CN118147245A - 水杨胺的生物合成方法及体系 - Google Patents

水杨胺的生物合成方法及体系 Download PDF

Info

Publication number
CN118147245A
CN118147245A CN202410369856.XA CN202410369856A CN118147245A CN 118147245 A CN118147245 A CN 118147245A CN 202410369856 A CN202410369856 A CN 202410369856A CN 118147245 A CN118147245 A CN 118147245A
Authority
CN
China
Prior art keywords
transaminase
mutant
mutated
aminotransferase
dehydrogenase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202410369856.XA
Other languages
English (en)
Inventor
吴世文
李超静
刘国强
龙玲
赵新岩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiyuan Group Co ltd
Original Assignee
Jiyuan Group Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiyuan Group Co ltd filed Critical Jiyuan Group Co ltd
Priority to CN202410369856.XA priority Critical patent/CN118147245A/zh
Publication of CN118147245A publication Critical patent/CN118147245A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01002—Formate dehydrogenase (1.2.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y206/00—Transferases transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C12Y206/01—Transaminases (2.6.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了水杨胺的生物合成方法及体系。本发明揭示了经过重组改造的、可用于规模化制备水杨胺(2‑羟基苄胺；2‑HOBA)的重组表达及生产系统，为规模化生产水杨胺提供了新途径。

Description

水杨胺的生物合成方法及体系
技术领域
本发明属于蛋白质工程和基因工程领域，涉及水杨胺(2-羟基苄胺)的生物合成；更具体地，本发明涉及利用催化效率提高的突变型转氨酶进行水杨胺的生物合成。
背景技术
2-羟基苄胺(2-Hydroxybenzylamine，2-HOBA)又名水杨胺，是一种强效γKA清除剂，清除γKAs的速度比γKA蛋白加合物的形成速度快980倍，因此保护细胞免受γKA加合物的有害作用。
体外研究已证明2-HOBA可保护HepG2细胞免受H2O2诱导细胞毒性的作用；2-HOBA在氧化应激相关疾病中的有益作用也在体内多个器官、系统中被发现。2-HOBA给药剂量依赖性降低了线虫中氧化剂损伤的生物标志物，并延长了寿命。2-HOBA可作为重要的药物或中间体，前景非常美好。
2-HOBA含有氨基作为重要基团，可以借助转氨酶催化水杨醛实现合成。其中，水杨醛(Sal)是廉价化学品，易于获得。转氨酶(transaminase，TAs)是催化氨基酸与酮酸之间氨基转移的酶，存在于动物、植物组织和微生物中。但是，尽管异源表达转氨酶进行工业化生产已有先例，但是必须克服酶活力低、底物耐受性差等缺点，这成为了这一领域的瓶颈。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水杨胺的生物合成方法，包括利用催化效率提高的突变型转氨酶进行水杨胺的生物合成。
在本发明的第一方面，提供一种制备水杨胺(2-羟基苄胺)的方法，包括：(1)重组表达转氨酶(TA)，丙酮酸脱氢酶(ADH)；较佳地还表达葡萄糖脱氢酶(GDH)或甲酸脱氢酶(FDH)；其中，所述转氨酶为突变型转氨酶，相对于野生型转氨酶，其发生选自下组的一或多个(包括二个)突变：L175G、M56L、V42I、F284L、F89L、F320L、P354Q或P243K；(2)添加底物水杨醛，生成水杨胺。
在一种或多种实施方式中，所述转氨酶催化氨基酸向酮酸之间的氨基转移(以氨基取代酮酸上的酮基)。
在一种或多种实施方式中，所述的方法提高水杨胺的产量或产率。
在一种或多种实施方式中，(2)中，仅添加底物水杨醛。
在一种或多种实施方式中，还包括添加氨基供体，辅因子和/或葡萄糖。
在一种或多种实施方式中，所述辅因子选自：磷酸吡哆醛(PLP)、NAD、NADH、NADP或NADPH。
在一种或多种实施方式中，各组分的量为：
水杨醛：2-16g/L，或2-60mM；
氨基供体：1-200mM；
葡萄糖：10-150mM；
磷酸吡哆醛：0.1-3mM；
NAD、NADH、NADP或NADPH：0.2-5mM。
在一种或多种实施方式中，所述氨基供体包括选自：甲酸铵(AMF)，L-丙氨酸(Ala)，对硝基苯乙胺(4HN)，氯化铵。
在一种或多种实施方式中，所述底物、糖基供体、转氨酶、丙酮酸脱氢酶，及可选的辅因子、葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶在反应中形成底物循环系统。
在一种或多种实施方式中，所述突变型转氨酶选自：L175G和M56L突变的转氨酶；L175G和V42I突变的转氨酶；L175G和F284L突变的转氨酶；F89L突变的转氨酶；L175G突变的转氨酶；F320L突变的转氨酶；P354Q突变的转氨酶；P243K突变的转氨酶。
在一种或多种实施方式中，所述野生型转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；ADH的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；GDH氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；或FDH的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
