CN101910403B - 方法和组合物 - Google Patents
方法和组合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101910403B CN101910403B CN2008801232954A CN200880123295A CN101910403B CN 101910403 B CN101910403 B CN 101910403B CN 2008801232954 A CN2008801232954 A CN 2008801232954A CN 200880123295 A CN200880123295 A CN 200880123295A CN 101910403 B CN101910403 B CN 101910403B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- trna
- acetyl
- lysine
- synthetic enzyme
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及能够结合Nε-乙酰赖氨酸的tRNA合成酶。特别地,本发明涉及能够结合Nε-乙酰赖氨酸的tRNA合成酶,其中所述合成酶包含与MbPylRS氨基酸序列具有至少90%序列同一性的多肽。本发明还涉及制备包含Nε-乙酰赖氨酸的多肽的方法,所述方法包括安排翻译编码所述多肽的RNA,其中所述RNA包含琥珀密码子,其中所述翻译在权利要求1-11中任一项所述的多肽存在下、能够负载有Nε-乙酰赖氨酸的tRNA存在下、且Nε-乙酰赖氨酸存在下进行。
Description
发明领域
本发明涉及生产生物学上重要的乙酰化大分子的领域。特别地,本发明涉及将Nε-乙酰-赖氨酸掺入多肽的领域。
背景技术
现已将原核生物和真核生物的遗传密码扩展,从而能够在体内对琥珀终止密码子反应位点特异性地掺入20种以上设计的非天然氨基酸。通过赋予生物体改进的正交氨酰tRNA合成酶/tRNACUA对(aminoacyl-tRNA synthetase/tRNACUA pairs)来完成所述合成遗传密码的扩展,其中所述正交氨酰tRNA合成酶/tRNACUA对指导对琥珀密码子反应位点特异性地掺入非天然氨基酸。正交氨酰tRNA合成酶用非天然氨基酸使同源的正交tRNA而非其他细胞tRNA进行氨基酰化(aminoacylate);而正交tRNA是正交合成酶的底物,但基本上不被任何内源氨酰tRNA合成酶氨基酰化。
使用正交的詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)酪氨酰-tRNA合成酶/RNACUA对的改进变体在大肠杆菌(E.coli)中的遗传密码扩展极大地提高了含非天然氨基酸的蛋白的产量,这是因为与依赖于向细胞或体外翻译反应物中添加按化学计量预氨基酰化的抑制性tRNA的方法相反,正交tRNACUA被其同源氨酰tRNA合成酶催化再酰化,因此氨基酰化不需限制翻译效率。
非天然氨基酸突变的很多潜在应用(包括相应于在蛋白质中多个位点存在的翻译后修饰例如乙酰化的氨基酸翻译掺入)需要更有效的掺入方法,以生产有用量的蛋白。然而,在天然细胞的情况下向蛋白中引入生物物理探针和化学上的精确扰动提供了以此前不能实现的方式理解和控制细胞功能的令人兴奋的可能性。
赖氨酸的Nε-乙酰化是可逆的翻译后修饰,并且在真核细胞中对竞争(rival)磷酸化具有调控作用1-14。尚不存在合成在指定位点包含Nε-乙酰-赖氨酸的蛋白的通用方法。
首次描述了在组蛋白上赖氨酸的Nε-乙酰化21。赖氨酸的乙酰化和脱乙酰化分别由组蛋白乙酰基转移酶(HAT)和组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)介导。近年来,已发现数以百计的真核蛋白(除组蛋白之外)受到乙酰化调控,包括多于20%的线粒体蛋白20。
尽管赖氨酸乙酰化具有巨大的重要性,但是尚没有生产在指定位点包含Nε-乙酰-赖氨酸的均质重组蛋白的通用方法。利用天然化学连接安置Nε-乙酰-赖氨酸的半合成方法被用于证明H4K16在染色质解压实中的作用1。这些研究显示了生产均质乙酰化蛋白的方法对我们理解乙酰化在生物学中的分子作用的影响。
目前,基于化学的乙酰化方法需要合成大量的修饰肽硫酯,这是一种缺陷。此外,这些已知的方法受到N-末端残基的限制。
一些研究者使用纯化的HAT复合体来使重组蛋白乙酰化。然而,这通常是不能令人满意的方案,其原因如下:i)可能尚不知道用于特定修饰的HAT;ii)制备活性HAT复合体通常需要绝妙的技巧;iii)通常难以使得完成HAT介导的反应,从而导致异质的(heterogeneous)样品;和iv)HAT可在多个位点进行乙酰化,从而难以确定在任一位点的分子乙酰化结果。
本发明试图克服与现有技术相关的问题。
发明内容
赖氨酸的Nε-乙酰化是具有高度生物学重要性的翻译后修饰。在现有技术中,Nε-乙酰化的研究非常困难。用于生产Nε-乙酰化蛋白的现有技术依赖于将Nε-乙酰赖氨酸安置到目标多肽中的化学或半合成方法。这些方法中的一些对技术的要求很高,而另一些方法具有严重的局限性,例如对N-末端残基修饰的限制。已知在现有技术中,没有生产包含Nε-乙酰赖氨酸的均质重组蛋白的通用方法。
为了可靠地向多肽中的精确设定位点掺入Nε-乙酰赖氨酸,本发明的发明人设计了研究细胞中天然存在的多肽合成机制(翻译机制)的方法。特别地,本发明的发明人研发出经修饰而接受Nε-乙酰赖氨酸,并催化Nε-乙酰赖氨酸掺入转运RNA(tRNA)的tRNA合成酶。因此,本发明的发明人创造出此前绝没有被发现的新酶活性。此外,本发明的发明人已经将此新型酶发展成适合 的tRNA合成酶/tRNA对,其可用于在合成时以及在操作者选择的位点处将Nε-乙酰赖氨酸特异地掺入蛋白中。
因此,本发明的发明人首次提供了新型tRNA合成酶,以及相应的用于生产掺入了Nε-乙酰赖氨酸的多肽的新方法。这些新型材料和技术能够生产同质的多肽样品,每个样品均包含所需的翻译后修饰。这无法简单地通过使用基于现有技术中已知技术的现有化学方法而实现。
本发明是基于这些显著的发现。
因此,一方面,本发明提供了能够结合Nε-乙酰赖氨酸的tRNA合成酶。
另一方面,本发明涉及上述tRNA合成酶,其中所述合成酶包含与MbPylRS氨基酸序列具有至少90%序列同一性的多肽。适合地,在至少50个连续氨基酸的范围内评估所述同一性。适合地,在包含对应于MbPylRS的L266至C313氨基酸的区域内评估所述同一性。
另一方面,本发明涉及上述tRNA合成酶,其中所述tRNA合成酶多肽包含对应于MbPylRS中至少L266至C313的氨基酸序列的氨基酸序列,或与其具有至少90%同一性的序列。
适合地,所述多肽包含相对于野生型MbPylRS序列而言在L266、L270、Y271、L274或C313中的一个或多个位置的突变。
适合地,所述至少一个突变(即所述一个或多个突变)在L270、Y271、L274或C313位置。
适合地,所述至少一个突变在L270、L274或C313位置。
适合地,所述tRNA合成酶包含Y271L。
适合地,所述tRNA合成酶包含Y271F。
适合地,所述tRNA合成酶包含L266V。
适合地,所述tRNA合成酶包含L270I、Y271L、L274A和C313F。
适合地,所述tRNA合成酶包含L266V、L270I、Y271F、L274A和C313F。
