JP3403412B2 - 単一微生物による発酵性炭素源の１，３−プロパンジオールへの生物転化 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は、単一微生物による発酵性炭素源の1,3−プ
ロパンジオールへの生物変換（bioconversion）に関す
る。

発明の技術背景 1,3−プロパンジオールは、ポリエステル繊維の製造
およびポリウレタンおよび環状化合物の製造における潜
在的用途を有するモノマーである。

1,3−プロパンジオールへの種々の化学的経路が知ら
れている。例えば、エチレンオキサイドは、ホスフィン
酸、水、一酸化炭素、水素および酸の存在下で触媒によ
って、アクロレインの触媒溶液相水和に続いて行われる
還元によって、あるいは、グリセロール等の炭化水素か
ら、一酸化炭素および水素の存在下で、周期表のVIII族
の原子を有する触媒によって反応させることによって1,
3−プロパンジオールへ変換することができる。1,3−プ
ロパンジオールはこれらの方法によって得ることが可能
であるものの、それらは費用がかかり、かつ、環境汚染
物質を含有する廃棄物流を生ずる。

一世紀も前から、1,3−プロパンジオールがグリセロ
ールの発酵から得られることが知られている。1,3−プ
ロパンジオールを産生可能な細菌株が、例えば、シトロ
バクター（Citrobacter）属、クトストリジウム（Clost
ridium）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、イ
リオバクター（Ilyobacter）属、クレプシエラ（Kleobs
iella）属、ラクトバシルス（Lactobacillus）属および
ペロバクター（Pelobacter）属において見出されてい
る。研究されている各ケースでは、グリセロールは２工
程の酵素触媒反応手順で1,3−プロパンジオールに変換
される。第１の工程では、デヒドラターゼ（dehydratas
e）が、グリセロールの、３−ヒドロキシルプロピオン
アルデヒド（３−HP）および水への変換（式１）を触媒
する。第２の工程では、３−HPが、NAD⁺連結オキシドレ
ダクターゼ（NAD⁺−linked oxidoreductase）によって
1,3−プロパンジオールへと還元される（式２）。

グリセロール→３−HP＋H₂O （式１） ３-HP+NADH+H⁺→1,3-プロパンジオール+NAD⁺ （式２） この1,3−プロパンジオールは、それ以上は代謝され
ず、その結果、高濃度で培地に蓄積する。反応全体とし
ては、補助因子（cofactor）の形態で還元当量の還元さ
れたβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD
H）が消費され、これは、酸化されてニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（NAD⁺）になる。

グリセロールからの1,3−プロパンジオールの製造
は、一般に、嫌気性条件下で、グリセロールを唯一の炭
素源として用いて、他の外来の還元当量受容体の不在下
で行われる。これらの条件下では、例えば、シトロバク
ター、クロストリジウムおよびクレプシエラの菌株にお
いて、グリセロールについての平行経路が働くが、この
経路には、まず最初に、NAD⁺（またはNADP⁺）結合グリ
セロールデヒドロゲナーゼにより、グリセロールをジヒ
ドロキシアセトン（DHA）へ酸化すること（式３）が包
含される。このDHAは、続いてDHAキナーゼによるジヒド
ロキシアセトンホスフェート（DHAP）へのリン酸化（式
４）を行うことによって、生合成に、そして、例えば、
解糖を経由するATP生成の支援に利用できる。この1,3−
プロパンジオール経路とは対照的に、本発明の経路は、
炭素およびエネルギーを細胞に付与し、かつNADHを消費
するのではなく、NADHを生成する。

グリセロール＋NAD⁺→DHA＋NADH＋H⁺ （式３） DHA＋ATP→DHAP＋ADP （式４） クレプシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumonia
e）およびシトロバクター・フロインディイ（Citrobact
er freundii）では、グリセロールデヒドラターゼ、1,3
−プロパンジオールオキシドレダクターゼ、グリセロー
ルデヒドロゲナーゼおよびジヒドロキシアセトンキナー
ゼの機能的に結合した活性（functionally linked acti
vities）をコードする遺伝子（それぞれ、順に、dhaB、
dhaT、dhaD、dhaK）は、dhaレギュロンによって包含さ
れる。シトロバクターおよびクレプシエラ由来のdhaレ
ギュロンは大腸菌（Escherichia coli）内で表現されて
おり、かつ、グリセロールを1,3−プロパンジオールへ
と変換することが示されている。

グリセロール製造のための生物学的方法は公知であ
る。圧倒的大多数のグリセロール産生者は酵母である
が、幾つかの細菌、他の真菌および藻類も知られてい
る。細菌および酵母はともに、グルコースまたは他の炭
水化物を、解糖におけるフルクトース−1,6−ビスホス
フェート経路によって、あるいはエムデン−マイヤーホ
フ−パルナス経路によって、グリセロールを産生する
が、一方、特定の藻類は、葉緑体内で、溶解した二酸化
炭素または重炭酸塩をカルビン回路の３−炭素中間体
（３−carbon intermediates）へと変換する。一連の工
程において、この３−炭素中間体であるホスホグリセリ
ン酸は、グリセルアルデヒド３−ホスフェートに変換さ
れ、これは、そのケト異性体であるジヒドロキシアセト
ンへ、そして最終的にはグリセロールへと容易に相互変
換することが可能である。グリセロールおよび1,3−プ
ロパンジオールを製造する生物学的方法はそれぞれ公知
であるが、全体のプロセスが単一の生物によって達成可
能であることは未だに証明されていない。

1,3−プロパンジオール製造のための上記の化学的方
法および生物学的方法のどちらも、工業的規模での製造
にはそれ程好適ではない。その理由は、化学的方法はエ
ネルギーを多く消費するものであり、生物学的方法は高
価な出発原料であるグリセロールを必要とするからであ
る。低エネルギーの投入および安価な出発原料しか必要
としない方法が必要とされている。さらに望ましい方法
は、炭水化物または糖などの基本的な炭素源を所望の1,
3−プロパンジオール最終生成物へと変換する能力を有
する微生物を取りいれたものであろう。

グリセロールまたはジヒドロキシアセトン以外の発酵
性炭素源を1,3−プロパンジオールへ単一生物を用いて
転化することが望ましいが、そのような試みには著しい
困難を克服しなければならないことが実証されている。
例えば、Gottschalkら（欧州特許第373230号）は、1,3
−プロパンジオール製造に有用な大部分の菌株、例え
ば、シトロバクター・フロインディイ（Citrobacter fr
eundii）、クロストリジウム・オートブチリカム（Clos
tridium autobutylicum）、クロストリジウム・ブチリ
カム（Clostridium butylcum）およびクレプシエラ・ニ
ューモニエ（Klebsiella pneumoniae）の増殖が、フル
クトースやグルコース等の水素供与体の存在によって阻
害されることを教示している。ラクトバシルス・ブレビ
ス（Lactobacillus brevis）およびラクトバシルス・ブ
フナー（Lactobacillus buchner）の菌株は、グリセロ
ールとフルクトースまたはグルコースとの共発酵（co−
fermentations）において1,3−プロパンジオールを生産
するが、グリセロールが唯一の炭素源として供給された
場合には増殖せず、かつ、休止細胞はグルコースまたは
フルクトースを代謝できることがわかっているけれど
も、それらは1,3−プロパンジオールを産生しない（Vie
ga DA Cunhaら、J.Bacteriol.174,1013,（1992））。同
様に、イリオバクター・ポリトロパス（Ilyobacter pol
ytropus）の菌株は、グリセロールおよびアセテートが
供給された場合には1,3−プロパンジオールを産生する
が、グリセロール以外の炭素基質（フルクトースおよび
グルコースを含む）からは1,3−プロパンジオールを産
生しない（Steibら、Arch.Microbiol.140,139（198
4））。最後に、Tongら（Appl.Biochem.Biotech.34,149
（1992））は、グリセロールデヒドラターゼをコードす
るdhaレギュロンで形質転換された組換え大腸菌が、外
来性グリセロール不在下ではグルコースからもキシロー
スからも1,3−プロパンジオールを産生しないことを教
示している。

グリセロールからの1,3−プロパンジオールの収率も
改善するための試みが報告されており、そこにおいて、
還元当量を提供することが可能な補助基質（co−substr
ates）、典型的には発酵性糖類、がその方法に含まれ
る。収率の改善は、グリセロールとグルコースとを共発
酵する（co−fermenting）シトロバクター・フロインデ
ィイおよびクレプシエラ・ニューモニエDSM4270の休止
細胞について権利請求されている（Gottschalkら、前
出；およびTran−Dinhら、独国特許第3734764号）。し
かし、権利請求されているのはグリセロールとグルコー
スとを共発酵するクレプシエラ・ニューモニエATCC2595
5の増殖細胞についてではなく、それらは、1,3−プロパ
ンジオールを全く産生しない（Ｉ−T.Tong,Ph.D.Thesi
s,University of Wisconsin−Medison（1992））。高い
収率は、組換え大腸菌によるグリセロールとグルコース
またはフラクトースとの共発酵について報告されてい
る。しかし、1,3−プロパンジオールは、グリセロール
の不在下では全く産生されない（Tongら、前出）。これ
らの系において、単一の生物は、NADH生成源として炭水
化物を用いるが、細胞の維持または増殖のためのエネル
ギーおよび炭素を供給しながらである。これらの開示
は、糖類が、1,3−プロパンジオールを生成する炭素の
流れに入らないことを示唆する。いずれの場合もグリセ
ロールの外来性供給源の不在下においては、決して1,3
−プロパンジオールは産生されない。したがって、文献
の重要性から、明らかに、単一の生物による1,3−プロ
パンジオールの炭水化物源からの産生が不可能であるこ
とが示唆される。

本発明により解決すべき問題は、単一の生物によるグ
ルコースまたは他の糖類のような安価な炭素基質からの
1,3−プロパンジオールの生物学的産生である。この1,3
−プロパンジオールの生物学的産生は、グリセロール
を、２工程の連続反応のための基質として必要とし、そ
の反応において、デヒドラターゼ酵素（典型的には補助
酵素B₁₂依存性デヒドラターゼ）が、グリセロールを中
間体である３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドへと変
換し、さらにNADH（またはNADPH）依存性オキシドレダ
クターゼによって1,3−プロパンジオールへと還元され
る。補助因子の要件が複雑なので、1,3−プロパンジオ
ール製造のための本発明の反応手順を用いる工業的方法
では全細胞触媒（whole cell catalyst）を用いること
が必要となる。さらに、この方法を経済的に採算が合う
ようにするために、グリセロールやヒドロキシアセトン
よりも安価な原料が必要となる。グルコースおよび他の
炭水化物は好適な基質であるが、上述のように、1,3−
プロパンジオールの産生を阻害することがわかってい
る。その結果、単一の生物では、グルコースを1,3−プ
ロパンジオールへ変換しないことが示されていた。

本出願人は、上述の問題を解決し、本発明は、単一の
生物を用いて、発酵性炭素源を1,3−プロパンジオール
へ直接的に生物変換することを提供する。グルコース
は、モデル基質として用いられ、この生物変換は、あら
ゆる既存の微生物に適用可能である。デヒドラターゼに
対する遺伝子を有する微生物は、グルコースおよび他の
糖類を、グリセロール分解経路を経て、1,3−プロパン
ジオールへ、良好な収率および選択性で変換することが
できる。さらに、本発明は、１）グリセロール、２）ジ
ヒドロキシアセトン、または３）グリセロールの酸化状
態にあるC₃化合物（例えば、グリセロール３−ホスフェ
ート）または）ジヒドロキシアセトンの酸化状態にある
C₃化合物（例えば、ジヒドロキシアセトンホスフェート
またはグリセロアルデヒド３−ホスフェート）に容易に
変換されるあらゆる炭素基質に広く適用することができ
る。

発明の要旨 本発明は、デヒドラターゼ酵素を表現可能な遺伝子を
少なくとも１種有する単一な微生物による、炭素基質の
1,3−プロパンジオールへの生物変換方法であって、前
記微生物を前記基質と接触させる工程による生物変換方
法を包含する。この微生物は、野生型であってもよく、
あるいは遺伝的に改変されていてもよく、例えば、組換
え微生物または微生物の突然変異体が挙げられる。好ま
しくは、上記デヒドラターゼ酵素は、グリセロールデヒ
ドラターゼ酵素またはジオールデヒドラターゼ酵素であ
る。

本発明は、さらに、上記方法の生産物を包含する。

本発明は、さらに、クレプシエラ・ニューモニエから
単離された約35kbのDNA断片を含有するコスミドであっ
て、前記断片が、図１の第１および第２カラムの制限消
化を有する活性グリセロールデヒドラターゼ酵素をコー
ドしていることを特徴とするコスミドを包含する。この
コスミドは、微生物に伝達されると、炭素基質、特に、
グルコース、の1,3−プロパンジオールへの代謝を可能
にする。

本発明は、さらに、宿主微生物と、上記コスミドまた
はグリセロールデヒドラターゼ酵素以外の活性機能性タ
ンパク質をコードする上記コスミドのDNA断片とを含有
する形質転換された微生物を包含する。

本発明は、さらに、好適な条件下で、グリセロール
を、デヒドラターゼ酵素を発現可能な遺伝子を少なくと
も１種有する単一の微生物と接触させる工程を具える、
1,3−プロパンジオールを製造するための生物変換方法
であって、上記微生物が、アスペルギルス（Aspergillu
s）属、サッカロミセス（Saccharomyces）属、ジゴサッ
カロミセス（Zygosaccharomyces）属、ピヒア（Pichi
a）属、クリベロミセス（Kluyveromyces）属、カンジダ
（Candida）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、デバリオ
ミセス（Debaryomyces）属、ムーコル（Mucor）属、ト
ルロプシス（Torulopsis）属、メチロバクター（Methyl
obacter）属、サルモネラ（Salmonella）属、バシルス
（Bacillus）属、ストレプトミセス（Streptomyces）
属、およびシュードモナス（Pseudomonas）属からなる
群から選ばれることを特徴とする方法を包含する。

本発明は、さらに、好適な条件下で、炭素基質を、デ
ヒドラターゼ酵素を表現可能な遺伝子を少なくとも１種
有する単一の微生物と接触させる工程を具える、1,3−
プロパンジオール製造のための生物変換方法であって、
上記遺伝子がグリセロールデヒドラターゼをコードし、
かつクレプシエラ属、ラクトバシルス属、エンテロバク
ター属、シトロバクター属、ペロバクター属、イリオバ
クター属、およびクロストリジウム属からなる群から単
離されることを特徴とする方法を包含する。

本発明は、さらに、適当な条件下で、炭素基質を、デ
ヒドラターゼ酵素を表現可能な遺伝子を少なくとも１種
有する単一の微生物と接触させる工程を具える。1,3−
プロパンジオール製造のための生物変換方法であって、
上記遺伝子が、グリセロールデヒドラターゼをコード
し、かつクレプシエラ属およびサルモネラ属からなる群
から単離されることを特徴とする方法を包含する。

好ましい宿主微生物は、シトロバクター属、エンテロ
バクター属、クロストリジウム属、クレプシエラ属、エ
ロバクター（Aerobacter）属、ラクトバシルス属、アス
ペルギルス属、サッカロミセス属、ジゴサッカロミセス
属、ピヒア属、クリベロミセス属、カンジダ属、ハンゼ
ヌラ属、デバリオミセス属、ムーコル属、トルロプシス
属、メチロバクター属、エシェリキア（Escherichia）
属、サルモネラ属、バシルス属、ストレプトミセス属お
よびシュードモナス属からなる群から選ばれる。

本発明を具体化する組換え微生物は、「生物学的寄託
の簡単な説明」で述べる。

図面の簡単な説明 図１は、それぞれカラム１、２および４として標識し
たコスミドpkP1、pKP2およびpKP4の制限消化（EcoR I、
BamH I、EcoR VおよびNot I）および0.8％アガロースゲ
ル電気泳動での分離を示す。分子サイズマーカーは、最
後のレーンに装荷した。１および２として標識したカラ
ムは、グリセロールデヒドラターゼ酵素を含有するコス
ミドを表わす。

図２は、pKP1の部分的な物理的地図およびDNA配列に
基づく遺伝子の位置を示す。遺伝子は、ウイスコンシン
大学の塩基配列分析ソフトウエアにより提供されるTfas
taプログラム［Genetics Computer Group,Version 7,Ap
ril,1991,575,Science Device、Madison,WI53711］を用
いて、推定したオープン・リーディング・フレームを、
ジーンバンク（Genbank）のデータベースと比較するこ
とによって同定した。

生物学的寄託および配列表の簡単な説明 グリセロールデヒドラターゼ酵素をコードするクレプ
シエラゲノムの一部を含有するコスミドpKP1を含有する
形質転換した大腸菌DH5αは、ブダペスト条約に基づき1
995年４月18日付でATCCに寄託し、ATCC69789に指定され
た。ジオールデヒドラターゼ酵素をコードするクレプシ
エラのゲノムの一部を含有するコスミドpKP4を含有する
形質転換した大腸菌DH5αは、ブタペスト条約に基づき1
995年４月18日付でATCCに寄託し、ATCC69790に指定され
た。緑膿菌［シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomo
nas aeruginosa）］株PAO2845:pDT9（dhaBオペロンを含
有するプラスミドで形質転換されている）は、ブダペス
ト条約に基づき1996年４月11日付でATCCに寄託し、ATCC
55760に指定された。ピヒア・パストリス（Pichia past
oris）株MSP42.81（dhaB1、dhaB2、dhaB3およびdhaT遺
伝子のための表現カセットを含有する非複製性プラスミ
ドで形質転換されている）は、ブダペスト条約に基づき
1996年４月11日付でATCCに寄託し、ATCC74363に指定さ
れた。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces ce
revisiae）株pMCK1/10/17（HM）＃Ａ（dhaB1、dhaB2、d
haB3およびdhaTオペロンを含有するプラスミドで形質転
換されている）は、本国際出願の提出前に、1996年５月
９日付でブダペスト条約に基づきATCCに寄託し、ATCC74
370に指定された。ストレプトミセス・リビダンス（Str
eptomyces lividans）株SL/14.2（dhaB1、dhaB2、dhaB3
およびdhaTオペロンを含有するプラスミドで形質転換さ
れている）は、本国際出願の提出前に、1996年５月９日
付でブダペスト条約に基づきATCCに寄託し、ATCC98052
に指定された。バシルス・リヘニフォルミス（Bacillus
licheniformis）株BG188/pM26（クローン＃８）（dhaB
1、dhaB2、およびdhaB3オペロンを含有するプラスミド
で形質転換されている）は、本国際出願の提出前に、19
96年５月９日付でブダペスト条約に基づきATCCに寄託
し、ATCC98051に指定された。枯草菌［バシルス・サチ
リス（Bacillus subtilis）］株BG2864/pM27（クローン
＃１）（dhaB1、dhaB2、dhaB3およびdhaTオペロンを含
有するプラスミドで形質転換されている）は、本国際出
願の提出前に、1996年５月９日付でブダペスト条約に基
づきATCCに寄託し、ATCC98050に指定された。アスペル
ギルス・ニガー（Aspergillus niger）株TGR40−13（dh
aB1、dhaB2、dhaB3およびdhaTオペロンを含有するプラ
スミドで形質転換されている）は、本国際出願の提出前
に、1996年５月９日付でブダペスト条約に基づきATCCに
寄託し、ATCC74369に指定された。「ATCC」とは、国際
寄託機関である「アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（American Type Culture Collection）」
（所在地:12301 Parklawn Drive,Rockvile,MD 20852 U.
S.A.）をいう。「指定（desingations）」とは、寄託物
質の受託番号をいう。

本出願人は、「特許出願におけるヌクレオチドおよび
アミノ酸配列の標準表記のための規則（Rules for the
Standard Representation of Nucleotide and Amino Ac
id Sequences in Patent Applications）」（「EPO長官
の決定（Decision of the President of the EPO）」の
別冊ＩおよびII）、および37C.F.R.1.821−1.825と追補
ＡおよびＢ（「ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配
列を含有する出願開示の要件（Requirements for Appli
cation Disclosures Containing Nucleotides and/or A
mino Acid Sequences）」）に従って46種の配列を提供
している。

発明の詳細な説明 本発明は、単一微生物における、1,3−プロパンジオ
ールの、発酵性炭素源からの生物学的製造方法を提供す
る。この方法は、炭素源と接触させるデヒドラターゼ酵
素含有微生物を組み入れ、1,3−プロパンジオールは、
増殖培地から単離される。この単一の微生物は、野生型
であってもよく、あるいは、デヒドラターゼ酵素をコー
ドする遺伝子を含有する遺伝的に改変された生物であっ
てもよい。

本発明は、ポリエステルおよび他のポリマーの製造に
有用な1,3−プロパンジオールモノマーの、迅速で、安
価で、かつ環境問題に責任を果たせる供給源を提供す
る。

ここで用いられているように、請求の範囲および明細
書を説明するために、以下の用語を用いてもよい。

ここで用いられているように、「核酸」という用語
は、一本鎖または二本鎖であってもよく、糖と、リン酸
と、プリンまたはピリミジンとを含有するモノマー（ヌ
クレオチド）からなる大きな分子をいう。「核酸断片」
という用語は、特定の核酸分子の断片である。高等植物
では、デオキシリボ核酸（DNA）が遺伝物質であり、一
方、リボ核酸（RNA）がDNA中の情報のタンパク質への伝
達に関与している。「ゲノム」は、生物の各細胞に含有
される遺伝物質の全体である。「ヌクレオチド配列」と
いう用語は、一本鎖または二本鎖であってもよく、DNA
またはRNAへの組み込みが可能な合成、非天然または改
変ヌクレオチド塩基を場合によっては含有するDNAまた
はRNAのポリマーをいう。

ここで用いられるように、「本質的に類似する」と
は、コードされたアミノ酸における変化をもたらさない
塩基の変化を含んでいてもよいDNA配列、あるいは、１
個以上のアミノ酸を改変してもよいが、そのDNA配列に
よってコードされるタンパク質の機能的特性に影響を及
ぼさない塩基の変化を含むDNA配列をいう。したがっ
て、本発明は、具体的に例示した配列以上のものを包含
すると理解される。表面に現れない変化（得られるタン
パク質分子の機能的特性に実質的に影響を及ぼさない変
化）を生ずる配列の修飾（例えば、配列における欠失、
挿入、または置換）も考慮される。例えば、遺伝子コー
ドの縮退を反映する、あるいは最終的には特定の部位で
化学的に同等のアミノ酸を産生する遺伝子配列における
改変が考慮される。したがって、アミノ酸のアラニン
（疎水性アミノ酸）に対するコドンは、別のより疎水性
の弱い残基（例えば、グリシン）またはより疎水性が強
い残基（例えば、パリン、ロイシンまたはイソロイシ
ン）をコードするコドンで置換してもよい。同様に、１
個の負に帯電した残基の他の残基への置換（例えば、ア
スパラギン酸からグルタミン酸への置換）、または１個
の正に帯電した残基の他の残基への置換（例えば、リジ
ンのアルギニンへの置換）をもたらす変化により、生物
学的に同等の生成物が産生されることが予想できるであ
ろう。タンパク質分子のＮ末端およびＣ末端部分の改変
をもたらすヌクレオチドを変化させても、タンパク質の
活性が変わらないことも予想できるであろう。幾つかの
場合では、事実、タンパク質の生物学的活性に対する改
変の効果を研究するために、配列の突然変異体をつくる
ことが望ましいかもしれない。提案された修飾の各々
は、十分に当業者の慣例手順の範囲内であり、例えば、
コードされた生成物において生物学的活性が保持されて
いるか否かを測定することなどが挙げられる。さらに、
当業者であれば、本発明に包含される「本質的に同様
の」配列は、緊縮（ストリンジェント）条件下（0.1xSS
C、0.1％SDS、65℃）で、ここにおいて例示した配列と
ハイブリッド形成する能力によっても定義されることが
わかる。

「遺伝子」とは、コード領域の前方（５′をコードし
ない）および後方（３′をコードしない）の調節配列を
含む、特定のタンパク質を表現する核酸断片をいう。
「生の（native）」あるいは「野生型の」遺伝子とは、
それ自身の調節配列を有する、天然に見出される遺伝子
をいう。

「遺伝的に改変された」または「遺伝的に改変された
微生物」という用語は、本発明における使用に適したあ
らゆる微生物であり、これは、該微生物の天然の遺伝的
機構の改変を受けているものである。微生物は、異種の
核酸断片を含有するベクターによる形質転換、突然変異
誘発剤（例えば、UV光、エタンスルホン酸）による突然
変異誘発、または細胞ゲノムの安定な改変をもたらす他
の方法によって、遺伝的に改変されてもよい。

