベーション後（５時間、３７℃、２５０ｒｐｍ）、かかる細胞を１ｍＭのＮ^ε−アセチルリシンの存在下又は不在下で、各々クロラムフェニコールの濃度を増大させた１ｍＭのＬＢ−ＫＴプレート上にそれぞれ載置した。Ｎ^ε−アセチルリシン依存的な強力なクロラムフェニコール耐性を示した２４のクローンから総プラスミドＤＮＡを単離した。かかるＤＮＡをHindIII（ｐＢＫ−ＰｙｌＳは消化しないが、ｄｉｇｅ２０ｔ ｐＲＥＰ−ＰｙｌＴは消化する）で消化し、これを使用してＤＨ１０Ｂを形質転換させた。観察された表現型が細胞内の変異の結果でないことを確認するために、ｐＲＥＰ−ＰｙｌＴを含有するレポータープラスミド細胞内のゲノム又は変異を、単離されたｐＢＫ−ＰｙｌＳプラスミドで形質転換し、２ｍＭのＮ^ε−アセチルリシンの存在下又は不在下でクロラムフェニコールの濃度を増加させた場合に成長能力があるか、試験に供した。また、Storm Phosphoimager（Molecular Dynamics社製）上でクロラムフェニコール無添加のプレートをスキャンすることで、ＧＦＰの発現を分析した。

アンバー抑制が媒介するミオグロビンの発現及び精製
大腸菌ＤＨ１０ＢをｐＢＫＰｙｌＳ、ＡｃＫＲＳ−１又はＡｃＫＲＳ−２及びｐＭｙｏ４ＴＡＧＰｙｌＴで形質転換し、かかる細胞をＬＢ−ＫＴ中でインキュベートした（１６時間、３７℃、２５０ｒｐｍ）。１ｍＭのＮ^ε−アセチルリシン又はＣｙｃ（Sigma社製）を添加した１ＬのＬＢ ＫＴに、一晩おいた前記培養物５０ｍＬを植菌した。３７℃で２時間後、かかる培養物に５０ｍＭのニコチンアミド（Sigma社製）を添加し、さらに３０分間増殖させた。タンパク質の発現は、０．２％のアラビノースを加えることにより誘導した。さらに３時間後、細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄した。タンパク質をプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche社製）、１ｍＭのＰＭＳＦ、５０ｍＭのニコチンアミド及び約１ｍｇ／ｍｌ^−１のリソジームを添加した３０ｍＬのBugBuster（Novagen社製）中で２５℃にて振盪することによって抽出した。かかる抽出物を遠心分離（１５分、２５００ｇ、４℃）にかけて清澄化し、２０ｍＭのイミダゾールと５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）を添加して総容量を４０ｍｌとした。かかる抽出物に０．３ｍｌのＮｉ^２＋−ＮＴＡビーズ（Qiagen社製）を追加し４℃で１時間攪拌しながらインキュベートした。ビーズをカラムに注入し、４０ｍｌの洗浄用緩衝液（５０ｍＭのトリス、２０ｍＭのイミダゾール、２００ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄した。タンパク質を２００ｍＭのイミダゾールを添加した１ｍＬの洗浄用緩衝液で溶出し、直ちにSephadex G25カラムを用いて１０ｍＭの炭酸アンモニウム（ｐＨ７．５）で再緩衝化した。精製したタンパク質を４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ヘキサヒスチジンタグ（Qiagen社製）及びＮ^ε−アセチルリシン（Santa Cruz社製）に対する抗体を用いてウェスタンブロットを実施した。

質量分析
１０ｍＭの重炭酸アンモニウム（ｐＨ７．５）に再緩衝化させたタンパク質を、５０％メタノール中、１％ギ酸と１：１で混合した。エレクトロスプレーイオン化を用いたＬＣＴ飛行時間質量分析計（Micromass社製）で全質量を測定した。試料を１０ｍｌ／ｍｉｎ^−１で注入し、ウマ心臓ミオグロビンを用いて陽イオンモードで較正を行った。６０〜９０回のスキャンの平均値をとり、分子質量は、MassLynxバージョン４．１（Micromass社製）を用いて、多価タンパク質質量分析のデコンボリューションを行うことによって得た。野生型タンパク質の理論質量は、Protparam（http://us.expasy.org/tools/protparam.html）を用いて計算し、非天然アミノ酸含有タンパク質の理論質量は手作業で調整した。