另一方面,本发明涉及包含编码上述多肽的核苷酸序列的核酸。
另一方面,本发明涉及上述多肽在向tRNA负载(charge)Nε-乙酰赖氨酸中的应用。适合地,所述tRNA包含MbtRNACUA(即,适合地,所述tRNA包含公众可以获得的,由MbPylT基因编码的野生型巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)tRNACUA)。
另一方面,本发明涉及制备包含Nε-乙酰赖氨酸的多肽的方法,所述方法包括安排翻译编码所述多肽的RNA,其中所述RNA包含琥珀密码子,其中所述翻译在上述多肽存在下、能够负载有Nε-乙酰赖氨酸的tRNA存在下、且Nε-乙酰赖氨酸存在下进行。
适合地,所述翻译在脱乙酰化抑制剂存在下进行。
适合地,所述抑制剂包含烟酰胺(NAM)。
另一方面,本发明涉及制备包含Nε-乙酰赖氨酸的多肽的方法,所述方法包括修饰编码所述多肽的核酸,以在对应于所述多肽中需要掺入Nε-乙酰赖氨酸的位置的一个或多个位置提供琥珀密码子。适合地,修饰所述核酸包括将编码赖氨酸的密码子突变为琥珀密码子(TAG)。
另一方面,本发明涉及包含Nε-乙酰赖氨酸的均质重组蛋白。现有技术中的蛋白在其Nε-乙酰赖氨酸含量方面是异质的。适合地,所述蛋白由上述方法制备。
另一方面,本发明涉及包含上述核酸的载体。适合地,所述载体还包含编码所述tRNA合成酶的tRNA底物的核酸序列。适合地,所述tRNA底物由MbPylT基因(见上文)编码。
另一方面,本发明涉及包含上述核酸,或包含上述载体的细胞。
另一方面,本发明涉及还包含失活的脱乙酰化酶基因的上述细胞。适合地,所述失活的脱乙酰化酶基因包括缺失或破坏(disruption)的CobB。
另一方面,本发明涉及包含上述载体或包含上述细胞,和一定量烟酰胺的试剂盒。
另一方面,本发明涉及制备能够结合Nε-乙酰赖氨酸的tRNA合成酶的方法,所述方法包括在L266、L270、Y271、L274或C313中的一个或多个位置突变编码亲本tRNA合成酶的核酸,和选择能够结合Nε-乙酰赖氨酸的一个或多个突变体。
具体实施方式
为了解决现有技术中用于合成乙酰化蛋白的方法的缺陷,我们设想通过产生正交Nε-乙酰赖氨酰-tRNA合成酶/tRNA对,以遗传编码的方式,对琥珀密码子反应高翻译保真且高功效地将Nε-乙酰赖氨酸掺入蛋白中。本文描述 了用于通过在大肠杆菌(E. coli)中对琥珀密码子反应以遗传学方式将Nε-乙酰赖氨酸掺入从而生产位点特异性乙酰化的重组蛋白的方法和材料。我们还能生产均质的此类蛋白,而这对于现有技术是不可能的。我们证明巴氏甲烷八叠球菌吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(MbPylRS)/MbtRNACUA对15-19在大肠杆菌中成正交,并且与此前报道的有用对具有相当的功效。我们改进了上述对用于对琥珀密码子反应高翻译保真且高功效地掺入Nε-乙酰赖氨酸。此外,我们还成功地消除了最初观察到的翻译后脱乙酰化。这些策略在破解乙酰化在推测的染色质修饰的表观遗传编码中的作用2,3以及更深入地理解Nε-乙酰化的细胞作用20方面具有广泛的应用。
定义
应理解,术语“包含”、“包括”、“含有”具有其在本领域的通常含义,即包括所述的特征或特征组,但此术语不排除任何其他的所述特征或特征组的存在。
通过复制前体基因(progenitor gene),随后在复制拷贝中获得新功能来改进生物体中分子相互作用的网络。本文描述了人工模拟产生正交分子的自然过程的方法,所述正交分子即这样的分子,其能够与其前体平行地处理信息而没有前体与复制分子之间的串扰。使用这些方法,可以从很多自然命运中选择出复制分子对的进化命运,从而获得复制分子与衍生出所述复制分子的前体分子之间的预定关系。在本文中,其体现于产生能够与野生型tRNA合成酶和tRNA平行地处理信息但没有野生型与正交分子之间串扰的正交tRNA合成酶-正交tRNA。在一些实施方式中,tRNA本身可保持其野生型序列。在这些实施方式中,适合地,在异源背景,即不同于其天然存在的野生型宿主细胞的背景或宿主细胞中,使用保持其野生型序列的所述实体。这样,野生型实体可在功能意义上是正交的,而无需结构上的改变。下文更详细地讨论了正交性及其可接受的标准。
巴氏甲烷八叠球菌PylS基因编码MbPylRS tRNA合成酶蛋白。巴氏甲烷八叠球菌PylT基因编码MbtRNACUAtRNA。
序列同源性/同一性
尽管也可将序列同源性视为功能类似性(即具有类似化学性质/功能的氨基酸残基),在本文中,优选通过序列同一性表示同源性。
可通过肉眼进行序列比对,但更常借助于可容易获得的序列比对程序进行。这些公用的和可商购的计算机程序能够计算两条或多条序列之间的同源性百分比(例如,同一性百分比)。
可计算连续序列的同一性百分比,即将一条序列与另一条序列比对,且将一条序列中的每个氨基酸与另一条序列中的对应氨基酸直接比较,每次比较一个残基。这被称作“无空位”比对。此类无空位比对通常仅在相对较短的残基数量范围(例如小于50个连续氨基酸)内进行。
尽管这是非常简单且可靠的方法,但其没有考虑在进行全局比对(在完整序列上进行比对)时,例如在其他方面相同的序列对中,一个插入或缺失将导致随后的氨基酸残基无法比对,这样潜在地导致同源性百分比(同一性百分比)大幅下降。因此,大多数序列比对方法经过设计以产生最佳比对,其考虑可能的插入和缺失,而不是过度地对整体同源性(同一性)进行罚分。这通过在序列比对中插入“空位”以设法使局部同源性/同一性最大化来实现。
这些更加复杂的方法为比对中出现的每个空位给出“空位罚分”,这样对于数量相等的相同氨基酸,空位较少的序列比对(反映出两条比较序列之间较高的关联性)所得的分数将高于空位很多的序列比对。“仿射空位罚分”通常用于对空位的存在给出相对高的罚分,而对空位中的每个后续残基给出较小的罚分。这在空位罚分系统中最为常用。显然,高空位罚分将产生空位较少的最佳比对。大多数比对程序允许更改空位罚分。然而,在使用此类软件进行序列比对时,优选使用默认值。例如,在使用GCG Wisconsin Bestfit软件包(见下文)时,氨基酸序列的默认空位罚分是空位-12分,而每个延伸-4分。
因此,计算最大同源性百分比首选需要在考虑空位罚分的情况下生成最佳比对。适合进行此类比对的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包(University of Wisconsin,U.S.A;Devereux et al.,1984,Nucleic Acids Research 12:387)。能够进行序列比对的其他软件的实例包括但不限于BLAST软件包、FASTA(Altschul et al.,1990,J.MoI.Biol.215:403-410)和比对工具组GENEWORKS。
尽管就同一性方面可测量最终的同源性百分比,但是比对程序本身通常 并不是基于全或无的成对比较。作为替代,通常使用分级的类似性记分矩阵,其基于化学类似性或进化距离给出每个成对比较的分数。此类常用矩阵的实例是BLOSUM62矩阵,其是BLAST程序组的默认矩阵。GCG Wisconsin程序通常使用公用的默认值,或者在有提供的情况下使用定制符号比较表格(custom symbol comparison table)。对于GCG软件包优选使用公用的默认值,或者在其他软件的情况下,使用如BLOSUM62的默认矩阵。一旦由软件产生最佳比对,即可计算同源性百分比,优选计算序列同一性百分比。软件通常将其作为序列比对的一部分进行,并产生数值结果。