「構築」という用語は、あらゆる供給源に由来するプ
ラスミド、ウイルス、自律複製配列、ゲノム組込み配
列、ファージまたはヌクレオチド配列、直鎖状または環
状の、一本鎖または二本鎖DNAまたはRNAであって、幾つ
かのヌクレオチド配列が、選択した遺伝子生産物のため
のプロモーター断片およびDNA配列を適当な3'非翻訳配
列と一緒に細胞に導入できる独特の構造に結合または組
換えられている。

「形質転換」または「トランスフェクション」という
用語は、核酸の取込み後の細胞における新たな遺伝子の
獲得をいう。獲得した遺伝子は、染色体DNAに組み込ま
れるか、あるいは、染色体複製配列として導入されても
よい。「形質転換体」とは、形質転換の生成物をいう。
「遺伝的に改変される」とは、形質転換または突然変異
によって遺伝的物質を変化させる工程をいう。

「表現」という用語は、遺伝子生成物の配列をコード
する遺伝子から該遺伝子生成物への転写および翻訳をい
う。

ここで用いられるような「プラスミド」または「ベク
ター」または「コスミド」とは、細胞の中心的代謝の一
部ではなく、かつ通常は環状の二本鎖DNA分子の形態で
ある、遺伝子をしばしば担持する染色体外のエレメント
をいう。

「デヒドラターゼ酵素」という用語は、グリセロール
分子を生成物である３−ヒドロキシプロピオンアルデヒ
ドへと異性化または転化することが可能なあらゆる酵素
をいう。本発明の目的では、このデヒドラターゼ酵素と
しては、それぞれグリセロールおよび1,2−プロパンジ
オールを好ましい基質とするグリセロールデヒドラター
ゼおよびジオールデヒドラターゼが挙げられる。

「炭素基質」または「炭素源」という用語は、微生物
によって代謝され得るあらゆる炭素供給源であって、少
なくとも１個の炭素原子を含有し、グリセロールまたは
ジヒドロキシアセトン以外のものを意味する。

組換え生物の構築 炭素基質を1,3−プロパンジオールに転化するための
酵素的経路をコードする必要な遺伝子を含有する組換え
生物は、当業界で周知の技術を用いて構築することがで
きる。本発明では、デヒドラターゼ酵素をコードする遺
伝子は、クレプシエラ等の天然のままの宿主から単離
し、これを用いて、大腸菌宿主株DH5α、ECL707およびA
A200を形質転換した。

所望の遺伝子を細菌ゲノムから得る方法は、分子生物
学の業界では周知慣用である。例えば、遺伝子の配列が
既知の場合、制限エンドヌクレアーゼ消化によって適当
なゲノムライブラリーを作成してもよく、所望の遺伝子
配列に相補的なプローブを用いてスクリーニングしても
よい。いったん配列を単離したら、ポリメラーゼ・チェ
ーン反応（PCR）（米国特許第4,683,202号）のような標
準プライマー誘導増幅方法を用いてDNAを増幅して、適
当なベクターを用いた形質転換に適した量のDNAを得て
もよい。

あるいはまた、ゲノムDNAの大きなセグメント（34〜4
5kb）がベクターにパッケージされていてもよいコスミ
ドライブラリーを作成して、適当な宿主を形質転換して
もよい。コスミドベクターは、大量のDNAを収容可能で
ある点において独特である。一般に、コスミドベクター
はcosDNA配列の少なくとも１個のコピーを有し、これ
は、外来DNAのパッケージングおよび続いて行われる環
化に必要である。このcos配列に加えて、これらのベク
ターは、複製起点（例えば、ColEl）および薬剤耐性マ
ーカー（例えば、アンピシリンまたはネオマイシン耐性
遺伝子）も含有する。好適な細菌宿主の形質転換のため
のコスミドベクターを用いる方法は、Sambrook,JらのMo
lecular Cloning:A Laboratory Manual.Second Edition
（1989）,Cold Spring Harbor Laboratory Pressに十分
に記載されており、引用することにより本明細書の一部
を構成するものとする。

クローンコスミドに典型的に行われているように、外
来DNAを単離し、適当な制限エンドヌクレアーゼを用い
てコスミドベクターのcos領域に隣接して連結する。直
鎖状にした外来DNAを含有するコスミドベクターは、次
に、バクテリオファージλ等のDNAパッケージングビヒ
クルと反応させる。このパッケージング工程を行う際
に、cos部位を切り出し、外来DNAを細菌ウイルス粒子の
頭部にパッケージする。次いで、これらの粒子を用い
て、大腸菌等の適当な宿主細胞をトランスフェクトす
る。この外来DNAは、いったん細胞に注入されると、cos
付着末端の影響で環化する。このようにして、外来DNA
の大きなセグメントを組換え宿主細胞に導入し発現する
ことができる。

コスミドベクターおよびコスミド・形質転換方法は、
本発明の文脈の範囲内で用いて、グリセロールを1,3−
プロパンジオールへと加工することができる遺伝子を有
することが知られている細菌の属由来のゲノムDNAの大
きなセグメントをクローニングした。具体的には、K.ニ
ューモニエ由来のゲノムDNAを当業界で周知の方法によ
り単離して、コスミドベクターSupercosl（商標）へ挿
入するための制限酵素Sau3Aで消化して、Gigapack IIパ
ッケージング抽出物を用いてパッケージングした。ベク
ターを構築した後、大腸菌XL1−BlueMR細胞をコスミドD
NAで形質転換した。グリセロールを1,3−プロパンジオ
ールに転化する能力について、形質転換体を、グリセロ
ールの存在下で細胞を増殖し、そして1,3−プロパンジ
オールが形成されているか否か培地を分析することによ
ってスクリーニングした。

1,3−プロパンジオール陽性形質転換体のうち２つを
分析し、これらのコスミドをpKP1およびpKP2と命名し
た。DNA配列決定により、C.フロインディイ由来のグリ
セロールデヒドラターゼ遺伝子に対する広範囲の相同性
が判明し、これらの形質転換体がグリセロールデヒドラ
ターゼ遺伝子をコードするDNA含有することが証明され
た。他の1,3−プロパンジオール陽性形質転換体を分析
し、これらのコスミドをpKP4およびpKP5と命名した。DN
A配列決定により、これらのコスミドがジオールデヒド
ラターゼ遺伝子をコードするDNA担持することが判明し
た。

本発明はクレプシエラのコスミド内から単離した遺伝
子を用いたが、別のデヒドララーゼ遺伝子の供給源とし
ては、シトロバクター、クロストリジウムおよびサルモ
ネラが挙げられる。しかし、これらに限定されるもので
はない。

1,3−プロパンジオールの生産に正の影響を与える他
の遺伝子を適当な宿主内で表現させてもよい。例えば、
特定の酵素を、グリセロール分解経路および／または他
の経路において、野生型細胞において現在わかっている
レベルよりもはるかに高いレベルで過剰表現させること
は非常に望ましい。これらは、それらの酵素をコードす
る遺伝子を多コピープラスミドに選択的クローニングす
ることにより、あるいはそれらの遺伝子を強力に誘導性
または構成性プロモーター下に配置することにより達成
することができる。所望のタンパク質の過剰発現の方法
は分子生物学の業界では周知慣用であり、例としては前
出のSambrookに見出すことができる。さらに、当業者に
公知の方法により或る遺伝子の特異的欠失は、1,3−プ
ロパンジオールの産生に正の影響を与える。かかる方法
の例は、Enzymology,Volume 217,R.Wu editor,Academic
Press:San Diego（1993）の方法に見出すことができ
る。

突然変異体 例示の細胞に加えて、本発明の方法は、特に1,3−プ
ロパンジオールの産生を強化するように設計された単一
または複数の突然変異を有する細胞を用いることができ
ると考えられる。通常は炭素原料を非生産性経路に流用
する細胞、または著しい異化代謝産物抑制を示す細胞
は、突然変異させて、これらの表現型の欠陥を回避して
もよいであろう。例えば、多くの野生型細胞は、培地中
のグルコースおよび副生物からの異化代謝産物抑制に供
され、グルコース抑制に耐性である1,3−プロパンジオ
ール産生能力をもつこれらの野生型生物の突然変異株
が、本発明においては特に有用であると考えられる。

突然変異株を作製する方法は当業界では周知慣用であ
る。例えば、野生型細胞を放射線または化学的突然変異
誘発剤等の種々の作用因子に曝し、所望の表現型をスク
リーニングしてもよい。放射線によって突然変異を起こ
す場合、紫外線（UV）またはイオン化放射線が用いられ
る。遺伝子突然変異に適した短いUV波長は、200nm〜300
nmの範囲であり、254nmが好ましい。この波長でのUV照
射は主に、核酸配列内での、グアニジンおよびシトシン
からアデニンおよびチミジンへの変化をもたらす。細胞
は、全てたいていのUV誘発突然変異を修復するDNA修復
機構を有するので、カフェインおよび他の阻害剤などの
薬剤を添加して、この修復プロセスを阻止し、有効な突
然変異の数を最大にしてもよい。300nm〜400nmの範囲の
光を用いた長波長UVによる突然変異も可能であるが、DN
Aと相互作用するプソラレン（psoralen）染料等の種々
の活性化剤と共に用いない場合には、一般に短波長のUV
光の場合程には効果的ではない。

化学薬剤による突然変異誘発も、突然変異株を得るの
に有効であり、一般に用いられる物質としては、フレー
ムシフト変異をもたらすことで著名な複製していないDN
Aに影響を及ぼす薬剤（例えば、HNO₂およびNH₂OH）、お
よび複製しているDNAに影響を及ぼす薬剤（例えば、ア
クリジン染料）が挙げられる。放射線照射または化学薬
剤を用いて突然変異を起こす具体的な方法は、当業界で
は十分な資料により実証されている。例えば、Thomas
D.BrockのBiotechnology:A Textbook of Industrial Mi
crobiology,Second Edition（1989）Sinauer Associate
s,Inc.,Sunderland,MA.,またはDeshpande,Mukund V.,Ap
pl.Biochem.Biotechnol.,36,227,（1992）を参照された
い。これらは引用することにより、本明細書の一部を構
成するものとする。

突然変異誘発が起きた後、所望の表現型を有する突然
変異体は、種々の方法によって選択することができる。
ランダム・スクリーニングは最も一般的であり、そこで
は、突然変異誘発された細胞は、所望の生成物または中
間体を産生する能力について選択される。あるいはま
た、突然変異体の選択的単離は、突然変異誘発した母集
団を耐性コロニーのみが発育することができる選択培地
上で増殖することによって行うことができる。突然変異
体の選択方法は、高度に発達しており、微生物工業界で
は周知である。前出のBrock、DeMancilhaら、Food Che
m.,14,313,（1984）を参照されたい。

1,3−プロパンジオール生成経路における突然変異およ
び形質転換 制限酵素経路:1,3−プロパンジオールのグルコースから
の生産は、以下の一連の工程によって達成できる。この
一連の工程は、当業者にとって公知である幾つかの経路
の代表的なものである。グルコースは、一連の工程にお
いて、解糖経路の酵素によって、デヒドロアセトンホス
フェート（DHAP）および３−ホスホログリセロアルデヒ
ド（３−PG）へと転化される。次いで、グリセロールが
形成されるが、これはDHAPを加水分解してジヒドロキシ
アセトン（DHA）とし、続いて還元するか、あるいは、D
HAPを還元してグリセロール３−ホスフェート（G3P）と
して、続いて加水分解することにより行われる。この加
水分解工程は、基質に関しては非特異性であることが知
られている幾つかの細胞性ホスファターゼによって触媒
されてもよく、あるいは、この活性を組換えによって宿
主に導入してもよい。上記還元工程は、NAD⁺（またはNA
DP⁺）結合宿主酵素によって触媒されてもよく、あるい
は、この活性を組換えによって宿主に導入してもよい。
dhaレギュロンが、式３の可逆反応を触媒するグリセロ
ールデヒドロゲナーゼ（E.C.1.1.1.6）を含有すること
には注目に値する。

グリセロール→３−HP＋H₂O （式１） ３-HP+NADH+H⁺→1,3-プロパンジオール+NAD⁺ （式２） グリセロール＋NAD⁺→DHA＋NADH＋H⁺ （式３） 上記で詳細に証明したように、グリセロールは、中間体
である３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−HP）
を経て1,3−プロパンジオールへと転化される。中間体
３−HPは、宿主によってコードされうる、あるいは組換
えによって宿主に導入されうるデヒドラターゼ酵素によ
ってグリセロールから製造される（式１）。このデヒド
ラターゼは、グリセロールデヒドラターゼ（E.C.4.2.1.
30）、ジオールデヒドラターゼ（E.C.4.2.1.28）、ある
いはこの形質転換を触媒することができるいずれの酵素
であってもよい。グリセロールデヒドラターゼ（ジオー
ルデヒドラターゼではない）は、dhaレギュロンによっ
てコードされる。1,3−プロパンジオールは、NAD⁺（ま
たはNADH⁺）結合宿主酵素によって、３−HPから製造さ
れる（式２）か、あるいはこの活性は組換えによって宿
主に導入することができる。1,3−プロパンジオールの
製造におけるこの最後の反応は、1,3−プロパンジオー
ルデヒドラターゼ（E.C.1.1.1.202）または他のアルコ
ールデヒドロゲナーゼによって触媒することができる。

炭素チャネリングに影響を及ぼす突然変異および形質転
換:1,3−プロパンジオール生成経路に変異（variation
s）を含む種々の突然変異生物が本発明では有用であ
る。例えば、トリオースリン酸イソメラーゼ突然変異
（tpi−）を本発明の微生物に導入することは、突然変
異を用いて炭素チャンネリングにより性能（performanc
e）を改善する一つの例である。この突然変異は、構造
遺伝子に向けられて酵素活性を弱めまたは向上するよう
にしてもよく、あるいは、調節遺伝子に向けられて酵素
活性の表現レベルを調整するようにしてもよい。

あるいはまた、形質転換および突然変異を組み合わせ
て、1,3−プロパンジオール産生を促進するために特定
の酵素活性を調節してもよい。したがって、1,3−プロ
パンジオール産生の増大をもたらす全細胞触媒の改変を
予期することは、本発明の範疇内である。

培地および炭素基質： 本発明における発酵培地は、適当な炭素基質を含有し
なければならない。適当な基質としては、グルコースお
よびフルクトース等のモノサッカライド、ラクトースま
たはスクロース等のオリゴサッカライド、デンプンまた
はセルロース等のポリサッカライド、またはそれらの混
合物、およびチーズ・ホエー・パーミエート、コーンス
ティープリカー、サトウダイコン糖蜜および大麦モルト
等の再生可能な原料からの非精製混合物が挙げられる
が、これらに限定されるものではない。さらに、炭素基
質は、二酸化炭素等の１炭素基質、または主要な生化学
的中間体への代謝による転化が実証されているメタノー
ルであってもよい。単一の炭素源（例えば、メタノー
ル、ホルムアルデヒドまたはギ酸エステル）からのグリ
セロール生産は、メチロトローフ酵母において（K.Yama
daら、Agric.Biol.,Chem.,53（２）541−543（1989））
および細菌において（Hunterら、Biochemistry,24,4148
−4155,（1985））報告されている。これらの生物は、
１炭素化合物を、メタンからギ酸エステル（formate）
にわたる酸化状態において、同化し、グリセロールを産
生することができる。炭素同化の経路は、リブロース一
リン酸を経由して、セリンを経由して、あるいはキシル
ロース−リン酸を経由してもよい（Gottschalk,Bacteri
al Metabolism,Second Edition,Springer−Verlag:New
York（1986））。リブロース一リン酸経路は、ギ酸エス
テルとリブロース−５−リン酸とを縮合して６炭糖を形
成することを包含し、この６炭糖はフルクトースにな
り、最終的には３炭素生成物であるグリセロアルデヒド
−３−リン酸になる。同様に、セリン経路は、１炭素化
合物を、メチレンテトラヒドロホレートを経て解糖経路
へと同化する。

１および２炭素基質に加えて、メチロトローフ生物
は、代謝活性のためにメチルアミン、グルコサミンなど
の幾つかの他の炭素含有化合物をおよび種々のアミノ酸
を利用することも知られている。例えば、メチロトロー
フ酵母は、メチルアミンからの炭素を用いてトレハロー
スまたはグリセロールを形成することが知られて（Bell
ionら、Microb.Growth Cl Compd.,［Int.Symp.］,7th
（1993）,415−32.Editor（ｓ）:Murrell,J.Collin;Kel
ly,Don P.Publisher:Intercept,Andover,UK）。同様
に、Candidaのいろいろな種はアラニンまたはオレイン
酸を代謝する（Sulterら、Arch.Microbiol.（1990）,15
3（５）,485−９）。したがって、本発明で用いられる
炭素の供給源は、広範囲にわたる炭素含有基質を包含
し、生物がどれを選択するかによって限定されるにすぎ
ない、と考えられる。

上記の炭素基質およびそれらの混合物の全部が本発明
に適していると考えられるが、好ましい炭素基質は、グ
ルコース、フルクトース、スクロースまたはメタノール
である。

適当な炭素源に加えて、発酵培地は、当業者にとって
公知であり、培養の増殖および1,3−プロパンジオール
生産に必要な酵素経路の促進に適している、適当な無機
質、塩、補助因子（cofactors）、緩衝液および他の成
分を含有しなければならない。Co（II）塩および／また
はビタミンB₁₂またはそれらの前駆体に特に注意すべき
である。

培養条件： 典型的には、細胞は30℃で適当な培地中で増殖させ
る。本発明において好ましい増殖培地は、通常の商業的
に調製された培地であり、例えば、ルリア・ベルタニ
（Luria Bertni:LB）ブイヨン、サブロー・デキストロ
ース（Sabouraud Dextrose:SD）ブイヨンまたは酵母培
地（YM）ブイヨンなどが挙げられる。他の定義された、
あるいは合成の増殖培地も使用可能であり、特定の微生
物の増殖に適した培地は微生物学または発酵科学の当業
者には公知であろう。異化代謝産物抑制を直接的または
間接的に調節することが知られている薬剤（例えば、環
状アデノイン２′:3′モノホスフェート）を反応培地に
組み込んでもよい。同様に、1,3−プロパンジオール生
産の促進をもたらす、酵素活性を調節することが知られ
ている薬剤（例えば、メチルビオローゲン）を遺伝子操
作と共働して、あるいは遺伝子操作の代替として用いて
もよい。

発酵に対する好適なpH範囲は、pH5.0〜pH9.0の範囲で
あり、pH6.0〜pH8.0が初期条件としては好ましい。

反応は、好気性または嫌気性の条件下で行ってもよ
く、嫌気的または微好気性の条件が好ましい。

バッチ発酵および連続発酵： 本発明の方法は、発酵のバッチ法を用いる。伝統的な
バッチ発酵は密閉系であり、そこでは、培地の組成が発
酵の開始時に設定され、発酵を行っている間に人為的な
改変はしない。つまり、発酵の開始時に、培地を所望の
一種または二種以上の生物と共に接種して、系に何も添
加しなくても発酵が起こるようにする。しかし、典型的
には、「バッチ発酵（batch fermentation）」とは、炭
素源の添加に関してはバッチ式であり、pHおよび酸素濃
度などの要因の調節がしばしば試みられている。バッチ
系では、系の代謝産物およびバイオマスの組成は、発酵
が停止するまで、絶えず変化している。バッチ式培養で
は、細胞は増減して、静止遅滞期（static lag phase）
を経て高増殖対数期（high growth log phase）へ最終
的には増殖速度が低下または停止する定常期に至る。未
処理の場合には、定常期にある細胞は、最終的には死滅
する。対数期にある細胞が通常最終生成物または中間体
の産生の大部分（bulk）を担っている。

標準的なバッチ系の１つの変形例は流加系（Feb−Bat
ch system）である。さらに流加発酵法も本発明では適
しており、発酵が進行するに従って基質が増量して添加
される以外は典型的なバッチ系を含む。流加系は、異化
代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害しやすい場合、および
培地中の基質量を制限することが望ましい場合に有用で
ある。流加系における実際の基質濃度の測定は困難であ
り、したがって、測定可能な因子（例えば、pH、溶存酸
素、およびCO₂等の廃ガスの分圧）の変化に基づいて推
定される。バッチおよび流加発酵は、当業界において周
知慣用であり、その例が前出のBrockに見られる。

本発明はバッチモードで行われるが、本方法は連続発
酵法に適合可能であると考えられる。連続発酵は開放系
であり、そこでは、決められた発酵培地が連続的にバイ
オリアクターに添加され、処理のために等量のならし培
地が同時に除去される。連続発酵は、通常、培養物を細
胞が主に対数期増殖をする一定の高密度に保持する。

連続発酵は、細胞の増殖または最終生成物の濃度に影
響を及ぼす１つの因子または任意数の因子の調節を可能
にする。例えば、１つの方法では、炭素源または窒素レ
ベルのような制限栄養素（limiting nutrient）を固定
した速度に保持し、かつ他の全てのパラメーターを増減
させる。他の系では、培地の濁度によって測定される細
胞濃度を一定に保持したままで、増殖に影響を及ぼす幾
つかの因子を連続的に変化させることができる。連続系
では、定常状態の増殖条件を保持しようと努力し、した
がって、発酵中に、培地が排出されることにより細胞の
損失は、細胞増殖速度とバランスを取らなくてはならな
い。連続発酵プロセスのための栄養素および増殖因子の
調節方法は、生成物形成速度を最大するための技法と並
んで、工業微生物学の業界で周知であり、種々の方法が
前出のBrockによって詳述されている。

本発明は、バッチ法、流加法または連続法のいずれを
用いて実施してもよく、どのような発酵方法も適してい
ると考えられる、さらに、細胞は、全細胞触媒（whole
cell catalysts）として基質に固定化して1,3−プロパ
ンジオール産生の発酵条件に供してもよい、と考えられ
る。

1,3−プロパンジオールの同定および精製 発酵培地からの1,3−プロパンジオールの精製方法
は、当業界において公知である。例えば、プロパンジオ
ールは、細胞培地から、反応混合物を有機溶剤による抽
出、蒸留およびカラムクロマトグラフィーに供すること
によって得ることが可能である（米国特許第5,356,812
号）。この方法において特に良い有機溶剤は、シクロヘ
キサンである（米国特許第5,008,473号）。

1,3−プロパンジオールは、培地を高速液体クロマト
グラフィ（HPLC）にかけることによって直接的に同定す
ることができる。本発明において好ましいのは、発酵培
地が、イソクラチック（isocratic）なやり方で0.01N硫
酸の移動相を用いた分析用イオン交換カラムで分析され
る方法である。

細胞 本発明に適している細胞は、デヒドラターゼ酵素を有
するものを含む。適している細胞は、原核または真核の
いずれであってもよく、その活性デヒドラターゼ酵素表
現能力によってのみ限定される、と考えられる。本発明
において特に有用なものは、大規模な発酵方法に容易に
適合し得る細胞である。かかる生物は、工業的バイオプ
ロセッシングの業界で周知であり、その例は、「Recomb
inant Microbes for Industrial and Agricultural App
lications」［Murooka et al.,eds.,Marcel Dekker,In
c.,New York,New York（1994）］に見られ、発酵性細
菌、さらには酵母および糸状菌が包含される。典型的に
は、該酵素は、それぞれグリセロールまたは1,2−プロ
パンジオールに基質特異性を有するグリセロールデヒド
ラターゼまたはジオールデヒドラターゼのいずれかであ
る。デヒドラターゼ酵素は、グリセロールをヒドロキプ
ロピオンアルデヒド（３−HPA）に転化することがで
き、この３−HPAは次いで1,3−プロパンジオールへと転
化される。この経路を含有する細胞は、シトロバクタ
ー、エンテロバクター、クロストリジウム、クレプシエ
ラ、サルモネラおよびラクトバシルス属に属する突然変
異または組換え生物を含む。発酵によってグリセロール
を生産する当業者にとって公知の微生物、例えば、アス
ペルギルス、サッカロミセス、ジゴサッカロミセス、ピ
ヒア、クリベロミセス、カンジダ、ハンゼヌラ、ジュナ
リエラ（Dunaliella）、デバリオミセス（DeBaryomyce
s）、ムーコル、トリロプシス（Torylopsis）、および
メチロバクテリア（Mathylobacteria）は、組換えデヒ
ドラターゼ酵素の宿主であり得る。本発明における宿主
として好適な他の細胞としては、バシルス、エシェリキ
ア、シュードモナス、およびストレプトミセスが挙げら
れる。理論に縛られるつまりはないが、上述の群に属す
る本発明に適している生物は、天然に存在すると考えら
れる。