在本发明的另一方面，提供一种突变型转氨酶，对应于野生型转氨酶的氨基酸序列，其发生选自下组的一或多个(包括二个)突变：L175G、M56L、V42I、F284L、F89L、F320L、P354Q或P243K。
在一种或多种实施方式中，所述突变型转氨酶选自：L175G和M56L突变的转氨酶；L175G和V42I突变的转氨酶；L175G和F284L突变的转氨酶；F89L突变的转氨酶；L175G突变的转氨酶；F320L突变的转氨酶；P354Q突变的转氨酶；P243K突变的转氨酶。
在本发明的另一方面，提供一种提高转氨酶的酶活性(催化效率)的方法，所述方法通过点突变进行，包括：将转氨酶进行突变改造，形成所述的突变型转氨酶；所述突变改造包括：L175G、M56L、V42I、F284L、F89L、F320L、P354Q或P243K；
在一种或多种实施方式中，所述突变改造包括：进行L175G和M56L的突变；进行L175G和V42I的突变；进行L175G和F284L的突变；进行F89L突变；进行L175G突变；进行F320L突变、进行P354Q突变或进行P243突变。
在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸、含有该多核苷酸的载体或遗传工程化的工程细胞(宿主细胞)，所述的多核苷酸编码所述的突变型转氨酶；所述工程细胞中含有所述载体或其基因组中整合有所述的多核苷酸。
在一种或多种实施方式中，所述工程细胞还包括表达丙酮酸脱氢酶的多核苷酸。
在一种或多种实施方式中，所述工程细胞还包括表达葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶的多核苷酸。
在一种或多种优选实施方式中，所述工程细胞为原核细胞；较佳地，所述原核工程细胞包括大肠杆菌。
在一种或多种优选实施方式中，所述载体中，所述的多核苷酸的5’端，还包括启动子，或进一步还可包括：信号肽、标签多肽、荧光蛋白。所述的多核苷酸的3’端，还包括终止子，或进一步还可包括：标签多肽、荧光蛋白。
在本发明的另一方面，提供所述的突变型转氨酶、表达该突变型转氨酶的工程细胞或其裂解产物在制备水杨胺中的应用。
在一种或多种实施方式中，所述工程细胞表达丙酮酸脱氢酶；更佳地还表达葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶。
在本发明的另一方面，提供一种用于制备水杨胺的反应体系或试剂盒，其中含有所述的突变型转氨酶、表达该突变型转氨酶的工程细胞或其裂解产物；较佳地，所述工程细胞还包括表达丙酮酸脱氢酶的多核苷酸；更佳地还包括表达葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶的多核苷酸。
在一种或多种实施方式中，所述反应体系或试剂盒中还包括：底物水杨醛，氨基供体，及可选的辅因子和/或葡萄糖；较佳地，所辅因子选自：磷酸吡哆醛(PLP)、NAD、NADH、NADP或NADPH。
在一种或多种实施方式中，所述反应体系中，所述水杨醛或辅因子的量为(或者，所述试剂盒中所述水杨醛或辅因子可以形成如下的量的体系)：
水杨醛：2-16g/L，或2-60mM；
氨基供体：1-200mM；
葡萄糖：10-150mM；
磷酸吡哆醛：0.1-3mM；
NAD、NADH、NADP或NADPH：0.2-5mM；
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、底物循环系统的组成。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究筛选，揭示了经过重组改造的、可用于规模化制备水杨胺(2-羟基苄胺；2-HOBA)的重组表达及生产系统。针对转氨酶催化活性低、水杨胺生产效率有待提高的技术瓶颈问题，本发明揭示了酶活性(催化活性)显著提高、并且具有特异性(专一性)的突变型转氨酶。本发明为规模化生产水杨胺提供了新途径。
如本文所用，除非另外说明，所述的“突变型转氨酶”、“转氨酶突变体”可互换使用，是指对应于突变前的转氨酶，在本发明人确定的一些与酶的酶活性具有相关性的位点发生突变后构成的酶(多肽/蛋白)。
若需要表示突变前的水杨胺(野生型)，其可以为氨基酸序列如SEQ ID NO:1的酶。除非另外说明，本发明中各突变型转氨酶的突变位点基于该SEQ ID NO:1所示的序列。
本发明中，除非另外说明，转氨酶突变体的标识采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示转氨酶突变体中突变的氨基酸，如L175G，表示位置175位的氨基酸由出发酶的L替换为G。
本发明中，可选地还包括其它的一些酶，包括ADH、GDH或FDH，优选的实施方式中，ADH的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；GDH氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；FDH的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
如本发明所用，“提高酶活性”是指与改造前的野生型转氨酶相比，发生突变的转氨酶的酶活性发生统计学意义的提高，或称为显著性的提高。例如，在同一种反应条件/环境下，酶活性提高的突变型转氨酶在一定时间的反应后，酶活性比改造前的酶显著提高5％以上，10％以上，20％以上，30％以上，40％以上，50％以上，60％以上，80％以上，100％以上，150％以上，200％以上等。
如本发明所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。术语“基本上由……构成”指在组合物/反应体系/试剂盒中，除了含有必要成分或必要组份之外，还可含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或杂质。
转氨酶催化活性较大程度上困扰了生物合成中水杨胺的生产和应用。鉴于此，本发明提供了一种改进的生产方案。本发明也提供了用于制备水杨胺的工程细胞。
在一种实施方式中，使用转氨酶、补全辅因子，打通合成路径。
在一种实施方式中，基于野生型转氨酶进行筛选，获得特异性合成2-HOBA、并且产量较高的酶。
在本发明的实施方式中，利用易错PCR技术对此野生型转氨酶TA1(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)进行随机突变，随机突变文库容量为10000个，得到优选突变体TA1M1(L75G)。进一步地，将TA1M1突变体、ADH(SEQ ID NO:2)与GDH(SEQ ID NO:3)或FDH(SEQ IDNO:4)共表达，形成底物循环系统，进一步提高2-HOBA的产量。