在本文中,同源氨基酸序列是指在氨基酸水平包含至少15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%同一性的氨基酸序列,优选至少95%或98%同一性的氨基酸序列。适合地,使用本文公开的相关多肽序列在至少50或100,优选200、300或更多氨基酸的范围内评估此同一性,最适合地,使用全长前体(亲本)tRNA合成酶序列进行评估。适合地,应考虑那些已知对蛋白功能所必须的区域的一个或多个序列而不是非必须的相邻序列的同源性。这在考虑来自远缘关系生物的同源序列时特别重要。
最适合地,至少应在MbPylRS氨基酸序列中从L266至C313的连续区域内,或其他tRNA合成酶的对应区域内评价序列同一性。
相同的考虑因素也适用于核酸核苷酸序列,例如tRNA序列。
参照序列
当使用数字标记指示具体氨基酸残基时,使用MbPylRS(巴氏甲烷八叠球菌吡咯赖氨酰-tRNA合成酶)的氨基酸序列作为参照序列(即,由公知的野生型巴氏甲烷八叠球菌PyIS基因编码)进行编号。本领域充分理解其用于目标残基的定位。这不总是严格的计数工作,还须注意上下文内容。例如,如果目标蛋白的长度略有不同,那么在此序列中对应于(例如)Y271的正确残基的定位可能需要比对序列并选出等价或对应的残基,而不能简单地选择目标序列的第271位残基。这很好地在本领域技术人员的能力范围之内。
突变具有其在本领域中的通常含义,并且可以指取代、截短或缺失所涉及的残基、基序或域。突变可在多肽水平上进行,例如通过合成具有突变序列的多肽;或者也可以在核苷酸水平上进行,例如通过制备编码突变序列的 核酸,随后翻译所述核酸以产生突变多肽。在没有氨基酸被指定作为给定突变位点的替换氨基酸的情况下,合适地使用所述位点的随机化,例如,如本文中有关本发明的tRNA合成酶改进和改造所描述的那些。可使用丙氨酸(A)作为默认突变。适合地,在具体位点使用的突变如本文所述。
片段的长度适合地为至少10个氨基酸,适合地为至少25个氨基酸,适合地为至少50个氨基酸,适合地为至少100个氨基酸,适合地为至少200个氨基酸,适合地为至少250个氨基酸,适合地为至少300个氨基酸,适合地为至少313个氨基酸,或适合地为目标tRNA合成酶多肽的大部分。
本发明的多肽
适合地,包含Nε-乙酰赖氨酸的多肽是核小体或核小体多肽。
适合地,包含Nε-乙酰赖氨酸的多肽是染色质或与染色质相关的多肽。
可将本发明的多核苷酸加入重组的可复制载体中。载体可用于在相容的宿主细胞中复制核酸。因此,在另一个实施方式中,本发明提供了制备本发明的多核苷酸的方法,其中通过将本发明的多核苷酸引入可复制载体中,将此载体引入相容的宿主细胞中,并在使所述载体发生复制的条件下培养所述宿主细胞。可从所述宿主细胞中回收所述载体。适合的宿主细胞包括细菌,例如大肠杆菌。
优选本发明多核苷酸在载体中与控制序列可操作地连接,其中所述控制序列能够通过宿主细胞提供编码序列的表达,即所述载体是表达载体。术语“可操作地连接”是指所述组分之间的关系使其能够以预期的方式发挥其作用。按照一定方式连接与编码序列“可操作地连接”的调控序列,从而在与控制序列相容的条件下完成编码序列的表达。
可将本发明的载体转化或转染进入所述的适合的宿主细胞,以提供本发明蛋白的表达。此方法可包括:在一定条件下培养由上述表达载体转化的宿主细胞以通过编码所述蛋白的编码序列的载体提供表达,并且任选地回收所表达的蛋白。
所述载体可以是,例如质粒或病毒载体,所述载体带有复制起点、任选的用于表达所述多核苷酸的启动子和任选的所述启动子的调控子。载体可包含一个或多个选择性的标记基因,例如在细菌质粒的情况下包含氨苄青霉素 抗性基因。载体可以用于,例如转染或转化宿主细胞。
与编码本发明蛋白的序列可操作地连接的控制序列包括启动子/增强子和其他表达调控信号。可选择与设计使用表达载体的宿主细胞相容的那些控制序列。术语启动子在本领域中是熟知的,并且包含大小和复杂性不同的核酸区域,其涉及从最小启动子到包含上游元件和增强子的启动子。
蛋白的表达和纯化
可使用包含本发明多核苷酸的宿主细胞表达本发明的蛋白。可在允许表达本发明蛋白的适合条件下培养宿主细胞。可以组成型地表达本发明蛋白以使其连续生产;或者是诱导型的,此时需要刺激以启动表达。在诱导型表达的情况下,蛋白生产当需要时可通过例如向培养基中添加诱导物质,例如地塞米松或IPTG来启动。
可通过本领域已知的各种技术从宿主细胞提取本发明的蛋白,包括酶解、化学和/或渗透裂解,和物理破裂。
优化
通过使用包含RF-1的热灭活突变体的S30提取物能够提高体外翻译反应中非天然氨基酸的掺入。RF-1的温度敏感突变体能够瞬时提高体内的整体(in global)琥珀型抑制。提高tRNACUA基因的拷贝数量以及从基本培养基到丰富培养基的转化也可改进掺入了非天然氨基酸的蛋白在大肠杆菌中的产量。
工业应用
Nε-乙酰化调控不同的细胞进程。多个组蛋白上赖氨酸残基的乙酰化调节染色质凝集1,可能是作为组蛋白密码一部分的表观标记2,以及通过正在开始破解的途径3组织招募参与转录、DNA复制、DNA修复、重组和基因组稳定性的因子。包括肿瘤抑制因子p534在内的60多种转录因子和共激活因子是乙酰化的,并且乙酰化还调控转录、DNA复制、DNA修复和重组机制的组分之间的相互作用5,6。乙酰化对于调控细胞骨架动态、组织免疫突触和刺激驱动蛋白转运都非常重要7,8。乙酰化还是葡萄糖、氨基酸和能量代谢的重要调控因子,并且多种关键酶包括组蛋白乙酰基转移酶、组蛋白脱乙酰酶、 乙酰辅酶A合酶、激酶、磷酸酶和泛素连接酶鼠双微体(ubiquitin ligase murine double minute)的活性均由乙酰化直接调控9。乙酰化是伴侣蛋白功能10、蛋白质运输和折叠11、stat3介导的信号转导12和凋亡13的关键调控因素。综上所述,可见Nε-乙酰化是对抗磷酸化的具有多种不同作用和功能重要性的修饰14。因此,本文公开的方法和材料在生产可销售产品以及促进对上述基本生物进程的研究方面具有明显的效用和工业实用性。
其他应用
可通过本领域技术人员已知的任何适合方法抑制脱乙酰化酶。适合地,通过内源脱乙酰化酶的基因缺失或破坏进行抑制。适合地,所述被破坏/缺失的脱乙酰化酶是CobB。适合地,通过抑制表达,例如抑制内源脱乙酰化酶的翻译进行抑制。适合地,通过添加如烟酰胺的外源抑制剂进行抑制。
一方面,本发明涉及将Nε-乙酰赖氨酸加入生物体例如大肠杆菌的遗传密码中。
本发明发现了在合成在特定组蛋白的指定位点带有Nε-乙酰赖氨酸的核小体和/或染色质的具体应用。此类应用的一个实例是用于测定指定修饰对核小体和染色质结构和功能的影响1,26。
可将MbPylRS/MbtRNACUA对进一步改进以通过遗传方式掺入单-、双-和/或三-甲基赖氨酸,从而研究这些修饰对组蛋白结构和功能的影响,以及其在表观遗传密码中的作用14。此外,本文所述的方法还可应用于通过遗传方式掺入不同官能团衍生化的赖氨酸残基和/或将生物物理探针掺入大肠杆菌的蛋白中。
由于MbPylRS不识别MbtRNACUA的反密码子18,还可以将改进的MbPylRS/MbtRNA对与其他改进的正交氨酰tRNA合成酶/tRNACUA对,和/或带有改进的解码性质的正交核糖体组合27,从而指导在单个蛋白中有效地掺入多个不同的有用非天然氨基酸。
