CN105294475A - 广谱的去乙酰化酶抑制剂乙酰化赖氨酸及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体为一种广谱的去乙酰化酶抑制剂乙酰化赖氨酸及其应用。本发明的去乙酰化酶的小分子抑制剂，简称：乙酰化赖氨酸，<i>N</i>_ε-Acetyl-L-lysine，记为AcK：通过结构生物学、生物化学、分子生物学和动物学实验，结果显示：该抑制剂与去乙酰化酶有很强的结合力，且能明显抑制酶的活性，能显著增强生物体内蛋白的乙酰化水平，调节代谢状态；对哺乳动物没有明显毒性。本发明抑制剂可用于制备预防或治疗由蛋白质乙酰化修饰引起疾病（如糖尿病、肿瘤和免疫性疾病）的药物。

Description

广谱的去乙酰化酶抑制剂乙酰化赖氨酸及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种作用于生物体内去乙酰化酶的小分子抑制剂及其应用。

背景技术

乙酰化修饰是可逆的动态的修饰，通过乙酰基转移酶（Acetyltransferases）将乙酰基团加到蛋白质内部的赖氨酸残基的-NH2上，通过去乙酰基转移酶（Deacetylases）移去乙酰基团。自从1964年乙酰化修饰被第一次发现在组蛋白上以来(1)，有将近200种蛋白质被发现并实验证实有乙酰化修饰，包括许多重要的转录调控因子如p53、RB、NF-B、E2F1和HIF-1等，因而乙酰化修饰调控着调控细胞凋亡、亚细胞的定位、DNA和蛋白质相互作用、DNA复制和修复、DNA转录的活性及蛋白质的稳定性等众多重要的生命活动，乙酰化修饰逐渐被认为是一种重要的翻译后修饰并且参与了包括糖尿病、肿瘤和免疫性疾病等多种疾病(2-6)。

去乙酰基转移酶（HistoneDeacetylases，HDACs）根据序列同源性细分，去乙酰化转移酶可进一步分成4类。第1类包括HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8，它们与酵母中的Rpd3同源；第2类是与酵母中的Hda1同源的，有HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9、HDAC10而HDAC11在序列与Rpd3和Hda1具有均等的保守性，被分成了第4类；第3类是SIRT1至SIRT7这7个蛋白，序列与酵母的Sir2在进化上保守的(7)。目前已经发现多种去乙酰化酶抑制剂：HDAC抑制剂的种类主要有：TSA、SAHA、trapoxin、apcidin、丁酸和丙戊酸等；而Sirt类的去乙酰化酶抑制剂：烟碱（Nicotinamide）、Sirtinol和splitomicin等。

在已经发现的去乙酰化酶抑制剂中，许多已经证实有药物效应：一些HDAC抑制剂如FK228和MS-275在异体移植模型中显示出强大的抗肿瘤活性(8)。丁酸，FK228，MS-275以及valproicacid已经经过了临床评估阶段。作为SIRT类抑制剂的烟碱(Nicotinamide）和Sirtinol被发现可以促进细胞内重要糖异生蛋白PEPCK1(phosphoenolpyruvatecarboxykinase1)的降解同时抑制细胞糖异生显示出了良好的治疗糖尿病的应用前景(3)。由默克公司开发的SAHA（商品名ZOLINZA），已于2006年底被美国FDA批准以皮肤T淋巴细胞瘤（CTCL）为适应症而上市应用。越来越多的去乙酰化酶抑制剂的发现和应用，标志着去乙酰化酶作为新颖药物靶标有着广阔开发前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种去乙酰化酶小分子抑制剂及其应用。

本发明提供的去乙酰化酶抑制剂，为结构式如下述Ⅰ式所示的化合物（简称：乙酰化赖氨酸；N _ε-Acetyl-L-lysine，记为AcK）：

。

本发明所述的抑制剂通过抑制去乙酰化酶的活性而发挥预防或治疗糖尿病、肿瘤和免疫性疾病的作用。

本发明所述的去乙酰化酶包括四类：第1类包括HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8，它们与酵母中的Rpd3同源；第2类是与酵母中的Hda1同源的，有HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9、HDAC10；第3类是SIRT1至SIRT7这7个蛋白；第4类是HDAC11，序列与Rpd3和Hda1具有均等的保守性。抑制剂是抑制上述四类去乙酰化酶的活性。

本发明所述的抑制剂可进一步用于制备预防和治疗由蛋白质乙酰化修饰改变引起疾病（包括糖尿病、肿瘤和免疫性疾病等）的药物。

本发明通过结构生物学、生物化学、分子生物学和动物学实验，对式Ⅰ的化合物进行抑制剂的确定、抑制活性的检测、抑制葡萄糖异生的检测，最后观察其对哺乳动物血糖利用及糖异生的作用。