実施例１：ＭｂＰｙｌＲＳ／ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡ対の選択と使用
大腸菌におけるＭｂＰｙｌＲＳ／ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡ対の活性を確認するために、及び、細胞アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼに対するＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡの直交性を確認するために、ＭｂＰｙｌＲＳとＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡをそれぞれコードし、ピロリシンアナログであるＮ^ε−シクロペンチルオキシカルボニル−Ｌ−リシン（Ｃｙｃ，従来はＭｂＰｙｌＲＳの効率的な基質として示されてきた（Polycarpo, C. R. et al. Pyrrolysine analogues as substrates for pyrrolysyl-tRNA synthetase. FEBS Lett 580, 6695-6700 (2006).））のアンバーコドン応答性の取込みを指示するＰｙｌＳ遺伝子及びＰｙｌＴ遺伝子の能力を調べた。ｐＢＫ−ＰｙｌＳ（ＭｂＰｙｌＲＳをコードする）及びｐＲＥＰ−ＰｙｌＴ（ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのアンバー変異体、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のアンバー変異体及びＴ７プロモーター上の緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする）で形質転換され、Ｃｙｃの存在下で生育された細胞は、１５０μｇ／ｍｌ^−１のクロラムフェニコール上で生存し、緑色蛍光を示した。Ｃｙｃ又はｐＢＫ−ＰｙｌＳが培地からなくなると、細胞は２０μｇ／ｍｌ^−１超のクロラムフェニコール上では生存できなくなり、緑色蛍光を示さなかった。これらの結果から、ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡが大腸菌における内因性アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼによっては実質的にアミノアシル化されていないこと、及びＭｂＰｙｌＲＳ／ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡ対が大腸菌におけるＣｙｃ依存性のアンバー抑制を媒介することが確認される。かかるＭｂＰｙｌＲＳ／ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡ対が、遺伝コード拡張のために従前に使用された対によるタンパク質発現に匹敵するレベルで、そのタンパク質発現を支持できることを示すために、ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡをコードする遺伝子と、セリン４のコドンの代わりとしてのアンバーコドン及びＣ末端ヘキサヒスチジンタグを担持するマッコウクジラミオグロビンとを含有する発現コンストラクト（Ｍｙｏ４ＴＡＧ−ＰｙｌＴ）を作製した。Ｍｙｏ４ＴＡＧ−ＰｙｌＴ、ｐＢＫ−ＰｙｌＳ及び１ｍＭのＣｙｃを含有する細胞は、培養物１Ｌ当たりの精製収率が２ｍｇの完全長ミオグロビンを産生した（図１）。同じミオグロビン遺伝子において、メタノコッカスヤンナシイ(Ｍｊ)チロシル−ｔＲＮＡシンテターゼｔＲＮＡ_ＣＵＡ対（ＭｊＴｙｒＲＳ／ＭｊｔＲＮＡ_ＣＵＡ）を用いてチロシンを挿入した場合、アンバーコドンに応答して上記に匹敵する量のミオグロビンを得た。このデータから、ＭｂＰｙｌＲＳ／ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡ対が、遺伝コード拡張のために従前に使用された対に匹敵する効率でアミノ酸取込みを指示することが確認される。Ｃｙｃ又はＭｂＰｙｌＲＳが細胞に含まれないときは、微量の完全長ミオグロビンのみがクーマシー染色によって検出され、内因性アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼではＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡのアミノアシル化のレベルが極端に低いことを示唆した。