附图说明
图1显示证明了MbPylRS/MbtRNACUA对对肌红蛋白基因中的琥珀终止密码子反应而有效且特异地掺入Nε-环戊氧羰基-L-赖氨酸(Cyc)的照片和图。 A.由Myo4TAG-PylT产生肌红蛋白取决于生长培养基中存在的Cyc。通过Ni2+-亲和层析纯化在MjTyrRS/MjtRNACUA存在下表达的肌红蛋白(第1道),或1mM Cyc存在或不存在且MbPylRS/MbtRNACUA存在下表达的肌红蛋白(第2道和第3道),通过SDS-PAGE分析并用考马斯亮蓝染色。B.对MjTyrRS/MjtRNACUA(Tyr)产生的肌红蛋白的ESI-MS分析显示18433.2Da的质量(预期为18431.2Da),而由MbPylRS/MbtRNACUA(Cyc)产生的肌红蛋白具有18510.7Da的质量。预期的质量差异(m(Cyc)-m(Tyr)=258.3Da-181.2Da=77.1Da)与所观察的质量差异(77.5Da)对应良好。
图2显示了说明设计用于遗传掺入Nε-乙酰赖氨酸的MbPylRS的分子结构。A-赖氨酸(1)、吡咯赖氨酸(2)和Nε-乙酰赖氨酸(3)的结构。B.与吡咯赖氨酸结合的MbPylRS的活性位点的结构。显示了形成吡咯赖氨酸的疏水结合口袋并在文库中突变成常见20种氨基酸中的每一种的氨基酸残基。此图像是使用PyMoIvθ.99(www.pymol.org)和PDB ID 2Q7H产生的。
图3显示证明改进的氨酰tRNA合成酶对琥珀密码子反应而有效地将Nε-乙酰基赖氨酸掺入蛋白中的照片和图片。A.在MjTyrRS/MjtRNACUA存在下产生的肌红蛋白(第1道),或1mM Nε-乙酰基赖氨酸存在或不存在且AcKRS-2存在下产生的肌红蛋白(第2道和第3道),或在1mM乙酰赖氨酸和50mM烟酰胺(NAM)存在下产生的肌红蛋白(第4道)。通过Ni2+-亲和层析纯化蛋白,通过SDS-PAGE分离,用考马斯亮蓝染色,或者转移到硝化纤维膜,并用抗体检测六组氨酸标签或乙酰赖氨酸。B.纯化乙酰化肌红蛋白的ESI-MS分析。在烟酰胺不存在下(绿色,-NAM)表达的肌红蛋白产生两个质量峰:18397.6(b)和18439.2Da(a),其分别对应于脱乙酰化和乙酰化的肌红蛋白(预期质量分别为:18396.2和18438.2Da)。在50mM烟酰胺存在下(蓝色,+NAM)表达的肌红蛋白时,仅观察到乙酰化蛋白的峰(c)。
下文将通过实施例的方式描述本发明。这些实施例用于说明,而非限制本发明的权利要求。
实施例-概述
某些产甲烷细菌,包括巴氏甲烷八叠球菌(Mb),对存在于多种甲基转移酶基因中的UAG密码子15,16反应掺入吡咯赖氨酸。对琥珀密码子反应,吡咯赖氨酸在巴氏甲烷八叠球菌中的掺入受到吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(MbPylRS)及其同源琥珀抑制基因MbtRNACUA的指导17。MbPylRS/MbtRNACUA对在大肠杆菌中发挥作用,但MbtRNACUA不是大肠杆菌中内源氨酰tRNA合成酶的有效底物16,18。因此,MbPylRS/MbtRNACUA似乎满足了关于内源氨酰tRNA合成酶和tRNA成正交性的三条标准中的两条22。
结合有关乙酰赖氨酸是吡咯赖氨酸基础的理解,这些观察促使我们研究将MbPylRS/MbtRNACUA改进成Nε-乙酰基赖氨酰-tRNA合成酶/tRNACUA对以用于将乙酰赖氨酸遗传性掺入在大肠杆菌中表达的蛋白。
实施例-通用方法
质粒的构建
质粒pMyo4TAG-PylT编码受阿拉伯糖启动子控制的肌红蛋白基因,其中第4个密码子被琥珀密码子取代。其还包含带有lpp启动子和rrnC终止子的PylT基因。pMyo4TAG-PylT通过连接两个PCR产物产生。使用pBADJYAMB4TAG22作为PCR反应中的模板生成一个PCR产物,其中在所述PCR反应中扩增除MjtRNACUA基因之外的整个载体。此PCR使用引物pMyoNotF(5′-CAA GCG GCC GCG AAT TCA GCG TTA CAA GTA TTA CA-3′)和pMyoPstR(5′-GAC CAC TGC AGA TCC TTA GCG AAA GCT-3′)。通过使用引物PYLTPST 13(5′-GCG ACG CTG CAG TGG CGG AAA CCC CGG GAA TC-3′)和PYLTNOT 15(5′-GGA AAC CGC GCG GCC GCG GGA ACC TGA TCA TGT AGA TCG-3′)从pREP-PylT扩增PylT基因,从而生成第二个PCR产物。使用NotI和PstI酶切两个PCR产物,并用T4DNA连接酶连接形成pMyo4TAG-PylT。
pREP-PylT衍生自pREP(2)YC-JYCUA22,28通过Quickchange突变试剂盒(Stratagene)缺失pREP(2)YC-JYCUA中的MjtRNACUA基因,在lpp启动子下游产生独特的BglII和SpeI位点。这使用引物pREPDtf(5′-CTAGATCTATGACTAGTATCCTTAGCGAAAGCTAA-3′)和pREPDtr(5′-ATACT AGTCATAGATCTAGCGTTACAAGTATTACA-3′)进行。通过引物pylTbegf(5′-GCT AGA TCT GGG AAC CTG ATC ATG TAG ATC GAA TGG ACT CTA AAT CCG TTC AGC C-3′)和pylTendr(5′-GAT ACT AGT TGG CGG AAA CCC CGG GAA TCT AAC CCG GCT GAA CGG ATT TAG AGT C-3′)经PCR产生PylT基因,并将其克隆到中间载体中的BglII和SpeI之间。
使用与从pREP(2)YC-JYCUA产生pREP-PylT相同的策略和引物,从pYOBB2衍生出pBAR-PylT(其包含受阿拉伯糖启动子控制,在Q2和D44位置带有琥珀密码子的毒性barnase基因,和lpp启动子上的PylT)。
文库构建
合成根据大肠杆菌密码子优化过的MbPylS基因(Geneart)。将此ORF克隆到pBK-JYRS22中的Ndel和Pstl位点之间,以取代MjTyrRS基因并产生pBK-PylS。在此模板上进行3轮反向PCR以使L266、L270、Y271、L274、C313和W383的密码子随机化,将前一轮的产物作为后一轮的模板。在各轮PCR反应中使用以下引物:(第1轮)PylSC313f(5′-GCG CAG GAAAGG TCTCAA ACT TTN NKC AAA TGG GCA GCG GCT GCA CCC GTG AAA AC-3′)和PylSC313r(5′-GCG CAG AGT AGG TCT CAA GTT AAC CAT GGT GAA TTC TTC CAG GTG TTC TTT CW);(第2轮)PylSL266f(5′-GCG CAG GTC TCA CCG ATG NNK GCC CCG ACC NNK NNK AAC TAT NNK CGT AAA CTG GAT CGT ATT CTG CCG GGT C-3′)和PylSL266r(5′-GCG CAG AGT AGG TCT CAT CGG ACG CAG GCA CAG GTT TTT ATC CAC GCG GAA AAT TTG-3′);(第3轮)PylSW383f2(5′-GCG CAG GAA AGG TCT CAA AAC CGN NKA TTG GCG CGG GTT TTG GCC TGG AAC GTC TGC TG-3′)和PylSW383r2(5′-GCG CAG AGT AGG TCT CAG TTT ATC AAT GCC CCA TTC ACG ATC CAG GCT AAC CGG AC-3′)。在100μL试样中制备酶促反向PCR反应物,其包含带有MgCl2的1×PCR缓冲液(Roche)、每种dNTP各200μM、每种引物各0.8μM、100ng模板和7U Expand高保真聚合酶(Roche)。使用以下温度程序在50μl试样中进行PCR反应:95℃2分钟,9×(95℃20秒;65℃[-1℃/循环]20秒,68℃ 4分钟),31×(95℃ 20秒,58℃ 20秒,68℃ 4分钟),68℃ 9分钟。