本出願人の実験研究に基づけは、非常に広範囲にわた
る細胞が本発明で使用可能であると考えられる。本出願
人は、例えば、広範囲にわたって多様な遺伝子型および
表現型の組成を有する細胞が、適当な炭素基質を1,3−
プロパンジオールへと生物転化し得ることを証明した。
細胞の例としては、dha遺伝子構成性K.ニューモニエ突
然変異株、グリセロールデヒドラターゼまたはジオール
デヒドラターゼのいずれかをコードする遺伝子を含有す
るクレプシエラ・ゲノムのエレメントを含む組換え大腸
菌株、および、同じくクレプシエア・ゲノムのエレメン
トでトランスフェクトされ、かつトリオースフォスフェ
ート・イソメラーゼ酵素をコードする遺伝子に突然変異
を有する組換え大腸菌（tpi−）株が挙げられる。

クレプシエラ・ニューモニエ由来のdhaレギロンを含
有する大腸菌形質転換体は、グルコースまたはキシロー
スの存在下であってもグリセロールを1,3−プロパンジ
オールへと転化することができたが（Tongら、Appl.Bio
chem.Biotech.,34,149（1992））、グルコースのみの存
在下では、これらの生物によって1,3−プロパンジオー
ルは全く検出されなかった。この開示と直接に対照的な
のは、本出願人は、クレプシエラ・ニューモニエ由来の
dhaレギュロンを含有する２種の独立して単離されたコ
スミドのいずれかを含有する大腸菌の３種の菌種が、外
来的に添加されたグリセロールの存在なしに、グルコー
スの供給材料（feed）から1,3−プロパンジオールを産
生することを発見した。大腸菌株ECL707はK.ニューモニ
エのdhaレギュロンを含有するコスミドベクターpKP−１
またはpKP−２を含有するが、この菌株は外来的に添加
されたグリセロールの存在なしに、グルコースからの1,
3−プロパンジオールの、検出可能ではあるが、小規模
な産生を示した（実施例４）。代替宿主生物から構築し
た組換え大腸菌株DH5α（これも、コスミドベクターpKP
−１またはpKP−２を含有する）は、適当な条件下では
グルコースからの1,3−プロンパンジオールの産生にお
いて、ECL707組換え体よりも有効であることがわかった
（実施例３）。実施例４の条件下でグルコースから1,3
−プロパンジオールを生産するのに最も有効なものは、
コスミドベクターpKP−１またはpKP−２を含有する組換
え大腸菌株AA200（実施例２）である。大腸菌株AA200
は、検出可能なトリオースフォスフェート・イソメラー
ゼ酵素（tpi−）を含有する。

AA200−pKP−１の菌株は、形質転換反応からの独立し
た単離物のプールからさらに研究するために選別された
ものであるが、これは、２段階反応でグルコースを1,3
−プロパンジオールへと添加した。第１段階では、菌株
AA200−pKP−１−５を、グルコースおよびグリセロール
の不在下で高細胞密度まで増殖させた。第２段階では、
グルコースは含有するが、グリセロールは全く含有しな
い培地に懸濁した増殖細胞は、高い転化率および選択性
でグルコースを1,3−プロパンジオールへと転化した
（実施例５）。免疫化学的、クロマトグラフィー的およ
び遺伝学的には異なるが、補酵素（coenzyme）B₁₂依存
性酵素であるグリセロールデヒドラターゼ（E.C.4.2.1.
30）およびオールデヒドラターゼ（E.C.4.2.1.28）は、
グリセロールの、1,3−ヒドロキシプロピオンアルデヒ
ドへの転化を触媒する。ジオールデヒドラターゼではな
くグリセロールデヒドラターゼは、dhaレギュロンに含
まれる（encompassed）。K.ニューモニエATCC8724は、
ジオールデヒドラターゼは含むがグリセロールデヒドラ
ターゼは含まないが、グリセロールを1,3−プロパンジ
オールへと転化する（Forageら、J.Bacteriol.,149,413
（1982））。組換え大腸菌株ECL707およびAA200は、ジ
オールデヒドラターゼの遺伝子をコードするコスミドベ
クターpKP4を含むが、グルコースを1,3−プロパンジオ
ールへと転化する（実施例２および実施例４）。

天然に発生する菌株から突然変異誘発によって調製し
たK.ニューモニエECL2106（Ruchら、J.Bacteriol.124,3
48（1975））は、dhaレギュロンのグリセロール）の構
成性表現を示す（Ruchら、前出;Johnsonら、J.Bacterio
l.164,479（1985））。同じ表現型を示すK.ニューモニ
エATCC25955由来の菌株が同様にして調製されている（F
orageら、J.Bacteriol.149,413（1982））。クレプシエ
ラdha構造遺伝子の表現は、部分的ではあるが、リプレ
ッサー（dhaRの産物）によって制御される。（Sprenger
ら、J.Gen.Microbiol.135,1255（1989）。本出願人は、
dha構造遺伝子を構成するECL2106が、外来的に添加され
たグリセロールの不在下で、グルコースの供給材料から
1,3−プロパンジオールを産生することを示した（実施
例６）。これは、同じ条件下で、検出可能なレベルの1,
3−プロパンジオールを産生しなかった野生型K.ニュー
モニエATCC25955とは異なる（実施例６）。

ECL2106におけるdha構造遺伝子の表現は、カタボライ
ト異化代謝産物表現によってさらに制御される（Spreng
erら、J.Gen.Microbiol.135,1255（1989））。異化代謝
産物抑制を除くことは、C.freundiiから誘導される1,3
−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（dhaT）およ
びK.oxytoca ATCC8724から誘導されるジオールデヒドラ
ターゼについて証明されているように、必要な構造遺伝
子を代替プロモーター（alternate promoters）の制御
下に配置することによって達成可能である（Danielら、
J.Bacteriolo.177,2151（1995）およびTobimatsuら、J.
Biol.Chem.270,7142（1995））。このようにしてECL210
6から異化代謝産物抑制を除くことによって、外来性の
グリセロール供給源が存在しなくても1,3−プロパンジ
オールのグルコースからの生産の改善が達成される。例
えば、tpi−突然変異によって説明されているような適
当な炭素チャネリングによって、さらなる改善が得られ
る。

シトロバクター種およびクレプシエラ種のdhaレギュ
ロンは驚くほど類似しているので、当業者であれば、ク
レプシエラ種についての外来性のグリセロール供給源の
不在下でのグルコースからの1,3−プロパンジオールの
産生が関係する技術は、シトロバクター種にも適用され
る、と考えるであろう。さらに、C.ブチリカムによるグ
リセロールの代謝はK.ニューモニエに匹敵するので（Ze
ngら、Biotechnol.And Bioeng.44,902（1994））、教示
は、クロストリジア（Clostridia）種にも及ぶ。

実施例 一般的方法 リン酸化、連結反応および形質転換の操作は、当業界
では公知である。以下の実施例で使用するのに適した技
法は、Sambrook,J.らによるMolecular Cloning:A Labor
atory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Lab
oratory Press（1989）にある。

細菌培養物の維持および増殖に適した材料および方法
は、当業界では公知である。以下の実施例で使用するの
に適した技法は、Manual of Methods for General Bact
eriology（Phillipp Gerhardt,R.G.E.Murray,Ralph N.C
ostilow,Eugene W.Nester,Willis A.Wood,Noel R.Krieg
and G.Briggs Phillips,eds）,American Society for
Microbiology,Washington,DC.（1994）またはThomas D.
BrockのBiotechnology:A Textbook of Industrial Micr
obiology,Second Edition（1989）Sinauer Associates.
Inc.,Sunderland,MAにある。細菌細胞の増殖および維持
に用いられる全ての試薬および材料は、特に指示しない
限り、Aldrich Chemicals（Milwaukee,WI）、DIFCO Lab
oratories（Detroit,MI）、GIBCO/BRL（Gaithersburg,M
D）、またはSigma Chemical Company（St.Louis,MO）か
ら得た。

略記の意味は以下のとおりである。すなわち、「ｈ」
は時間を意味し、「min」は分を意味し、「sec」は秒を
意味し、「ｄ」は日を意味し、「mL」はミリリットルを
意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「50amp」は50g/m
Lのアンピシリンであり、「LB−50amp」は50g/mLのアン
ピシリンを含有するLuria−Bertaniブイヨンである。

表中、以下の略語が用いられる。すなわち、「Con.」
は転化であり、「Sel.」は炭素に対する選択性であり、
「nd」は検出できなかったことを意味する。

酵素アッセイ 無細胞抽出物におけるグリセロールデヒドラターゼ活
性は、1,2−プロパンジオールを基質として用いて測定
した。このアッセイは、アルデヒドとメチルベンゾ−２
−チアゾロンヒドラゾンとの反応に基づくものであり、
ForageおよびFosterによって記載されている（Biochem.
Biophys.Acta.569,249（1979））。1,3−プロパンジオ
ールオキシドレダクターゼ（しばしば、1,3−プロパン
ジオールデヒドラターゼという）の活性は、記載されて
いるように、溶液中またはスラブゲル中で、1,3−プロ
パンジオールおよびNAD⁺を基質として用いて測定した
（JohnsonおよびLin,J.Bacteriol.169,2050（198
7））。

1,3−プロパンジオールの単離および同定 グリセロールの1,3−プロパンジオールへの転化は、H
PLCによってモニターした。分析は、標準的な技法およ
びクロマトグラフィーの分野に習熟した者であれば入手
可能な材料を用いて行った。１つの適した方法では、UV
（210nm）およびRI検出を使用するWaters Maxima 820HP
LC装置を用いた。サンプルは、Shodex SH−1011Pプレカ
ラム（6mm×50mm）を装備したShodex SH−1011カラム
（8mm×300mm、Waters社（Milford,MA）から購入）に注
入した（温度は50℃に調節し、0.01NのH₂SO₄を移動相と
して用いて、0.5mL/minの流量で行った）。定量分析が
望まれる場合には、サンプルは、既知量のトリメチル酢
酸を外部標準として用いて調製した。典型的には、グリ
セロールの保持時間（RI検出）、1,3−プロパンジオー
ル（RI検出）、およびトリメチル酢酸（UVおよびRI検
出）は、それぞれ20.67分、26.08分、および35.03分で
ある。

1,3−プロパンジオールの産生は、GC/MSによって確認
した。分析は、標準的な技法およびGC/MSの分野に習熟
した者であれば入手可能な材料を用いて行った。１つの
適した方法では、Hewlett Packard 5971シリーズ・マス
選択的検出装置（mass selective detector）（EI）お
よびHP−INNOWaxカラム（長さ30m、内径0.25mm、膜厚0.
25ミクロン）に結合したHewlett Packard 5890シリーズ
IIガスクロマトグラフを用いた。生成した1,3−プロパ
ンジオールの保持時間および質量スペクトルは、確実な
1,3−プロパンジオール（m/e:57,58）と比較した。

GC/MSのもう１つの方法は、サンプルの誘導（derivat
ization）を含む。1.0mLのサンプル（例えば、培養上
清）に、30uLの濃縮（70％ v/v）過塩酸を添加した。
混合後、そのサンプルを凍結乾燥した。ビス（トリメチ
ルシリル）トリフルオロアセトアミド：ピリジンの1:1
混合物（300uL）を、凍結乾燥物に添加し、激しく混合
し、65℃で１時間にわたって放置した。このサンプルか
ら遠心分離により不溶性物質を取り除いた。得られた液
体を２つの層に分離して、その上部層を分析に用いた。
このサンプルを、DB−５カラム（48m、内径0.25mm、膜
厚0.25um;L＆W Scientific社製）でクロマトグラフし
て、培養上清から得られた1,3−プロパンジオール誘導
体の保持時間および質量スペクトルを、認証標準物質か
ら得られたものと比較した。TMS由来の1,3−プロパンジ
オールの質量スペクトルは、205、177、130、および115
AMUの特有のイオンを含有している。

K.ニューモニエコスミドライブラリーの構築 K.ニューモニエ（ATCC25955）を、100mLのLB培地で８
時間にわたって37℃で通気しながら増殖させた。細菌
（試験管（tube）１本あたり25mL）を3,000rpmで15分間
にあたり、DuPont Sorbvall GLC 2.B遠心分離機で、室
温で遠心分離した。この細菌をペレット化し、上清をデ
カンテーションした。この細菌細胞ペレットを−20℃で
凍結した。染色体DNAを、以下に略述するようにして、D
NAに剪断作用がかからないように特別の注意を払いなが
ら（すなわち、ボルテックス処理はせずに）単離した。
試験管１本の細菌を、2.5mLの50mM Tris−10mM EDTA再
懸濁し、500μｇのリゾチーム（1mg/ml）を添加した。
このペレットを穏やかに再懸濁し、懸濁液を37℃で15分
間にわたってインキュベートした。ドデシル硫酸ナトリ
ウムを添加して最終濃度を0.5％にした、これにより、
溶液は透明になった。プロテイナーゼＫ（50ug/mL）を
添加し、懸濁液を55℃で２時間にわたってインキュベー
トした。この試験管を取り出し、氷浴に移し、塩化ナト
リウムを添加して、最終濃度を0.4Mにした。２倍量のエ
タノールを該溶液に添加した。ガラス棒を界面に挿入し
て、DNAを穏やかに巻き付けた。DNAを70％エタノールを
含有する試験管に浸漬した。減圧乾燥した後、そのDNA
を500ulの水に再懸濁し、DNAの濃度を分光光度計により
測定した。希釈したDNAのアリコートを、0.5％アガロー
スゲルにかけて、DNAのそのままの性質（intact natur
e）を測定した。

この染色体DNAを、Sambrookら（前出）に略述されて
いるようにしてSau3Aで部分的に消化した。DNA（2ug）
を２単位のSau3A（Promega社,Madison,WI）で室温で全
容量200μＬで消化した。０、５、10および20分の時点
で、サンプル（50μＬ）を抜き取り、5umolのEDTAを含
有する試験管に移した。これらの試験管を70℃で10分間
にわたってインキュベートした。１アリコート（２μ
Ｌ）を抜き取り、0.5％アガロースゲル電気泳動で分析
して、消化のレベルを測定し、サンプルの残り（48μ
Ｌ）を−20℃で保存した。上記ゲルをエチジウムブロマ
イドで染色して、UV下で可視化して、染色体DNAの部分
消化を測定した。時間の増加に伴う染色体DNAのサイズ
の減少が観察され、このことは、染色体DNAのサイズの
減少が、Sau3Aの作用によるものであることを示してい
る。DNAを、標準プロトコール法（Sambrookら、前出）
によって残りのサンプルから抽出した。

部分的に消化されたK.ニューモニエ由来DNAのコスミ
ド・ライブラリーは、Supercosコスミドベクター・キッ
トおよびGigapack IIパッケージング抽出物を用い、Str
atagene社（La Jolla,CA）から購入した試薬を用いて作
製した。製造業者により提供された指示に従った。パッ
ケージされたK.ニューモニエは、大腸菌XL1−Blue MRを
トランスフェクトすることによって測定したところ４×
10⁴〜1.0×10⁵ファージ力価）を含有していた。

コスミドDNAは、６個の大腸菌形質転換体から単離
し、DNAの大きな挿入断片（25〜30kb）を含有すること
がわかった。

実施例１ 1,3−プロパンジオールの発現のための大腸菌宿主細胞
のコスミドDNAによるクローニングおよび形質転換 培地 合成S12培地を用いて、細菌の形質転換体の、1,3−プ
ロパンジオール製造能についてスクリーニングした。S1
2培地は、10mM硫酸アンモニウム、50mMリン酸カルシウ
ム緩衝液（pH7.0）、2mMのMgCl₂、0.7mMのCaCl₂、50μ
ＭのMnCl₂、１μＭのFeCl₃、１μＭのZnCl、1.7μＭのC
uSo₃、2.5μＭのCoCl₂、2.4μＭのNa₂MoO₄、および２μ
Ｍの塩酸チアミンを含有する。

増殖および発酵に用いられる培地Ａは、10mMの硫酸ア
ンモニウム、50mMのMOPS/KOH緩衝液（pH7.5）、5mMのリ
ン酸カルシウム緩衝液（pH7.5）、2mMのMgCl₂、0.7mMの
CaCl₂、50mMのMnCl₂、１μＭのFeCl₃、１μＭのZnCl、
1.72μＭのCuSO₄、2.53μＭのCoCl₂、2.42μＭのNa₂MoO
₄、２μＭの塩酸チアミン、0.01％酵母エキス、0.01％
のカザミノ酸、0.8μg/mLのビタミンB₁₂、および50amp
から構成されていた。培地Ａは、0.2％グリセロールま
たは0.2％のグリセロール＋0.2％Ｄ−グルコースのいず
れかを補足した。

細胞 クレプシエラ・ニューモニエECL2106（Ruchら、J.Bac
teriol.124,348（1975））（これは、文献では、K.エロ
ゲネス（K.aerogenes）またはエロバクター・エロゲネ
ス（Aerobacter aerogenes）としても知られている）
は、E.C.C.Lin（Harvard Medical School,Cambride,M
A）から入手し、実験室の培養物として保持した。

クレプシエラ・ニューモニエATCC 25955は、American
Type Culture Collection（Rockville,MD）から購入し
た。

大腸菌DH5αは、Gibco/BRLから購入し、グリセロール
デヒドラターゼ酵素またはジオールデヒドラターゼ酵素
のいずれかをコードする遺伝子を含有するクレプシエラ
・ニューモニエATCC 25955から単離したコスミドDNAで
形質転換した。グリセロールデヒドラターゼを含有する
コスミドは、pKP1およびpKP2として同定され、ジオール
デヒドラターゼ酵素を含有するコスミドは、pKP4として
同定された。形質転換したDH5α細胞は、DH5α−pKP1、
DH5α−pKP2およびDH5α−pKP4として同定された。

大腸菌ECL707（Sprengerら、J.Gen.Microbiol.,135,1
255（1989））は、E.C.C.Lin（Harvard Medical Schoo
l,Cambridge,MA）から入手し、同様にして、クレプシエ
ラ・ニューモニエ由来のコスミドDNAで形質転換した。
これらの形質転換体は、ECL707−pKP1およびECL707−pK
P2（グリセロールデヒドラターゼ遺伝子を含有）および
ECL707−pKP4（ジオールデヒドラターゼ遺伝子を含有）
として同定された。

tpi遺伝子における突然変異を含有する大腸菌AA200
（Andersonら、J.Gen Microbiol.,62,329（1970））は
大腸菌Genetic Stock Center,Yale University（New Ha
ven,CT）から購入し、クレプシエラ・コスミドDNAで形
質転換して、組換え生物AA200−pKP1およびAA200−pKP2
（グリセロールデヒドラターゼ遺伝子を含有）およびAA
200−pKP4（ジオールデヒドラターゼ遺伝子を含有）を
得た。

DH5α： K.ニューモニエDNAでトランスフェクトされた大腸菌X
L1−Blue MRのおよそ1,000個のコロニーを含有する６枚
の形質転換プレートを、5mLのLB培地で洗浄し、遠心分
離した。細菌をペレット化し、5mLのLB培地＋グリセロ
ールに再懸濁した。アリコート（50μＬ）を、0.2％グ
リセロール＋400ng/mLのビタミンB₁₂ 0.001％酵母エキ
ス＋50ampを有するS12合成培地を含有する15mL容試験管
に接種した。この試験管を、上部まで培地で満たし、パ
ラフィルムで覆い、30℃でインキュベートした。わずか
な濁りが48時間後に観察された。上記のようにして78時
間および132時間の時点で生成物の分布を分析したアリ
コートは、1,3−プロパンジオールについて陽性であ
り、それ以降の時点では1,3−プロパンジオールの含有
量は増加していた。

1,3−プロパンジオール産生に陽性であることがわか
った細菌は、段階的に希釈し、LB−50ampプレートに拡
げて、単一コロニーを単離した。48個の単一コロニーを
単離し、1,3−プロパンジオール産生について再度チェ
ックした。コスミドDNAは、６個の独立したクローンか
ら単離し、大腸菌株DH5αに形質転換した。この形質転
換体は、1,3−プロパンジオール産生について再度チェ
ックした。２種の形質転換体をさらに特徴付けして、DH
5α−pKP1およびDH5α−pKP2と命名した。

pKP1から得た12.1kbのEcoR I−Sal I断片は、pIBI31
（IBI Biosystem,New Haven,CN）にサブクローニング
し、配列決定し、pHK28−26（配列番号１）とした。配
列決定により、グリセロールデヒドラターゼおよび調節
に必要な遺伝子をコードするdhaオペロンの関連するオ
ープン・リーディング・フレームの遺伝子座が明らかに
なった。

配列番号１について言えば、ジヒドロキシアセトンキ
ナーゼをコードするdhaKのオープン・リーディング・フ
レームの断片が１〜399番目の塩基に見出され、グリセ
ロールジヒドロゲナーゼをコードするdhaDのオープン・
リーディング・フレームが983〜2107番目の塩基に見出
され、リプレッサーをコードするdhaRをコードするオー
プン・リーディング・フレームが2209〜4134番目の塩基
に見出され、1,3−プロパンジオールオキシドレダクタ
ーゼをコードするdhaTのオープン・リーディング・フレ
ームが5017〜6180番目の塩基に見出され、アルファ・サ
ブユニットのグリセロールデヒドラターゼをコードする
dhaB1のオープン・リーディング・フレームが7044〜871
1番目の塩基に見出され、ベータ・サブユニットのグリ
セロールデヒドラターゼをコードするdhaB2のオープン
・リーディング・フレームが8724〜9308番目の塩基に見
出され、ガンマ・サブユニットのグリセロールデヒドラ
ターゼをコードするdhaB3のオープン・リーディング・
フレームが9311〜9736番目の塩基に見出され、未知の機
能のタンパク質をコードするdhaBXのオープン・リーデ
ィング・フレームが9749〜11572番目の塩基に見出され
る。

パッケージされたK.ニューモニエ由来のコスミドDNA
でトランスフェクトされた大腸菌XL1−Blue MRの単一コ
ロニーを、200uLのS15培地（10mMの硫酸アンモニウム、
0.1mMのリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）、50mMのMOPS/K
OH緩衝液（pH7.0）、2mMのMgCl₂、0.7mMのCaCl₂、50uM
のMnCl₂、1uMのFeCl₃、1uMのZnCl、1.72uMのCuSO₄、2.5
3uMのCoCl₂、2.42uMのNa₂MoO₄、および2uMの塩酸チアミ
ン）＋0.2％のグリセロール＋400ng/mLのビタミンB₁₂＋
0.001％の酵母エキス＋50ug/mLのアンピシリンを含有す
るマイクロタイター・ウエルに接種した。マイクロタイ
ター・ウエルに加えて、LB−50ampを含有するマスター
のプレートにも接種した。96時間後、100uLを抜き取
り、0.2ミクロンのナイロン製メンブランフィルターを
含有するRaininマイクロフュージ・チューブ（microfug
e tube）で遠心分離した。細菌を保持し、濾液をHPLC分
析用に処理した。約240個のコロニーをスクリーニング
して1,3−プロパンジオール産生を示す陽性のクローン
を同定した。３個の陽性のコロニーを同定し、その中の
２個はLB−50amp上で増殖したものであり、もう１個は
増殖しなかったものである。単一のコロニーを、LB−50
amp上で増殖した上記２個の陽性のコロニーの一方から
単離し、かつ1,3−プロパンジオール産生を実証し、こ
れをpKP4と命名した。コスミドDNA、pKP4を含有する大
腸菌株から単離し、大腸菌株DH5αを形質転換した。独
立した形質転換体（DH5α−pKP4と命名した）は1,3−プ
ロパンジオールを産生することが実証された。

ECL707 大腸菌株ECL707は、pKP1、pKP2、pKP4およびSupercos
ベクター単独に対応するコスミドK.ニューモニエDNAで
形質転換して、それぞれをECL707−pKP1、ECL707−pKP
2、ECL707−pKP4およびECL707−scと命名した。ECL707
は、それぞれATP依存性グリセロールキナーゼ、NAD⁺結
合グリセロールデヒドロゲナーゼ、およびホスホエノー
ルピルベート依存性ホスホトランスフェラーゼ系のジヒ
ドロキシアセトンに対する酵素IIをコードするglpK、gl
dおよびptsDが欠損している。

各コスミドによる形質転換の20個の単一コロニーおよ
びSupercosベクター単独（負のコントロール）の形質転
換の５個のコロニーを、LB−50ampプレートから単離
し、マスターのLB−50ampプレートへ移した。これらの
単離体についても、グリセロールを1,3−プロパンジオ
ールへ転化する能力について試験して、それらがデヒド
ラターゼ活性を含んでいるかを調べた。形質転換体は、
滅菌した楊枝（toothpick）で、0.2％グリセロールまた
は0.2％グリセロール＋0.2％Ｄ−グルコースのいずれか
を補足した200μＬの培地Ａを含有するマイクロタイタ
ープレートに移した。48時間にわたって30℃でインキュ
ベートした後、該マイクロタイタープレートのウエルの
内容物を、0.45μのナイロン製フィルターで濾過し、HP
LCでクロマトグラフィーした。これらの試験結果を表１
に示す。