以上述优选突变体TA1M1(L175G)为模板，利用易错PCR对进行进一步的随机突变，突变文库容量为10000个，得到优选突变体TA1M2(L175GM56L)。
将突变体TA1M2(L175GM56L)与GDH、ADH共表达，并进一步提高底物浓度，获得了产2-HOBA产量更高的菌株。
本发明中，所述的水杨胺包括其衍生物。
本发明中，所述的转氨酶突变体发生选自下组的一或多个(包括二个)突变：L175G、M56L、V42I、F284L、F89L、F320L、P354Q或P243K。更具体的方案中，所述突变型转氨酶包括：L175G和M56L突变的转氨酶；L175G和V42I突变的转氨酶；L175G和F284L突变的转氨酶；F89L突变的转氨酶；L175G突变的转氨酶；F320L突变的转氨酶；P354Q突变的转氨酶；P243K突变的转氨酶。
本发明还包括所述转氨酶突变体、ADH、GDH或FDH的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然转氨酶突变体相同的生物学功能或酶活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。然而，需要满足的条件是：所述的转氨酶突变体及其片段、衍生物和类似物的氨基酸序列中，必然存在至少一种本发明上面所特别指出的突变。
在本发明中，所述“转氨酶突变体”、ADH、GDH或FDH还包括(但并不限于)：与实施例中所示的序列相比，发生若干个(通常为1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括转氨酶突变体的酶活性片段和酶活性衍生物。但是，对于“转氨酶突变体”而言，这些变异形式中，肯定存在至少一个本发明所述的突变。
在本发明中，所述“转氨酶突变体”、ADH、GDH或FDH还包括(但并不限于)：与实施例中所示的序列相比，具有80％以上，较佳地85％以上，更佳地90％以上，进一步更佳地95％以上，如98％以上、99％以上序列相同性的保留酶活性的衍生的蛋白。但是，对于“转氨酶突变体”而言，这些衍生的蛋白中，肯定存在至少一个本发明所述的突变。
所述“转氨酶突变体”、ADH、GDH或FDH的类似物也可被包括在本发明中。这些类似物与所述转氨酶突变体、ADH、GDH或FDH的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性的蛋白。
本发明还提供了编码本发明转氨酶突变体、ADH、GDH或FDH或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码所述突变体的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或转氨酶突变体编码序列经基因工程产生的工程细胞，以及经重组技术产生本发明所述突变的酶的方法。
本发明中，转氨酶突变体、ADH、GDH和/或FDH多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。只要能在宿主体内复制和稳定，多种质粒和载体是适用的。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、终止子和翻译控制元件。
本领域已知的方法能用于构建含转氨酶突变体、ADH、GDH和/或FDH编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的工程细胞的表型性状。
在本发的优选实施方式中，所述表达载体包括pET28a和/或pET22b。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的工程细胞，以使其能够表达蛋白质。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的转氨酶突变体、ADH、GDH和/或FDH。一般来说有以下步骤：(1).用本发明的编码转氨酶突变体、ADH、GDH和/或FDH的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的工程细胞；(2).在合适的培养基中培养的工程细胞。
本发明的优选方式中，所述的工程细胞可以是原核细胞，如细菌细胞。在本发明的优选方式中，所述表达载体转化的微生物工程细胞为大肠杆菌细胞。在更具体的实施方式中，本发明中用于所述表达载体转化的微生物工程细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
同时，本发明也提供了一种制备水杨胺的方法，包括：(1)重组表达TA、ADH；较佳地还表达GDH或FDH；其中，所述TA为突变型转氨酶，相对于野生型TA，其发生选自下组的一或多个(包括二个)突变：L175G、M56L、V42I、F284L、F89L、F320L、P354Q或P243K；(2)添加底物水杨醛以及可选的氨基供体，辅因子和/或葡萄糖，生成水杨胺。
在优选的方式中，所述反应体系中，所述水杨醛或辅因子的量可以为(但不限于)：
水杨醛：2-16g/L，例如3、5、6、8、10、12、13、14、15g/L；或2-60mM，例如5、10、15、20、30、40、50、55mM；
氨基供体：1-200mM，例如2、5、10、20、30、50、60、80、90、100、120、150、150mM；
葡萄糖：10-150mM，例如15、20、30、50、60、80、90、100、120、140mM；
磷酸吡哆醛：0.1-3mM，例如0.2、0.3、0.5、0.8、1、1.5、2、2.5mM；
NAD、NADH、NADP或NADPH：0.2-5mM，例如0.3、0.5、0.8、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5mM。
多种能够提供氨基基团的氨基供体可被应用于本发明中。在优选的实施方式中，所述氨基供体包括选自：甲酸铵(AMF)，L-丙氨酸(Ala)，对硝基苯乙胺(4HN)，氯化铵。
为了便于扩大化应用或商业应用，本发明还提供了一种检测体系或检测试剂盒，其中包括：本发明的转氨酶突变体、表达该突变型转氨酶的工程细胞或其裂解产物；较佳地，所述工程细胞还包括表达ADH的多核苷酸；更佳地还包括表达GDH或FDH的多核苷酸。
所述的检测试剂盒中，还可包括底物水杨醛，氨基供体，及可选的辅因子和/或葡萄糖；较佳地，所辅因子选自：磷酸吡哆醛(PLP)、NAD、NADH、NADP或NADPH。
所述的检测试剂盒中，还可包括使用说明书，以指导人们以正确的方法应用本发明的试剂盒。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
I.材料和方法
1、培养基
以下实施例中涉及的培养基及培养基配方如下：