実施例２：定量的取込み
細胞性ｔＲＮＡに対するＭｂＰｙｌＲＳの機能的な直交性を調べ、かつ、ＭｂＰｙｌＲＳ／ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡ対によるＣｙｃの取込みが定量的なものであることを実証するために、発明者らは、Ｃｙｃを含有する精製ミオグロビンのエレクトロスプレーイオン化質量分析を行った（図１）。かかる分析は、Ｃｙｃのコードされた取込みに対応する単一ピークを示す。このデータから、Ｃｙｃがセンスコドンに応答して測定可能には取り込まれず（すなわち、ＭｂＰｙｌＲＳは機能的に直交性である）、及び、天然アミノ酸はＣｙｃ存在下ではアンバーコドンに応答して測定可能には取り込まれないことが確認される。以上のことから、表現型データ、タンパク質発現データ及び質量分析データは、全体的に、ＭｂＰｙｌＲＳ／ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡ対が大腸菌内で高度に活性、特異的かつ直交性の対であることを示している。

実施例３：Ｎ^ε−アセチルリシン活性の進化
この実施例では、Ｎ^ε−アセチルリシンを結合可能なｔＲＮＡシンテターゼを作製する方法を示す。かかる方法は、親ｔＲＮＡシンテターゼ配列をコードする核酸を、Ｌ２６６、Ｌ２７０、Ｙ２７１、Ｌ２７４及びＣ３１３の1又は２以上の位置において変異させるステップを含む。この実施例では、上記の残基の各々に変異導入されている。Ｎ^ε−アセチルリシンを結合可能な以下の変異及び変異体が選択される。

変異
先ず、アンバーコドン応答性のＮ^ε−アセチルリシン取込みのためのＭｂＰｙｌＲＳ／ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡの直交性対を進化させるために、６個の残基（Ｌｅｕ２６６、Ｌｅｕ２７０、Ｔｙｒ２７１、Ｌｅｕ２７４、Ｃｙｓ３１３、Ｔｒｐ３８３）がランダム化されたＭｂＰｙｌＲＳ変異体１０^８個のライブラリーを作製した（図２）。これらの残基を、ピロリシンと複合体を形成するＭｂＰｙｌＲＳの構造（Kavran, J. M. et al. Structure of pyrrolysyl-tRNA synthetase, an archaeal enzyme for genetic code innovation. Proc Natl Acad Sci USA 104, 11268-11273 (2007).）に基づき選択したところ、これらの残基は 結合しているピロリシンのピロール環上で６Åの距離内にある。

選択
Ｎ^ε−アセチルリシンの遺伝子取込みを指示する変異体ＭｂＰｙｌＲＳ／ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡ対を選択するために、３ラウンドの選択（正、負、正）を行った。正の選択では、細胞をアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼライブラリー及びｐＲＥＰ−ＰｙｌＴで形質転換し、１ｍＭのＮ^ε−アセチルリシン及び５０μｇ／ｍｌ^-1のクロラムフェニコールの存在下で培養して活性なシンテターゼを選択した（Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L. & Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Proc Natl Acad Sci USA 99, 11020-11024 (2002).）。生存しているシンテターゼクローンを、ｐＢＡＲ ＰｙｌＴ（ＰｙｌＴと２つのコドンがアンバーコドンに転換された有毒性のセイヨウナタネリボヌクレアーゼ遺伝子とを含有する）との同時形質転換によって、Ｎ^ε−アセチルリシンの不在下で負の選択に供した（Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L. & Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Proc Natl Acad Sci USA 99, 11020-11024 (2002).）。このステップは、基質としての天然アミノ酸を使用するアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼを除去する。