如上所述29,使用DpnI和BsaI酶切纯化的PCR反应产物,连接,沉淀并用于转化电感受态的DH10B细胞。如上所述30,为了增加最后一轮酶促 反向PCR后独立的转化体的数量,使用Phi29DNA聚合酶在500μl反应中扩增沉淀的连接产物。最后的转化产生约108个突变体的文库。通过对随机选择的12个克隆进行测序来检验文库的质量,其显示在随机位点掺入的核苷酸没有偏差。
选择Nε-乙酰赖氨酸特异性氨酰tRNA合成酶
使用突变合成酶克隆文库转化带有质粒pREP-PylT的大肠杆菌DH10B,产生109个转化体。在补充有12.5μg ml-1四环素和25μg ml-1卡那霉素(LB-KT)的100mL LB中培养细胞(16h,37℃,250r.p.m.)。将2mL此培养物以1∶50的比例稀释到包含1mM Nε-乙酰赖氨酸(Bachem)的新鲜LB-KT中,并培养(3-4h,37℃,250r.p.m.)。将0.5ml培养物平铺到补充有1mM乙酰赖氨酸和50μgml-1氯霉素的LB-KT平板(24cm x 24cm)。培养(48h,37℃)后,从平板上剥下细胞,并分离质粒。通过琼脂糖凝胶电泳从报告质粒分离合成酶质粒,并使用Qiagen凝胶纯化试剂盒提取。
为了选择指导对琥珀密码子反应掺入天然氨基酸的合成酶,使用在此阳性选择中分离的质粒转化包含pBar-PylT的DH10B。电穿孔后,使细胞在SOB培养基中恢复(3h,37℃,250r.p.m.)。将约107个细胞平铺到补充有0.2%阿拉伯糖、25μg ml-1卡那霉素和25μg ml-1氯霉素的LB-琼脂平板(24cm x 24cm)。将平板在37℃下培养24小时。收集来自所得菌落的细胞,并按上文所述分离合成酶质粒。
按照与第1轮相同的方式进行第3轮筛选,只是不是收集合成酶质粒的集合,我们挑出单个菌落并使其平行地生长在1mL LB-KT中。在生长过夜后,以1∶10的比例将200μL每种培养物稀释到新鲜LB-KT中,并分成由单个菌落获得的两等份1mL培养物。向一份培养物中添加1mM Nε-乙酰赖氨酸,而另一份不添加。在培养(5h,37℃,250r.p.m.)后,将细胞挑到含有或不含1mM Nε-乙酰赖氨酸且包含浓度提高的氯霉素的LB-KT平板上。由显示强Nε-乙酰赖氨酸依赖性的氯霉素抗性的24个克隆分离总质粒DNA。将此DNA用HindIII(其不酶切pBK-PylS,但酶切pREP-PylT)酶切,并用于转化DH10B。为了验证所观察到的表型不是细胞基因组突变或报告质粒突变的结果,使用分离的pBK-PylS质粒转化包含pREP-PylT的细胞,并检测其在2mM Nε-乙酰赖氨酸存在或不存在下,在浓度提高的氯霉素中的生长能力。此外,我们还通过在Storm Phosphoimager(Molecular Dynamics)上扫描不含氯霉素的平板来分析GFP的表达。
通过琥珀型抑制表达和纯化肌红蛋白
使用pBKPylS、AcKRS-1或AcKRS-2和pMyo4TAG-PylT转化大肠杆菌DH10B。在LB-KT中培养细胞(16h,37℃,250r.p.m.)。向1升补充有1mM Nε-乙酰赖氨酸或Cyc(Sigma)的LB-KT中接种50mL此过夜培养物。在37℃培养2小时后,向培养物中补充50mM烟酰胺(Sigma),并再培养30分钟。通过添加0.2%阿拉伯糖诱导蛋白表达。3小时后,收集细胞并用PBS清洗。通过在25℃下振摇补充有蛋白酶抑制剂混合物(Roche)、1mM PMSF、50mM烟酰胺和约1mg ml-1溶菌酶的30mL BugBuster(Novagen),以提取蛋白。通过离心(15分钟,2500g,4℃)净化提取物,并补充20mM咪唑和50mM Tris(pH 8.0)至40ml的总体积。向提取物中添加0.3ml Ni2+-NTA珠(Qiagen),并在4℃振荡培养1小时。将珠倾入柱中,并用40ml清洗缓冲液(50mM Tris、20mM咪唑、200mM NaCl)清洗。将蛋白洗脱到补充有200mM咪唑的1ml清洗缓冲液中,并立即使用Sephadex G25柱将其重新缓冲到10mM碳酸铵(pH 7.5)中。通过4-20%SDS-PAGE分析纯化的蛋白。使用抗六组氨酸标签的抗体(Qiagen)和Nε-乙酰赖氨酸的抗体(Santa Cruz)进行蛋白质印迹。
质谱
以1∶1的比例将重新缓冲到10mM碳酸铵(pH 7.5)的蛋白与含1%甲酸的50%甲醇混合。在带有电喷雾电离的LCT时间飞行质谱仪(Micromass)上确定总质量。以10ml min-1注射样品,并在阳离子模式下使用马心脏肌红蛋白进行校准。对60-90个扫描进行平均,通过使用MassLynx 4.1版(Micromass)对多电荷蛋白质谱进行退卷积(deconvoluting),从而获得分子质量。使用Protparam(http://us.expasv.org/tools/protparam.html)计算野生型蛋白的理论质量,并人工调整包含非天然氨基酸的蛋白的理论质量。
实施例1:MbPylRS/MbtRNACUA对的选择和应用
为了确认MbPylRS/MbtRNACUA对在大肠杆菌中的活性以及MbtRNACUA与细胞氨酰tRNA合成酶的正交性,我们检查了分别编码MbPylRS和MbtRNACUA的PylS和PylT基因指导对琥珀密码子反应掺入吡咯赖氨酸类似物Nε-环戊氧羰基-L-赖氨酸(Cyc,此前证明是MbPylRS的有效底物19)的能力。用pBK-PylS(编码MbPylRS)和pREP-PylT(编码MbtRNACUA,氯霉素乙酰基转移酶的琥珀突变体,T7RNA聚合酶基因的琥珀突变体和T7启动子上的绿色荧光蛋白基因)转化细胞,并在Cyc存在下,在150μg ml-1氯霉素下存活并显示绿色的荧光。在不向培养基中添加Cyc或pBK-PylS时,细胞不能在高于20μg ml-1的氯霉素下存活,并且没有显示绿色荧光。这些结果证实MbtRNACUA基本上没有被大肠杆菌中的内源性氨酰tRNA合成酶氨基乙酰化,并且证实MbPylRS/MbtRNACUA对在大肠杆菌中介导Cyc依赖性琥珀型抑制。为了证明MbPylRS/MbtRNACUA对能够支持与此前用于遗传编码扩增的对水平相当的蛋白表达,我们构建了包含编码MbtRNACUA和抹香鲸肌红蛋白的基因(其带有替代4位丝氨酸密码子的琥珀密码子和C-末端六组氨酸标签)的表达构建体(Myo4TAG-PylT)。包含Myo4TAG-PylT,pBK-PylS和1mMCyc的细胞产生全长的肌红蛋白(图1),其纯化产量为每升培养物2mg(在使用詹氏甲烷球菌(Mj)酪氨酰-tRNA合成酶tRNACUA(MjTyrRS/MjtRNACUA)对对相同肌红蛋白基因中的琥珀密码子反应而插入酪氨酸时,获得了相当的肌红蛋白产量)(图1)。此数据证实MbPylRS/MbtRNACUA对以相当于此前用于遗传编码扩增的对的效率指导氨基酸掺入。如果不向细胞添加Cyc或MbPylRS,那么通过考马斯亮蓝染色仅检测到痕量的全长肌红蛋白,这表明内源氨酰tRNA合成酶对MbtRNACUA的氨基乙酰化水平非常低。