结果显示，本发明的化合物与去乙酰化酶的活性位点相结合，直接竞争性抑制了去乙酰化酶的活性，导致生物体内蛋白质乙酰化水平升高，明显促进了葡萄糖的利用并且抑制了葡萄糖的异生，抑制了肿瘤密切相关的mTOR信号通路。

附图说明

图1：计算机模拟式Ⅰ的化合物和SIRT2蛋白活性位点的结合图示。其中，(a)为计算机模拟的SIRT2蛋白活性区域和药物结合示意图，(b)为计算机模拟的SIRT2蛋白活性位点氨基酸结构和药物结合示意图。

图2：式Ⅰ的化合物抑制SIRT3体外去乙酰化反应图示。

图3：式Ⅰ的化合物体外抑制SIRT3活力的曲线。

图4：式Ⅰ的化合物对SIRT3的抑制呈竞争性抑制图示。

图5：式Ⅰ的化合物促进293T细胞全蛋白乙酰化增加图示。其中，(a)为药物浓度梯度处理细胞后免疫印迹法检测乙酰化蛋白信号图，(b)为药物时间梯度处理细胞后免疫印迹法检测乙酰化蛋白信号图。

图6：式Ⅰ的化合物促进293T细胞mTOR信号通路中S6K蛋白磷酸化增加图示。

图7：式Ⅰ的化合物抑制肝细胞糖异生图示。

图8：式Ⅰ的化合物抑制小鼠糖异生图示(AcK200：200mg/kg小鼠体重；AcK400：400mg/kg小鼠体重；Met：200mg/kg小鼠体重)。

具体实施方式

下面结合实验例对本发明进一步描述，但不限制本发明。

实施例1：式Ⅰ的化合物与SIRT2蛋白酶活性部位结合的计算机模拟

1、实验材料与方法

根据式Ⅰ的化合物的化学结构式和人源的SIRT2氨基酸序列利用计算机模拟式Ⅰ的化合物和SIRT2蛋白活性位点的结合。

2、实验结果

结果显示，式Ⅰ的化合物可以结合到SIRT2蛋白的活性位点，提示式Ⅰ的化合物有抑制SIRT2蛋白活性的作用（见图1）。

实施例2：式Ⅰ的化合物抑制SIRT3蛋白体外去乙酰化反应

1、实验材料与方法

（1）把测序正确的人源SIRT3表达质粒（质粒由上海某实验室提供）转化到合适的表达宿主菌（BL21，DE3）中并涂布在相应抗性的LB平板上培养过夜；分别挑两个单克隆于3ml含抗生素的LB培养基中培养过夜；

（2）按2%接种过夜培养的菌液于4ml含抗生素LB培养基中37℃培养2-3小时；加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达3个小时左右，取样做蛋白电泳分析目标蛋白的表达情况。如果目的蛋白的确表达了，再做下一步的大规模纯化。挑单克隆至5-10ml含相应抗生素LB的培养瓶中250rpm37℃过夜；OD600>1.2；将菌液转移至含200-300（1：100）ml含抗生素的LB的2L培养瓶中，摇床250rpm37℃孵育3-4小时，至OD600在0.6～0.8左右；加入适量的IPTG（使用浓度0.2mM）至菌液中，18-20℃，摇床250rpm孵育4-6小时；

（3）离心收集菌体(7000–8000gfor30分钟4℃)；弃去上清液，将装有菌体的离心管置于冰中；每ml菌体加入50ul冰冷的提取缓冲液混悬菌体；冰浴中超声裂解菌体(超声4秒，停止4秒，总时间15-30分钟)，之后取样进行SDS-PAG电泳分析；

（4）离心使细胞碎片沉降(12000gfor10分钟4℃)；小心将上清液移到干净的容器中，并取样进行SDS-PAGE电泳分析；样品上样前必须完全溶解并用稀释或换液的方法调整缓冲液；如样品暂时不使用应存于-20℃；

（5）使用HiTrapChelating(Ni2+)纯化(His)6融合蛋白（缓冲液：a、起始缓冲液:50mMTris-HCl,0.15MNaCl0-10mM咪唑pH7.4；b、洗脱缓冲液:50mMTris-HCl,0.15MNaCl,0.3-0.5M咪唑pH7.4；c、清洗缓冲液:50mMTris-HCl,0.15MNaCl,30-50mM咪唑pH7.42）层析柱准备）；

（6）样品纯化：a.用起始缓冲液平衡5-10柱体积；b.上样。收集部分流穿以备检测；c.用清洗缓冲液洗涤5-10柱体积；d.用洗脱缓冲液洗脱10-20柱体积；e.层析柱清洗：用20%乙醇或起始缓冲液洗柱20个柱体积；