AA200 大腸菌株AA200は、pKP1、pKP2、pKP4およびSupercos
ベクター単独に対応するコスミドK.ニューモニエDNAで
形質転換して、それぞれをAA200−pKP1、AA200−pKP2、
AA200−pKP4およびAA200−scと命名した。菌株AA200
は、トリオースフォスフェートイソメラーゼを欠損して
いる（tpi−）。

各コスミドによる形質転換の20個の単一コロニーおよ
びエンプティ（empty）ベクターによる形質転換の５個
のコロニーを、大腸菌株ECL707について記載したのと同
様にして、単離し、グリセロールを1,3−プロパンジオ
ールへ転化する能力について試験した。これらの試験結
果を表２に示す。

実施例２ デヒドラターゼ活性を含むクレプシテア・ニューモニエ
DNAで形質転換した大腸菌株AA200によるＤ−グルコース
の1,3−プロパンジオールへの転化 ガラス製血清ビンを、培地（101μg/mLのカナマイシ
ンおよび0.2％のＤ−グルコースを補足し、さらに0.5〜
1.0mMの環状アデノシン２′:3′−モノホスフェート（c
AMP）を補足した、あるいは補足していない、実施例１
で定義した約14mLの培地Ａ）で容量いっぱいまで満た
し、それに、K.ニューモニエdhaレギュロン・コスミドp
KP1またはpKP2、K.ニューモニエpduオペロンpKP4または
Supercosベクター単独を含有する大腸菌株AA200から単
離した選択した単一コロニーを植菌した。グリセロール
と接触しないようにするために、植菌は、LB−50ampの
寒天培地または同じ培地の液体培養のいずれかから行っ
た。反応物を、250rpmで攪拌しながら、約72時間にわた
って30℃でインキュベートした。増殖は、600nmでの吸
光度の変化によって測定し、そこにおいて、初期のOD
₆₀₀は0.020AUであった。グルコースの消費（depletio
n）および生成物の分布の程度は、HPLCによって測定し
た。単一コロニーの単離物は、番号付けした接尾後「−
ｘ」によって同定した（例えば、AA200−pKP1−ｘ）。
累積した結果を表３および表４に示す。

実施例３ デヒドラターゼ活性を含有するクレプシエラ・ニューモ
ニエDNAで形質転換された大腸菌株DH5αによるＤ−グル
コースの1,3−プロパンジオールへの転化 K.ニューモニエのdhaレギュロン・コスミドpKP1また
はpKP2を含有する大腸菌株DH5αを、実施例２に記載し
たようにして、Ｄ−グルコースを1,3−プロパンジオー
ルに転化する能力について試験した。結果を表５に示
す。

実施例４ デヒドラターゼ活性を含有するクレプシエラ・ニューモ
ニエDNAで形質転換された大腸菌株ECL707によるＤ−グ
ルコースの1,3−プロパンジオールへの転換 大腸菌株ECL707は、K.ニューモニエのdhaレギュロン
・コスミドpKP1またはpKP2、K.ニューモニエpduオペロ
ンpKP4あるいはSupercosベクター単独を含有しており、
これらを、Ｄ−グルコースを1,3−プロパンジオールへ
転化する能力について実施例２に記載したのと同様にし
て試験した。それぞれの場合において、転化は定量的に
行った。結果を表６に示す。

実施例５ 大腸菌AA200−pKP1−５によるＤ−グルコースの1,3−プ
ロパンジオールへの２段階転化 50mLのLB−amp培地を含有するバッフル付フラスコ（b
uffled flasks）（250mL）に、AA200−pKP1−５の単一
コロニーを植菌した。細胞を、二重反復で（in duplica
te）、一夜にわたって30または37℃で攪拌しながら（25
0rpm）増殖させた。

増殖した培養物を回転させ（10分間、10,000rpm、４
℃）、微量の金属類Ａ（0.08μＭのCoCl₂、0.06μＭのC
uCl₂、７μＭのFeSO₄、２μＭのH₃BO₄、0.2μＭのMnC
l₂、0.1μＭのNa₂MoO₄、0.08μＭのNiCl₂、0.3μＭのZn
SO₄、および0.03mMのチアミン）または微量の金属Ｂ
（0.7mMのCaCl₂、2.53μＭのCoCl₂、1.72μＭのCuSO₄、
1.0μＭのFeCl₃、2mMのMgCl₂、2.42μＭのNa₂MoO₄、1.0
μＭのZnCl₂、および0.03mMのチアミン）のいずれかを
含有するグルコース非含有生成培地（10mMの（NH₄）₂SO
₄、5mMのリン酸カルシウム緩衝液（pH7.5）、50mMのMOP
S（pH7.5）、0.01％の酵母エキス、0.01％のカザミノ
酸、0.8μg/mLのビタミンB₁₂、および50μg/mLのアンピ
シリン）に再懸濁した。、細胞を２秒間にわたって攪拌
し、Ｄ−グルコースを含有する50mLの新たな生成培地に
再懸濁し、60mL容血清ビンに小分けし、そのビンをキャ
ップし、ブチルゴム製隔膜（septa）で密閉した。この
ビンを攪拌し（250rpm）、シリンジで該隔膜を通してサ
ンプルを抜き取り、0.2μのフィルターで濾過した後で
分析した。結果を表７および表８に示す。残留したグル
コースは、酵素的分析（Biochemistry Analyzer、Yello
w Springs Instruments Co.,Inc.）によって測定し、1,
3−プロパンジオールをHPLCにより分析した。

実施例６ クレプシエラ・ニューモニエATCC25955ではなくクレプ
シエラ・ニューモニエECL2106によるＤ−グルコースの
1,3−プロパンジオールへの転化 容量いっぱい（約14mL）まで培地で満たしたガラス製
血清ピンを、K.ニューモニエECL2106またはK.ニューモ
ニエATCC25955を含有するLB寒天プレートからかるく植
菌した。この培地は、50mMのグルコース、3mMの（NH₄）
₂SO₄、0.9mM CaCl₂、４μＭのCoCl₂、0.06μＭのCuC
l₂、７μＭのFeSO₄、２μＭのH₃BO₄、0.8mMのMgSO₄、0.
2μＭのMnCl₂、0.1μＭのNa₂MoO₄、0.08μＭのNiCl₂、
0.3μＭのZnSO₄ 0.1mg/mLのDL−システイン、10μＭの
エチレンジアミン四酢酸、0.8μg/mLのビタミンB₁₂、表
９に示すリン酸カルシウム、および50mMのHEPESまたは5
0mMのMOPS緩衝液（pH7.5）のいずか一方を含有してい
た。反応物を250rpmで攪拌しながら、47時間にわたって
30℃でインキュベートした。それ以外は反応物を実施例
２に記載した通りに行った。結果を表９に示す。

実施例７ 組換えピヒア・パストリスによる1,3−プロパンジオー
ルの生産汎用目的の表現プラスミドの構築 pHIL−D4（Phillips Petroleum,Bartlesville,OK）中
の0.9kbのEcoR I/Xba1断片を、pAO815（Invistrogen,Sa
n Diego,CA）の0.9kbのEcoR I/Xba1断片と置き換えて、
以下のエレメントを含有するプラスミドpHIL−D4B2を得
た。すなわち、このプラスミドは、５′AOX1（P.パスト
リス メタノール誘導性アルコールオキシダーゼＩ（AO
X1）プロモーター）、AOX1 term（P.pastoris AOX1転写
終結領域）HIS4（his4宿主における選択用のP.パストリ
ス ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ・コード遺伝
子）、kan（アミノグリコシド３′−ホスホトランスフ
ェラーゼをコードし、非常に多様な宿主にカナマイシ
ン、ネオマイシンおよびG418耐性を付与し、かつカセッ
トコピー数の指示物として有用な、トランスポソンTn90
3由来の配列）、３′AOX1（部位指向性（site−directe
d）ベクター組込みのための５′AOX1との結合に用いら
れる、AOX1の下流にあるP.パストリス配列）、ori（大
腸菌におけるプラスミド操作を可能にする、pBR322のDN
A複製の起点）、およびamp（アンピシリンに対する耐性
を付与するpBR322由来のβ−ラクタマーゼ遺伝子）を含
有していた。PHIL−D4B2のもう１つの特徴は、Bgl2/Xba
1断片上のカセットをBamH1/Xba1部位にサブクローニン
グすることによって複数の表現カセット（５′AOX I−g
ene−AOX I term）を１つのプラスミドに容易に配置で
きることである。

dhaB1およびdhaB2の同時表現のためのプラスミドの構築 dhaB1およびdhaB2のオープン・リーディング・フレー
ムは、コスミドpKP1から、PCRによって、５′末端にEco
R I部位が組込まれているプライマー（それぞれ、dhaB1
およびdha2Bとして配列番号３を有する配列番号２およ
び配列番号５を有する配列番号４）を用いて増幅した
（10mM Tris（pH8.2）、50mM KCl、1.5mM MgCl₂、0.000
1％ゼラチン、200μM dATP、200μM dCTP、200μM dGT
P、200μM dTTP、１μＭの各プライマー、１〜10ng標的
DNA、25単位/mL Amplitaq（登録商標）DNAポリメラーゼ
（Perkin Elmer Cetus,Norwalk CT）。PCRラメータは、
94℃で１分間、55℃で１分間、72℃で１分間を35サイク
ルであった。その生成物を、pHIL−D4B2のEcoR I部位に
サブクローニングして、それぞれdhaB1およびdhaB2を含
有する表現プラスミドpMP19およびpMP20を得た。

pMP19から得たBgl2/Xba1断片にあるdhaB1表現カセッ
トを、pMP20のBamH1/Xba1部位へサブクローニングし
て、pMP21を得た。プラスミドpMP21は、dhaB2およびdha
B1の両方の表現カセットおよびHIS4選択性マーカーを含
有する。

dhaB3およびdhaTの同時表現のためのプラスミドの構築 dhaTおよびdhaB3のオープン・リーディング・フレー
ムは、PCRにより、コスミドpKP1から、５′末端にEcoR
I部位を有するプライマー（それぞれdhaTおよびdhaB3と
して配列番号７を有する配列番号６および配列番号９を
有する配列番号８）を用いて増幅した。この生成物をpH
IL−D4B2のEcoR I部位にサブクローニングして、それぞ
れdhaTおよびdhaB3を含有する表現プラスミドpMP17およ
びpMP18を得た。

このpMP1から得たBgl2/Xba1上にあるdhaT表現カセッ
トを、pMP18のBamH1/Xba1部位にサブクローニングし
て、dhaTおよびdhaB3の両方に対する表現カセットを含
有するpMP22を得た。

SUC2を含有する4.1kbのEcoR1断片を、pRK20（Phillip
Petroleum,Bartlessville,OK）から欠失させて、pMP2
を得た。SUC2は、ピヒアにおける第２の選択マーカーと
して用いることができるインベルターゼをコードしてい
る。LacZを含有する4.0kbのHind3断片をpMP2から欠失さ
せて、pMP3を得た。pHIL−D4から得たAOX1 termを含有
する0.4kbのHind3断片を、pMP3のHind3部位にサブクロ
ーニングして、pMP10を得た。

pMP10にある2.0kbのBgl12/Xba1断片を、pMP22から得
たdhaB3およびdhaT表現カセットを含有する5.0kbのBgl2
/Xba1断片と置き換えて、pMP23を得た。pRK20から得たS
UC2を含有する5.4kbのPst1/Bgl2断片を、pSP73（Promeg
a社,Madison,W I）のPst1/Bgl2部位にサブクローニング
して、pMP11aを得た。プラスミドpMP11aをEcoR1で切断
し、T4DNAポリメラーゼで満たして、再結合して、pMP11
bを得た。pMP10にある1.1kbのPst1/Bgl2断片を、pMP11b
から得たSUC2を含有する5.4kbのgBg12/Pst1断片で置き
換えて、pMP12を得た。

pMP23にある1.0kbのSca1/Bgl2断片を、pMP12から得た
SUC2を含有する5.2kbのSca1/Bgl2断片で置き換えて、pM
P24を得た。プラスミドpMP24は、dhaTおよびdhaB3の両
方の表現カセットおよびSUC2選択性マーカーを含有す
る。

dhaB1/dhaB2表現プラスミドpMP21によるP.パストリスの
形質転換 P.パストリス菌株GTS115（his4）（Phillips Petrole
um,Bartlesville,OK）を、１〜2ugのBgl2一直鎖化プラ
スミドpMP21で、Creggら（Mol.Cell.Biol.5,3376,（198
5））により記載されているスフェロプラスト形質転換
法を用いて形質転換した。細胞は、ヒスチジンを含有し
ないプレート上で３〜４日間にわたって30℃で再生し
た。プラスミドDNAを染色体に組込んだ後で、全ての形
質転換体が生じた。形質転換体をYPD（１％Bacto酵母エ
キス、２％ペプトン、２％グルコース）マスタープレー
トにパッチした（patched）。

dhaB1およびdhaB2についてのP.パストリス形質転換体の
スクリーニング 染色体DNAは、上記のhis⁺形質転換体から調製し、dha
B1およびdhaB2に特異的であるプライマーを用いたPCR分
析に供した。高コピー数の菌株を、dhaB1およびdhaB2の
両方を含有する形質転換体から、2000μg/mL以下の高濃
度のG418（sigma社,St.Louis,MO）を補充したYPD培地で
の増殖によって選択した。高濃度のG418に対する耐性
は、表現カセットの顕著な複製を示唆する。

P.パストリスのdhaB3/dhaT表現プラスミドpMP24による
２次形質転換 上記の高濃度のG418に対する耐性を有する形質転換体
を、プラスミドpMP24用いて、スフェロプラスト形質転
換法を用いて再形質転換した。細胞は、まず最初に非選
択性プレート上で２日間にわたって30℃で再生し、その
後で、再生した細胞を含有する上部の寒天を該プレート
から削り取り、20mLの水の中で広く渦動処理した。４つ
折りにしたチーズクロスを通過させた後、該細胞を遠心
分離によりペレット化し、10mLの水に再懸濁した。200
μＬのアリコートをスクロース・プレートに拡げ、２日
間にわたって30℃でインキュベートした。全ての形質転
換体は、プラスミドDNAを染色体に組込んだ後で生じ
た。形質転換体は、小さなコロニーの背景の中に大きな
コロニーとして出現し、単離が必要となる。Msu培地（1
L当たり、13.4gの酵母窒素ベースw/oアミノ酸、10gのス
クロース、0.4gのビオチン）中で30℃で攪拌しながら24
時間増殖させた後、形質転換体をMsuプレート（Msu培地
＋15g/Lの寒天）に縞状に塗布し、２日間にわたって30
℃で増殖させた。大きな単離コロニーをYPDマスタープ
レートにパッチした。

dhaB1、dhaB2、dhaB3およびdhaTのP.パストリス二重形
質転換体のスクリーニングおよびそれらの対応する酵素
活性 染色体DNAを上記のsuc⁺二重形質転換体から調製し、d
haB1、dhaB2。DhaB3およびdhaTに特異的なプライマーを
用いたPCR分析に供した。このようにして、全４種のオ
ープン・リーディング・フレームの存在が確認された。

活性グリセロールデヒドラターゼ（dhaB）および1,3
−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（dhaT）の存
在は、in vitro酵素アッセイを用いて実証した。さら
に、ウエスタン・ブロット解析により、全４種のオープ
ン・リーディング・フレームからのタンパク質表現が確
認された。これらのタンパク質の特徴決定のための無細
胞抽出物を以下のようにして調製した。すなわち、dhaB
1、dhaB2、dhaB3およびdhaTを含有する二重形質転換体
を、MGY（1L当たり、13.4gの酵母窒素ベース（アミノ酸
なし）、0.4mgのビオチン、10mLのグリセロール）中で
２日間にわたって30℃で攪拌しながら好気的に増殖させ
た。この細胞を遠心分離によってペレット化し、MM（1L
当たり、13.4gの酵母窒素ベース（アミノ酸なし）、0.4
mgのビオチン、5mLのメタノール）中に再懸濁し、上記
したようにしてインキュベートした。約24時間後、その
細胞を収集し、緩衝液（0.1Mのトリセン（tricene）/KO
H緩衝液（pH8.2）、50mMのKCl,および２％の1,2−プロ
パンジオール）に再懸濁し（ガラス製ロッドを用いてガ
ラスビーズの存在下で渦動処理しながら）、機械的に粉
砕し、遠心分離した。

全４種（dhaB1、dhaB2、dhaB3およびdhaT）のオープ
ン・リーディング・フレームの存在について陽性を示
し、かつそれらの対応する活性を示した１つの菌株をMS
P42.81と命名し、これをさらなる研究用に選択した。

組換えピヒア・パストリスを用いた1,3−プロパンジオ
ールのin vivo生産 P.パストリスMSP42.81（ATCC74363）を、8.5g/LのKH₂
PO₄と、2.1g/Lの（NH₄）₂SO₄と、10g/Lのグリセロール
と、2.3g/LのMgSO₄・7H₂Oと、0.18g/LのCaSO₄・2H₂O
と、0.29mL/LのPTMIとを含有する1.5Lの最少培地を含有
するBuostat B発酵槽（B.Braun Biotech,Inc.）で増殖
させた。PTMIは、24mMのCuSO₄、4.8mMのKI、18mMのMnSO
₄、0.8mMのNa₂MoO₄、0.3mMのH₃BO₃、2.1mMのCoCl₂、70m
MのZnSO₄、26mMのH₂SO₄、234mMのFeSO₄、および0.8mMの
ビオチンを含有する保存無機溶液である。この発酵槽
は、2MのNH₄OHを用いてpH5.0に、および攪拌コントロー
ルにより30％の溶存酸素圧力に制御した。YMブイヨン中
30℃で増殖させたP.パストリスMSP42.81の培養物を接種
材料として用い、20mLの該培養物を用いて上記発酵槽に
接種した。

グリセロールが枯渇したことが示されたら（接種から
24時間後）、メタノール供給材料の添加によりAOXプロ
モーターの誘発を開始した。この供給材料は、１リット
ルのメタノールと、5mLのPTMIと、0.2g/L（水中）とし
て調製された5mLの保存ビオチン溶液とを含有してい
た。このメタノール溶液を手操作で添加して、0.5％（H
PLC解析で決定）の平均濃度を維持した。誘発から50時
間後に50mLの細胞（OD₆₀₀＝20AU）を上記反応槽から取
り出した。

この50mLの細胞懸濁液をペレット化し、12.5mLの窒素
吹込みしたベース培地6.7g/Lの酵母窒素ベース、3.0g/L
の酵母エキス、1.0g/LのK₂HPO₄、1.0g/LのKH₂PO₄、3.0g
/Lの（NH₄）₂SO₄、pH7.2に滴定し、濾過滅菌したもの］
に再懸濁した。補酵素B₁₂は、窒素吹込みした水に溶解
した2mg/mLの保存溶液として調製し、これを、上記細胞
懸濁液に添加して、20μg/mLの最終濃度にした。３種の
培地保存溶液を調製して１％のグルコース、0.5％のグ
ルコースと0.5％（w/v）のグリセロール、および1.0％
（w/v）のグリセロールを含有するベース培地とした。
クロロキン（chloroquine）の保存溶液（1.06g/50mL、p
H7.2）も調製した。

表10に記載した最終濃度になるように調製した2mLの
上記培地保存溶液およびクロロクインと水との混合物1m
Lとを10mL容の圧着密封した血清ビンに入れ、窒素吹込
みしてから1mLの細胞と補酵素B₁₂との混合物を添加し
た。この血清ビンを30℃で振盪しながらインキュベート
した。細胞を添加した直後および24時間インキュベート
した後に取り出したサンプルをHPLCで分析した。結果を
表10に示す。

実施例８ Ｄ−グルコースからの1,3−プロパンジオール生産のた
めのピヒア・パストリス二重形質転換体の使用 P.パストリスMSP42.81をBiostatB発酵槽（B.Braun Bi
otech,Inc.）内で1.5Lの最少培地（8.5g/LのKH₂PO₄、2.
1g/Lの（NH₄）₂SO₄、10g/Lのグルコース、2.3g/LのMgSO
₄・7H₂O、0.18g/LのCaSO₄・2H₂Oおよび0.29mL/LのPTMI
を含有）で増殖させた。それ以外は、発酵および誘発条
件は、実施例７に記載のものと同一であった。誘発の15
時間後に反応槽から50mLの細胞を取り出した。

改変したベース培地（6.7g/Lの酵母窒素ベース、1.0g
/LのKH₂PO₄、1g/LのK₂KPO₄、3g/Lの（NH₄）₂SO₄、pH7.2
に滴定し、濾過滅菌した）を用いた以外は実施例７に記
載した通り細胞懸濁液を処理した。この改変ベース培地
でも３種類の培地保存溶液を調製した。他の溶液は全て
同一であった。反応混合物を記載のようにして調製し、
30℃で振盪しながらインキュベートした。細胞添加直後
および75時間インキュベートした後で取り出したサンプ
ルをHPLCで分析した。炭素源としてのグルコースおよび
5mMクロロキンを含有する反応物（reaction）では、0.1
7mMの1,3−プロパンジオールが得られた。

実施例９ 形質転換のためのプラスミド構築およびサッカロミセス
・セレビシエにおけるdhaBおよびdhaTの表現 汎用の表現プラスミドの構築 ２種類の表現プラスミドを作製した。すなわち、組換
えによって染色体に組込み可能なものと、複製エピゾー
ムエレメントとして存在可能なものである。各種類の普
遍的表現（general expression）プラスミドでは、酵母
プロモーターが存在し、酵母転写ターミネーターから、
１種以上の制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位を
含有するDNAの断片によって分離した。各種の普遍的表
現プラスミドは、アンピシリン含有培地における大腸菌
の選択のためのβ−ラクタマーゼの遺伝子、大腸菌での
プラスミド保持のための複製起点、および２ミクロンの
エピゾーム・エレメントの複製起点または染色体に導入
されたDNAの組換えおよび組込みのためのS.セレビシエ
染色体で見られるものと相同な配列の一方も含有してい
た。酵母で用いられ、かつ表現プラスミド上に存在する
選択性栄養素マーカーは、イミダゾールグリセロールホ
スフェートデヒドラターゼをコードするHIS3遺伝子、オ
ロチジン５′−ホスフェートデカルボキシラーゼをコー
ドするURA3遺伝子、Ｎ−（５′−ホスホリボシル）−ア
ントラニレートイソメラーゼをコードするTRP1遺伝子、
およびβ−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼをコ
ードするLEU2遺伝子のうちの１つである。用いられる酵
母プロモーターはADH1またはGAL1であり、転写ターミネ
ーターはADH1、CYC1、またはAOX1であり、後者はピヒア
・パストリス由来である。

プラスミドpGADGH（Clontech社,Palo Alto,CA）をHin
d IIIで消化し、その１本鎖末端を、Hind III−Xmn Iお
よびEcoR I−Xmn Iアダプター（New England Biolabs
社,Berverly,MA）との結合反応によってEcoR I末端に変
換した。正しいEcoR I末端を有するプラスミドの選択
は、プラスミドpUC4K（Pharmacia Biotech社,Uppsala）
から得たEcoR I断片上のカナマイシン耐性遺伝子との結
合反応、大腸菌株DH5αへの形質転換および25μg/mLの
カナマイシンを含有するLBプレート上での選択によって
達成した。得られたプラスミド（pGAD/KAN2）を、SnaB
IおよびEcoR Iで消化し、ADH1プロモーターを有する1.8
kbの断片を単離した。プラスミドpGBT9（Clonetech社,P
alo Alto,CA）をSnaB IおよびEcoR Iで消化し、1.5kbの
ADH1/GAL4断片を、pGAD/KAN2からSnaB IおよびEcoR Iに
よる消化によって単離した1.8kbのADH1プロモーター断
片で置き換えた。得られたベクター（pMCK11）は、ADH1
プロモーターと、ターミネーターと、TRP1マーカーとを
有する、酵母における複製プラスミドである。

プラスミドpGADGHを、SnaB IおよびHind IIIで消化
し、ADH1プロモーターを含有する1.8kbの断片を単離し
た。この断片を、あらかじめSma IおよびHind IIIで消
化したベクターpRS405（Staratagene社,La Jolla,CA）
に結合した。陽性のクローンは、プラスミド・コード化
lacZアルファ・ペプチドの挿入不活性化（insertional
−inactivation）およびADH1プロモーター断片の存在に
より同定した。得られたプラスミド（pMCK4）は、ADH1
プロモーターおよびLEU2マーカーを含有していた。

pDH1ターミネーターを含有するpGBT9由来の約0.2kb
（〜0.2kb）のNae I−EcoR I断片は、EcoR I−Hinc II
消化pRS403（Stratagene社,La Jolla,CA）に結合して、
約4.8kbのプラスミドpRVN5を得た。ADH1プロモーターを
含有するpGAD/KAN2由来の約2.0kbのSnaB I−EcoR I断片
を、Sma I−EcoR I消化pRVN5に結合して、ADH1プロモー
ターと、ターミネーターと、中間に独自のEcoR Iクロー
ニング部位とを有する約6.8kbのプラスミドpRVN6を得
た。