实施例2:定量掺入
为了检查MbPylRS对细胞tRNA的正交性,以及证明MbPylRS/MbtRNACUA对定量地掺入Cyc,我们获取了包含Cyc的纯化肌红蛋白的电喷雾质谱(图1)。质谱显示了对应于编码掺入的Cyc的单个峰。此数据证实了没有对有意密码子反应以可测定的程度掺入Cyc(即MbPylRS在功能上是正交的),并且在Cyc存在下没有对琥珀密码子反应以可测定的程度掺入天然氨基酸。综上所述,表型数据、蛋白表达数据和质谱数据证明MbPylRS/MbtRNACUA对在大肠杆菌中是具有高度活性、特异性和正交性的对。
实施例3:Nε-乙酰赖氨酸活性的评估
在此实施例中,阐述了用于制备能够结合Nε-乙酰赖氨酸的tRNA合成酶的方法。此方法包括在L266、L270、Y271、L274或C313中的至少一个或多个位置突变编码亲本tRNA合成酶序列的核酸。在此实施例中,突变上述残基中的每一个。在突变后,选择能够结合Nε-乙酰赖氨酸的突变体。
突变
为了开始改进出用于对琥珀密码子反应而掺入Nε-乙酰赖氨酸的MbPylRS/MbtRNACUA正交对,我们制备了108个MbPylRS突变体的文库,在所述突变体中,有6个残基(Leu 266、Leu 270、Tyr 271、Leu 274、Cys 313、Trp 383)被随机化(图2)。基于与吡咯赖氨酸复合的MbPylRS的结构选择这些残基23,并且在吡咯赖氨酸的结合吡咯环 之内。
选择
为了选择指导遗传掺入Nε-乙酰赖氨酸的突变MbPylRS/MbtRNACUA对,我们进行了三轮筛选(阳性、阴性、阳性)。在阳性筛选中,使用氨酰tRNA合成酶文库和pREP-PylT转化细胞,并将细胞在存在1mM Nε-乙酰赖氨酸和50μg ml-1氯霉素的条件下生长以选择活性合成酶22。通过使用pBAR PylT(其包含PylT和毒性核酸酶barnase的基因,在该barnase的基因中有两个密码子转化为琥珀密码子)共转化,在不存在Nε-乙酰赖氨酸的条件下对存活的合成酶克隆进行阴性筛选。此步骤除去了使用天然氨基酸作为底物的氨酰tRNA合成酶。
在三轮阳性和阴性筛选后,分离存活的氨酰tRNA合成酶克隆,并用pREP-PylT转化。根据Nε-乙酰赖氨酸依赖性氯霉素抗性和GFP荧光筛选96个克隆。其中22个克隆在存在和不存在2mM Nε-乙酰赖氨酸的条件下分别赋予大肠杆菌耐受高达150μg ml-1和20-30μg ml-1氯霉素的氯霉素抗性;这些克隆还显示出氨基酸依赖性GFP荧光。在Nε-乙酰赖氨酸存在和不存在下氯霉素抗性的巨大差异表明,与在细胞中发现的所有20种常见氨基酸相比,所选择的合成酶具有对琥珀密码子反应插入Nε-乙酰赖氨酸的高度体内特异 性。测序表明22个克隆对应于两个不同的氨酰tRNA合成酶序列,我们将其分别命名为AcKRS-1和AcKRS-2。相对于MbPylRS,AcKRS-1具有5个突变(L266V、L270I、Y271F、L274A、C313F),而AcKRS-2具有4个突变(L270I、Y271L、L274A和C313F)。
尽管不希望被理论限制,但可能MbPylRS中结合吡咯环的疏水腔被重排以结合乙酰基团,并且通过改进的合成酶中突变氨基酸的较大体积补偿了吡咯赖氨酸和Nε-乙酰赖氨酸之间的体积差异。
实施例4:包含Nε-乙酰赖氨酸的多肽的制备方法
在此实施例中,产生包含Nε-乙酰赖氨酸的多肽。这通过安排翻译编码所述多肽的RNA进行。此RNA包含琥珀密码子。
在如本发明实施例3中所述的多肽,即AcKRS-1或AcKRS-2存在的条件下进行翻译。还在能够负载有Nε-乙酰赖氨酸的tRNA(在此实施例中为PylT)存在下,且Nε-乙酰赖氨酸存在下进行翻译。
因此,为了证明对琥珀密码子反应掺入乙酰赖氨酸的保真性和功效,使用包含Myo4TAG-PylT、AcKRS-1或AcKRS-2和1mM Nε-乙酰赖氨酸的细胞产生全长肌红蛋白。纯化肌红蛋白,其产量为每升培养物1.5mg(图3),其与报道使用活性最高的MjTyrRS/MjtRNACUA对变体掺入非天然氨基酸的产量相当22。如果不向细胞添加Nε-乙酰赖氨酸,通过考马斯亮蓝染色或对C-末端His-6标签的蛋白质印迹仅检测到痕量的肌红蛋白。对Nε-乙酰赖氨酸的蛋白质印迹进一步验证了肌红蛋白中掺入了所述氨基酸。这些数据进一步证实了所选择的氨酰tRNA合成酶对Nε-乙酰赖氨酸的选择性非常高。
实施例5:包含Nε-乙酰赖氨酸的多肽的制备方法
在此实施例中,在抑制脱乙酰化酶的条件下产生多肽。首先根据实施例4生产多肽。从包含AcKRS-2、Myo4TAG-PylT和Nε-乙酰赖氨酸的细胞中纯化的肌红蛋白的电喷雾电离质谱给出了两个峰(图3):一个峰对应于掺入的Nε-乙酰赖氨酸,而第二个峰的质量少42Da。我们将第二个峰归属于带有赖氨酸而非Nε-乙酰赖氨酸的肌红蛋白。我们的推论是,由于从Myo4TAG-PylT表达肌红蛋白依赖于向细胞添加Nε-乙酰赖氨酸,而包含赖氨酸的肌红蛋白必然是由大肠杆菌中翻译后脱乙酰化衍生而来的。
大肠杆菌具有单个表征的脱乙酰化酶CobB:属于sirtuin家族的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性酶24,25。由于已知烟酰胺有效地抑制sirtuin家族的酶,我们根据实施例4,但另外还存在此抑制剂下进行蛋白表达。从包含烟酰胺的细胞中产生的肌红蛋白的电喷雾电离质谱给出了对应于乙酰化蛋白的单个峰(图3),没有观察到脱乙酰化蛋白的峰。我们的结论是烟酰胺完全抑制了大肠杆菌中遗传掺入乙酰赖氨酸的翻译后脱乙酰化。
实施例部分的总结
综上所述,我们证实了MbtRNACUA对大肠杆菌中细胞氨酰tRNA合成酶的正交性,证明了MbPylRS对大肠杆菌中细胞tRNA的正交性,还证明了此正交对在大肠杆菌中的功效。我们还开发了用于指导Nε-乙酰赖氨酸高翻译保真和高有效地掺入大肠杆菌中表达的蛋白中的MbPylRS/MbtRNACUA正交对。此外,我们还开发了基于抑制剂的策略,以彻底消除最初观察到的在大肠杆菌中共翻译掺入Nε-乙酰赖氨酸的翻译后脱乙酰化。因此,本文所述的材料和技术可用于生产位点特异性乙酰化的重组蛋白。
参考文件
1.Shogren-Knaak,M.et al.Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions.Science 311,844-847(2006).
2.Jenuwein,T. & Allis,CD.Translating the histone code.Science 293,1074-1080(2001).
3.Kouzarides,T. Chromatin modifications and their function.Cell 128,693-705(2007).