正、負の選択を３ラウンド行った後、生存するアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼクローンを単離し、ｐＲＥＰ−ＰｙｌＴで形質転換した。Ｎ^ε−アセチルリシン依存的なクロラムフェニコール耐性とＧＦＰ蛍光について、９６のクローンをスクリーニングした。２２のクローンが、大腸菌で、それぞれ２ｍＭのＮ^ε−アセチルリシンの存在下で１５０μｇ／ｍｌ^−１まで、２ｍＭのＮ^ε−アセチルリシンの不在下で２０〜３０μｇ／ｍｌ^−１までのクロラムフェニコール耐性を示した。これらのクローンは、アミノ酸依存的なＧＦＰ蛍光も示した。Ｎ^ε−アセチルリシンの存在下と不在下でクロラムフェニコール耐性が大きく相違することは、選択されたシンテターゼが細胞内に見い出される全部で２０の通常のアミノ酸にわたって、Ｎ^ε−アセチルリシンの挿入に関し、アンバーコドンに応答して実質的なインビボでの特異性を有することを示唆している。配列決定の結果、本発明者らがＡｃＫＲＳ−１及びＡｃＫＲＳ−２と命名した２つの異なるアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ配列に対応する２２のクローンが明らかになった。ＭｂＰｙｌＲＳに関して、ＡｃＫＲＳ−１が５つの変異（Ｌ２６６Ｖ、Ｌ２７０Ｉ、Ｙ２７１Ｆ、Ｌ２７４Ａ、Ｃ３１３Ｆ）を有する一方、ＡｃＫＲＳ−２は４つの変異（Ｌ２７０Ｉ、Ｙ２７１Ｌ、Ｌ２７４Ａ、Ｃ３１３Ｆ）を有する。

理論に縛られることを望まずに言えば、ＭｂＰｙｌＲＳ内のピロール環を結合する疎水性空洞が再度配置を換えてアセチル基を結合すると思われ、又、ピロリシンとＮ^ε−アセチルリシンとの嵩高さの相違は、進化したシンテターゼ中の嵩が高い方の変異アミノ酸によって埋め合わされると思われる。

実施例４：Ｎ^ε−アセチルリシンを含むポリペプチドを作製する方法
この実施例では、Ｎ^ε−アセチルリシンを含むポリペプチドを作製する。これは、前記ポリペプチドをコードするＲＮＡの翻訳を調節することにより実行される。このＲＮＡはアンバーコドンを含む。

翻訳は、上記の実施例３に記載された本発明のポリペプチド、すなわちＡｃＫＲＳ−１又はＡｃＫＲＳ−２の存在下で行われる。かかる翻訳は、Ｎ^ε−アセチルリシンをチャージされることができるｔＲＮＡ、本実施例ではＰｙｌＴの存在下及びＮ^ε−アセチルリシンの存在下でも実行される。

したがって、アンバーコドン応答性のアセチルリシンの取込み忠実性と効率性とを実証するため、Ｍｙｏ４ＴＡＧ−ＰｙｌＴ、ＡｃＫＲＳ−１又はＡｃＫＲＳ−２及び１ｍＭのＮ^ε−アセチルリシンを含有する細胞を用いて完全長のミオグロビンを作製した。かかるミオグロビンを培養液１Ｌに対して１．５ｍｇの収率で精製したが（図３）、かかる収率はＭｊＴｙｒＲＳ／ＭｊｔＲＮＡ_ＣＵＡ対の最も活性な変種を用いた非天然アミノ酸の取込みで報告された収率に匹敵するものである（Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L. & Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Proc Natl Acad Sci USA 99, 11020-11024 (2002).）。Ｎ^ε−アセチルリシンが細胞にない場合には、微量のミオグロビンのみがＣ末端のＨｉｓ−６タグに対するクーマシー染色又はウェスタンブロットによって検出された。Ｎ^ε−アセチルリシンにウェスタンブロットを施すと、アミノ酸のミオグロビンへの取込みがさらに確認される。これらのデータから、選択されたアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼがＮ^ε−アセチルリシンに対して極めて選択的であることがさらに確認される。

実施例５：Ｎ^ε−アセチルリシンを含むポリペプチドを作製する方法
この実施例では、ポリペプチドをデアセチラーゼ阻害下で作製する。まず、実施例４に従ってポリペプチドを作製する。ＡｃＫＲＳ−２、Ｍｙｏ４ＴＡＧ−ＰｙｌＴ及びＮ^ε−アセチルリシンを含有する細胞から精製したミオグロビンをエレクトロスプレーイオン化質量分析に供したところ、２つのピークが出現した（図３）。第１のピークはＮ^ε−アセチルリシン取込みに対応し、第２のピークは４２Ｄａ未満の質量を有する。第２のピークをＮ^ε−アセチルリシンの代わりにリシンを担持するミオグロビンに割り当てた。Ｍｙｏ４ＴＡＧ−ＰｙｌＴからのミオグロビン発現が細胞にＮ^ε−アセチルリシンを加えることに依存するため、ミオグロビンを含有するリシンは大腸菌の翻訳後脱アセチル化に由来するはずであると考えられた。