（7）酶活测定:首先合成一条底物肽段：N-NLASVEELK(Ac)EIDVEVRK。在反应体系中加入2μgSIRT3去乙酰化酶,0.3μg肽段，于30μl反应体系中(30mMHEPES,0.6mMMgCl2,1mMDTT,1mMNAD+,10mMPMSF)，37℃反应半小时。放入-20℃终止反应。去乙酰化反应体系用C18ZipTip(Millipore)脱盐柱脱盐，纯化肽段。然后用4700质谱仪检验产物和底物肽段的峰度。在做式Ⅰ化合物抑制反应实验时，在反应体系中加入所需要浓度的化合物。

2、实验结果

被乙酰化修饰的肽段可以在体外反应体系中被SIRT3反应从而除去乙酰化修饰基团，而式Ⅰ的化合物可以抑制SIRT3的体外去乙酰化反应(见图2)，并且对SIRT3的体外去乙酰化反应呈浓度依赖性，通过曲线拟合计算出该化合物的IC50=82.64μM(见图3)，并且呈竞争性抑制(见图4)。

实施例3：式Ⅰ的化合物促进细胞内蛋白质的乙酰化修饰水平升高

1、实验材料与方法

（1）将HEK293细胞（HEK293T是人胚胎肾细胞）培养于DMEM培养基外加10%新生牛血清，100U/ml的青霉素和链霉素中。收获细胞时小心吸干细胞培养液，用预冷PBS润洗贴壁细胞1次以去除残留血清内的杂蛋白；

（2）向每个10cm平皿中加入1ml裂解液含0.5%NP-40缓冲液，预先加入各种蛋白酶抑制剂，置于4℃摇晃30分钟。将裂解液从培养皿中转移到1.5mlEP管中，于4℃以13,000rpm离心15分钟。将上清移入新的EP管中；

（3）吸取40ul上清，加入10ul的5×蛋白上样缓冲液，100℃变性5分钟后进行Westernblot，用以检测被转染质粒在宿主细胞中的表达情况；

（4）免疫印迹（WesternBlot）主要操作流程：电泳—>转膜—>杂交—>显色；

（5）根据所要分离的蛋白质分子量大小，配制适当浓度的SDS-PAGE胶，常用浓度为10%。P300需要用5%的SDS-PAGE胶。常规电泳程序为：80V，20分钟；120V，80分钟；

（6）在一适当容器中加入预冷转膜缓冲液（transferbuffer），将2块海绵、硝酸纤维素膜（NC膜）和2张普通滤纸浸泡约10min。依次将1块海绵、1张滤纸、SDS-PAGE胶、NC膜、1张滤纸、1块海绵叠放在一起，对齐并赶出其中的气泡；将膜靠近阳极装入转膜电泳槽中(胶在阴极，对于黑色面)；接通电源，在冰浴中进行转膜，恒流300毫安（或恒压100伏）转膜1小时，或恒压30伏转膜过夜；

（7）将转好的膜浸于5％脱脂牛奶（用1×TBST配置，4度保存一周内使用）中封闭60min；当做乙酰化实验时，牛奶以peptone替代。将膜浸于含有一抗（根据需要1：1000-1：3000稀释）的5％脱脂牛奶中室温1-2hr或者4℃过夜；用TBST将膜浸洗3次，每次10分钟；将膜浸于含有二抗（根据需要1：3000-1：10000稀释）的5％脱脂牛奶中室温60min；用TBST将膜浸洗3次，每次10分钟，膜即可用于显色反应；

（8）使用ECL-PLUS试剂盒显色。将膜表面的液体略微沥干；将SolutionA和SolutionB以40:1的比例混合，均匀覆盖于膜的表面，避光放置2分钟，通常每张膜用700ul混合液，将膜表面的液体略微沥干后，用typhoon扫描显影。

2、实验结果

式Ⅰ的化合物处理细胞4小时后，293T细胞全蛋白乙酰化修饰增加，并且呈现剂量依赖性和实践依赖性（见图5）；还可以促进mTOR信号通路中S6K蛋白磷酸化增加（见图6）。

实施例4：式Ⅰ的化合物抑制肝细胞糖异生

1、实验材料与方法

（1）小鼠固定在小鼠固定板上，取仰卧位。碘伏消毒整个腹部，用眼科剪于下腹部做U型开口，从中间剪开腹部皮瓣，用钉将皮瓣固定于两侧，充分暴露肝门静脉；

（2）用钩针于肝门静脉下方穿线，预打结（不要扎紧），将结翻向胸腔侧；

（3）留置针穿刺肝门静脉，开启蠕动泵，可见肝脏由暗红色迅速变为灰黄色，用眼科剪于下腔静脉下端剪短该静脉，使灌入肝脏的液体从下腔静脉断段流出。持续灌流D-Hanks液约30毫升（期间，用棉签压住下腔静脉阻止液体流出，此时肝脏明显胀大，松开棉签后液体继续流出且肝脏缩小，此法可以判断灌注是否成功）。蠕动泵速度为42rpm，此过程约15分钟；