LB液体培养基：酵母提取物5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L。
LB固体培养基：酵母提取物5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L，琼脂2.0g/L。
TB液体培养基：蛋白胨12.0g/L，酵母提取物24.0g/L，甘油4mL/L，磷酸氢二钾9.4g/L，磷酸二氢钾2.2g/L。
2、序列信息
TA1氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：
MGKQRTTSQWRELDAAHHLHPFTDTASLNQAGARVMTRGEGVYLWDSEGNKIIDGMAGLWCVNVGYGRKDFAEAARRQMEELPFYNTFFKTTHPAVVELSSLLAEVTPAGFDRVFYTNSGSESVDTMIRMVRRYWDVQGKPEKKTLIGRWNGYHGSTIGGASLGGMKYMHEQGDLPIPGMAHIEQPWWYKHGKDMTPDEFGVVAARWLEEKILEIGADKVAAFVGEPIQGAGGVIVPPATYWPEIERICRKYDVLLVADEVICGFGRTGEWFGHQHFGFQPDLFTAAKGLSSGYLPIGAVFVGKRVAEGLIAGGDFNHGFTYSGHPVCAAVAHANVAALRDEGIVQRVKDDIGPYMQKRWRETFSRFEHVDDVRGVGMVQAFTLVKNKAKRELFPDFGEIGTLCRDIFFRNNLIMRACGDHIVSAPPLVMTRAEVDEMLAVAERCLEEFEQTLKARGLAMEFKRSNSNN*
TA1核苷酸序列：
ATGGGTAAACAACGCACCACCTCACAATGGCGCGAACTGGATGCCGCACACCACCTGCACCCGTTTACCGACACCGCAAGCCTGAATCAGGCCGGCGCCCGTGTTATGACCCGCGGCGAAGGTGTGTATCTGTGGGATTCTGAGGGTAACAAAATTATCGACGGCATGGCTGGTCTGTGGTGCGTTAATGTCGGCTATGGTCGTAAAGATTTTGCCGAAGCGGCCCGTCGCCAAATGGAAGAACTGCCGTTCTACAACACCTTTTTCAAAACCACGCATCCGGCGGTGGTTGAACTGAGCAGCCTGCTGGCGGAAGTTACGCCGGCCGGCTTTGATCGTGTGTTCTATACCAATTCAGGTTCGGAAAGCGTGGATACGATGATCCGCATGGTTCGTCGCTACTGGGACGTCCAGGGCAAACCGGAAAAGAAAACCCTGATCGGTCGTTGGAACGGCTATCATGGTTCTACGATTGGCGGTGCAAGTCTGGGCGGTATGAAATACATGCACGAACAGGGCGATCTGCCGATTCCGGGTATGGCGCATATCGAACAACCGTGGTGGTACAAACACGGCAAAGATATGACCCCGGACGAATTTGGTGTCGTGGCAGCTCGCTGGCTGGAAGAAAAAATTCTGGAAATCGGCGCCGATAAAGTGGCGGCCTTTGTTGGCGAACCGATTCAGGGTGCGGGCGGTGTGATTGTTCCGCCGGCCACCTATTGGCCGGAAATTGAACGTATCTGCCGCAAATACGATGTTCTGCTGGTCGCAGACGAAGTTATTTGTGGCTTTGGTCGTACCGGCGAATGGTTCGGTCATCAGCACTTTGGCTTCCAACCGGACCTGTTTACGGCAGCTAAAGGCCTGAGTTCCGGTTATCTGCCGATCGGCGCCGTCTTCGTGGGTAAACGCGTTGCAGAAGGTCTGATTGCTGGCGGTGATTTTAATCATGGCTTCACCTATAGCGGTCACCCGGTCTGTGCGGCCGTGGCACATGCTAATGTGGCAGCTCTGCGTGACGAAGGCATCGTGCAGCGCGTTAAAGATGACATTGGTCCGTATATGCAAAAACGTTGGCGCGAAACGTTTAGCCGTTTCGAACACGTCGATGACGTGCGCGGCGTTGGTATGGTCCAGGCATTTACCCTGGTGAAAAATAAAGCTAAACGCGAACTGTTTCCGGATTTCGGCGAAATTGGTACGCTGTGCCGTGACATCTTTTTCCGCAACAATCTGATTATGCGTGCGTGTGGTGATCACATTGTTAGCGCCCCGCCGCTGGTTATGACCCGCGCAGAAGTCGACGAAATGCTGGCCGTGGCGGAACGCTGCCTGGAAGAATTTGAACAGACCCTGAAAGCTCGTGGCCTGGCGATGGAATTTAAGAGGTCTAACTCTAACAACTAA
ADH氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：
MIIGVPKEIKNNENRVALTPGGVSQLISNGHRVLVETGAGLGSGFENEAYESAGAEIIADPKQVWDAEMVMKVKEPLPEEYVYFRKGLVLFTYLHLAAEPELAQALKDKGVTAIAYETVSEGRTLPLLTPMSEVAGRMAAQIGAQFLEKPKGGKGILLAGVPGVSRGKVTIIGGGVVGTNAAKMAVGLGADVTIIDLNADRLRQLDDIFGHQIKTLISNPVNIADAVAEADLLICAVLIPGAKAPTLVTEEMVKQMKPGSVIVDVAIDQGGIVETVDHITTHDQPTYEKHGVVHYAVANMPGAVPRTSTIALTNVTVPYALQIANKGAVKALADNTALRAGLNTANGHVTYEAVARDLGYEYVPAEKALQDESSVAGA*
GDH氨基酸序列(SEQ ID NO:3)：
MGYTDLKDKVVVITGGSTGLGRAMAVRFGQEEAKVVINYYNNEEEALDAKKEVEEAGGQAIIVQGDVTKEEDVVNLVQTAIKEFGTLDVMINNAGVENPVPSHELSLDNWNKVIDTNLTGAFLGSREAIKYFVENDIKGNVINMSSVHEMIPWPLFVHYAASKGGMKLMTETLALEYAPKGIRVNNIGPGAMNTPINAEKFADPEQRADVESMIPMGYIGKPEEVAAVAAFLASSQASYVTGITLFADGGMTKYPSFQAGRG*
FDH氨基酸序列(SEQ ID NO:4)：