4.Gu,W. & Roeder,R.G.Activation of p53 sequence-specific DNA binding by acetylation of the p53C-terminal domain.Cell 90,595-606(1997).
5.Groth,A.,Rocha,W.,Verreault,A. & Almouzni,G. Chromatin challenges during DNA replication and repair.Cell 128,721-733(2007).
6.Peterson,CL. & Cote,J.Cellular machineries for chromosomal DNA repair.Genes Dev 18,602-616(2004).
7.Hubbert,C.et al.HDAC6 is a microtubule-associated deacetylase.Nature417,455-458(2002).
8.Serrador, J.M.et al.HDAC6 deacetylase activity links the tubulin cytoskeleton with immune synapse organization.Immunity 20,417-428(2004).
9.Yang,XJ. & Gregoire,S.Metabolism,cytoskeleton and cellular signalling in the grip of protein Nepsilon-and O-acetylation.EMBO Rep 8,556-562(2007).
10.Scroggins,B.T.et al.An acetylation site in the middle domain of Hsp90regulates chaperone function.MoI Cell 25,151-159(2007).
11.Bannister,A.J.,Miska,E.A.,Gorlich,D. & Kouzarides,T. Acetylation of importin-alpha nuclear import factors by CBP/p300.Curr Biol 10,467-470(2000).
12.Yuan,Z.L.,Guan,Y.J.,Chatterjee,D. & Chin,Y.E.Stat3 dimerization regulated by reversible acetylation of a single lysine residue. Science 307,269-273(2005).
13.Cohen,H.Y.et al.Acetylation of the C terminus of Ku70 by CBP and PCAF controls Bax-mediated apoptosis.MoI Cell 13,627-638(2004).
14.Kouzarides,T.Acetylation:a regulatory modification to rival phosphorylation?Embo J 19,1176-1179(2000).
15.Hao,B.et al.A new UAG-encoded residue in the structure of a methanogen methyltransferase.Science 296,1462-1466(2002).
16.Srinivasan,G.,James,CM. & Krzycki,J.A.Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea:charging of a UAG-decoding specialized tRNA.Science 296,1459-1462(2002).
17.Blight,S.K.et al.Direct charging of tRNA(CUA)with pyrrolysine in vitro and in vivo.Nature 431,333-335(2004).
18.Ambrogelly,A.et al.Pyrrolysine is not hardwired for cotranslational insertion at UAG codons.Proc Natl Acad Sd U S A 104,3141-3146(2007).
19.Polycarpo,CR.et al.Pyrrolysine analogues as substrates for pyrrolysyl-tRNA synthetase.FEBS Lett 580,6695-6700(2006).
20.Kim,S.C et al.Substrate and functional diversity of lysine acetylation revealed by a proteomics survey.MoI Cell 23,607-618(2006).
21.Allfrey,V.G.,Faulkner,R. & Mirsky,A.E.Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis.Proc Natl Acad Sd USA 51,786-794(1964).
22.Chin,J.W.,Martin,A.B.,King,D.S.,Wang,L. & Schultz,P.G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli.Proc Natl Acad Sd USA 99,\\020-11024(2002).
23.Kavran,J.M.et al.Structure of pyrrolysyl-tRNA synthetase,an archaeal enzyme for genetic code innovation.Proc Natl Acad Sd USA 104,11268-11273(2007).
24.Blander,G. & Guarente,L. The Sir2 family of protein deacetylases.Annu RevBiochem 73,417-435(2004).
25.Schwer,B.,Bunkenborg,J.,Verdin″R.O.,Andersen,J.S. & Verdin,E.Reversible lysine acetylation controls the activity of the mitochondrial enzyme acetyl-CoA synthetase 2.Proc Natl Acad Sd U S A 103,10224-10229(2006).
26.Luger,K.,Mader, A.W.,Richmond,R.K.,Sargent,D.F. & Richmond,T.J.Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8A resolution.Nature 389,251-260(1997).
27.Wang,K.,Neumann,H.,Peak-Chew,S.Y. & Chin,J.W. Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic code expansion.Nat Biotechnol 25,770-777(2007).
28.Santoro,S.W.,Wang,L.,Herberich,B.,King,D.S. & Schultz,P.G. An efficient system for the evolution of aminoacyl-tRNA synthetase specificity.Nat Biotechnol 20,1044-1048(2002).
29.Rackham,O. & Chin,J.W. A network of orthogonal ribosome x mRNA pairs.Nat Chem Biol 1,159-166(2005).
30.Christ,D.,Famm,K. & Winter,G. Tapping diversity lost in transformations-in vitro amplification of ligation reactions.Nucleic Acids 34,el08(2006).
以上说明书中提到的所有公开物均通过引用并入本文。本发明描述的各方面和实施方式的各种改变和变体对本领域技术人员而言都是显而易见的,而不脱离本发明的范围。尽管已就具体优选实施方式描述了本发明,但应理解,本发明的保护范围绝不应仅限于这些具体实施方式。实际上,对本领域技术人员而言显而易见的实施本发明所述方式的各种改变都落入权利要求书的范围之内。
Claims (11)
1.tRNA合成酶,其能够结合Nε-乙酰赖氨酸,其中相对于野生型MbPylRS序列而言,所述tRNA合成酶的突变在于L270I、Y271L、L274A和C313F,或者L266V、L270I、Y271F、L274A和C313F。
2.一种核酸,其编码权利要求1所述的tRNA合成酶。
3.权利要求1所述的tRNA合成酶向tRNA负载Nε-乙酰赖氨酸的应用。
4.如权利要求3所述的应用,其中所述tRNA包含MbtRNACUA。
5.制备包含Nε-乙酰赖氨酸的多肽的方法,所述方法包括安排翻译编码所述多肽的RNA,其中所述RNA包含琥珀密码子,其中所述翻译在权利要求1所述的tRNA合成酶存在下、能够负载Nε-乙酰赖氨酸的tRNA存在下、且Nε-乙酰赖氨酸存在下进行。
6.如权利要求5所述的方法,其中所述翻译在脱乙酰化抑制剂存在下进行。
7.如权利要求6所述的方法,其中所述抑制剂包含烟酰胺。
8.一种载体,其包含权利要求2所述的核酸,其中所述载体还包含编码所述tRNA合成酶的tRNA底物的核酸序列。
9.如权利要求8所述的载体,其中所述tRNA底物由MbPylT基因编码。
10.一种试剂盒,其包含权利要求8或9所述的载体和一定量的烟酰胺。
11.制备能够结合Nε-乙酰赖氨酸的tRNA合成酶的方法,所述方法包括在L266、L270、Y271、L274或C313中的一个或多个位置突变编码亲本tRNA合成酶MbPylRS的核酸,和选择能够结合Nε-乙酰赖氨酸的一个或多个突变体。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB0721291.3 | 2007-10-30 | ||
GBGB0721291.3A GB0721291D0 (en) | 2007-10-30 | 2007-10-30 | Methods and compositions |
PCT/GB2008/003611 WO2009056803A1 (en) | 2007-10-30 | 2008-10-27 | Methods and compositions |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101910403A CN101910403A (zh) | 2010-12-08 |
CN101910403B true CN101910403B (zh) | 2013-08-07 |
Family
ID=38834528
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2008801232954A Expired - Fee Related CN101910403B (zh) | 2007-10-30 | 2008-10-27 | 方法和组合物 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20110027829A1 (zh) |
EP (1) | EP2212422A1 (zh) |
JP (1) | JP2011500077A (zh) |
CN (1) | CN101910403B (zh) |
CA (1) | CA2703847A1 (zh) |
GB (1) | GB0721291D0 (zh) |
WO (1) | WO2009056803A1 (zh) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB2470770A (en) | 2009-06-04 | 2010-12-08 | Medical Res Council | Incorporation of unnatural amino acids having an orthogonal functional group into polypeptides using orthogonal tRNA/tRNA synthetase pairs |
GB0917240D0 (en) | 2009-10-01 | 2009-11-18 | Medical Res Council | Incorporation of methyl lysine into poiypeptide |
GB0917242D0 (en) | 2009-10-01 | 2009-11-18 | Medical Res Council | Acetyl lysine incorporation with tRNA synthetase |
JP2013522352A (ja) * | 2010-03-24 | 2013-06-13 | メディカル リサーチ カウンシル | 方法 |
US20150148525A1 (en) * | 2012-05-18 | 2015-05-28 | Medical Research Council | Methods of incorporating an amino acid comprising a bcn group into a polypeptide using an orthogonal codon encoding it and an orthorgonal pylrs synthase |