（4）将D-Hanks液更换为Hanks液，灌流速度调整为30rpm，灌流20-30毫升Hanks液，此过程约15分钟（见到如下征象时说明消化完全：肝脏明显松软膨大；肝脏表面出现明显裂纹；棉签压住下腔静脉肝脏不再明显膨大；棉签触及肝脏，肝脏易破裂）；

（5）原位剪下肝脏，90mm细胞培养皿中加入20毫升4度的原代完全培养基，将肝脏转移其中，取1毫升注射器针芯，于培养皿中捣碎肝脏组织，除去纤维结缔组织；

（6）将细胞悬液过200目滤网，500rpm离心1min，弃上清。20毫升4度的原代完全培养基重悬细胞，加入10毫升4度的Percoll梯度离心液混匀，2500rpm离心5min，弃上清；

（7）完全培养基重悬细胞，铺板（每只小鼠提取的肝细胞可用50-60毫升完全培养基重悬，6孔板每孔2毫升；60mm培养皿每个3毫升；90mm培养皿每个7毫升）。细胞铺板后2-3小时换液；

（8）使用二甲双胍（Metformin，Met）作为实验阳性对照，式Ⅰ的化合物和二甲双胍处理细胞7小时。细胞收获前3小时将培养液吸走，换成含0.1%BSA,2mM丙酮酸和20mM乳酸的Krebs–Henseleit–HEPES缓冲液[KHHbuffer;包含:NaCl120mM,KCl4.7mM,CaCl22.5mM,MgSO41.2mM,KH2PO41.2mM,NaHCO325mM,HEPES25mMatpH=7.4]。收集培养液，培养液内的葡萄糖浓度用苯酚硫酸法测定，在490nm波长下测定其吸光值。使用SIGMA（GAGO20）的试剂盒。

2、实验结果

式Ⅰ的化合物和二甲双胍均可以降低小鼠原代肝细胞的葡萄糖异生，而且两者相同浓度时降低糖异生的程度相当，均呈药物剂量依赖性（见图7）。对细胞显微镜观察均未发现明显的细胞形态改变。

实施例5：式Ⅰ的化合物抑制小鼠糖异生

1、实验材料与方法

（1）实验动物来源于复旦大学动物房。6-8周雄性BalB/c小鼠均在湿度，温度都很适合的环境中喂养，光线为12小时明暗自动控制；

（2）实验操作参考(9)描述，小鼠饥饿过夜后，监测血糖并随机分组，腹腔注射200和400mg/kg式Ⅰ的化合物，二甲双胍（Metformin，Met）200mg/kg腹腔注射作为阳性对照组，阴性对照组注射生理盐水；

（3）一小时后监测血糖，并给与丙酮酸钠2g/kg腹腔注射；

（4）然后在不同的时间点进行血糖监测。

2、实验结果

相对于生理盐水组，二甲双胍在1、1.5、2h均明显抑制小鼠血糖，式Ⅰ的化合物有类似二甲双胍的作用趋势，但只在1.5h时相对生理盐水组有明显抑制血糖升高的作用（见图8）。

参考文献：

1.D.M.Phillips,BiochemJ 87,258(May,1963).

2.S.Zhaoetal.,Science 327,1000(Feb19,2010).

3.W.Jiangetal.,MolCell 43,33(Jul8,2011).

4.D.Zhaoetal.,CancerCell 23,464(Apr15,2013).

5.T.Zhangetal.,CellMetab 15,75(Jan4,2012).

6.W.Xu,Y.Li,C.Liu,S.Zhao,Oncogene 33,2279(May1,2014).

7.X.J.Yang,E.Seto,NatRevMolCellBiol 9,206(Mar,2008).

8.A.Maietal.,JMedChem 48,7789(Dec1,2005).

9.U.Kintscheretal.,ArteriosclerThrombVascBiol 28,1304(Jul,2008)。

Claims (4)

1.一种去乙酰化酶抑制剂，为结构式如下述Ⅰ式所示的化合物，简称乙酰化赖氨酸：

。

2.根据权利要求1所述的去乙酰化酶抑制剂，其特征在于所述去乙酰化酶，包括四类：第1类包括HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8，它们与酵母中的Rpd3同源；第2类是与酵母中的Hda1同源，有HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9、HDAC10；第3类是SIRT1至SIRT7这7个蛋白；第4类是HDAC11，序列与Rpd3和Hda1具有均等的保守性。

3.如权利要求1所述的去乙酰化酶抑制剂在制备预防和治疗由蛋白质乙酰化修饰改变引起疾病的药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其中，所述疾病为糖尿病、肿瘤和免疫性疾病。