もう１つのXmn I部位を含有するpGADGH由来の0.4kbの
Hind III断片を欠失させ、このベクターを再度結合し
て、7.0kbのベクターpGAD−D3を得た。ベクターpGAD−D
3を、Xmn Iで消化して、ADH1プロモーターと、ターミネ
ーターと、介在するHind IIIクローニング部位とを含有
する約2.4kbの断片を精製した。pRS404ベクター（Stara
tegene社,La Jolla,CA）をPvu IIで消化し、TRP1を有す
る大きい方の3.8kbの断片を精製し、pGAD−D3から得たX
mn Iプロモーターおよびターミネーター断片に結合し
て、プラスミドpRVN11を得た。

dhaT、dhaB3およびdhaB1のためのオープン・リーディ
ング・フレームは、pHK28−26（配列番号１）から、PCR
により、プライマー（dhaT、dhaB3およびdhaB1の各々に
ついて、それぞれ配列番号７と配列番号６、配列番号８
と配列番号９、および配列番号２と配列番号３）を用い
て、EcoR I部位を５′末端に組込んで増幅した［10mM T
ris（pH8.3）、50mM KCl、1.5mM MgCl₂、0.0001％ゼラ
チン、200μM dATP、200μM dCTP、200μM dGTP、200μ
M dTTP、１μＭの各プライマー、１〜10ng標的DNA、25
単位/mL Amplotaq（登録商標）DNAポリメラーゼ（Perki
n Elmer Cetus社,Norwalk CT）］。PCRパラメーター
は、94℃で１分間、55℃で１分間、および72℃で１分間
で35サイクルであった。生産物を、pHIL−D4（Philips
Petroleum社,Bartlesville,OK）のEcoR I部位へサブク
ローニングして、dhaT、dhaB3およびdhaB1をそれぞれ含
有するプラスミドpMP13、pMP14およびpMP15を得た。

dhaT表現用プラスミドの構築 複製プラスミドpGAD/KAN2をEcoR Iで消化してカナマ
イシン耐性断片を取り除き、脱リン酸化し、pMP13から
得たdhaT EcoR I断片に結合した。得られたプラスミド
（pMCK13）は、ADH1プロモーターからの転写に対して正
しい方向に挿入されているdhaTを有しており、かつLEU2
マーカーを含有していた。

プラスミドpRNV6をEcoR Iで消化し、pMP13から得たdh
aT EcoR I断片に結合した。得られたプラスミド（pRVN6
T）は、ADH1プロモーターからの転写に対して正しい方
向に挿入されているdhaTを有しており、かつHIS3マーカ
ーを含有していた。

dhaB1表現用プラスミドの構築 複製プラスミドpGADGHをHind IIIで消化し、脱リン酸
化し、pMP15から得たdhaB1 Hind III断片に結合した。
得られたプラスミド（pMCK10）は、ADH1プロモーターか
らの転写に対して正しい方向に挿入されているdhaB1を
有しており、かつLEU2マーカーを含有していた。

dhaB2表現用プラスミドの構築 複製プラスミドpMCK11をEcoR Iで消化、脱リン酸化
し、pMP20から得たdhaB2 EcoR I断片に結合した。得ら
れたプラスミド（pMCK17）は、ADH1プロモーターからの
転写に対して正しい方向に挿入されているdhaB2を有し
ており、かつTRP1マーカーを含有していた。

プラスミドpRS403をSma Iで消化し、pMCK17から得たS
naB I−Nae I dhaB2断片に結合した。得られたプラス
ミド（pMCK21）は、ADH1プロモーターからの転写に対し
て正しい方向に挿入されているdhaB2を有しており、か
つHIS3マーカーを含有していた。

dhaB3表現用プラスミドの構築 複製プラスミドpYES2（Invitrogen社,San Diego,CA）
をEcoR Iで消化、脱リン酸化し、pMP14から得たdhaB3 E
coR I断片に結合した。得られたプラスミド（pMCK1）
は、GAL1プロモーターからの転写に対して正しい方向に
挿入されているdhaB3を有しており、かつURA3マーカー
を含有していた。

複製プラスミドpGAD/KAN2をEcoR Iで消化し、脱リン
酸化し、pMP14から得たdhaB3 EcoR I断片に結合した。
得られたプラスミド（pMCK15）は、ADH1プロモーターか
らの転写に対して正しい方向に挿入されているdhaB3を
有しており、かつLEU2マーカーを含有していた。

プラスミドpRS404をPstおよびHinc IIで消化し、pMCK
15から得たPst I/EcoR V dhaB3断片に結合した。得られ
たプラスミド（pMCK20）は、ADH1プロモーターからの転
写に対して正しい方向に挿入されているdhaB3を有して
おり、かつTRP1マーカーを含有していた。

dha表現プラスミドによるS.セレビシエの形質転換 S.セレビシエ株YPH499（ura3−52 lys2−801 ade2−101
tripl−del63 his3−del200 leu2−del1）（Stragagene社,La Jolla,C
A）を１〜２μｇのプラスミドDNAにより、Stratagene社
から発行されているLiCl/ポリエチレングリコール・プ
ロトコール（カタログ番号217406）を用いて形質転換し
た。あるいはまた、形質転換は、Zymo Research社（Ora
nge,CA）の凍結−EZ酵母形質転換キット（カタログ番号
T2001）を用いて達成した。コロニーは、補足最少培地
（SMM−0.67％の酵母窒素ベース（アミノ酸なし）、２
％のグルコース）で３〜４日間にわたって29℃で、以下
の添加物の１種以上を用いて増殖させた。すなわち、ア
デニンサルフェート（20mg/L）、ウラシル（20mg/L）、
Ｌ−トリプトファン（20mg/L）、Ｌ−ヒスチジン（20mg
/L）、Ｌ−ロイシン（30mg/L）、Ｌ−リジン（30mg/L）
の添加物である。コロニーを選択プレート（選択培地）
に縞状に塗布し、液体培地への接種に用いた。使用する
ベクターに応じて、コロニーは、プラスミドDNAの組込
みの後に得られたもの、あるいはエピゾームの複製から
得られたもののいずれかであった。単一の種類のプラス
ミドによる形質転換に加えて、２種以上のプラスミドに
よる同時形質転換を行った。

形質転換したS.セレビシエにおけるdhaB活性の表現 プラスミドpMCK1、pMCK10およびpMCK17により形質転
換した菌株YPH499を、補足最少培地（アミノ酸を含有し
ない0.67％の酵母窒素ベース、２％のグルコース、２％
のラフィノース、20mg/Lのアデニンサルフェート、30mg
/LのＬ−リジン、20mg/LのＬ−ヒスチジンを含有）で増
殖させた。細胞をホモジナイズし、抽出物をdhaB活性に
ついてアッセイした。0.021ユニット/mgの比活性が得ら
れた。

実施例10 S.セレビシエの形質転換体に対する代替複製および組換
えプラスミドの構築 汎用の表現プラスミドは、SnaB I/EcoR I ADH1プロモ
ーター断片をpGAD/KAN2から単離し、この断片を、Hinc
IIおよびEcoR Iで予め消化しておいたベクターpRS406
（Stratagene社,La Jolla,CA）に結合する。陽性のコロ
ニーは、プラスミドによってコード化されるlacZアルフ
ァペプチドの挿入不活性化およびADH1プロモーター断片
の存在により同定する。得られたプラスミド（pMCK3）
をEcoR IおよびSma Iで消化し、プラスミドpGBT9をEcoR
IおよびNae Iで消化することにより遊離させた0.2kbの
ADH1ターミネーター断片に結合する。得られたプラスミ
ド（pMCK5）は、ADH1プロモーターおよびターミネータ
ーの双方の配列とURA3マーカーとを含有する。

DhaT表現用プラスミドの構築 ベクターpMCK5を、EcoR Iで消化し、脱リン酸化し
た。dhaT遺伝子を、プラスミドpMP13からEcoR I断片と
して切り出し、pMCK5に結合する。得られたプラスミド
（pMCK7）は、ADH1プロモーターからの転写に対して正
しい方向に挿入されているdhaTを有しており、かつURA3
マーカーを含有している。

組込みベクターpRS404をKpn IおよびSac Iで消化す
る。フランキング・プロモーターおよびターミネーター
を有するdhaT遺伝子は、プラスミドpMCK7からKpn I/Sac
I断片として切り出し、pRS404に結合する。得られたプ
ラスミドは、ADH1プロモーターからの転写に対して正し
い方向に挿入されているdhaTを有しており、かつTRP1マ
ーカーを含有している。

dhaB1表現用プラスミドの構築 ベクターpMCK5をEcoR Iで消化し、脱リン酸化する。d
haB1遺伝子を、プラスミドpMP15からEcoR I断片として
切り出し、pMCK5と結合する。得られたプラスミド（pMC
K8）は、ADH1プロモーターからの転写に対して正しい方
向に挿入されているdhaB1を有しており、かつURA3マー
カーを含有している。

組込みベクターpRS403をCla IおよびAat IIで消化す
る。フランキング・プロモーターおよびターミネーター
を有するdhaB1遺伝子を、プラスミドpMCK8からCla I/Aa
t II断片として切り出し、pRS403に結合する。得られた
プラスミドは、ADH1プロモーターからの転写に対して正
しい方向に挿入されているdhaB1を有しており、かつHIS
3マーカーを含有する。

複製プラスミドpYES2をHind IIIおよびSnaB Iで消化
し、GAL1プロモーター・エレメントを、pGADGHからSnaB
IおよびHind IIIで消化したADH1プロモーター断片によ
る結合によって置き換える。pMP19から得たdhaB1 Hind
IIIおよびXba I断片を、改変したADH Iプロモーターバ
ージョンのpYES2のそれらの部位に結合する。得られた
プラスミドは、ADH1プロモーターからの転写に対して正
しい方向に挿入されたdhaB1を有し、かつURA3マーカー
を含有する。

ベクターpMCK4をHind IIIで消化し、脱リン酸化す
る。dhaB1遺伝子を、プラスミドpMP15からHind III断片
として切り出し、pMCK4に結合する。得られたプラスミ
ドは、ADH1プロモーターからの転写に対して正しい方向
に挿入されたdhaB1を有し、かつLEU2マーカーを含有す
る。

dhaB2表現用プラスミドの構築 ベクターpRS404、pRS405およびpRS406をSma Iで消化
する。フランキング・プロモーターおよびターミネータ
ーを有するdhaB2遺伝子を、プラスミドpMCK17からSnaB
I/Nae I断片として切り出し、組換えベクターの各々に
結合する。得られたプラスミドは、ADH1プロモーターか
らの転写に対して正しい方向に挿入されているdhaB2を
有しており、かつLEU2、TRP1またはURA3マーカーのいず
れかを含有する。

実施例11 S.セレビシエのdha形質転換体についてのスクリーニン
グおよびＤ−グルコースの1,3−プロパンジオールへの
転化 S.セレビシエのdha遺伝子についてのスクリーニング Ura⁺、His⁺、Trp⁺またはLeu⁺形質転換体（実施例９お
よび10に記載の通り構築したもの）から得た染色体DNA
を、PCRにより、ピヒア・パストリスについて記載した
ような各遺伝子に特異的なプライマー（配列番号２〜
９）を用いて分析する。

dha遺伝子で形質転換したS.セレビシエによるＤ−グル
コースからの1,3−プロパンジオールの生産 dhaT、dhaB1、dhaB2およびdhaB3を含有する形質転換
体（実施例９および10に記載の通り構築したもの）を、
振盪しながら、29℃で、20mg/Lのアデニンサルフェー
ト、30mg/LのＬ−リジン、1mg/LのビタミンB₁₂を補足し
たSMM中で、好気的または嫌気的に増殖させる。増殖
は、定常期に達するまで継続し、1,3−プロパンジオー
ルの存在をHPLCによって測定する。形質転換体S.セレビ
シエpMCK1/10/17（HM）＃Ａは寄託し、ATCC___と命名し
た。

実施例12 水素雰囲気下でのクロストリジウム・パストリアナム
（Clostridium pasteurianum）（ATCC6013）によるＤ−
グルコースからの1,3−プロパンジオールの生産 クロストリジウム・パストリアナムに一般的な増殖条件 クロストリジウム・パストリアナムATCC6013を、特記
しない限り10mLの培地を含有する60mL容の圧着密封した
血清ビン内で増殖させた。培地を含有するこの圧着ビン
に窒素を無菌的に吹込んだ後で、植菌した。ベース培地
（培地Ａ）（pH7.2に調整したもの）は、以下の成分（g
/L）:1.4のKH₂PO₄、0.69のNaH₂PO₄、1.8〜2.5のNH₄Cl、
0.50のKCl、0.50のMgSO₄・7H₂O、0.025のCaCl₂、1.0のN
aCl、2.0の酵母エキス、0.50のシステイン・HCl、2.5の
重炭酸ナトリウム、0.0080のｐ−アミノ安息香酸、0.00
0040のビオチン、0.01のクエン酸ナトリウム・2H₂O、0.
050のFeSO₄・7H₂O、0.010のCoCl₂・6H₂O、0.0010のMnCl
₂・4H₂O、0.00050のZnCl₂、0.0025のNa₂MoO₄・2H₂O、0.
010のNiCl₂・6H₂O、および0.0050のCuSO₄・5H₂Oを含有
しており、そこに、炭素成分を以下に示すように添加し
た。全てのインキュベーションは、30℃で、250rpmで振
盪しながら行った。

５％グルコースを補足した培地Ａの10mL容バッチに、
約15％（v/v）のグリセロールを含有するクロストリジ
ウム・パストリアナムATCC6013の凍結保存物1mLを２連
で接種した。96時間後、0.5mLの増殖細胞懸濁液を10mL
の新たに調製した培地に継代し、増殖を継続した。24時
間後、新たに接種したビンの中の雰囲気を水素を用いて
30psiの気圧に保ち、インキュベーションをさらに96時
間にわたって継続した。その水相を、最後の96時間の最
初と最後にサンプリングし、一般的方法の欄に記載され
ているようなHPLCによる分析に供した。結果を表11に示
す。

実施例13 メチルビオローゲン存在下でのクロストリジウム・パス
トリアナムATCC6013によるＤ−グルコースからの1,3−
プロパンジオールの生産 実験1.全細胞を実施例12のプロトコールにしたがって増
殖させた。10mL容バッチの５％グルコースを補足した培
地Ａ（実施例12に記載のもの）に、1mLのクロストリジ
ウム・パストリアナムATCC6013の凍結保存（約15％（v/
v）のグリセロールを含有）を２連に接種した。96時間
後、0.5mLの増殖細胞懸濁液を10mLの新たに調製した培
地に継代し、増殖を継続した。24時間後、メチルビオロ
ーゲン（1,1′−ジメチル−4,4′−ビピリジニウムジク
ロライド）を、新たに接種したビンに1mMの最終濃度で
添加して、インキュベーションをさらに96時間にわたっ
て継続した。水相を、最後の96時間の開始時および最後
にサンプリングして、一般的方法の欄に記載のようなHP
LCによる分析に供した。結果を表12に示す。

実験2:1％（v/v）グリセロール＋１％（w/v）グルコー
スを補足した培地Ａを、クロストリジウム・パストリア
ナムATCC6013の凍結ストック（約15％（v/v）のグリセ
ロールを含有）で培地20mL当たり凍結ストックを0.2mL
の比率で接種した。48時間後、10mLの細胞懸濁液を90mL
の新たに調製した培地に添加して、増殖を24時間にわた
って継続した。100mLの細胞懸濁液を氷上で冷却し、嫌
気的条件下で遠心分離によって細胞を集めた。この細胞
を嫌気的緩衝液（50mMリン酸緩衝液（pH7.2）＋0.5g/L
システイン・HCl、予めN₂を吹込み、N₂下でオートクレ
ーブ処理したもの）で３回洗浄し、嫌気的緩衝液に再懸
濁して8mLとした。２連の実験では、1mLのこの細胞懸濁
液を、10mLの培地Ａ（１％グルコースおよび0mM、1mM、
5mMまたは10mMのメチルビオローゲンを補足したもの）
に接種し、240時間にわたってインキュベートした。最
後の240時間の開始時と最後に水相をサンプリングし
て、一般的方法の欄に記載のようなHPLCによる分析に供
した。結果を表13に示す。

実験3:クロストリジウム・パストリアナニウムATCC6013
を最初にチオグリコレート培地（Difco（登録商標））
に保持し、続いて行われる全ての研究用として、0.4％
グルコースを補足した培地Ａに移した。後者の培地に数
回移した後、保存培養物の1mLのアリコートを10mLの上
記の培地中で一夜増殖させることによって、接種材料を
調製した。新たに調製した培地のビン中にメチルビオロ
ーゲンを表14に記載のような濃度で含有する一連の血清
ビンに、1mLの上記一夜の培養物を接種し、表14に記載
の時間にわたって再度インキュベートした。ビンは、グ
ルコース利用性（glucose utilization）を測定するた
めに一定時間毎にサンプリングし、1,3−プロパンジオ
ールおよびグルコースの存在を一般的方法の欄に記載の
ようにしてHPLCにより分析した。表14には、その分析結
果をまとめる。

実施例14 バシルス、ストレプトミセスおよびシュードモナス種の
形質転換に使用するための汎用表現プラスミドの構築 表現ベクターpTacIQ 大腸菌表現ベクターであるpTacIQは、pBR322（Sutcli
ffeら、Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.43,77（197
9））のEcoR Iに挿入されたlacIq遺伝子（Farabaugh,Na
ture 274,5673（1978））およびtacプロモーター（Aman
nら、Gene 25,167（1983））を含有する。複数のクロー
ニング部位およびターミネーター配列（配列番号10）
は、pBR322配列を、EcoR IからSph Iへと置き換える。

グリセロールデヒドラターゼ遺伝子（dhaB1,2,3）のサ
ブクローニング dhaB3遺伝子に対するオープン・リーディング・フレ
ームを、pHK28−26から、PCRにより、プライマー（配列
番号41および42）を用いて、EcoR I部位を５′末端に、
およびXba I部位を３′末端に組込んで増幅した。生成
物をpLitmus29（New England Biolab社,Inc.,Beverly,M
A）にサブクローニングして、dhaB3含有するプラスミド
pDHAB3を得た。

pHK28−26から得たdhaBオペロンの４種の遺伝子に対
する全コード領域を含有する領域を、制限酵素Kpn Iお
よびEcoR Iを用いてpBluescript II KS⁺（Stratagene
社,La Jolla,CA）にクローニングして、プラスミドpM7
を調製した。

このdhaB X遺伝子は、dhaB（1,2,3,4）を含有するプ
ラスミドpM7を、Apa IおよびXba Iで消化すること（dha
B3の部分およびdhaB Xの全部を欠失すること）によって
取り出した。得られた5.9kbの断片を精製し、プラスミ
ドpDHAB3（dhaB3遺伝子を再保存している）から得られ
た325bpのApa I−Xba I断片に結合して、dhaB（1,2,3）
を含有するpM11を調製した。

dhaB1遺伝子に対するオープン・リーディング・フレ
ームを、pHK28−26から、PCRにより、プライマー（配列
番号11および12）を用いて増幅し、Hind III部位および
コンセンサスRBSリボソーム結合部位を５′末端に、お
よびXba I部位を３′末端に組込んだ。この生成物を、p
Litmus28（New England Biolab,Inc.）にサブクローニ
ングして、dhaB1を含有するプラスミドpDT1を得た。

dhaB1遺伝子、dhaB2遺伝子およびdhaB3遺伝子の一部
を含有するpM11から得たNot I−Xba I断片をpDT1に挿入
して、dhaB表現プラスミドを作製した。pDT2から得たdh
aB（1,2,3）遺伝子を含有するHind III−Xba I断片をpT
acIQに挿入して、pDT3を調製した。

1,3−プロパンジオールデヒドラターゼ遺伝子（dhaT）
のサブクローニング 完全な1,3−プロパンジオールデヒドラターゼ（dha
T）遺伝子を含有する、pHK28−26のKpn I−Sac I断片
を、pBluescript II KS⁺にサブクローニングして、プラ
スミドpAH1を構築した。このdhaT遺伝子を、鋳型DNAと
してpAH1から、PCRにより、合成プライマー（配列番号1
3と配列番号14）を用いて増幅して、Xba I部位を５′末
端に、およびBamH I部位を３′末端に組込んだ。この生
成物をpCR−Script（Stratagene社）のSrf I部位にサブ
クローニングして、dhaTを含有するプラスミドpAH4およ
びpAH5を得た。プラスミドpAH4は、dhaT遺伝子を、pCR
−Scriptにおけるlacプロモーターからの表現に対して
正しい方向に含有し、pAH5は、dhaT遺伝子をその逆方向
に含有する。dhaT遺伝子を含有するpAH4から得たXba I
−BamH I断片を、pTacIQに挿入して、プラスミドpAH8を
得た。RBSおよびdhaT遺伝子を含有するpAH8から得たHin
d III−BamH I断片をpBluescript II KS⁺に挿入して、p
AH11を構築した。RBSを含有するpAH8から得たHind III
−Sal I断片、dhaT遺伝子およびターミネーターをpBlue
script II KS⁺に挿入して、pAH12を作製した。

dhaB（1,2,3）およびdhaTの表現カセットの構築 dhaB（1,2,3）およびdhaTのための表現カセットは、
上記のdhaB（1,2,3）およびdhaTサブクローンの各々か
ら、標準的な分子生物学的方法を用いてアセンブリし
た。RBSを含有するPAH8から得たSpe I−Kpn I断片、dha
T遺伝子およびターミネーターをpDT3のXba I−Kpn I部
位に挿入して、pAH23を作製した。pAH23のdhaB3遺伝子
とdhaT遺伝子との間にあるSma I−EcoR I断片を除去し
て、pAH26を作製した。pPDT2由来のEcoR I部位を含有す
るSpe I−Not I断片を用いて、pAH26のSpe I−Not I断
片を置き換えて、pAH27を得た。

dhaTおよびdhaB（1,2,3）の表現カセットの構築 dhaTおよびdhaB（1,2,3）の表現カセットを、前述のd
haB（1,2,3）およびdhaTサブクローンの各々から、標準
的な分子生物学的方法を用いてアセンブリした。pDT3由
来のdhaB（1,2,3）遺伝子を含有するSpe I−Sac I断片
をpAH11のSpe I−Sac I部位に挿入して、pAH24を作製し
た。

実施例15 組換えストレプトミセス・リビダンスによる1,3−プロ
パンジオールの生産 グルコースイソメラーゼ・プロモーターのサブクローニ
ング ベクターpCOs121（配列番号15）またはpCO121low（配
列番号16）から得たグルコースイソメラーゼ・プロモー
ターの２種類のバージョンをPCRによって、プライマー
（配列番号17および18）を用いて増幅して、Spe Iおよ
びEcoR I位を５′末端に、およびHind III部位を３′末
端に組込んだ。この生成物をpLitmus29（New England B
iolabs,Inc.,Berverly,MA）にサブクローニングして、
プラスミドpDT7およびpDT8を得た。

dhaB（1,2,3）およびdhaTの表現カセットの構築 pAH27（実施例14）由来のdhaB（1,2,3）およびdhaTの
ための4.1kbの表現カセットを、制限酵素Hind IIIおよ
びSal Iを用いてpDT7またはpDT8に挿入して、pDT11およ
びpDT12をそれぞれ得た。

ストレプトミセスにおけるdhaB（1,2,3）およびdhaTの
同時表現用のプラスミドの構築 4.3kbのdhaB（1,2,3）およびdhaTの表現カセットを、
EcoR IおよびSal Iによる消化によりpDT11またはpDT12
から取り出した。ベクターpIJ488−101を制限酵素EcoR
IおよびXba Iで消化した。この表現カセットおよびベク
ターをSal−Xbaリンカー（配列番号19および20）と共に
結合し、pDT13およびpDT14をそれぞれ作製した。

pIJ488−101は、ストレプトミセス・リビダンス（Ken
dallおよびCohen,J.Bacteriol.170,4634（1988））から
得たpIJ101からの複製起点および大腸菌から得たpUC18
から構成される。これらの配列は、以下に由来する。す
なわち、１〜2086番目の塩基はpIJ101（１〜2086）由来
であり、7688〜8437番目の塩基はpIJ101（8080〜8830）
由来である。2087〜3368番目の塩基は、S.アズレウス
（S.azureus）（Thompsonら、Gene,20,51（1982））か
らのチオストレプトン耐性遺伝子由来である。3369〜76
87番目の塩基は、Kpn I部位に挿入されたS.エリスレウ
ス（S.erythreus）（前出のThompsonら）からのエリス
ロマイシン耐性遺伝子を含有するpUC18由来である。