MGKIVLVLYDAGKHAADEEKLYGCTENKLGIANWLKDQGHELITTSDKEGETSELDKHIPDADIIITTPFHPAYITKERLDKAKNLKLVVVAGVGSDHIDLDYINQTGKKISVLEVTGSNVVSVAEHVVMTMLVLVRNFVPAHEQIINHDWEVAAIAKDAYDIEGKTIATIGAGRIGYRVLERLLPFNPKELLYYDYQALPKEAEEKVGARRVENIEELVAQADIVTVNAPLHAGTKGLINKELLSKFKKGAWLVNTARGAICVAEDVAAALESGQLRGYGGDVWFPQPAPKDHPWRDMRNKYGAGNAMTPHYSGTTLDAQTRYAEGTKNILESFFTGKFDYRPQDIILLNGEYVTKAYGKHDKK*
TA2氨基酸序列(SEQ ID NO:5)：
MEFKRSNSNNKAWLKEHNTVHMMHPMQDPKALHEQRPLIIQSGKGVHITDVDGRRFIDCQGGLWCVNAGYGRREIIDAVTRQMEELAYYSLFPGSTNAPAIALSQKLTEVAAEEGMVKASFGLGGSDAVETALKIARQYWKLEGQPDKVKFVSLYNGYHGLNFGGMSACGGNAWKSSYEPLMPGFFQVESPHLYRNPFTNDPEELAEICAQILERQIEMQAPGTVAALIAEPIQGAGGVIVPPASYWPRLRQICDKYDILLIADEVITGLGRSGSLFGSRGWGVKPDIMCLAKGISSGYVPLSATLVNSRVARAWERDAGFTSVYMHGYTYSGHPVSCAAALAAIDIVLQENLAENARVVGDYFLEKLLILKDKHRAIGDVRGKGLMLAVELVKERATKEPFGPADAYPLAISEACVNNGVMIRTIVNKLIISPPLTFTTEHVDEVIEVLDRAFVANPW*
TA3氨基酸序列(SEQ ID NO:6)：
MNKPQSWEARAETYSLYGFTDMPSLHQRGTVVVTHGEGPYIVDVNGRRYLDANSGLWNMVAGFDHKGLIDAAKAQYERFPGYHAFFGRMSDQTVMLSEKLVEVSPFDSGRVFYTNSGSEANDTMVKMLWFLHAAEGKPQKRKILTRWNAYHGVTAVSASMTGKPYNSVFGLPLPGFVHLTCPHYWRYGEEGETEEQFVARLARELEETIQREGADTIAGFFAEPVMGAGGVIPPAKGYFQAILPILRKYDIPVISDEVICGFGRTGNTWGCVTYDFTPDAIISSKNLTAGFFPMGAVILGPELSKRLETAIEAIEEFPHGFTASGHPVGCAIALKAIDVVMNEGLAENVRRLAPRFEERLKHIAERPNIGEYRGIGFMWALEAVKDKASKTPFDGNLSVSERIANTCTDLGLICRPLGQSVVLCPPFILTEAQMDEMFDKLEKALDKVFAEVA*
TA4氨基酸序列(SEQ ID NO:7)：
MQTQDYQALDRAHHLHPFTDFKALGEEGSRVVTHAEGVYIHDSEGNRILDGMAGLWCVNLGYGRRELVEAATAQLEQLPYYNTFFKTTHPPAVRLAEKLCDLAPAHINRVFFTGSGSEANDTVLRMVRRYWALKGQPDKQWIIGRENAYHGSTLAGMSLGGMAPMHAQGGPCVPGIAHIRQPYWFGEGRDMSPEAFGQTCAEALEEKILELGEEKVAAFIAEPVQGAGGAIMPPESYWPAVKKVLAKYDILLVADEVICGFGRLGEWFGSQHYGLEPDLMPIAKGLSSGYLPIGGVLVGDRVAETLIEEGGEFFHGFTYSGHPTCAAVALKNLELLEAEGVVDRVRDDLGPYLAERWASLVDHPIVGEARSLGLMGALELVADKTTGQRFDKSLGAGNLCRDLCFANGLVMRSVGDTMIISPPLVIRREEIDELVELARRALDETARQLTQVPHTQEEPTA*
TA5氨基酸序列(SEQ ID NO:8)：
MATMQEIFKGFEERQAKLVEDGLKNPLAHGAALIEGQITPLLDAKIPVLDQGFLHSDLTYDVPAVWDGKLFRFNDHLDRLERSCAKLRLKPPMSRNEIEQATINLISKSGIRDAYVQIIVTRGFRFVREPLPTSDAPENHFIYILVMPYIWVMPPQMQPVGGEAVVTRTVRRIPPGAIDPTIKNLQWGDLIRGLLEAQDRGSQYPFLTDGDGNITEGAGYNIVFVKDGALYTAKKGVLEGITRQSVFDVAEKAKILVYLDDVPASLAYVADEIFLCTTAGGIMPITKLDGESKGEVGPITKLIWDGYWAMHYDPRYTTKISYEP*
TA6氨基酸序列(SEQ ID NO:9)：
MTAQPNSLEARDIRYHLHSYTDAVRLEAEGPLVIERGDGIYVEDVSGKRYIEAMSGLLSVGVGFSEPRLAEAAARQMKKLPFYHTFSYRSHGPVIDLAEKLVSMAPVPMSKAYFTNSGSEANDTVVKLIWYRSNALGEPERKKIISRKRGYHGVTIASASLTGLPNNHRSFDLPIDRILHTGCPHFYREGQAGESEEQFATRLADELEQLIIAEGPHTIAAFIGEPVMGAGGVVVPPKTYWEKVQAVLKRYDILLIADEVICGFGRTGNLFGSQTFDMKPDILVMSKQLSSSYLPISAFLINERVYAPIAEESHKIGTLGTGFTASGHPVAAAVALENLAIIEERDLVANARDRGTYMQKRLRELQDHPLVGEVRGVGLIAGVELVTDKQAKTGLEPTGALGAKANAVLQERGVISRAMGDTLAFCPPLIINDQQVDTMVSALEATLNDVQASLTR*
3、质粒及菌株构建
ES01(BL21(DE3)::pET28a-TA1+pET22b-ADH)的构建：
将TA1核苷酸序列引入到pET28a的多克隆位点内，以T7为启动子驱动TA1的表达，获得重组质粒pET28a-TA1。
将编码ADH的核苷酸引入到pET22b的多克隆位点内，以T7为启动子驱动ADH的表达，获得重组质粒pET22b-ADH。
将上述重组质粒pET28a-TA1和pET22b-ADH引入到感受态的BL21(DE3)中，获取重组菌株称为ES01，同时表达TA1和ADH。