大腸菌は、単一の特徴的なデアセチラーゼであるＣｏｂＢを有する。かかるＣｏｂＢは、サーチュイン科のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド依存的酵素である（Blander, G. & Guarente, L. The Sir2 family of protein deacetylases. Annu Rev Biochem 73, 417-435 (2004).、Schwer, B., Bunkenborg, J., Verdin, R. O., Andersen, J. S. & Verdin, E. Reversible lysine acetylation controls the activity of the mitochondrial enzyme acetyl-CoA synthetase 2. Proc Natl Acad Sci USA 103, 10224-10229 (2006).）。サーチュイン科の酵素は、ニコチンアミド（ＮＡＭ）により強く阻害されることが知られているため、実施例４に従ってタンパク質の発現を行ったが、阻害剤の追加的な存在下で行ったものであった。ニコチンアミドを含有する細胞から作製されたミオグロビンのエレクトロスプレーイオン化質量分析（図３）の結果、アセチル化されたタンパク質に対応する単一のピークが出現したが、脱アセチル化されたタンパク質からはピークが観察されなかった。そこで、ニコチンアミドが大腸菌に遺伝子学的に取り込まれたアセチルリシンの翻訳後脱アセチル化を完全に阻害すると結論付けた。

実施例部分の概要
結論として、本発明者らは、大腸菌における細胞性アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼに対するＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡの直交性を確認し、大腸菌における細胞性ｔＲＮＡに対するＭｂＰｙｌＲＳの直交性を実証し、大腸菌におけるこの直交性対の効率性を実証した。本発明者らは、大腸菌で発現されたタンパク質への高い翻訳忠実性及び効率性を有するＮ^ε−アセチルリシンの取込みを指示するために、ＭｂＰｙｌＲＳ／ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡ直交性対を進化させた。さらに、本発明者らは、阻害剤に基づく戦略を開発して、最初に観察された、大腸菌において共同翻訳的に取り込まれたＮ^ε−アセチルリシン翻訳後の脱アセチル化を消滅させた。したがって、本明細書に記載された材料及び技法は、部位特異的にアセチル化された組換えタンパク質の作製に有用である。

以上、本明細書に引用された全ての出版物をそれらの全体において、参照により本明細書に組み込む。本発明の範囲を逸脱することなく、本発明の記載された態様及び実施形態の様々な修正及び改変をそこに加えられることは、当業者には自明であろう。本発明を、その具体的な好ましい実施形態との関係において記載したが、特許請求の範囲に記載されている発明は、かかる具体的な形態に不当に制限されるものであってはならない点、理解されるべきである。実際、当業者に自明な、本発明を実施するための記載された形態に種々の改変を加えられることは、以下に記載する特許請求の範囲内にあるものと意図されている。

Claims (30)