ストレプトミセス・リビダンスのdhaB（1,2,3）およびd
haTによる形質転換 プラスミドpDT13またはpDT14を、標準的な原形質形質
転換技術（Hopwoodら、Genetic Manipulation of Strep
tomyces,The Johns Foundation（1985））を用いてスト
レプトミセス・リビダンスTK23に形質転換した。形質転
換体は、50μg/mL）のチオストレプトンを含有する培地
（plate）上で選択して、30℃でインキュベートした。
形質転換体から得た胞子を再度培地に拡げて、純粋な培
養物を得た。

グリセロールデヒドラターゼ活性の検出 ストレプトミセス形質転換体を25mLのTSB（トリプト
ンソイブロス;Difco,Detroit,MI;さらに、１％グルコー
ス、２％グリセロール、1mg/LビタミンB₁₂、50μg/mLチ
オストレプトンを補足したもの）で30℃で３日間にわた
って増殖させた。細胞を遠心分離により収集し、1mLの1
00mMトリス緩衝液（pH7.4）に再懸濁した。細胞をフレ
ンチプレス（20,000psi）を用いて破砕し、細胞抽出物
を、一般的方法の欄に記載のようにしてグリセロールデ
ヒドラターゼについてアッセイした。pDT13またはpDT14
のいずれかにより形質転換したS.リビダンスTK23（それ
ぞれ、クローン番号８またはクローン番号２）から得た
細胞抽出物は、0.1U/mgの比活性を有するグリセロール
デヒドラターゼを含有していた。

組換えストレプトミセス・リビダンスにおける1,3−プ
ロパンジオールの生産 S.リビダンスTK23/pDT14（クローン番号２）（ATCC__
_、S.リビダンス株SL14.2としても同定される）をTSAプ
レートから接種し、250mL容のフラスコに入れた25mLのT
SB（トリプトンソイブロス,Difco,Detroit,MI;さらに、
１％グルコース、２％グリセロール、1mg/Lビタミン
B₁₂、50μg/mLチオストレプトンを補足したもの）中で
増殖させた。振盪フラスコを30℃で激しく振盪しながら
３日間にわたってインキュベートし、その後、一般的方
法の欄に記載のようにして、上清のGC−MS分析（TMS誘
導体）により、3mg/Lの1,3−プロパンジオールを検出し
た。

実施例16 組換えストレプトミセス・リビダンスを用いたＤ−グル
コースからの1,3−プロパンジオールの生産 1,3−プロパンジオール生産を証明するための、pDT13
またはpDT14を含有するストレプトミセス・リビダンスT
K23における増殖は、30℃で振盪フラスコ培養（エルレ
ンマイヤー・フラスコ、液体体積：全容積の1/10）で好
気的に行う。

富培地（rich media）の振盪フラスコにおける培養
は、２日経過したTSAプレート（トリプチダーゼソイ寒
天、BBL＃11043）から接種することにより開始する。豊
富培地は、TBS（トリプチカーゼソイブロス;BBL＃1176
8）、液体ブイヨン（1L当たり、16gのトリプトン、10g
の酵母エキス、および5gのNaClを含有）、培地Ｂ（1L当
たり、10.0gのグルコース、NTAをクエン酸に置き換えた
2mLの改変バルヒ（Balch）微量元素溶液、2.0gのNa₂C
O₃、4.0gのK₂HPO₄、1mgのビタミンB₁₂を補足したTSB、
最終pH＝7.2）、または培地Ｃ（培地Ｂ、pH6.4）のいず
れかである。改変バルヒ微量元素溶液の組成は、Method
s for General and Molecular Bacteriology（P.Gerhar
dtら編、p.158,American Society for Microbiology,Wa
shington,D.C.（1994））に見出すことができる。最少
培地振盪フラスコ内での培養は、２日経過した液体TSB
培養物から、1/30（v/v）の接種材料を用いて接種する
ことにより開始する。最少培地は、MM322（1L当たり、1
2.0gのグルコース、11.3gのK₂HPO₄、1.0gの（NH₄）₂S
O₄、0.2gのDifco酵母エキス、0.1gのNaCl、2mgのビタミ
ンB₁₂、および10mLの上記のように改変した改変バルヒ
微量元素溶液を含有、最終pH6.7（HCl））、培地Ｄ（1L
当たり2gのNa₂CO₃を補足した培地MM322、最終pH7.2）、
または培地Ｅ（培地D,最終pH6.4）である。培地Ｂおよ
びＣおよび最少培地は、濾過滅菌し、他の培地はオート
クレーブ処理する。

振盪フラスコを、30℃で激しく振盪しながら２日間に
わたってインキュベートし、その後、それらをサンプリ
ングして、上清をHPLC分析に供する。グルコースを添加
し、培養物を１時間にわたって好気的条件下でインキュ
ベートし、その後、培養物を25mL容のガラス管（ほどん
ど上まで一杯になる）に移す。続いて、これらの管を嫌
気的条件下で30℃でインキュベートする。２〜５日間イ
ンキュベートした後、上清中の1,3−プロパンジオール
をHPLCによって一般的方法の欄に記載の通り検出する。

実施例17 汎用プラスミド、バシルスでのdhaB（１−３）およびdh
aTの過剰表現用プラスミドの構築、および組換えB.リヘ
ニフォルミスおよびB.サチリスによる1,3−プロパンジ
オールの生産 汎用表現プラスミドの構築 複製性高コピー数シャトルベクターpVS02を用いて、d
haB（１−３）およびdhaTをバシルス中で同時表現させ
る。pVS02は、B.サチリスaprプロモーターに融合したバ
シルス・レンタス（Bacillus lentus）由来のアルカリ
セリンホスファターゼを担持するEcoR I/BamH I断片
を、pBS19にクローニングすることによって構築した。p
BS19は、pBS42（BandおよびHenner,DNA 3,17（1984））
の誘導体であり、そこにおいて、EcoR I/BamH I断片
が、pUC19（Boehringer Mannheim）由来のEcoR I/Hind
IIIポリリンカーで置き換えられている。配列決定およ
びPCR反応を促進するために、45bpの合成リンカー（配
列番号21）を、PCRによってプロテアーゼ遺伝子の終点
と転写ターミネーターとの間に導入した。

複製性低コピー数シャトルベクターpSS15−Ｂを用い
て、dhaB（１−３）およびdhaTをバシルス中で同時表現
させる。プラスミドpSS15−Ｂは、プラスミドpHP13（Ha
imaら、Mol.Gen.Genet.209,335（1987））をHind III/S
al I（ポリリンカーに存在する部位）で消化し、その末
端をT4DNAポリメラーゼで充填（平滑化）し、再度結合
して、pSS13を得た。PVS02から得た2kbのEcoR I/BamH I
断片を、プラスミドpSS13のEcoR I/BamH I部位に挿入し
て、pSS15−Ｂを作製した。

dhaB（１−３）およびdhaTカセットの過剰表現用プラス
ミド dhaTの５′末端にバシルス・コンセンサス・リボゾー
ム結合部位を作製するために、合成プライマー（配列番
号22と配列番号23）をアニーリングすることにより得た
EcoR I/Xbaリンカーを、pAH23のEcoR I/Xba I部位に挿
入して、pM17を得た。Hind III/Bgl IIリンカーを、合
成プライマー（配列番号24と配列番号25）を用いて、プ
ラスミドpM17のHind III/bgl II部位に添加して、dhaB1
の５′末端のSal I部位を導入して、pM20を作製した。
プラスミドpM20から得た0.3kbのMlu I/Kpn I断片を、プ
ラスミドpAH4から得たMlu I/Kpn I断片と置き換えて、H
ind III部位を導入して、pM21を作製した。

Sal I−Xba Iリンカー（配列番号26および27）を、制
限酵素Sal I−Xba Iで消化してあるpAH5に挿入して、pD
T15を作製した。このリンカーは、Xba I部位を破壊して
リーディング・フォームを変化させてdhaT遺伝子がプラ
スミドpSS15−ＢおよびpVS2のプロテアーゼ・コード配
列のオープン・リーディング・フレームと融合するよう
にした。pDT5から得た1kbのSal I−Mlu I断片を、pAH24
に挿入し、既存のSal I−Mlu I断片と置き換えて、pDT1
7を作製した。

Sal I−Xba Iリンカー（配列番号28および29）を、制
限酵素Sal I−Xba Iで消化したpAH5に挿入して、pDT16
を作製した。このリンカーは、Xba I部位を破壊してリ
ーデング・フォームを変化させてdhaT遺伝子がプラスミ
ドpUSH1（SchonおよびSchuman、Gene 147,91（1994））
のポリ−Hisコード配列のオープン・リーディング・フ
レームと融合するようにした。pDT16から得た1kbのSal
I−Mlu I断片を、pAH24に挿入し、既存のSal I−Mlu I
断片と置き換えて、pDT18を作製した。

プラスミドpDT4（dhaB（１−３）を含有）は、pDT2か
ら得た2.7kbのEcoR I/Xba I断片を、EcoR I/Xba Iで消
化したpUC18（Boehringer Mannheim）に導入することに
よって構築した。

バシルスにおけるdhaTおよびdhaB（１−３）カセットの
過剰表現用プラスミド pDT17をSac Iで消化し、末端をT4DNAポリメラーゼで
充填し、このDNAをSal Iで消化して、dhaTおよびdhaBを
含有する断片を遊離した。この断片を、Hind III（末端
はT4DNAポリメラーゼで平滑化してある）およびSal Iで
消化したpSS15−Ｂに結合して、pM27を作製した。

lacをベースとする誘導系を用いたバシルスにおけるdha
B（１−３）の過剰表現用プラスミド プラスミドpDT4から得たdhaB（１−３）を含有する2.
7kbのBgl II/Hind III断片を、pUSH1のポリリンカーに
あるHind III/BamH I部位にクローニングして、pM26を
作製した。このdhaB1遺伝子をpUSH1のポリHisコード配
列のオープン・リーディング・フレームに融合させた。

プラスミドのバシルスへの形質転換 プラスミドpM26およびpM27を、自然の形質転換（McCu
enおよびThome,J.Bacteriol.107,635−645（1971））に
よりB.リヘニフォルミスBG307に形質転換し、それぞ
れ、10ug/mLカナマイシンおよび30ug/mLクロラムフェニ
コールで選択した。同じプラスミドを、標準的な原形質
形質転換技法（Pragaiら、Microbiology,140,305（199
4））を用いてB.リヘニフォルミス株BG188に形質転換
し、上記のようにして選択した。B.サチリス株BG2864
を、自然の形質転換により、プラスミドpM27で形質転換
した。プラスミドを含有する形質転換体を、10ug/mLの
クロラムフェニコールを含有するLAプレート上で選択し
た。

プラスミドpM26も、B.サチリス株1E62（Saitoら、Mo
l.Gen.Genet.,170,117（1979））に形質転換し、プラス
ミドを含有する形質転換体を、10ug/mLのエリスロマイ
シンおよび20ug/mLのカナマイシンを含有するLAプレー
ト上で選択した。

全ての形質転換体を30℃で増殖させた。

グリセロールデヒドラターゼ活性の検出 pM26で形質転換したB.リヘニフォルミス株BG188（ク
ローン番号８）を、25mLのLB（Difco）＋１％グルコー
スおよび10ug/mLのカナマイシン中で、30℃で一夜増殖
させた。この細胞を遠心分離により収集し、1mLの0.1M
トリシン/KOH緩衝液（pH8.2）、50mMのKCl、1mMのジチ
オスレイトールおおび200uMのフェニルメチルスルホニ
ルフルオライドに再懸濁した。細胞をフレンチプレス
（20,000PSI）で破砕することにより細胞抽出物を得、
一般的方法の欄に記載されている通りグリセロールデヒ
ドラターゼについての分析を行った。0.036U/mgの比活
性が得られた。1,3−プロパンジオールデヒドラターゼ
の比活性は、一般的方法の欄に記載の通り測定したとこ
ろ、0.2U/mgであった。

組換えバシルスにおける1,3−プロパンジオールの産生 pM26で形質転換したB.リヘニフォルミス株BG188（ク
ローン番号８）（ATCC___）を、25mLのLB（Difco）＋１
％グルコースおよび10ug/mLのカナマイシンを含有する
振盪フラスコ内で30℃で一夜、激しく振盪させながら増
殖させ、その後、1mLを用いて、25mLのLB＋１％グルコ
ース、１％グリセロール、0.33ug/mLビタミンB12、およ
び10ug/mLカナマイシンを含有する250mL容フラスコに接
種した。振盪フラスコを30℃で激しく振盪しながらイン
キュベートし、９時間増殖させた後、一般的方法の欄に
記載の通りGC/MS（TMS誘導）により、300ug/Lの1,3−プ
ロパンジオールが検出された。

PM27で形質転換したB.サチリス株BG2864（クローン番
号１）（ATCC___）を、25mLのLB＋１％グルコース、１
％グリセロール、0.33ug/mLビタミンB₁₂、および10ug/m
Lのクロラムフェニコールを含有する振盪フラスコ（250
mL容）内で増殖させた。振盪フラスコは、30℃で激しく
振盪しながらインキュベートし、43時間増殖させた後、
1,3−プロパンジオールを検出した。

組換えバシルスにおける３−ヒドロキシプロピオンアル
デヒドの産生 バシルスの発酵を、全容量15.5LのBiolafitte発酵槽
内で、処理体積が最初は７リットルとし、操作を行う間
に9.5リットルまで上昇させた。好気的条件は、空気
を、７リットル／分の速度で、羽根車速度が650rpmで、
および背圧が0.8barで通気させることにより確実にした
［好気的条件は、溶存酸素（DO）の％（100％のDOを大
気圧で定義した）で定義し、インストールしたDOプロー
ブを用いて測定し、最少値35％のDOを好気的であると考
えた］。pHは、10％ H₂SO₄または28％ NH₄OHの自動的添
加により6.70に保持した。温度は30℃に保持した。

下記の化合物をタンクにバッチ添加し121℃で30分間
滅菌した：（g/l）で6NaH₂PO₄・1H₂O、10K₂HPO₄、1.5Na
Cl、10（NH₄）₂SO₄、0.2FeCl₃、1.5トリプトン、６酵母
エキス、10mLバルヒ改変微量元素溶液（Methods for Ge
neral and Molecular Bacteriology（P.Gerhardtら
編）、p.1518,American Society for Microbiology,Was
hington,DC（1994））、および2MAZU DF204（特注消泡
剤）。滅菌後、350gの50％グルコース供給材料をカナマ
イシンおよびクロランフェニコール（ともに最終濃度10
mg/l以下）とともに添加した。

0.6Lの24時間経過したバシルス・リヘニフォルミスBG
188/pM26（クローン番号８）［振盪フラスコで、LBG1％
（＝10gトリプトン、5g酵母エキス5g NaCl10gグルコー
ス）中で増殖させたもの］を用いて、上記発酵槽に接種
した。この培養物を増殖させ、グルコースを排出した。
pHが目標の6.60よりも高くなると、グルコースの供給を
開始した（50％グルコース、オートクレーブ処理、0.7g
/分の速度）。45時間後、栄養物の添加を行った（50ml
のバルヒの微量元素溶液、14gのK₂HPO₄、14gの酵母エキ
ス、14mLのビタミン溶液、pHを6.60に設定、濾過滅
菌）。70時間後、ビタミンB₁₂を、最終濃度が10mg/Lに
なるまで添加した。最初に92時間は、％DOを好気性レベ
ルに保持した。グルコースは、操作を行っている間中、
（多少）過剰に存在した［好気的部分の間（最初の92時
間）では0.2〜12g/L、O₂制限部分（92〜164時間）の間
では、0.2〜36g/L）。87時間後に取り出したサンプルで
は、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの存在が疑わ
れたので、上清サンプルを還元剤である水素化ホウ素ナ
トリウムで処理した後、1,3−プロパンジオールの検出
により確認した。

実施例18 バシルスにおけるdhaTおよびdhaB（１−３）カセットの
過剰表現用の代替プラスミド バシルスにおけるdhaTおよびdhaB（１−３）の過剰表現
用プラスミド プラスミドpM21から得たSal I/Hind III断片（dhaB
（１−３）およびdhaTを含有）を5kbのSal/Hind III pV
S02ベクターと結合して、pM22を作製する。PM22は、dha
BおよびdhaTを、高コピー数ベクター内でapaプロモータ
ー下に有する。

プラスミドpM21から得たSal I/Hind III断片を、pSS1
5−Ｂから得た5.8kbのSal/Hind III断片と結合して、pM
23を作製する。PM23は、低コピー数ベクター内でapaプ
ロモーター下にdhaBおよびdhaTを有する。

バシルスにおけるdhaTおよびdhaB（１−３）カセットの
過剰表現用プラスミド pDT17をSac Iで消化し、末端をT4ポリメラーゼで充填
し、このDNAをSal Iで消化して、dhaTおよびdhaBを含有
する断片を放出する。この断片を、Hind III（末端をT4
DNAポリメラーゼで平滑化した）およびSal Iで消化した
pVS02と結合して、pM25を得る。

lacをベースとする誘発系を用いたバシルスにおけるdha
TおよびdhaB（１−３）の過剰表現用プラスミド pDT18をSac Iで消化し、末端をT4ポリメラーゼで充填
し、このDNAをSal Iで消化して、dhaTおよびdhaB（この
両方の遺伝子は、バシルス・コンセンサス・リボゾーム
結合部位を含有）を含有する断片を放出する。この断片
を、Hind III（末端をT4DNAポリメラーゼで平滑化し
た）およびSal Iで消化したpVS02と結合して、pM24を得
る。

実施例19 組換えバシルスによるＤ−グルコースの1,3−プロパン
ジオールへの転化 バシルスの増殖条件 バシルス・リヘニフォルミスおよびバシルス・サチリ
スによる1,3−プロパンジオール産生を証明するための
増殖は、（指示するように）30℃または35℃で、振盪フ
ラスコ培養（エルレンマイヤー・フラスコ）中および1
5.5L（全容積）容のBiolafitte発酵槽（処理容積:7〜10
L）中で好気的に進行する。

LBG（1L当たり、16gのトリプトン、10gのグルコー
ス、10gの酵母エキス、および5gのNaClを含有）振盪フ
ラスコ中での培養は、１日経過のTSAプレート（トリプ
チカーゼソイ寒天、BBL＃11043）から接種することから
開始する。これらの振盪フラスコを用いて、発酵槽また
は振盪フラスコのいずれかに接種し、そこにおいて、Ｄ
−グルコースの1,3−プロパンジオールへの転化に固有
の証拠が示される。

振盪フラスコでのバッチ培養 富培地は、TSB（トリプチカーゼソイブロス;BBL＃117
68）、LBG、培地Ｂ（1L当たり、10.0gのグルコース、2m
LのNTAがクエン酸で置き換わっている改変バルヒの微量
元素溶液、2.0gのNa₂CO₃、4.0gのK₂HPO₄、1mgのビタミ
ンB₁₂補足したTSB、最終pH＝7.2）、または培地Ｃ（培
地Ｂ、pH6.4）のいずれかである。改変バルヒの微量元
素溶液の組成は、改変バルヒ微量元素溶液の組成は、Me
thods for General and Molecular Bacteriology（P.Ge
rhardtら編、p.158,American Society for Microbiolog
y,Washington,D.C.（1994））に見出すことができる。
最少培地は、MM322（1L当たり、12.0gのグルコース、1
1.3gのK₂HPO₄、1.0gの（NH₄）₂SO₄、0.2gのDifco酵母エ
キス、0.1gのNaCl、2mgのビタミンB₁₂および10mLの上記
のように改変した改変バルヒ微量元素溶液を含有、最終
pH6.7（HCl））、培地Ｄ（1L当たり2gのNa₂CO₃を補足し
た培地MM322、最終pH7.2）、または培地Ｅ（培地D,最終
pH6.4）のいずれかである。培地ＢおよびＣおよび最少
培地は、濾過滅菌し、他の培地はオートクレーブ処理す
る。

振盪フラスコを、30℃で激しく振盪しながら１日間に
わたってインキュベートし、その後、それらをサンプリ
ングして、上清をHPLC分析に供する。グルコースを添加
し、培養物を１時間にわたって好気的条件下でインキュ
ベートし、その後、培養物を25mL容のガラス管（ほとん
ど上まで一杯になる）に移す。続いて、これらの管を嫌
気的条件下で30℃でインキュベートする。１〜５日間イ
ンキュベートした後、上清中の1,3−プロパンジオール
をHPLCによって一般的方法の欄に記載の通り検出する。

発酵槽内でのバッチ培養および添加バッチ培養 振盪フラスコからの全容量600mlの培養物（LBG培地）
を用いて、発酵槽に6.4Lの培地を接種し、１バッチと
し、30分間（最少培地）または45分間（富培地）にわた
ってオートクレーブ処理する。この発酵槽における典型
的な最少培地は培地Ｄであり、典型的な「富（rich）」
培地は、さらに50gの酵母エキス（/L）を含有する培地
Ｄである。オートクレーブ処理してある濾過滅菌した添
加物（ビタミンB₁₂、または栄養要求に対する補償物
質）の添加を、発酵槽の蓋にあるシリンジ（syringue）
および隔膜ポートを用いて発酵後に行う。

背圧（BP、0.1〜0.5bar）、通気（１分間当たりの空
気の量（Ｌ）、0.4〜1vvm）、攪拌（rpm、200〜600）、
温度（Ｔ、30〜37℃）、溶存酸素（％DO）、およびpH
（5.8〜7.2、NH₄OHおよびH₂SO₄またはH₃PO₄の添加）を
モニターし、指示通りの所望の値に調整する。

接種を行った後、細胞をバッチ内で最初の14時間にわ
たって増殖させ、その後、グルコースの供給を開始す
る。嫌気的な増殖／産生では、指示通りrpmおよびBPの
いずれかを低下させ、さらに流入する空気をN₂で置き換
えることにより％DOが０％になるようにする。

発酵槽および振盪フラスコをサンプリングして、我々
の標準的な手順にしたがって（一般的方法の欄に概説さ
れている）、上清をOD₅₅₀の読取（増殖）および酵素的
グルコース・アッセイに供し、上清をさらにHPLC分析用
に調製する。上清には、1,3−プロパンジオールが存在
する。

実施例20 dhaB（1,2,3）およびdhaTによるシュードモナスの形質
転換および1,3−プロパンジオール産生の実証 シュードモナスにおけるdhaB（1,2,3）およびdhaTの同
時表現用プラスミドの構築 pAH27から得たdhaB（1,2,3）およびdhaTのための4.1k
bの表現カセットを、制限酵素EcoR IおよびSal Iを用い
て、ベクターpMMB66EH（Fusteら、Gene,48,119（198
6））およびpMMB207（Moralesら、Gene,97,39（199
1））に挿入して、pDT10およびpDT9をそれぞれ作製し
た。

pDT9表現プラスミドによるP.エルギノーサPAO2845の形
質転換 P.エルギノーサPAO845細胞は、Ｌ−ブイヨン中で、37
℃で、200rpmで振盪しながら一夜増殖させることにより
形質転換用に調製した。この培養物の1:25の接種を25mL
の新たに予備加温し予備通気したＬ−ブイヨンに行っ
た。この新たな培養物を、初期対数期まで、37℃、200r
pmで２〜３時間インキュベートした。遠心分離により回
収した細胞を、10mLの氷冷した0.15M MgCl₂（５％ジメ
チルスルホキシドを含有）で２回洗浄し、2mLのジメチ
ルスルホキシド溶液に再懸濁した。この細胞懸濁液（0.
2mL）を、100〜200ngのpDT9 DNAと合わせ、氷上に60分
間にわたって静置した。この反応混合物に37℃で２分間
にわたって熱ショックを与え、氷に５分間にわたって移
した。Ｌ−ブイヨン（0.5mL）を添加し、細胞を20分間
にわたって37℃でインキュベートした。37.5ug/Lのクロ
ラムフェニコールを補足した栄養寒天プレートから単一
コロニーを得た。

pDT10のP.エルギノーサPAO1への接合転移（conjugal tr
ansfer） プラスミドpDT10を、FigurskiおよびHelinskiの方法
（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,76,1648（1979））によ
りPA01に交配した（mated）。pDT10を大腸菌AC80（Chak
rartyら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,75,3109（197
8））に形質転換して、ドナー菌株を作製した。ヘルパ
ー菌株は、pRK2013（FugurskiおよびHelinski、前出）
を含有する大腸菌HB101であった。受容菌株は、シュー
ドモナス・エルギノーサPAO1（Royleら、J.Bacteriol.,
145,145（1981））」であった。上記菌株の各々の培養
物（5mL）をLB中で37℃で一夜増殖させた。細胞を0.9％
NaClで洗浄し、200μＬに再懸濁した。この細胞を一緒
に混合して、LAプレート（Luira Agar,Difco）に拡げ
た。このプレートを、37℃で６時間にわたってインキュ
ベートした。細胞をプレートから取り出し、250μg/mL
のカルベニシリンを含有するPIA（Difco）プレートに移
し、一夜増殖させた。同じ培地から単一コロニーを単離
した。