基于基本相同的方法，建立ES02:(BL21(DE3)::pET28a-TA2)，ES03(BL21(DE3)::pET28a-TA3)，ES04(BL21(DE3)::pET28a-TA4)，ES05(BL21(DE3)::pET28a-TA5)，ES06(BL21(DE3)::pET28a-TA6)重组菌株。同时表达相应的TA以及ADH。
基于基本相同的方法，建立ES07(BL21(DE3)::pET28a-TA1-ADH)，其中TA1与ADH共用T7启动子。
基于基本相同的方法，建立ES08(BL21(DE3)::pET28a-TA1-ADH-FDH)，其中TA1与ADH、FDH共用T7启动子。
基于基本相同的方法，建立ES09(BL21(DE3)::pET28a-TA1-ADH-GDH)，其中TA1与ADH、GDH之间共用T7启动子。
基于基本相同的方法，建立ES10(BL21(DE3)::pET28a-TA1M2-ADH-GDH)，其中TA1M2与ADH、GDH共用T7启动子。
实施例1、初代菌株ES01构建，实现生物合成
构建初代菌株ES01(BL21(DE3)::pET28a-TA1)，并按照下列步骤获得细胞溶液：
(1)将平板上的菌落接种于LB+Kan(50mg/L)+Amp(100mg/L)试管37℃250rpm过夜培养；
(2)将试管内的菌液按照1％转接于50mL LB+Kan(50mg/L)+Amp(100mg/L)；
(3)37℃250rpm培养至OD＝0.6-0.8；
(4)加入IPTG(终浓度0.1mM)，在16℃，150rpm培养19h；
(5)4000rpm离心20min弃上清；
(6)重悬于pH＝6的缓冲液，定容至2mL，获得细胞溶液；
按照表1(序号1至序号6)加料进行反应，结果表明成功实现了2-HOBA的合成。
表1、打通合成路径原料配比
序号 1 2 3 4 5 6
水杨醛(Sal)(mM) 23.5 23.5 23.5 23.5 23.5 23.5
L-丙氨酸(Ala)(mM) 10 10 10 0 10 10
NAD(mM) 0.5 0 0.5 0.5 0.5 0
PLP(mM) 0.5 0.5 0 0.5 0.5 0.5
氯化铵(mM) 1 1 1 1 0 1
NADH(mM) 0 0 0 0 0 1
产量(mg/L) 162.02 462.96 447.57 304.07 236.67 511.97
2-HOBA产率 4％ 11％ 10％ 7％ 5％ 12％
实施例2、催化元件筛选
为提高催化效率，根据TA1结构，分析调研了几百条具有潜在功能的蛋白，从中筛选获得五种具有潜在催化活性的酶(TA2，SEQ ID NO:5；TA3，SEQ ID NO:6；TA4，SEQ ID NO:7；TA5，SEQ ID NO:8；TA6，SEQ ID NO:9)。
分别构建菌株ES02(BL21(DE3)::pET28a-TA2)，ES03(BL21(DE3)::pET28a-TA3)，ES04(BL21(DE3)::pET28a-TA4)，ES05(BL21(DE3)::pET28a-TA5)，ES06(BL21(DE3)::pET28a-TA6)。
按照下列步骤获得细胞溶液：
(1)将这些菌株接种于LB+Kan(50mg/L)培养基，过夜培养；
(2)将菌液按照1％转接到100mL LB+Kan(50mg/L)培养基，37℃培养3h；
(3)向培养基添加0.1mM IPTG，在16℃过夜诱导；
(4)在4000rpm 3min的条件下离心浓缩50倍；
(5)使用对应的PBS缓冲液重悬细胞，添加等量底物水杨醛(Sal)进行反应；
结果表明(表2)，TA1(SEQ ID NO:1)的催化活性最高，2-HOBA可获得最高的产率，用于后续突变体库构建。
表2、不同催化元件产量对比
酶名称 Sal(mM) 产量(mg/L) 2-HOBA产率
TA1 28.2 112.12 2.2％
TA2 28.2 32.91 0.6％
TA3 28.2 6.31 0.1％
TA4 28.2 0 0
TA5 28.2 4.75 0.1％
TA6 28.2 2.64 0.1％
空载体 28.2 0 0
实施例3、配料比例优化
为了提高原料利用率，构建菌株ES07(BL21(DE3)::pET28a-TA1-ADH)，如实施例2同样的方法步骤获得细胞溶液及浓缩，测试不同配料比下的产量(NADH和氯化铵均统一用1.8mM)，反应体系加料如表3中列举。
结果表明(表3)，提高投料量对提高产量有帮助，但是产率还是较低，因此发明人考虑进一步优化以提高催化效率。
表3、配料比例的优化
实施例4、高通量筛选工艺
为了对突变体文库进行快速鉴定，发明人进一步开发高通量筛选工艺：采用如实施例3的菌株ES07(BL21(DE3)::pET28a-TA1-ADH)，使用4HN(对硝基苯乙胺)作为氨基供体进行反应，根据反应液的颜色深浅判断产量高低。为了确认最终产物的生成，如实施例2同样的方法步骤制备细胞溶液、但使用不浓缩的发酵液进行过夜反应，反应体系加料如表4。
结果表明(表4)，显色的氨基供体能够完成反应，并且颜色的深浅能够体现出产量的高低，最终将条件2作为后续高通量筛选工艺的参考条件。
表4、高通量筛选工艺构建
条件 Sal(mM) 4HN(mM) PLP(mM) 产量(mg/L) 产率
条件1 28.1 44.1 3 6.03 0.12％
条件2 4.69 4.9 0.25 51.53 6.00％
条件3 7.04 22.05 0.19 18.31 1.42％
条件4 9.39 19.6 0.38 2.54 0.15％
实施例5、高产突变株的筛选
随机突变文库构建：利用GeneMorph II Random Mutagenesis Kit易错PCR试剂盒对野生型转氨酶编码基因TA1(SEQ ID NO:1)进行随机突变(PCR具体反应程序参照GeneMorph II Random Mutagenesis Kit)，同时通过高保真PCR扩增获得ADH(SEQ ID NO:2)的编码基因，然后用Vazyme ClonExpress IIOne Step Cloning Kit重组到pET28a载体中，转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中并涂布含Kan抗生素的LB固体平板，37℃孵育过夜。用牙签将孵育过夜的转化子挑至含有Kana抗生素的LB液体培养基96孔培养板中,37℃孵育12h后，以1％接种量转接至新的LB液体96孔板，添加IPTG至终浓度为0.1mM，16℃诱导19h。
随机突变文库的筛选：按照表4条件2向96孔板加入原料，在37℃培养12h。保留颜色较深的位置对应的菌株，保菌做进一步验证。该轮文库覆盖10000个转化子。
优选突变体的产量验证：从10000个转化子中，筛选得到6株较之野生型反应液颜色加深的菌株。使用TB培养基对这6株菌进行重新发酵，如实施例2同样的方法步骤获得细胞溶液及浓缩，用于反应。补全辅因子(表5)进行反应，最终确认了三个提高产量的位点TA1M1(L175G)、TA1M3(F89L)和TA1M9(F320L)。