GB2528227A (en) | 2014-03-14 | 2016-01-20 | Medical Res Council | Cyclopropene amino acids and methods |
CN105294475A (zh) * | 2015-11-14 | 2016-02-03 | 复旦大学 | 广谱的去乙酰化酶抑制剂乙酰化赖氨酸及其应用 |
FI3630977T3 (fi) * | 2017-06-02 | 2024-04-24 | Ambrx Inc | Menetelmiä ja koostumuksia ei-luonnollisen aminohapon sisältävän proteiinin tuotannon edistämiseksi |
WO2020007899A1 (en) * | 2018-07-03 | 2020-01-09 | Technische Universität München | Means and methods for site-specific protein modification using transpeptidases |
CN111718920B (zh) * | 2019-03-19 | 2021-05-07 | 宁波鲲鹏生物科技有限公司 | 在蛋白中高效引入赖氨酸衍生物的氨酰基-tRNA合成酶 |
EP4328308A1 (en) | 2022-08-22 | 2024-02-28 | Technische Universität Berlin | Modified trna-synthetase for the incorporation of non-canonical amino acids |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007099854A1 (ja) * | 2006-02-22 | 2007-09-07 | Riken | サプレッサーtRNAの合成方法、DNA構築物及びそれを用いた非天然型アミノ酸組み込みタンパク質の製造 |
-
2007
- 2007-10-30 GB GBGB0721291.3A patent/GB0721291D0/en not_active Ceased
-
2008
- 2008-10-27 US US12/739,247 patent/US20110027829A1/en not_active Abandoned
- 2008-10-27 EP EP08844006A patent/EP2212422A1/en not_active Withdrawn
- 2008-10-27 WO PCT/GB2008/003611 patent/WO2009056803A1/en active Application Filing
- 2008-10-27 CN CN2008801232954A patent/CN101910403B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2008-10-27 CA CA2703847A patent/CA2703847A1/en not_active Abandoned
- 2008-10-27 JP JP2010530545A patent/JP2011500077A/ja active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007099854A1 (ja) * | 2006-02-22 | 2007-09-07 | Riken | サプレッサーtRNAの合成方法、DNA構築物及びそれを用いた非天然型アミノ酸組み込みタンパク質の製造 |
Non-Patent Citations (9)
Title |
---|
Carla Polycarpo等.An aminoacyl-tRNA synthetase that specifically activates pyrrolysine.《Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America》.2004,第101卷(第34期),12450-12454. * |
Carla R. Polycarpo等.Pyrrolysine analogues as substrates for pyrrolysyl-tRNA synthetase.《FEBS Letters》.2006,第580卷(第28-29期),6695-6670. * |
Heinz Neumann等.Genetically encoding Nε-acetyllysine in recombinant proteins.《Nature Chemical biology》.2008,第4卷(第4期),232-234. * |
Jennifer M. Kavran等.Structure of pyrrolysyl-tRNA synthetase, an archaeal enzyme for genetic code innovation.《Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America》.2007,第104卷(第27期),11268-11273. * |
JenniferM.Kavran等.Structureofpyrrolysyl-tRNAsynthetase an archaeal enzyme for genetic code innovation.《Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America》.2007 |
Jianming Xie等.Adding amino acids to the genetic repertoire.《Current Opinion in Chemical Biology》.2005,第9卷(第6期),548-554. * |
Kayo Nozawa等.Pyrrolysyl-tRNA synthetase–tRNA(Pyl) structure reveals the molecular basis of orthogonality.《nature》.2009,第457卷(第7233期),1163-1167. * |
Takahito Mukai等.Adding L-lysine derivatives to the genetic code of mammalian cells with engineered pyrrolysyl-tRNA synthetases.《Biochemical and Biophysical Research Communications》.2008,第371卷(第4期),摘要,图3. * |
凌晨等.吡咯赖氨酸:第22种参与蛋白质生物合成的氨基酸.《生物化学与生物物理进展》.2005,第32卷(第6期),490-494. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2011500077A (ja) | 2011-01-06 |
GB0721291D0 (en) | 2007-12-12 |
EP2212422A1 (en) | 2010-08-04 |
US20110027829A1 (en) | 2011-02-03 |
CN101910403A (zh) | 2010-12-08 |
CA2703847A1 (en) | 2009-05-07 |
WO2009056803A1 (en) | 2009-05-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101910403B (zh) | 方法和组合物 | |
AU2022200130B2 (en) | Engineered Cas9 systems for eukaryotic genome modification | |
Koga et al. | Inverting enantioselectivity of Burkholderia cepacia KWI-56 lipase by combinatorial mutation and high-throughput screening using single-molecule PCR and in vitro expression | |
CN106795521A (zh) | 用于修饰所靶向基因座的方法和组合物 | |
CN101400796A (zh) | 在真细菌宿主细胞内表达正交翻译组分的系统 | |
US11946039B2 (en) | Class II, type II CRISPR systems | |
Krahn et al. | Engineering aminoacyl-tRNA synthetases for use in synthetic biology | |
US20110034680A1 (en) | Microginin producing proteins and nucleic acids encoding a microginin gene cluster as well as methods for creating novel microginins | |
CN104053772A (zh) | 乙内酰脲酶的突变体 | |
Demir et al. | Hybrid-architectured double-promoter expression systems enhance and upregulate-deregulated gene expressions in Pichia pastoris in methanol-free media | |
Furumura et al. | Identification and functional characterization of fungal chalcone synthase and chalcone isomerase | |
AU2021236230A1 (en) | High fidelity SpCas9 nucleases for genome modification | |
Vondenhoff et al. | N-Alkylated aminoacyl sulfamoyladenosines as potential inhibitors of aminoacylation reactions and microcin C analogues containing d-amino acids | |
Fang et al. | Biosynthesis of 10-Hydroxy-2-decenoic Acid through a One-Step Whole-Cell Catalysis | |
Liu et al. | Constructing an Antibiotic-Free Protein Expression System for Ovalbumin Biosynthesis in Probiotic Escherichia coli Nissle 1917 | |
Sharma | The Engineering and Optimization of Pyrrolysyl-Synthetase as a Tool for Noncanonical Amino Acid Incorporation | |
Zhang et al. | Multiple Functions of Compatible Solute Ectoine and Strategies for Constructing Overproducers for Biobased Production | |
KR101251620B1 (ko) | 아데노신 디아미네이즈의 효소 활성 증가 방법, 상기활성이 증가된 아데노신 디아미네이즈 변이체, 및 상기변이체를 이용한 디옥시구아노신의 생산방법 | |
CN115838712B (zh) | 具有肌肽水解酶功能的蛋白酶及其在l-肌肽合成中的应用 | |
Karbalaei-Heidari et al. | Genomically integrated orthogonal translation in Escherichia coli, a new synthetic auxotrophic chassis with altered genetic code, genetic firewall, and enhanced protein expression | |
Xing et al. | High-level expression of phenylalanine ammonia-lyase in Lactococcus Lactis via synthesized sequence based on bias codons | |
Mahmood | Using Rb-TnSeq to Analyze Natural Variation in Saccharomyces cerevisiae | |
Grasso | Resolving the Limitations of Genetic Code Expansion Platforms | |
Zhou et al. | Regulator DegU can remarkably influence alkaline protease AprE biosynthesis in Bacillus licheniformis 2709 | |
Muramatsu et al. | ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF ESTROGEN RESPONSIVE GENES FROM HUMAN GENOME |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C17 | Cessation of patent right | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130807 Termination date: 20131027 |