グリセロールデヒドラターゼおよび1,3−プロパンジオ
ールデヒドラターゼの活性の検出 シュードモナス・エルギノーサPAO1/pDT10を、25mLの
2XYT（16g/Lの酵母エキス、16g/Lのトリプトン、5g/Lの
NaCl）（250μg/mLのカルベニシリン、0.1mMのIPTGを補
足したもの）で37℃で一夜増殖させた。細胞を遠心分離
により収集し、1mLの100mMトリス緩衝液（pH7.4）に再
懸濁した。細胞をフレンチプレスで15,000psiで破砕し
た。粗抽出物を、標準的なアッセイを用いて、グリセロ
ールデヒドラターゼおよび1,3−プロパンジオールデヒ
ドラターゼの活性についてアッセイした。タンパク質の
測定は、Bio−Rad（Bradford）Protein Assayにより行
った。グリセロールデヒドラターゼの比活性は5U/mgで
あった。1,3−プロパンジオールデヒドラターゼの比活
性は20U/mgであった。同様にして調製した、pDT9で形質
転換したP.エルギノーサPAO2845の粗抽出物は、0.05U/m
gのグリセロールデヒドラターゼ活性を含有していた。

プラスミドpDT9を含有するシュードモナス・エルギノー
サによる1,3−プロパンジオールの産生 pDT9プラスミドを含有するシュードモナス・エルギノ
ーサPAO2845（ATCC 55760）を、37℃で一夜、200rpmで
振盪させながら、25μg/mLのクロラムフェニコールを補
足した2XYT培地中で増殖させた。一夜増殖させた後、細
胞懸濁液のアリコートを、増殖培地（３部の2XYT培地＋
１部のHEPES0.1培地;0.25％（w/v）のグルコース、0.2
％（w/v）のKNO₃、25μg/mLのクロラムフェニコール、5
0mg/Lの酵母エキス、および80mg/Lの栄養ブロスを補足
したもの）に移し、OD₆₆₀が0.5〜0.8AUの細胞懸濁液を
得た。HEPES0.1培地は以下の成分を含有する。すなわ
ち、NH4Cl9.52mM;MgCl₂・6H₂O0.523mM;K₂SO₄0.276mM;HE
PES（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ−
［２−エタンスルホン酸］）40mM;トリシン（Ｎ−トリ
ス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）4mM;FeSO₄・7
H₂O0.010mM;K₂HPO₄0.132mM;および以下の成分の最終濃
度（g/L）を付与する微量の無機質：クエン酸ナトリウ
ム・6H₂O0.001、FeSO₄・7H₂O0.0005、CoCl₂・6H₂O0.000
1、MnCl₂・4H₂O0.00001、ZnCl₂0.000005、Na₂MoO₄・2H₂
O0.000025、、NiCl₂・6H₂O0.0001、CuSO₂・2H₂O0.00005
である。30℃で250rpmで振盪しながら約１時間増殖させ
た後、0.5mMのIPTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラ
クトシド）をその増殖培地に添加し、細胞の増殖を継続
した。さらに約５時間にわたって増殖させた後、細胞を
遠心分離によって室温で回収した。細胞を産生培地（0.
25％（w/v）のグルコース、0.2％（w/v）のKNO3、25μg
/mLのクロラムフェニコール、50mg/Lの酵母エキスおよ
び80mg/Lの栄養ブロスを補足したHEPES0.1培地）で３回
洗浄した。２連で、洗浄した細胞を、0.2％（v/v）のグ
リセロールを含有する産生培地に最初に回収した体積に
なるよう再懸濁した。細胞懸濁液を窒素雰囲気下で30℃
で250rpmで振盪しながらインキュベートした。約１時間
後、５μg/mLの補酵素B₁₂（5,6−ジメチル−ベンズイミ
ダゾリルコパミド５−デオキシアデノシン）をその細胞
懸濁液に添加し、インキュベートを30℃で250rpmで振盪
しながら継続した。細胞懸濁液のサンプルを一定期間毎
に集め、生成物の分析に供した。回収に際して、細胞
を、サンプルから遠心分離によって除去し、水系の上清
を分析するまで凍結保存した。

認証標準物質に基づく検定を伴うHPLCによる分析によ
り、これらの細胞懸濁液が1,3−プロパンジオールを産
生したことを示した。この結果を表15に示す。産生物の
同定は、一般的方法の欄に記載の通りGC/MSにより確認
した。

実施例21 シュードモナス・エルギノーサを用いたＤ−グルコース
からの1,3−プロパンジオールの産生 PGSC（Pseudomonas Genetic Stock Center,East Caro
lina School of Medicine,Greenville,NC）からのシュ
ードモナス・エルギノーサ株PAO2845をベース培地HEPES
0.1で増殖させる。この培地は以下の成分であった。す
なわち、NH₄Cl9.52mM;MgCl₂・6H₂O0.523mM;K₂SO₄0.276m
M;HEPES（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−
Ｎ−［２−エタンスルホン酸］）40mM;トリシン（Ｎ−
トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）4mM;FeSO
4・7H₂O0.010mM;K₂HPO₄0.132mM;および以下の成分の最
終濃度（g/L）を付与する微量の無機質：クエン酸ナト
リウム・6H₂O0.001、FeSO₄・7H₂O0.0005、CoCl₂・6H₂O
0.0001、MnCl₂・4H₂O0.00001、ZnCl₂0.000005、Na₂MoO₄
・2H₂O0.000025、NiCl₂・6H₂O0.0001、CuSO₂・2H₂O0.00
005である。HEPES0.1は全ての実験に用いる。補足成分
がある場合には特記する。

遺伝子分断によるP.エルギノーサPAO2845のグリセロー
ル陰性突然変異体の構築 P.エルギノーサPAO2845は、栄養ブロス（Difco、Detr
oit,MI）で37℃で200rpmで振盪させながら一夜増殖させ
る。細胞を遠心分離により回収し、DNAを細胞から標準
的なアルカリ溶菌操作（Sambrook 1989）により抽出す
る。glpR（グリセロール代謝調節タンパク質遺伝子、Ge
nbank ACCESSION＃60805）のオープン・リーディング・
フレームを、P.エルギノーサPAO2845から、PCRにより、
プライマーJJ−gplR−５′およびJJ−glpR−３′（それ
ぞれ配列番号30および31）を用いて増幅し、EcoR I部位
を５′末端に組込む。このDNA断片を、プラスミドpARO1
80（Parke,Gene 93,135,（1990））に、その特異的なEc
oR I切断部位に結合して、プラスミドpJJ10を得る。PJJ
10結合反応混合物から得たDNAで形質転換した大腸菌
を、50μg/mLのアンピシリンおよび0.08mg/mLのXgal
（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラ
クトシド）を含有する栄養寒天（Difco,Detroit,MI）に
拡げる。白色のコロニーはglpR挿入の可能性が高いこと
を示すものであり、これを拾い上げて、50μg/mLのアン
ピシリンを補足したLB培地に移す。37℃で200rpmで振盪
させながら一夜増殖させた後回収した細胞から、pJJ10D
NAを回収する。

pUC4K（Pharmacia Cat.No.27−4958−01）から得たカ
ナマイシン・カセット領域をPCRにより、適当に設計し
たプライマー（配列番号32および33）を用いて、該領域
を増幅して、フラグメントの末端を制限酵素Sty1（Prom
ega社,Madison,WI）に適合するように修飾して、4kbの
断片pUC4K−sty1を得る。このpUC4K−sty1DNA断片を、
プラスミドpJJ10のglpR遺伝子内にあるSty1部位にサブ
クローニングして、プラスミドpJJ11を得る。PJJ11結合
反応混合物から得たDNAで形質転換した大腸菌を、25μg
/mLのカナマイシンおよび50μg/mLのアンピシリンを補
足したLB培地に拡げる。５〜20個の単離コロニーから得
たDNAをそれぞれ回収して、続いて25μg/mLのカナマイ
シンおよび50μg/mLのアンピシリンを補足したLB培地で
37℃で一夜増殖させる。所望のプラスミドDNAの存在を
ゲル電気泳動により確認する。

P.エルギノーサPAO2845を標準的なプロトコールに従
ってpJJ11DNAで形質転換する。簡単に述べると、P.エル
ギノーサの細胞を、Ｌ−ブイヨンで37℃で一夜、200rpm
で振盪しながら増殖させることにより、形質転換用に調
製する。この一夜の培養物の1:25の接種を25mLの新たに
予備加温し予備通気したＬ−ブイヨンで行う。この新た
な培養物を、37℃、200rpmで２〜３時間（初期対数期ま
で）インキュベートする。細胞を遠心分離し、上清をデ
カンテーションする。回収した細胞を、10mLの氷冷した
無菌0.15M MgCl₂（５％ジメチルスルホキシドを含有）
に再懸濁し、氷上で５〜10分間にわたって保持する。細
胞を遠心分離し、上清から分離し、10mLの氷冷した無菌
0.15M MgCl₂（５％ジメチルスルホキシドを含有）に再
懸濁し、氷上で５〜10分間にわたって保持する。最後の
遠心分離および上清からの分離を行った後、細胞を2mL
の氷冷した無菌0.15M MgCl₂（５％ジメチルスルホキシ
ドを含有）に再懸濁する。この冷細胞濃縮物の0.2mLの
アリコートを、100〜200ngのpJJ11 DNAと一緒に合わせ
て、予め冷却しておいた1.5mL容のポリプロピレン製遠
沈管に入れ、この混合物を氷上に60分間にわたって保持
する。この遠沈管を迅速に37℃の水浴に２分間にわたっ
て移し、直ちに氷中に５分間にわたって戻す。約0.5mL
のＬ−ブイヨンを添加し、細胞を0.3〜１時間にわたっ
て穏やかに振盪しながら37℃でインキュベートする。回
収インキュベーションに続いて、この細胞懸濁液の10μ
Ｌおよび50μＬのアリコートを、50μg/mLのカナマイシ
ンを補足した栄養寒天プレートに拡げる。選択培地上に
現れたコロニーを、１％のコハク酸または１％のグリセ
ロールを補足したHEPES0.1培地を用いた寒天プレート上
での増殖についてスクリーニングする。グリセロール上
では増殖できないが、コハク酸上では増殖可能なコロニ
ーを、15％グリセロール中に凍結することにより、後の
使用のために保存する。

pDT9によるgplR−P.エルギノーサPAO2845の形質転換 P.エルギノーサを、上記の方法により、形質転換用に
調製する。0.2mLの冷細胞濃縮物を、100〜200ngのpDT9
DNAと一緒に合わせて、予め冷却しておいた1.5mL容のポ
リプロピレン製遠沈管に入れ、この混合物を氷上に60分
間にわたって保持する。この遠沈管を迅速に37℃の水浴
に２分間にわたって移し、直ちに氷中に５分間にわたっ
て戻す。約0.5mLのＬ−ブイヨンおよび細胞を0.3〜１時
間にわたって穏やかに振盪しながら37℃でインキュベー
トする。回収インキュベーションに続いて、この際棒懸
濁液の10μＬおよび50μＬのアリコートを、37.5μg/mL
のクロラムフェニコールを補足した栄養寒天プレートに
拡げる。

gplR−P.エルギノーサPAO2845形質転換体のpDT9の存在
についてのスクリーニング 上記から得た形質転換体を、37.5μg/mLのクロラムフ
ェニコールを補足した栄養寒天プレートに拡げ、37℃で
一夜増殖させる。これらの選択培地上に現れたコロニー
から、約20個を拾い上げ、37.5μg/mLのクロラムフェニ
コールを含有する10mLの栄養ブロス（Difco,Detroit,M
I）に移し、37℃で200rpmで振盪させながら一夜増殖さ
せる。選択した形質転換体においてpDT9プラスミドの存
在を確認するために、プラスミドDNAを抽出し、精製
し、EcoR I（Promega社,Madison,WI）で切断する。直鎖
状にしたDNAの分子量を、ゲル電気泳動により分析す
る。さらに、dhaT、dhaB1、dhaB2およびdhaB3に共通す
る配列を有するプライマー対（それぞれ、配列番号34と
35、36と37、８と９）を用いたPCR増幅、続いて行われ
るゲル電気泳動を用いた断片の分子量の特徴付けを用い
て、所望の遺伝子の存在を確認する。

pDT9により形質転換したglpR−P.エルギノーサの代謝ス
クリーニング １〜20個のコロニーを、上記の陽性の形質転換体から
選び出して、さらなる特徴付けに供する。細胞を、37.5
μg/Lのクロラムフェニコールを補足した栄養ブロス
で、30℃で250rpmで振盪しながら一夜、好気的に増殖さ
せる。細胞を、1:8の希釈率で1.5mMのIPTG（イソプロピ
ル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を有する同じ培地に移
し、４〜６時間にわたって増殖させる。細胞を遠心分離
により回収し、10g/Lのグリセロール、0.03g/Lの牛肉エ
キス、0.05g/Lのペプトン、0.05g/Lの酵母エキス（全
て、Difco製、Detroit,WI）および0.2％のKNO₃を補足し
たHEPES0.1培地で１回洗浄する。この細胞を、最初の体
積の1/5で、空気の隙間がないようにして、小さなビン
中で再懸濁し、30℃で100rpmで振盪しながら18〜72時間
にたってインキュベートする。細胞を遠心分離により除
去し、上清を、HPLCにより、1,3−プロパンジオールの
存在について分析する。さらに、1,3−プロパンジオー
ルの化学的同定を、ガスクロマトグラフィー−質量ペク
トル測定により確認する。

pDT9により形質転換したglpR−P.エルギノーサPAO2845
（ATCC55760）によるグルコースからの1,3−プロパンジ
オールの産生 上記のスクリーニング操作から、グリセロールから最
大量の1,3−プロパンジオールを産生する１〜５個のコ
ロニーを、37.5μg/Lのクロラムフェニコールを補足し
た栄養ブロスで、30℃で250rpmで振盪しながら一夜、好
気的に増殖させる。細胞を、1:8の希釈率で1.5mMのIPTG
を有する同じ培地に移し、４〜６時間にわたって増殖さ
せ、遠心分離により回収し、10g/Lのグルコース、0.03g
/Lの牛肉エキス、0.05g/Lのペプトン、0.05g/Lの酵母エ
キスおよび0.2％のKNO₃を補足したHEPES0.1培地で１回
洗浄する。この細胞を、最初の体積の1/5で、空気の隙
間がないようにして、小さなビン中で再懸濁する。細胞
を、30℃で100rpmで振盪しながら約36時間にわたってイ
ンキュベートする。細胞を遠心分離により除去し、上清
を、HPLCにより、1,3−プロパンジオールの存在につい
て分析する。さらに、1,3−プロパンジオールの化学的
同定を、ガスクロマトグラフィー−質量ペクトル測定に
より確認する。

実施例22 アスペルギルス・ニガーにおけるdhaB1、dhaB2、dhaB3
およびdhaTの表現用の表現カセットの構築 汎用表現カセット（pAEX） プラスミドpGPTpyrG（Berkaら、“The development o
f gene expression systems for filamentous fungi",B
iotechnol.Adv.7:127−154（1989））から得た、アスペ
ルギルス・ニガーg1aAプロモーターおよびターミネータ
ーの適切な調節に十分な部分を含有する1.4kbのSpe I−
EcoR I断片を、pLITMUS39（New England Biolabs社,Bev
erly,MA）のポリリンカーにあるSpe IおよびEcoR I部位
に結合した。

A.ニガーの各クローン表現カセット 各クレプシエラ・ニューモニエdhaBサブユニットおよ
びdgaTのオープン・リーディング・フレーム（ORF's）
を、同じクローニング戦略を用いて、クローニングし、
汎用プラスミドベクター（pAEX）に結合した。

dhaB ORFおよびdhaT ORFの各々をPCR増幅するための
プライマー対は、全遺伝子オペロンの既知の配列に基づ
いて、各ORFの５′末端および３′末端の配列に合致
（マッチ）するように設計した（dhaB1、dhaB2、dhaB3
およびdhaT:それぞれ、配列番号38と12、39と40、41と4
2、45と46、43と44）。合致配列に加えて、各ORFの５′
末端に対するプライマーは、EcoR I切断部位、続いてBg
l II切断部位を配列の５′最末端に、さらに各ORFの最
初のATGの上流に５個の塩基配列CAGCAを含有するように
設計した。各ORFの３′末端に合致するように設計され
たプライマーは、クローンの３′最末端に、翻訳停止コ
ドンの下流にXbal I切断部位を配置していた。

dhaBおよびdhaT ORFに対する各クローン断片を、PCR
により、プラスミドpHK26−28（全部のK.ニューモニエd
haオペロンを含有）から、上記のプライマーを用いて増
幅した。各ORFクローン断片は、それらの分子量（dhaB1
＝1540bp、dhaB2＝607bp、dhaB3＝448bp、dhaB X＝1846
bp、dhaT＝1187bp）に基づいて単離した。PCRプライマ
ーにおいて設計された特異的EcoR IおよびXba1切断部位
を用いて、dhaBおよびdhaT ORF断片の各々を、pLITMUS2
9（New England Biolabs社）のポリリンカーにあるEcoR
IおよびXba1切断部位に結合した。pLITMUS29にあるdha
B2およびdhaB3クローンは、塩基配列決定により、正し
いことが確認された。pLITMUS29にあるdhaB1クローンの
コード領域から得られた特異的1363bpNco1−EcoR V切断
断片を除去し、pHK26−28から得られた対応する切断断
片で置き換えた。pLITMUS29にあるdhaTクローンのコー
ド領域から得られた特異的783bp Tth111I−Mlu I切断断
片は、pHK26−28から得られた対応する切断断片で置き
換えた。pLITMUS29にあるdhaB Xクローンのコード領域
から得られた特異的1626bpEcoR V切断断片は、pM7（K.
ニューモニエdhaBオペロンを含有）から得られた対応す
る切断断片で置き換えた。dhaB1、dhaB XおよびdhaTク
ローンの５′および３′末端の配列（約250pb、置換さ
れた断片からの幾つかの配列を含有）は、塩基配列決定
により、正しいことが確認された。

pLITMUS29にあるdhaB1、dhaB2、dhaB3、dhaB Xおよび
dhaTクローンのORFを含有する特異的Bgl II−Xba1切断
断片を、個別に、汎用表現ベクターpAEXにあるBgl II−
Xba1切断部位に結合し、各クローンの表現をA.ニガーgl
aAプロモーターおよびターミネーターの制御下におい
た。得られたベクターは、それぞれ、各ORFによって、p
AEX:dhaB1、pAEX:dhaB2、pAEX:dhaB3、pAEX:dhaB Xおよ
びpAEX:dhaTと命名した。

A.ニガーに対する二重表現カセットベクター dhaB1表現カセットを含有する特異的SnaB I−Stu1切
断断片（A.ニガーglaAプロモーター、dhaB1 ORF、およ
びターミネーターから構成される）を、ベクターpAEX:d
haB1から単離し、pAEX:dhaB2ベクターの特異的SnaB1切
断部位に結合した。pBH2（Wardら、Exp.Myc.,13,289,
（1989））から得られた約2.2kbのSca1−Sma1切断断片
（アスペルギルス・ニジュランスpyrG栄養要求選択マー
カーを含有する）を、dhaB1およびdhaB2表現カセットを
含有するベクターにある特異的Stu1制限部位に結合し
た。このベクターを、pAEX:B1＋B2と命名した。

dhaB3およびdhaTの全表現カセットを含有するユニー
クなSpe1−Hind III切断断片を、pAEX:dhaB3ベクターお
よびpAEX:dhaTベクターからそれぞれ単離した。この２
種の表現カセット断片を、ベクターpUC18にある特異的H
ind III切断部位に、同時に、一列に並べて結合した。
このベクターをpAEX:B3＋Ｔと命名した。

アスペルギルスにおけるdhaBおよびdhaT遺伝子の形質転
換、形質転換体の単離、表現カセットの組込みの確認お
よび表現 アスペルギルス・ニガー株FS1（pyrG−）を、Campbel
lらの方法（Campbell、“Improved transformation eff
iciency of A.niger using homologous niaDgene for n
itrate reductase",Curr.Genet.,16:53−56,（1989））
を用いて、２種の表現ベクターpAEX:B1＋2BおよびpAEX:
B3＋Ｔと共に同時形質転換した。形質転換体を、ウリジ
ンを含有しない選択培地での増殖能力によって選択し
た。形質転換体のゲノムDNAを、Hind IIIおよびSpe1で
消化して、予期した分子量の断片を放出し、無傷の表現
カセットが組込まれたことを実証した。各表現カセット
の検出は、サザン（Southern）解析によって、各遺伝子
を別個に用いてプローブして行った。DhaB2タンパク質
の存在は、ウエスタン解析により、抗dhaB抗体を用いて
検出した。

各ORFの表現は、形質転換体（pAEX:B1＋B2ベクターお
よびpAEX:B3＋Ｔベクターが組込まれている）を、種培
養として、10％CSL培地［コーン・スティープ・リカー
（50％固形分）、10％（w/v）;NaH₂PO₄・H₂O1.0g/L;MgS
O₄0.50g/L;マルトース100.0g/L;グルコース10.0g/L;お
よびMazu消泡剤0.003％（v/v）］中で増殖させ、次に、
1/10体積の該種培養をMBM炭素培地［NaHPO₄0.70g/L;K₂H
PO₄0.70g/L;KH₂PO₄0.70g/L;MgSO₄・7H₂O1.40g/L;（N
H₄）₂SO₄10.5g/L;CaCl₂・2H₂O0.70g/L;NH₄NO₃3.50g/L;
クエン酸ナトリウム14g/L;FeCl₂・4H₂O1.0mg/L;ZnCl₂5.
87mg/L;CuCl₂・2H₂O0.42mg/L;MnCl₂・4H₂O0.21mg/L;Na₂
B₄O7・10H₂O0.07mg/L;葉酸0.174mg/L;ピリドキシンHCl
6.21mg/L;リボフラビン1.83mg/L;パントテン酸23.60mg/
L;ニコチン酸26.66mg/L;ビオチン0.49mg/L;チアミンHCl
1.39mg/L;マルトース120.0g/L;カルベニシリン0.035mg/
L;ストレプトマイシン0.035mg/L;ツイーン80 0.07％
（w/v）；およびMazu消泡剤0.14％（v/v）］に移してgl
aAプロモーターの誘発を行うことにより試験した。mRNA
を、形質転換体の培養物から単離し（Fast Track2Kit,I
nvitrogen Corp.）、化学ルミネセンス（Genius（登録
商標）System,Boehringer−Mannheim）を用いてノーザ
ン解析を行って、各遺伝子から転写されたメッセージを
検出した。振盪フラスコ培養物中のdhaB1、dhaB2、dhaB
3およびdhaT遺伝子の同調転写は、ノーザン・ハイブリ
ダイゼーションにより、dhaBおよびdhaTのORFの各々の
遺伝子でプローブて、証明した。

形質転換された遺伝子の全てを転写することが証明さ
れた単離コロニーを選んで、pAEX:dhaB Xでさらに形質
転換した。これらの単離物は、pAEX:dhaB XおよびpAA10
（3.2kb、アスペルギルス・ニジュランスamdS選択マー
カーをpUC18中に含有するAcc1−Asp718切断断片）で同
時形質転換した。これらの新たに形質転換した培養物
は、アセトアミドを単一の炭素源として含有する培地上
で選択した。アセトアミドを単一の炭素源として利用す
ることが可能な形質転換体のコロニーは、プライマーKp
dhaB X−５′およびKpdhaB X−３′（配列番号45および
46）を用いたゲノムDNAからのdhaB X ORFのPCR増幅によ
り組込まれたdhaB XのORFを有することが証明された。

A.ニガー株FS1によるグリセロールの産生 アスペルギルス・ニガー株FS1を、種培養として10％C
SL培地で増殖させ、1:10希釈物としてMBM炭素培地＋12
％マルトースに移した。培養上清は、アスペルギルスに
より産生された6g/Lのグリセロールを含有することが証
明された。グリセロールの分析は、HPLCにより行った。