表5、补全辅因子后对突变体测试酶活
实施例6、底物循环系统的构建
为了降低成本，避免昂贵辅因子的使用，在高产突变株中表达FDH或GDH，并且同时表达TA1突变体和ADH，构建出三基因表达系统，用于产物生产(图1)。
如实施例2同样的方法步骤获得细胞溶液及浓缩，用于反应。
酶催化反应统一添加40mM水杨醛，128mM L-丙氨酸(Ala)，0.6mM PLP，52mM甲酸铵(AMF，作为氨基供体)和60mM葡萄糖(Glu)。
结果表明(表6)，在表达底物循环系统后，引入点突变能够进一步提高产量，此时不必额外添加NADH或NADPH，产量可达2.1g/L。
表6、补全辅因子后对突变体测试酶活
酶名称 产量(mg/L) 产率
TA1&ADH,FDH 1738.5 24％
TA1M1(L175G)&ADH,FDH 1679.2 23％
TA1M3(F89L)&ADH,FDH 2059.8 28％
TA1&ADH,GDH 1713.8 23％
TA1M1(L175G)&ADH,GDH 2127.9 29％
TA1M3(F89L)&ADH,GDH 1908.9 26％
实施例7、进一步建库筛选
为了进一步提高产率，在现有高产突变体的基础上建立进一步建立突变体文库。以前述的优选突变体TA1M1为模板，利用GeneMorph II Random Mutagenesis Kit易错PCR试剂盒进行随机突变，其后续构建方法与第一轮随机突变文库构建方法无异。但是最终将高产菌株的突变位点直接引入底物循环系统，共表达TA1突变体、ADH和GDH，进行摇瓶复筛。如实施例2同样的方法步骤获得细胞溶液，用于反应。
结果表明，采用128mM L-丙氨酸(Ala)，0.6mM PLP，52mM甲酸铵(AMF，作为氨基供体)和60mM葡萄糖(Glu)，添加底物水杨醛(Sal)。不添加NADH或NADPH，新突变体能够转化更高浓度的底物，由此获得了更高的产量(表7)。
表7、将组合突变位点引入底物循环系统
酶名称 底物(g/L) 产量(mg/L) 产率
TA1M1(L175G)&ADH,GDH 8.5 5496.1 43％
TA1M1(L175G)&ADH,GDH 12.7 322.4 2％
TA1M1(L175G)&ADH,GDH 15.3 352.9 2％
TA1M2(L175GM56L)&ADH,GDH 8.5 5456.9 43％
TA1M2(L175GM56L)&ADH,GDH 12.7 6996.0 37％
TA1M2(L175GM56L)&ADH,GDH 15.3 3783.5 17％
TA1M4(L175GV42I)&ADH,GDH 8.5 4444.0 35％
TA1M4(L175GV42I)&ADH,GDH 12.7 6690.5 35％
TA1M4(L175GV42I)&ADH,GDH 15.3 1728.8 8％
TA1M5(L175GF284L)&ADH,GDH 8.5 4419.7 35％
TA1M5(L175GF284L)&ADH,GDH 12.7 4473.0 24％
TA1M5(L175GF284L)&ADH,GDH 15.3 1217.3 5％
表中，底物用量增加反而导致产量的下降，这是由于过多的底物Sal会对酶产生反馈抑制作用。
综上，突变体TA1M2(L175GM56L)，TA1M4(L175GV42I)，TA1M5(L175GF284L)可以显著地提高产量。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims (10)

1.一种制备水杨胺的方法，包括：
(1)重组表达转氨酶，丙酮酸脱氢酶；较佳地还表达葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶；
其中，所述转氨酶为突变型转氨酶，相对于野生型转氨酶，其发生选自下组的一或多个(包括二个)突变：L175G、M56L、V42I、F284L、F89L、F320L、P354Q或P243K；
(2)添加底物水杨醛，生成水杨胺。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中，仅添加底物水杨醛；或还包括添加氨基供体，辅因子和/或葡萄糖；较佳地，所述辅因子选自：磷酸吡哆醛、NAD、NADH、NADP或NADPH；
较佳地，各组分的量为：
水杨醛：2-16g/L，或2-60mM；
氨基供体：1-200mM；
葡萄糖：10-150mM；
磷酸吡哆醛：0.1-3mM；
NAD、NADH、NADP或NADPH：0.2-5mM；
较佳地，所述氨基供体包括选自：甲酸铵，L-丙氨酸，对硝基苯乙胺，氯化铵；
较佳地，所述底物、糖基供体、转氨酶、丙酮酸脱氢酶，及可选的辅因子、葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶在反应中形成底物循环系统。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述突变型转氨酶选自：L175G和M56L突变的转氨酶；L175G和V42I突变的转氨酶；L175G和F284L突变的转氨酶；F89L突变的转氨酶；L175G突变的转氨酶；F320L突变的转氨酶；P354Q突变的转氨酶；P243K突变的转氨酶；或
所述野生型转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；ADH的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；GDH氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；或FDH的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
4.一种突变型转氨酶，对应于野生型转氨酶的氨基酸序列，其发生选自下组的一或多个(包括二个)突变：L175G、M56L、V42I、F284L、F89L、F320L、P354Q或P243K。
5.如权利要求4所述的突变型转氨酶，其特征在于，所述突变型转氨酶选自：L175G和M56L突变的转氨酶；L175G和V42I突变的转氨酶；L175G和F284L突变的转氨酶；F89L突变的转氨酶；L175G突变的转氨酶；F320L突变的转氨酶；P354Q突变的转氨酶；P243K突变的转氨酶。
6.一种提高转氨酶的酶活性的方法，所述方法通过点突变进行，包括：将转氨酶进行突变改造，形成所述的突变型转氨酶；所述突变改造包括：L175G、M56L、V42I、F284L、F89L、F320L、P354Q或P243K。