1. Ｎ^ε−アセチルリシンを結合可能なｔＲＮＡシンテターゼ。
2. シンテターゼが、ＭｂＰｙｌＲＳのアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１に記載のｔＲＮＡシンテターゼ。
3. ｔＲＮＡシンテターゼが、ＭｂＰｙｌＲＳの少なくともＬ２６６〜Ｃ３１３のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、請求項２に記載のｔＲＮＡシンテターゼ。
4. ポリペプチドが、野生型ＭｂＰｙｌＲＳ配列に対し、Ｌ２６６、Ｌ２７０、Ｙ２７１、Ｌ２７４又はＣ３１３の１又は２以上において変異を有する、請求項３に記載のｔＲＮＡシンテターゼ。
5. 少なくとも１つの変異が、Ｌ２７０、Ｙ２７１、Ｌ２７４又はＣ３１３における変異である、請求項４に記載のｔＲＮＡシンテターゼ。
6. 少なくとも１つの変異が、Ｌ２７０、Ｌ２７４又はＣ３１３における変異である、請求項５に記載のｔＲＮＡシンテターゼ。
7. Ｙ２７１Ｌを含む、請求項１〜６のいずれかに記載のｔＲＮＡシンテターゼ。
8. Ｙ２７１Ｆを含む、請求項１〜７のいずれかに記載のｔＲＮＡシンテターゼ。
9. Ｌ２６６Ｖを含む、請求項１〜８のいずれかに記載のｔＲＮＡシンテターゼ。
10. Ｌ２７０Ｉ、Ｙ２７１Ｌ、Ｌ２７４Ａ及びＣ３１３Ｆを含む、請求項１〜９のいずれかに記載のｔＲＮＡシンテターゼ。
11. Ｌ２６６Ｖ、Ｌ２７０Ｉ、Ｙ２７１Ｆ、Ｌ２７４Ａ及びＣ３１３Ｆを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載のｔＲＮＡシンテターゼ。
12. 請求項１〜１１のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
13. ｔＲＮＡにＮ^ε−アセチルリシンをチャージするための、請求項１〜１１のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
14. ｔＲＮＡがＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡを含む、請求項１３に記載の使用。
15. ポリペプチドをコードするＲＮＡの翻訳をアレンジするステップを含むＮ^ε−アセチルリシンを含むポリペプチドを作製する方法であって、前記ＲＮＡがアンバーコドンを含み、前記翻訳が請求項１〜１１のいずれかに記載のポリペプチドの存在下で、かつ、Ｎ^ε−アセチルリシンをチャージすることができるｔＲＮＡの存在下で、かつ、Ｎ^ε−アセチルリシンの存在下で行われる方法。
16. 翻訳が脱アセチル化阻害剤の存在下で行われる、請求項１５に記載の方法。
17. 阻害剤がニコチンアミド（ＮＡＭ）を含む、請求項１６に記載の方法。
18. Ｎ^ε−アセチルリシンを含むポリペプチドを作製する方法であって、前記方法が、Ｎ^ε−アセチルリシンを取り込むのに望ましい前記ポリペプチドにおける位置に対応する１又は２以上の位置でアンバーコドンを提供するために、前記ポリペプチドをコードする核酸を修飾するステップを含む方法。
19. 核酸を修飾するステップが、リシンに対するコドンをアンバーコドン（ＴＡＧ）に変異させるステップを含む、請求項１８に記載の方法。
20. Ｎ^ε−アセチルリシンを含むホモジニアスな組換えタンパク質。
21. タンパク質が、請求項１５〜１９のいずれかに記載の方法で作製される、請求項２０に記載のホモジニアスな組換えタンパク質。
22. 請求項１２に記載の核酸を含むベクター。
23. ベクターが、ｔＲＮＡシンテターゼのｔＲＮＡ基質をコードする核酸配列をさらに含む、請求項２２に記載のベクター。
24. ｔＲＮＡ基質が、ＭｂＰｙｌＴ遺伝子によってコードされる、請求項２３に記載のベクター。
25. 請求項１２に記載の核酸又は請求項２２〜２４のいずれかに記載のベクターを含む細胞。
26. 不活性化されたデアセチラーゼ遺伝子をさらに含む、請求項２５に記載の細胞。
27. 不活性化されたデアセチラーゼ遺伝子が、ＣｏｂＢの欠失又は破壊を含む、請求項２６に記載の細胞。
28. 請求項２２〜２４のいずれかに記載のベクター又は請求項２５〜２７のいずれかに記載の細胞、及びニコチンアミドを一定量含むキット。
29. Ｎ^ε−アセチルリシンを結合可能なｔＲＮＡシンテターゼを作製する方法であって、Ｌ２６６、Ｌ２７０、Ｙ２７１、Ｌ２７４又はＣ３１３の１又は２以上において親ｔＲＮＡシンテターゼ配列をコードする核酸を変異させるステップと、Ｎ^ε−アセチルリシンを結合可能な１又は２以上の変異体を選択するステップとを含む方法。
30. 本明細書に実質的に記載されている高分子又は方法。

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