組換えA.ニガーによる1,3−プロパンジオールの産生 アスペルギルスの発酵は、全15.5L容のBiolafitte発
酵槽で、処理体積が最初に8L、作業の間に11Lまで増加
させて行った。好気的条件は、空気を10L/分の速度で、
羽根車速度が700〜800rpmで、および背圧が1.1barで通
気させることにより確実にした［好気的条件は、溶存酸
素（DO）の％（100％のDOを大気圧で定義した）で定義
し、インストールしたDOプローブを用いて測定し、最少
値35％のDOを好気的であると考えた］。pHは、10％H₃PO
₄または28％NH₄OHの自動的添加により5.60に保持した。
温度は32℃に保持した。

以下の化合物を一回分としてタンクに入れ、121℃で3
0分間にわたって滅菌した。すなわち、2g/LのNaH₂PO₄・
H₂O、17g/Lの（NH₄）₂SO₄、1g/LのMgSO₄、2g/Lのツイー
ン80、45g/LのPromosoy−100（70％タンパク質の大豆濃
縮物）、6g/Lのコーン・スティープ・リカー（50％固形
分）、10g/Lのマルトース、および2g/LのMAZU DF204
（特注の消泡剤）。滅菌後、500gの50％Maltrin 150供
給材料を添加し、それと一緒にカルベニシリンおよびス
トレプトマイシン（共に、最終濃度を10mg/Lまで）を添
加した。

２種類の表現ベクターpAEX:B1＋B2およびpAEX:B3＋Ｔ
で形質転換し、10％CSLを含有する振盪フラスコで増殖
させた45時間経過したアスペルギルス・ニガー株（菌株
TGR40）の1Lを用いて、発酵槽に接種した。培養物をバ
ッチ式で、十分に好気的に、28時間にわたって増殖させ
た後に、供給材料（50％マルトリン（Maltrin 150溶
液、加熱滅菌）を0.8〜1.0g/分の速度で開始した。この
培養物をさらに20時間にわたって処理し、その間に、％
DOは事実上ゼロまで下降した。これは、細胞のO₂要求に
よるものである（培養物は、処理の間ずっと、ゼロ〜５
％のままであった）。その後（つまり、接種の48時間
後）、８時間にわたってグリセロールを供給し、最終の
グリセロール濃度が163g/Lになるまで行った。マルトリ
ンの供給は、接種の97時間後に停止し、背圧および通気
をそれぞれ0.2barおよび4L/分まで低減した。培養物が1
22時間経過したら、ブロスを回収し、遠心分離し、0.2L
のエタノールを1Lの上清に添加した。

1Lの無細胞発酵ブロスを減圧蒸留して、約60mLの暗色
のスラリーを得た。このスラリーを遠心分離し、約40mL
の液体上清を回収した。この液体を、40mLのエタノール
で処理して、残留固形分を析出させた。この析出物を遠
心分離により除去した。デンカンテーションした液体の
少量のサンプルをHPLCにより分析し、1,3−プロパンジ
オールを含有することがわかった。このプロパンジオー
ルの同定は、GC/MSによって確認した。

出願人は、dhaB（１−３）、dhaBxおよびdhaTをコー
ドするDNAを含有する組換えアスペルギルス・ニガー株T
GR40−13を寄託している（ATCC___）。

実施例23 組換えA.ニガーを用いたマルトースからの1,3−プロパ
ンジオールの産生 アスペルギルスの発酵を、全容量15.5LのBiolafitte
発酵槽内で、処理体積が最初は８リットルとし、操作を
行う間に11リットルまで上昇させて行う。好気的条件
は、空気を、10リットル／分の速度で、羽根車速度が70
0〜800rpmで、および背圧が1.1barで通気させることに
より確実にする［好気的条件は、溶存酸素（DO）の％
（100％のDOを大気圧で定義した）で定義し、インスト
ールしたDOプローブを用いて測定し、最少値35％のDOを
好気的であると考える］。pHは、10％H₂SO₄または28％N
H₄OHの自動的添加により5.60に保持した。温度は32℃に
保持する。

以下の化合物を一回分としてタンクに入れ、121℃で3
0分間にわたって滅菌した。すなわち、2g/LのNaH₂PO₄・
H₂O、17g/Lの（NH₄）₂SO₄、1g/LのMgSO₄、2g/Lのツイー
ン80、45g/LのPromosoy−100（70％タンパク質の大豆濃
縮物）、6g/Lのコーン・スティープ・リカー（50％固形
分）、10g/Lのマルトース、および2g/LのMAZU DF204
（特注の消泡剤）。滅菌後、500gの50％Maltrin 150供
給材料を添加し、それと一緒にカルベニシリンおよびス
トレプトマイシン（共に、最終濃度を10mg/Lまで）を添
加する。

dhaB1、dhaB2、dhaB3、dhaB4およびdhaBT遺伝子で形
質転換し、10％CSL（実施例22で定義したもの）を含有
する振盪フラスコで増殖させた40〜48時間経過したアス
ペルギルス・ニガー株の1Lを用いて、発酵槽に接種し
た。培養物を30〜35時間にわたって増殖させた後に、供
給（50％マルトリン（Maltrin 150溶液、加熱滅菌）を1
g/分の速度で開始する。この培養物をさらに５時間にわ
たってO₂を制限した条件下（％DOがゼロ、十分な通気
下）で処理する。その後、マルトリンの供給を停止し、
測定した上清中のグルコースが事実上ゼロになったら、
rpmを150に下げ、BPを0.2にし、通気を停止する。発酵
槽を嫌気的気体混合物（５％H₂、５％CO₂、90％N₂）で7
L/分の速度で30分間にわたって洗う。気体導入口および
排出口を閉じ、BPを0.4barに保持し、補酵素B₁₂を添加
して最終濃度を5mg/Lとする。全体を通して、ブロスサ
ンプルを遠心分離し、HPLCおよびGC分析用に上清を調製
する。1,3−プロパンジオールは、上清に検出される。

実施例24 ラクトバシルス・レウテリ（Lactobacillus reuteri）
（ATCC23272）によるグリセロール以外の基質からの1,3
−プロパンジオールの産生 ラクトバシルス・レウテリ（ATCC23272）を、MRS（Di
fco、Detroit,MI）プレートに保持した。プレートから
得られたコロニーを用いて、250mL容エルレンマイヤー
・フラスコ内の、25mM NaHCO₃を補足した70mLのラクト
バシルスMRSブイヨン（Difco,＃088−17）に接種した。
このフラスコを、嫌気的雰囲気下（５〜７％H2、２〜８
％CO2、85〜93％N2）でインキュベートした。

ラクトバシルスMRSブイヨンのHPLC分析は、グリセロ
ールの保持時間を有する成分を示した。ラクトバシルス
MRSブイヨンを、アルカリ沸騰により処理し、グリセロ
ールについてHPLCおよび酵素アッセイにより分析した。
多くとも、最初の培地からは0.25g/Lのグリセロールが
検出できた。このグリセロールの全部が1,3−プロパン
ジオールに転化された場合、0.21g/Lのプロパンジオー
ルがグリセロールから生産されていると言えるであろ
う。

10日間のインキュベーション後、ラクトバシルス・レ
ウテリ培養フラスコから得たサンプルを取り出し、HPLC
およびGC−MSにより分析し、最初の培地サンプルと比較
した。培地中に存在するグリセロールについて補正する
と、1.35g/Lの1,3−プロパンジオールがラクトバシルス
・レウテリによってグリセロール以外の基質から産生さ
れたことになる。

配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名宛人：イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌム
ール・アンド・カンパニー （Ｂ）通り名：マーケット ストリート1007 （Ｃ）市名：ウィルミントン （Ｄ）州名：デラウェア （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号（ZIP）:19898 （Ｇ）電話:302−892−8112 （Ｈ）テレファックス:302−773−0164 （ｉ）出願人： （Ａ）名宛名：ジェネンカー インターナショナル
インコーポレイテッド （Ｂ）通り名：サウス ウィントン ロード 1870
ケンブリッジ プレイス ４ （Ｃ）市名：ロチェスター （Ｄ）州名：ニューヨーク （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号（ZIP）:14618 （Ｇ）電話： （Ｈ）テレファックス： （ii）発明の名称：発酵性炭素源の、単一微生物によ
る1,3−プロパンジオールへの生物変換 （iii）配列の数:46 （iv）コンピュータ読取り可能形式： （Ａ）媒体の型:3.50インチのフロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ:IBM （Ｃ）オペレーティングシステム：マイクロソフト
・ウインドウズ3.1 （Ｄ） ソフトウエア：マイクロソフト・ワード6.
0 （ｖ）本出願のデータ： （Ａ）出願番号 （Ｂ）出願日 （Ｃ）分類： （vi）先出願のデータ： （Ａ）出願番号:08/440,293 （Ｂ）出願日:1995年５月12日 （vii）代理人の情報： （Ａ）代理人名：リンダ、アクサメシー、フロイド （Ｂ）登録番号:33,692 （Ｃ）参照／事件番号:CR−9715−Ｂ （２）配列番号1: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:12145塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号2: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:30塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号3: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:29塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号4: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:30塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号5: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:25塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号6: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:27塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号7: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:28塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号8: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:28塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号9: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:27塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号10: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:94塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号11: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:33塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号12: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:26塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号13: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:42塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号14: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:36塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号15: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:181塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号16: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:149塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号17: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:33塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号18: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:33塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号19: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:16塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号20: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:16塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号21: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:45塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号22: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:14塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号23: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:14塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号24: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:19塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号25: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:19塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号26: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:13塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号27: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:13塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号28: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:18塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号29: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:18塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号30: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:23塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号31: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:22塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号32: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:31塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号33: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:32塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号34: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:23塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号35: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:21塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号36: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:21塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号37: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:21塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号38: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:35塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号39: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:34塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号40: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:28塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号41: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:37塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号42: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:27塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号43: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:38塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号44: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:24塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号45: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:35塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列： （２）配列番号46: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:26塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 7/18 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ９８０５０ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ９８０５１ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ９８０５２ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ５５７６０ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ７４３６３ (72)発明者 ラッフェンド，リサ，アン アメリカ合衆国 19703−2422 デラウ ェア州 クレイモント マウント ヴァ ーノン ドライブ ２ (72)発明者 ナガラジャン，ヴァサンサ アメリカ合衆国 19807−3131 デラウ ェア州 ウィルミントン ディキンソン レーン 13 (72)発明者 ナカムラ，チャールズ，エドウィン アメリカ合衆国 19703−2422 デラウ ェア州 クレイモント マウント ヴァ ーノン ドライブ ２ (56)参考文献 特開 平３−65192（ＪＰ，Ａ) ＡＰＰＬ．ＥＮＶＩＲＯＮ．ＭＩＣＲ ＯＢＩＯＬ． ｖｏｌ．57， ｎｏ．12 （1991） ｐ．354 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (31)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】適当な条件下で、グリセロールまたはジヒ
   ドロキシアセトン以外の炭素基質を、デヒドラターゼ酵
   素活性を有するポリペプチドをコードし、かつ以下の
   （ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のいずれかのDNA配列で
   表されるDNAを有する単一の微生物に接触させることを
   特徴とする1,3−プロパンジオールを製造するための生
   物転化方法： （ａ）配列番号１中の塩基番号7044〜8711、8724〜930
   8、および9311〜9736のDNA配列； （ｂ）（ａ）のDNA配列によってコードされるアミノ酸
   のうち１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、または
   付加により得られるアミノ酸をコードするDNA配列； （ｃ）（ａ）のDNA配列とストリンジェントな条件下で
   ハイズリダイズするDNA配列。
2. 【請求項２】適当な条件下で、グリセロールまたはジヒ
   ドロキシアセトン以外の炭素基質を、デヒドラターゼ酵
   素活性を有するポリペプチドをコードし、かつ以下の
   （ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のいずれかのDNA配列で
   表されるDNAを有する、単一の微生物に接触させること
   を特徴とする1,3−プロパンジオールを製造するための
   生物転化方法： （ａ）配列番号１中の塩基番号7044〜8711、8724〜930
   8、9311〜9736、および5017〜6180のDNA配列； （ｂ）（ａ）のDNA配列によってコードされるアミノ酸
   のうち１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、または
   付加により得られるアミノ酸をコードするDNA配列； （ｃ）（ａ）のDNA配列とストリンジェントな条件下で
   ハイズリダイズするDNA配列。
3. 【請求項３】適当な条件下で、グリセロールを、デヒド
   ラターゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードし、か
   つ以下の（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のいずれかのDN
   A配列で表されるDNAを有する単一の微生物に接触させる
   ことを特徴とする1,3−プロパンジオールを製造するた
   めの生物転化方法であって、 （ａ）配列番号１中の塩基番号7044〜8711、8724〜930
   8、および9311〜9736のDNA配列； （ｂ）（ａ）のDNA配列によってコードされるアミノ酸
   のうち１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、または
   付加により得られるアミノ酸をコードするDNA配列； （ｃ）（ａ）のDNA配列とストリンジェントな条件下で
   ハイズリダイズするDNA配列； 前記微生物が、アスペルギルス（Aspergillus）属、サ
   ッカロミセス（Saccharomyces）属、ジゴサッカロミセ
   ス（Zygosaccharomyces）属、ピヒア（Pichia）属、ク
   リベロミセス（Kluyveromyces）属、カンジダ（Candid
   a）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、デバリオミセス
   （Debaryomyces）属、ムコール（Mucor）属、トルロプ
   シス（Torulopsis）属、バシルス（Bacillus）属、スト
   レプトミセス（Streptomyces）属およびシュードモナス
   （Pseudomonas）属からなる群から選ばれることを特徴
   とする生物転化方法。
4. 【請求項４】適当な条件下で、グリセロールを、デヒド
   ラターゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードし、か
   つ以下の（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のいずれかのDN
   A配列で表されるDNAを有する単一の微生物に接触させる
   ことを特徴とする1,3−プロパンジオールを製造するた
   めの生物転化方法であって、 （ａ）配列番号１中の塩基番号7044〜8711、8724〜930
   8、9311〜9736、および5017〜6180のDNA配列； （ｂ）（ａ）のDNA配列によってコードされるアミノ酸
   のうち１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、または
   付加により得られるアミノ酸をコードするDNA配列； （ｃ）（ａ）のDNA配列とストリンジェントな条件下で
   ハイズリダイズするDNA配列； 前記微生物が、アスペルギルス（Aspergillus）属、サ
   ッカロミセス（Saccharomyces属、ジゴサッカロミセス
   （Zygosaccharomyces）属、ピヒア（Pichia）属、クリ
   ベロミセス（Kluyveromyces）属、カンジダ（Candida）
   属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、デバリオミセス（Deb
   aryomyces）属、ムコール（Mucor）属、トルロプシス
   （Torulopsis）属、バシルス（Bacillus）属、ストレプ
   トミセス（Streptomyces）属およびシュードモナス（Ps
   eudomonas）属からなる群から選ばれることを特徴とす
   る生物転化方法。
5. 【請求項５】前記微生物が、シトロバクター（Citrobac
   ter）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、クロ
   ストリジウム（Clostridium）属、クレプシエラ（Klebs
   iella）属、エロバクター（Aerobacter）属、ラクトバ
   シルス（Lactobacillus）属、アスペルギルス（Aspergi
   llus）属、サッカロミセス（Saccharomyces）属、ジゴ
   サッカロミセス（Zygosaccharomyces）属、ピヒア（Pic
   hia）属、クリベロミセス（Kluyveromyces）属、カンジ
   ダ（Candida）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、デバリ
   オミセス（Debaryomyces）属、ムコール（Mucor）属、
   トルロプシス（Torulopsis）属、メチロバクター（Meth
   ylobacter）属、エシェリヒア（Escherichia）属、サル
   モネラ（Salmonella）属、バシルス（Bacillus）属、ス
   トレプトミセス（Streptomyces）属およびシュードモナ
   ス（Pseudomonas）属からなる群から選ばれることを特
   徴とする請求項１または２に記載の方法。
6. 【請求項６】前記微生物が、1,3−プロパンジオールの
   産生を促進する表現型を有する突然変異微生物からなる
   群から選ばれることを特徴とする請求項５に記載の方
   法。
7. 【請求項７】前記微生物が、クレプシエラ（Klebsiell
   a）属、エンテロバクター（Enterobacter）属およびシ
   トロバクター（Citrobacter）属からなる群から選ばれ
   るか、あるいは組換えエシェリヒア（Escherichia）属
   の細菌からなる群から選ばれることを特徴とする請求項
   ５に記載の方法。
8. 【請求項８】前記微生物が組換え大腸菌であることを特
   徴とする請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】前記微生物が、組換えストレプトミセス
   エスピー（Streptomyces s.p.）、バシルス エスピー
   （Bacillus s.p.）、シュードモナス エスピー（Pseu
   domonas s.p.）、サッカロミセス エスピー（Sacchar
   omyces s.p.）、アスペルギルス エスピー（Aspergil
   lus s.p.）、ラクトバシルス エスピー（Lactobacill
   us s.p.）、およびピヒア エスピー（Pichia s.p.）
   からなる群から選ばれ、かつ前記炭素基質がモノサッカ
   ライドであることを特徴とする請求項１、２、および６
   のいずれか１項に記載の方法。
10. 【請求項１０】前記微生物が、サッカロミセス・セレビ
    シエ（Saccharomyces cerevisiae）、枯草菌（バシラ
    ス・サチリス;Bacillus subtilis）、ピヒア・パスト
    リス（Pichia pastoris）、およびバシルス・リヘニフ
    ォルミス（Bacillus licheniformis）からなる群から
    選ばれ、かつ前記炭素基質がモノサッカライドであるこ
    とを特徴とする請求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】前記炭素基質が少なくとも１個の炭素原
    子を有し、該炭素基質がグリセロールまたはヒドロキシ
    アセトン以外であることを特徴とする請求項１または２
    に記載の方法。
12. 【請求項１２】前記炭素基質が、モノサッカライド、オ
    リゴサッカライドおよびポリサッカイライドからなる群
    から選ばれることを特徴とする請求項１または２に記載
    の方法。
13. 【請求項１３】前記炭素基質がグルコースであることを
    特徴とする請求項12に記載の方法。
14. 【請求項１４】前記炭素基質がアルコールであることを
    特徴とする請求項１または２に記載の方法。
15. 【請求項１５】前記微生物を前記炭素基質と接触させる
    工程の前に、さらに、前記微生物を培地中で増殖させる
    工程を具えることを特徴とする請求項１または２に記載
    の方法。
16. 【請求項１６】デヒドラクターゼ酵素活性を有するポリ
    ペプチドをコードし、かつ以下の（ａ）、（ｂ）、また
    は（ｃ）のいずれかのDNA配列で表されるDNAを含むこと
    を特徴とするコスミド： （ａ）配列番号１中の塩基番号7044〜8711、8724〜930
    8、および9311〜9736のDNA配列； （ｂ）（ａ）のDNA配列によってコードされるアミノ酸
    のうち１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、または
    付加により得られるアミノ酸をコードするDNA配列； （ｃ）（ａ）のDNA配列とストリンジェントな条件下で
    ハイズリダイズするDNA配列。
17. 【請求項１７】デヒドラターゼ酵素活性を有するポリペ
    プチドをコードし、かつ以下の（ａ）、（ｂ）、または
    （ｃ）のいずれかのDNA配列で表されるDNAを含むことを
    特徴とするコスミド： （ａ）配列番号１中の塩基番号7044〜8711、8724〜930
    8、9311〜9736、および5017〜6180のDNA配列； （ｂ）（ａ）のDNA配列によってコードされるアミノ酸
    のうち１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、または
    付加により得られるアミノ酸をコードするDNA配列； （ｃ）（ａ）のDNA配列とストリンジェントな条件下で
    ハイズリダイズするDNA配列。
18. 【請求項１８】宿主微生物と請求項16または17に記載の
    前記コスミドとを含有することを特徴とする形質転換微
    生物。
19. 【請求項１９】前記宿主微生物が大腸菌であり、前記微
    生物がATCC受託番号第69789号に指定されていることを
    特徴とする請求項16に記載の形質転換微生物。
20. 【請求項２０】dhaB1、dhaB2、dhaB3およびdhaTをコー
    ドするDNA断片を含有し、かつATCC受託番号第55760号に
    指定されていることを特徴とする組換えシュードモナス
    エスピー（Pseudomonas s.p.）。
21. 【請求項２１】dhaB1、dhaB2、dhaB3およびdhaTをコー
    ドするDNA断片を含有し、かつATCC受託番号第74363号に
    指定されていることを特徴とする組換えピヒア・パスト
    リス。
22. 【請求項２２】dhaB1、dhaB2、dhaB3およびdhaTをコー
    ドするDNA断片を含有し、かつATCC受託番号第74370号に
    指定されていることを特徴とする組換えサッカロミセス
    ・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株pMCK1/1
    0/17（MH）＃Ａ。
23. 【請求項２３】dhaB1、dhaB2、およびdhaB3をコードす
    るDNA断片を含有し、かつATCC受託番号第98051号に指定
    されていることを特徴とする組換えバシルス・リヘニフ
    ォルミス（Bacillus licheniformis）株BG188/pM26
    （クローン＃８）。
24. 【請求項２４】dhaB1、dhaB2、dhaB3およびdhaTをコー
    ドするDNA断片を含有し、かつACTT受託番号第98050号に
    指定されていることを特徴とする組換えバシラス・サチ
    リス（Bacillus subtilis）株BG2864/pM27（クローン
    ＃１）。
25. 【請求項２５】dhaB1、dhaB2、dhaB3およびdhaTをコー
    ドするDNA断片を含有し、かつACTT受託番号第98052号に
    指定されていることを特徴とする組換えストレプトミセ
    ス・リビダンス（Streptomyces lividans）株SL14−
    ２。
26. 【請求項２６】dhaB1、dhaB2、dhaB3およびdhaTをコー
    ドするDNA断片を含有し、かつATCC受託番号第74369号に
    指定されていることを特徴とする組換えアスペルギルス
    ・ニガー（Aspergillus niger）株TGR40−13。
27. 【請求項２７】デヒドラターゼ酵素活性を有するポリペ
    プチドをコードし、かつ以下の（ａ）、（ｂ）、または
    （ｃ）のいずれかのDNA配列で表されるDNAを有すること
    を特徴とする微生物： （ａ）配列番号１中の塩基番号7044〜8711、8724〜930
    8、および9311〜9736のDNA配列； （ｂ）（ａ）のDNA配列によってコードされるアミノ酸
    のうち１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、または
    付加により得られるアミノ酸をコードするDNA配列； （ｃ）（ａ）のDNA配列とストリンジェントな条件下で
    ハイズリダイズするDNA配列。
28. 【請求項２８】デヒドラターゼ酵素活性を有するポリペ
    プチドをコードし、かつ以下の（ａ）、（ｂ）、または
    （ｃ）のいずれかのDNA配列で表されるDNAを有すること
    を特徴とする微生物： （ａ）配列番号１中の塩基番号7044〜8711、8724〜930
    8、9311〜9736、および5017〜6180のDNA配列； （ｂ）（ａ）のDNA配列によってコードされるアミノ酸
    のうち１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、または
    付加により得られるアミノ酸をコードするDNA配列； （ｃ）（ａ）のDNA配列とストリンジェントな条件下で
    ハイズリダイズするDNA配列。
29. 【請求項２９】さらに、1,3−プロパンジオールを回収
    する工程を具えることを特徴とする請求項１から３のい
    ずれか１項に記載の方法。
30. 【請求項３０】デヒドラターゼ酵素活性を有するポリペ
    プチドをコードし、かつ以下の（ａ）、（ｂ）、または
    （ｃ）のいずれかのDNA配列で表されることを特徴とす
    るDNA: （ａ）配列番号１中の塩基番号7044〜8711、8724〜930
    8、および9311〜9736のDNA配列； （ｂ）（ａ）のDNA配列によってコードされるアミノ酸
    のうち１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、または
    付加により得られるアミノ酸をコードするDNA配列； （ｃ）（ａ）のDNA配列とストリンジェントな条件下で
    ハイズリダイズするDNA配列。
31. 【請求項３１】デヒドラターゼ酵素活性を有するポリペ
    プチドをコードし、かつ以下の（ａ）、（ｂ）、または
    （ｃ）のいずれかのDNA配列で表されることを特徴とす
    るDNA: （ａ）配列番号１中の塩基番号7044〜8711、8724〜930
    8、9311〜9736、および5017〜6180のDNA配列； （ｂ）（ａ）のDNA配列によってコードされるアミノ酸
    のうち１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、または
    付加により得られるアミノ酸をコードするDNA配列； （ｃ）（ａ）のDNA配列とストリンジェントな条件下で
    ハイズリダイズするDNA配列。