7.一种多核苷酸、含有该多核苷酸的载体或遗传工程化的工程细胞，所述的多核苷酸编码权利要求4或5所述的突变型转氨酶；所述工程细胞中含有所述载体或其基因组中整合有所述的多核苷酸；
较佳地，所述工程细胞还包括表达丙酮酸脱氢酶的多核苷酸；更佳地还包括表达葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶的多核苷酸。
8.权利要求4或5所述的突变型转氨酶、表达该突变型转氨酶的工程细胞或其裂解产物在制备水杨胺中的应用；
较佳地，所述工程细胞表达丙酮酸脱氢酶；更佳地还表达葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶。
9.一种用于制备水杨胺的反应体系或试剂盒，其特征在于，其中含有权利要求4或5所述的突变型转氨酶、表达该突变型转氨酶的工程细胞或其裂解产物；较佳地，所述工程细胞还包括表达丙酮酸脱氢酶的多核苷酸；更佳地还包括表达葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶的多核苷酸。
10.如权利要求9所述的用于制备水杨胺的反应体系或试剂盒，其特征在于，其中还包括：底物水杨醛，氨基供体，及可选的辅因子和/或葡萄糖；较佳地，所辅因子选自：磷酸吡哆醛、NAD、NADH、NADP或NADPH；
较佳地，所述反应体系中，所述水杨醛或辅因子的量为：
水杨醛：2-16g/L，或2-60mM；
氨基供体：1-200mM；
葡萄糖：10-150mM；
磷酸吡哆醛：0.1-3mM；
NAD、NADH、NADP或NADPH：0.2-5mM；
较佳地，所述氨基供体包括选自：甲酸铵，L-丙氨酸，对硝基苯乙胺，氯化铵。
CN202410369856.XA 2024-03-28 2024-03-28 水杨胺的生物合成方法及体系 Pending CN118147245A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410369856.XA CN118147245A (zh) 2024-03-28 2024-03-28 水杨胺的生物合成方法及体系

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410369856.XA CN118147245A (zh) 2024-03-28 2024-03-28 水杨胺的生物合成方法及体系

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118147245A true CN118147245A (zh) 2024-06-07

Family

ID=91298317

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410369856.XA Pending CN118147245A (zh) 2024-03-28 2024-03-28 水杨胺的生物合成方法及体系

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN118147245A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3403412B2 (ja) 単一微生物による発酵性炭素源の１，３−プロパンジオールへの生物転化
CN113151127B (zh) 一种l-高丝氨酸生产菌株及其构建方法和应用
CN109777763B (zh) 一株用于l-茶氨酸生产的基因工程菌及其构建与应用
CN110373370B (zh) 一种耦合atp再生系统的催化体系及其在生产谷胱甘肽过程中的应用
CN110904018B (zh) 5-氨基乙酰丙酸生产菌株及其构建方法和应用
CN108463555A (zh) 生产苯甲醛的方法
WO2020099303A1 (en) Improved production of riboflavin
CN111808829B (zh) 一种γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体及其应用
CN117660277A (zh) 代谢工程改造大肠杆菌及其在发酵制备红景天苷中的应用
US20220049235A1 (en) Engineering Bacteria for Ferulic Acid Production, Preparation Method and Use Thereof
CN114667346A (zh) EanB酶突变体及其应用
US20240294866A1 (en) Recombinant strain with modified gene bbd29_04920 for producing l-glutamic acid, and method for constructing the same and use thereof
CN107287144B (zh) 一种代谢改造的枯草芽孢杆菌生物转化细胞及其制备方法与应用
JP2009142289A (ja) コバラミンを製造し得る生合成方法
CN113122563B (zh) 构建r-3-氨基丁酸生产菌的方法
CN118147245A (zh) 水杨胺的生物合成方法及体系
EP4230723A1 (en) Polypeptide with aspartate kinase activity and use thereof in production of amino acid
CN114958890B (zh) 构建稳定遗传的水杨酸生物合成的基因工程菌株的方法及其应用
KR102489243B1 (ko) S-메틸메티오닌 생산용 재조합 미생물 및 이를 이용한 s-메틸메티오닌의 제조방법
KR102253701B1 (ko) 하이브리드형 해당 경로
KR20200023450A (ko) 기능적 dna 서열의 안정화된 카피 수를 갖는 미생물 및 관련 방법
EP3978515A1 (en) Genetically modified methylobacillus bacteria having improving properties
WO2000008170A1 (fr) Gene participant a la production d'acide homoglutamique, et utilisation associee
CN116286761A (zh) 一种醛缩酶生物元件筛选方法的构建与应用
CN115873852A (zh) 重组核酸序列、基因工程菌及生产1,5-戊二胺的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination