KR20140003258A - 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산의 생산방법 - Google Patents

3-하이드록시프로피온산을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일로박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus) 유래의 글리세롤 데하이드라타제(glycerol dehydratase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 3-하이드록시프로피온알데히드를 3-하이드록시프로피온산으로 전환시키는 데하이드로게나제(dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 3-하이드록시프로피온산의 생산방법 및 그에 사용되는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 재조합 미생물 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산의 생산방법은 기존에 보고된 크렙시엘라 뉴모니아(klebsiella pneumoniae) 유래의 비타민 B12 의존성 글리세롤 데하이드라타제를 발현하는 유전자를 포함하는 재조합 미생물보다 3-하이드록시프로피온의 생산이 현저하게 증가하고, 또한 3-하이드록시프로피온산 생산시 부산물로 발생하는 1,3-프로판디올(1,3-propanediol; 1,3-PDO)의 생산량을 현저히 감소하는 효과를 발휘한다.

Description

3-하이드록시프로피온산을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산의 생산방법{3-HYDROXYPROPIONIC ACID-PRODUCING RECOMBINANT MICROORGANISM AND METHOD OF PRODUCING 3-HYDROXYPROPIONIC ACID USING THE SAME}
본 발명은 3-하이드록시프로피온산의 생산방법 및 그에 사용되는 재조합 미생물에 관한 것으로, 구체적으로는 일로박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus) 유래의 글리세롤 데하이드라타제(glycerol dehydratase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 3-하이드록시프로피온알데히드를 3-하이드록시프로피온산으로 전환시키는 데하이드로게나제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 미생물 및 이를 배양하는 단계를 포함하는 3-하이드록시프로피온산의 생산방법이다.
최근 석유 기반 산업의 확장에 따른 지구 온난화 문제와 석유 가격의 심한 변동 및 상승 등으로 인한 석유 기반 산업의 문제점들이 논의되기 시작하였고, 이에 바이오를 기반으로 한 화학, 에너지 산업이 주목을 받게 되었다. 바이오 연료의 하나인 바이오 디젤은 식물성 기름이나 동물성 지방으로부터 트리글리세리드의 에스테르 교환반응에 의하여 생산되고 있다. 바이오 디젤의 대량생산으로 인하여 부산물인 글리세롤의 생산이 급증하게 되었고, 대량으로 생산되는 글리세롤은 계속하여 가격이 낮아지는 추세에 있다. 앞으로 바이오 디젤의 시장 수요가 증가하여 시장이 커질수록 부산물인 글리세롤의 생산량은 급격하게 증가할 것이며 글리세롤의 가격도 현재보다 더욱 낮아질 것으로 예측된다.
글리세롤은 유지, 섬유, 피혁의 대전 방지제, 세제용 유화제의 원료로 사용될 수 있으며, 뿐만 아니라 미생물의 탄소원으로 사용가능하여 이를 활용하여 미생물 기반으로 다양한 케미칼을 만들 수 있다. 그 중 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid; 3-HP)은 젖산, 숙신산과 더불어 다양한 케미칼의 원료로 사용될 수 있는 유망 플랫폼 화학원료 중 하나로, 글리세롤을 기반으로 미생물로부터 생산될 수 있다. 3-HP는 광학적으로 활성이 있는 물질의 합성을 위해 중요한 역할을 하는 2개의 작용기를 가지고 있는데, 이는 화학산업에서 3-HP가 중요한 전구체로 각광을 받게 하는 요소이다. 3-HP를 전구체로 하여 합성되는 핵심 화합물로는 아크릴산 (acrylic acid, MW 72.06), 말론산 (malonic acid, MW 104.06), 1,3-프로판디올(1,3-propanediol, MW 76.06) 등이 있다(도 1 참조).
도 1에 나타낸 바와 같이, 생물학적으로 두 종의 효소가 촉매하는 탈수 및 산화 공정을 통하여 글리세롤로부터 3-HP를 생산할 수 있다. 첫 번째 효소인 글리세롤 데하이드라타제(Glycerol dehydratase)로 글리세롤을 탈수반응시켜 3-하이드록시프로피온알데히드(3-Hydroxypropionaldehyde; 3-HPA)로 전환하고, 두 번째 효소인 3-하이드록시프로피온알데히드 데하이드로게나아제(3-HPA dehydrogenase)가 3-HPA를 산화시켜 3-HP를 생성하게 된다.
글리세롤 데하이드라타제는 작용 방식에 따라 2가지로 나뉘어진다.
먼저 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum) 유래의 글리세롤 데하이드라타제는 비타민 B12 비의존성 효소로서, 비타민 B12 도움 없이 활성을 나타내는 것으로 보고되었으나 극도의 산소 민감도를 가지고 있다(PNAS, 100: pp 5010-5015 (2003)). 이와 같은 비타민 B12 비의존성 글리세롤 데하이드라타제를 이용한 3-HP 생산은 비타민 B12를 필요로 하지 않기 때문에 생산단가를 낮출 수 있지만 산소 민감도가 극도로 높기 때문에 재조합 미생물을 만들어 3-HP를 생산시, 발효에 어려움을 겪는다.
다음으로 크랩시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 유래의 글리세롤 데하이드라타제는 비타민 B12 의존성 효소로 알려져 있다(US 6,852,517). 이 효소는 비타민 B12 의존성 효소로서, 3-HP 생산에 이용시 비타민 B12를 첨가하여야 하지만, 대장균을 비롯한 일반적인 호기성 미생물에서 높은 활성을 나타내므로 고농도로 3-HP생산하는데 있어 비타민 비의존성 효소에 비해 상대적으로 유리하다.
한편 3-HP 생산의 중간 산물인 3-HPA는 또한 1,3-프로판디올(1,3-propanediol, PDO)을 생산하는 중간체로 사용될 수 있다. 즉, 글리세롤이 3-HPA로 전환된 후 1,3-PDO 옥시도리덕테이즈(oxidoreductase)에 의하여 1,3-프로판디올로 전환될 수 있으며, 3-HP 생산을 증가시키기 위하여 1,3-PDO 생산을 억제하는 것이 필요하다.
1. 미국공개특허 US 2011/0144377 2. 미국등록특허 제6,852,517호
1. Biotechnol.Letters. 28:1755-1759 (2006) 2. Biotechnol. J, 2, p 736-742(2007) 3. PNAS, 100: pp 5010-5015 (2003) 4. Wood W. L. 등, Proc. Natl. Acad. Sci., vol.82, pp.1585-1588, 1985.
본 발명의 목적은 3-하이드록시프로피온산 생산능이 우수하면서 부산물의 생산이 적은 3-하이드록시프로피온산의 효과적인 생산방법 및 그에 사용되는 3-하이드록시프로피온산 생합성에 관여하는 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명에 따르면, 일로박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus) 유래의 글리세롤 데하이드라타제(glycerol dehydratase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 3-하이드록시프로피온알데히드 데하이드로게나제(3-HPA dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 3-하이드록시프로피온산의 생산방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, ⅰ) (a) 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 6의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 (a)의 상보적 서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 글리세롤 데하이드라타제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 ⅱ) 3-하이드록시프로피온알데히드를 3-하이드록시프로피온산으로 전환시키는 (a) 서열번호 12의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 (a)의 상보적 서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 데하이드로게나제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 3-하이드록시프로피온산의 생산방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 글리세롤 데하이드라타제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 5 중에서 선택된 것임을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 상기 3-하이드록시프로피온알데히드 데하이드로게나제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 11인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 상기 재조합 미생물은 (a) 서열번호 8 및 서열번호 10 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 (a)의 상보적 서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 글리세롤 데하이드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 상기 글리세롤 데하이드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 7 및 서열번호 9 중에서 선택된 것임을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 일로박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus) 유래의 글리세롤 데하이드라타제(glycerol dehydratase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열및 3-하이드록시프로피온알데히드 데하이드로게나제(3-HPA dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3-하이드록시프로피온산의 생합성에 관여하는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명에 따르면, ⅰ) (a) 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 6의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 (a)의 상보적 서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 글리세롤 데하이드라타제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 ⅱ) 3-하이드록시프로피온알데히드를 3-하이드록시프로피온산으로 전환시키는 (a) 서열번호 12의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 (a)의 상보적 서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 데하이드로게나제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3-하이드록시프로피온산의 생합성에 관여하는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 글리세롤 데하이드라타제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 5 중에서 선택된 것임을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 상기 3-하이드록시프로피온알데히드 데하이드로게나제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 11인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 상기 재조합 미생물은 (a) 서열번호 8 및 서열번호 10 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 (a)의 상보적 서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 글리세롤 데하이드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 상기 글리세롤 데하이드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 7 및 서열번호 9 중에서 선택된 것임을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 3-하이드록시프로피온산의 생산방법 및 그에 사용되는 재조합 미생물은 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산 생산방법은 기존에 보고된 크렙시엘라 뉴모니아(klebsiella pneumoniae) 유래의 비타민 B12 의존성 글리세롤 데하이드라타제를 발현하는 유전자를 포함하는 재조합 미생물보다 3-하이드록시프로피온산의 생산이 현저하게 증가하고, 또한 3-하이드록시프로피온산 생산시 부산물로 발생하는 1,3-프로판디올(1,3-propanediol; 1,3-PDO)의 생산량을 현저히 감소하는 효과를 발휘한다.
따라서 본 발명의 재조합 미생물을 이용하여 3-하이드록시프로피온산을 경제적으로 대량 수득할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산을 생성하는 경로와 이를 전구체로 하여 합성되는 핵심 화합물들을 보여주는 개략적인 모식도이다.
도 2는 실시예 1의 재조합 벡터(ET-iBAB-H)에 대한 개략적인 개열지도이다.
1) dhaB1, dhaB2 및 dhaB3유전자는 일로박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus) 유래의 글리세롤 데하이드라타제(glycerol dehydratase) 코딩 유전자이고, 2) gdrA, gdrB는 일로박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus) 유래의 글리세롤 데하이드라타제 재활성인자(glycerol dehydratase reactivator) 코딩 유전자이고, 3) aldH는 대장균 K-12 유래의 알데히드 데하이드로게나제 코딩 유전자이다.
도 3은 비교예 1의 재조합 벡터(ET-BAB-H)에 대한 개략적인 개열지도이다. 1) dhaB1, dhaB2 및 dhaB3유전자는 크렙시엘라 뉴모니아(klebsiella pneumoniae) 유래의 글리세롤 데하이드라타제(glycerol dehydratase) 유전자, 2) gdrA, gdrB는 크렙시엘라 뉴모니아(klebsiella pneumoniae) 유래의 글리세롤 데하이드라타제 재활성인자(glycerol dehydratase reactivator) 유전자, 3) aldH는 대장균 K-12 유래의 알데히드 데하이드로게나제 코딩 유전자이다.
도 4는 아크롤레인과 트립토판을 이용한 3-하이드록시프로피온 알데히드(3-Hydroxypropionaldehyde; 3-HPA)의 농도 측정방법을 개략적으로 보여준다.
도 5은 실시예 1 및 비교예 1에서 제조한 재조합 대장균에 대한 시간에 따른 세포 배양액의 농도(OD) 변화를 보여준다.
도 6은 실시예 1 및 비교예 1에서 제조한 재조합 대장균에 대한 시간에 따른 세포 배양액의 pH 변화를 보여준다.
도 7은 실시예 1 및 비교예 1에서 제조한 재조합 대장균에 대한 시간에 따른 3-HP의 생산량을 보여준다.
도 8은 실시예 1 및 비교예 1에서 제조한 재조합 대장균에 대한 시간에 따른 1,3-PDO의 생산량을 보여준다.
도 9은 실시예 1 및 비교예 1에서 제조한 재조합 대장균에 대한 시간에 따른 3-HPA의 생산량을 보여준다.
본 발명의 구체적인 내용을 기술하기에 앞서 본 명세서에 사용된 용어에 대하여 의미를 서술한다.
본 명세서에서 사용되는 '폴리펩타이드'는 해당 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 사용되는 알로리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 90%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.
예를 들어, 상기 폴리펩타이드는 기재된 특정의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 61% 이상, 62% 이상, 63% 이상, 64% 이상, 65% 이상, 66% 이상, 67% 이상, 68% 이상, 69% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상, 또는 99.9% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며 3-하이드록시프로피온산 생합성 관련하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일반적으로, 동일성 % 는 높을수록 더욱 바람직하다.
또한 상기 동일성을 가지는 폴리펩타이드는 기재된 특정 아미노산 서열의 폴리펩타이드에서 1 내지 100, 1 내지 90, 1 내지 80, 1 내지 70, 1 내지 60, 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 39, 1 내지 38, 1 내지 37, 1 내지 36, 1 내지 35, 1 내지 34, 1 내지 33, 1 내지 32, 1 내지 31, 1 내지 30, 1 내지 29, 1 내지 28, 1 내지 27, 1 내지 26, 1 내지 25, 1 내지 24, 1 내지 23, 1 내지 22, 1 내지 21, 1 내지 20, 1 내지 19, 1 내지 18, 1 내지 17, 1 내지 16, 1 내지 15, 1 내지 14, 1 내지 13, 1 내지 12, 1 내지 11, 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1 개의 아미노산 잔기가 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하면서 3-하이드록시프로피온산 합성과 관련되는 폴리펩타이드를 포함한다. 일반적으로, 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가의 수는 적을수록 더욱 바람직하다.
본 명세서에 사용되는 '폴리뉴클레오타이드'는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogues)도 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 상기 기재된 특정의 아미노산 서열(폴리펩타이드)을 암호화하는 핵산 분자에 제한되지 않고, 상기에서 서술한 것처럼 특정 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 아미노산 서열 또는 그에 상응하는 기능을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 사용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 90%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.
상기 상응하는 기능을 가진 폴리펩타이드는 예를 들어, 하나 이상의 아미노산이 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가되는 아미노산 서열의 폴리펩타이드를 포함한다. 그러한 폴리펩타이드는 상기 상술한 것처럼 1 개 이상의 아미노산 잔기가 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 이루어지며 3-하이드록시프로피온산 합성 관련되는 폴리펩타이드를 포함하며, 아미노산 잔기의 소실,치환,삽입, 및/또는 첨가의 수가 적은 것이 바람직하다. 또한, 상기 폴리펩타이드는 상기 상술한 것처럼 기재된 특정의 아미노산 서열과 약 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며 3-하이드록시프로피온산 합성 관련하는 폴리펩타이드를 포함하며, 동일성이 높을 수록 바람직하다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "상보적" 또는 "상보성"은 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드가 수소 결합을 통해 결합하여 더블 스트랜드 핵산 분자를 형성하는 능력을 언급하며, 부분적으로 상보적인 경우도 포함한다. 하기 염기쌍이 상보성과 관련된다: 구아닌 및 시토신; 아데닌 및 티민; 및 아데닌 및 우라실. "상보적"은 상기 언급된 관계가 전장의 상기 분자에 걸쳐 2개의 싱글-스트랜드 핵산 분자를 포함하는 모든 염기쌍에 실질적으로 적용된다. "부분적으로 상보적"은 2개의 싱글-스트랜드 핵산 분자중 하나의 길이 짧기 때문에 그 분자들 중 하나의 일부가 싱글 스트랜드로 남아있는 것 관계를 언급한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "혼성화"는 싱글 스트랜드 핵산 분자가 뉴클레오티드 염기 쌍을 통해 상보적인 스트랜드와 결합하는 과정을 언급한다. 따라서, 본 명세서에서 '서열번호 1과 혼성화 되는 뉴클레오타이드 서열"은 서열목록 제1서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부를 사용하여 콜로니 혼성화 기술, 플라크 혼성화 기술, 서던 혼성화 기술 등에 의해 수득된, DNA 와 같은 핵산 분자를 말한다. 혼성화 방법은 당업자에게 알려진 다양한 방법이 사용가능하며, 예를 들어, Wood W. I. 등 (비특허문헌 4)에 기술된 방법일 수 있다.
한편 상기 '혼성화'는 발명에 필요한 범위내에서 행해지는 '엄격한 조건하에서 혼성화'되는 것으로 해석될 수 있다. 상기 "엄격"은 혼성화 조건을 언급한다. 고도로 엄격한 조건은 비상동성인 염기 쌍에 바람직하지 못하다. 낮은 엄격성은 반대 작용을 갖고 있다. 엄격성은 예를 들면, 온도, 염 농도에 의해 변경될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "엄격한 조건" 은 낮은 엄격한 조건, 중간 엄격한 조건, 또는 높은 엄격한 조건 중 임의일 수 있다. "낮은 엄격한 조건" 은, 예를 들어, 32℃ 에서 5 x SSC, 5 x Denhardt's 용액, 0.5% Sodium Dodecyl Sulfate(SDS), 50% 포름아미드(formamide)이다. "중간 엄격한 조건" 은 예를 들어, 42℃ 에서 5 x SSC, 5 x Denhardt's 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. "높은 엄격한 조건" 은 예를 들어, 50℃ 에서 5 x SSC, 5 x Denhardt's 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. 상기 조건 하에, 더 높은 상동성을 가진 DNA와 같은 폴리뉴클레오티드가 더 높은 온도에서 효율적으로 수득될 것으로 예상되며, 그럼에도 불구하고, 다수의 요소가 온도, 프로브 농도, 프로브 길이, 이온 세기, 시간, 염 농도 및 기타를 포함하여 혼성화 엄격성에 관여하고, 당업자는 이러한 요소를 적절하게 선택하여, 유사한 엄격성을 실현시킬 수 있다. 시판의 키트가 혼성화에 사용되는 경우, 예를 들어, Alkphos Direct Labeling Reagents (Amersham Pharmacia, 영국)가 사용될 수 있다. 이 경우, 첨부된 프로토콜에 따르면, 표지된 프로브로 밤새 인큐베이션시킨 후, 55℃에서 0.1% (w/v) SDS 를 함유하는 1 차 세정 완충액으로 막을 세정하여, DNA 와 같은 혼성화 된 핵산 분자를 검출한다.
한편, 혼성화될 수 있는 기타 핵산 분자는 디폴트 변수를 사용하는 FASTA 및 BLAST 와 같은 상동성 연구 소프트웨어에 의해 계산된 바와 같이, 기재된 특정 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자에 약 60% 이상, 61% 이상, 62% 이상, 63% 이상, 64% 이상, 65% 이상, 66% 이상, 67% 이상, 68% 이상, 69% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상 또는 99.9% 이상의 동일성을 가진 핵산 분자를 포함한다.
아미노산 서열 또는 뉴클레타이드 서열 사이의 동일성은 Karlin 및 Altschul 에 의한 알고리즘 BLAST를 사용해 측정될 수 있으며, BLAST 알고리즘을 바탕으로 한 BLASTN 및 BLASTX 라고 하는 프로그램에 의할 수 있다. 뉴클레타이드 서열이 BLASTN 을 사용하여 서열화되는 경우, 변수는 예를 들어, 스코어 = 100 이고, 워드길이 = 12 이다. 아미노산 서열이 BLASTX 를 사용하여 서열화되는 경우, 변수는 예를 들어, 스코어 = 50 이고 워드 길이 = 3 이다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램이 사용되는 경우, 각각의 프로그램에 대해 디폴트 변수가 적용된다.
상기 상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 일로박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus) 유래의 글리세롤 데하이드라타제(glycerol dehydratase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 3-하이드록시프로피온알데히드를 3-하이드록시프로피온산으로 전환시키는 데하이드로게나제(3-HPA dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 3-하이드록시프로피온산의 생산방법 및 그에 사용되는 미생물을 제공한다. 이하 도면을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명은, 일로박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus) 유래의 글리세롤 데하이드라타제(glycerol dehydratase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 3-하이드록시프로피온알데히드를 3-하이드록시프로피온산으로 전환시키는 데하이드로게나제(dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 3-하이드록시프로피온산의 생산방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일 태양은, ⅰ) (a) 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 6의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 (a)의 상보적 서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 글리세롤 데하이드라타제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 ⅱ) 3-하이드록시프로피온알데히드를 3-하이드록시프로피온산으로 전환시키는 (a) 서열번호 12의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 (a)의 상보적 서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 데하이드로게나제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 3-하이드록시프로피온산의 생산방법을 제공한다.
본 발명의 '일로박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus) 유래의 글리세롤 데하이드라타제'는 글리세롤을 3-히드록시프로피온알데히드로(3-HPA) 전환시키는 효소 활성을 가지는 폴리펩티드를 의미한다.
상기의 일로박터 폴리트로퍼스의 글리세롤 데하이드라타제는 각각 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16의, 3개의 구조적 서브유닛으로 구성되며, 각각 DhaB1, DhaB2 및 DhaB3으로서 글리세롤 데하이드라타제 효소의 α, β 및 γ 서브 유닛을 구성한다.
보다 구체적으로, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열은 일로박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus) 유래의 DhaB1에 대응하고, 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열은 일로박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus)유래의 DhaB2, 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열은 일로박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus) 유래의 DhaB3에 대응한다.
한편, 서열번호 1에 기재된 뉴클레오타이드 서열은 일로박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus) 유래의 dhaB1에 대응하고, 서열번호 3에 기재된 뉴클레오타이드 서열은 일로박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus)유래의 dhaB2, 서열번호 5에 기재된 뉴클레오타이드 서열은 일로박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus) 유래의 dhaB3에 대응한다.
본 발명에 따른 글리세롤 데하이드라타제는 미생물이 글리세롤을 기질로 사용할 수 있게 하며, 공지의 비타민 B12 의존성 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 유래의 글리세롤 데하이드라타제보다 글리세롤을 3-HPA로 전환하는 활성이 우수한 특징이 있다. 또한, 3HPA를 3-HP로 전환시키는 데하이드로게나제와의 밸런스가 적합하여 1,3-PDO 생성 경로를 최소화하여 1,3-PDO의 생산량을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 '3-하이드록시프로피온알데히드를 3-하이드록시프로피온산으로 전환시키는 데하이드로게나제'는 3-하이드록시프로피온알데히드 데하이드로게나제(3-HP dehydrogenase)라고 명명되고, 이는 탈수소 반응을 통해 3-HPA를 3-HP로 전환할 수 있으면 어떤 효소라도 가능하며, 조효소로서 NAD+/NADH 또는 NADP+/NADPH를 사용한다.
본 발명에서 3-하이드록시프로피온알데히드를 3-하이드록시프로피온산으로 전환시키는 데하이드로게나제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로는, 호모 사피엔스(Homo sapiens) 유래의 aldH2 유전자(NM_000690.3, NM_001204889.1), 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) 유래의 ald4 유전자(NM_001183794.1), 대장균(E. coli) 유래의 aldA, aldB, aldH 유전자(NC_000913.2) 등으로부터 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
보다 구체적으로, 서열번호 11에 기재된 뉴클레오타이드 서열은 대장균 K-12 유래의 aldH에 대응하고, 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열은 대장균 K-12 유래의 AldH에 대응한다.
본 발명의 데하이드라타제는 촉매 작용을 하는 동안 글리세롤에 의해 또는 1,3-프로판디올과의 상호작용에 의해 비가역적으로 불활성화된다. 따라서, 본 발명의 3-HP를 생산하는 재조합 미생물은 데하이드라타제를 활성화시키기 위한 글리세롤 데하이드라타제 재활성화 인자(Glycerol dehydratase reactivator)를 암호화하는 뉴클레오타이드를 추가로 더 포함할 수 있다.
상기 글리세롤 데하이드라타제 재활성화 인자는 일반적으로 알려진 어느 것이라도 사용할 수 있고, WO 98/21341호(US 6,013,494), 문헌 [Daniel et al., 상기 문헌], 문헌 [Toraya and Mori, J. Biol. Chem. 274:3372 (1999)] 및 문헌 [Tobimatsu et al., J. Bacteriol. 181:4110 (1999)]에 공지되어 있다. 상기 데하이드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 dhaFG (ABI36568.1), gdrAB (EF077655.1), ddrAB (AAC15871) 등으로부터 선택될 수 있다.
이에 따라, 본 발명의 재조합 미생물은 (a) 서열번호 8 및 서열번호 10 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 (a)의 상보적 서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 글리세롤 데하이드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 추가로 더 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열은 일로박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus) 유래의 GdrA에 대응하고, 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열은 일로박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus) 유래의 GdrB에 대응한다.
한편, 서열번호 7에 기재된 뉴클레오타이드 서열은 일로박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus) 유래의 gdrA에 대응하고, 서열번호 9에 기재된 뉴클레오타이드 서열은 일로박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus) 유래의 gdrB에 대응한다.
본 발명에 따른 재조합 미생물은 글리세롤 데하이드라타제 재활성화 인자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 글리세롤 데하이드라타제를 암호화는 뉴클레오타이드 서열이 동일한 미생물 종으로부터 유래할 수 있으며, 양자 모두 일로박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus)로부터 유래한 것이 3-하이드록시프로피온산의 합성 효율 면에서 가장 바람직하다.
따라서, 본 발명에 따른 바람직한 재조합 미생물은 서열번호 2(DhaB1), 서열번호 4(DhaB1) 및 서열번호 6(DhaB1), 서열번호 8(GdrA), 서열번호 10(GdrB) 및 서열번호 12(AldH)에 기재된 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 표현될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1(dhaB1), 서열번호 3(dhaB1), 서열번호 5(dhaB1), 서열번호 7(gdrA), 서열번호 9(gdrB) 및 서열번호 11(aldh)에 기재된 뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 표현될 수 있다.
본 발명의 3-하이드록시프로피온산의 생산방법 또는 3-하이드록시프로피온산 생합성에 사용되는 재조합 미생물의 배양은 탄소원(carbon source)으로 단당류, 올리고당류, 다당류, 또는 글리세롤로부터 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 탄소원의 존재하에서 수행될 수 있다. 그 중에도 글루코스 및/또는 글리세롤을 탄소원으로 제공하는 것이 3-HP의 생산효율이나 경제면에서 바람직하다. 자연적으로 글루코스를 글리세롤로 전환하지 못하는 미생물의 경우에는 공지의 방법으로 상기 전환에 필요한 외래 유전자를 도입시켜 글루코스로부터 3-HP가 생산되도록 할 수 있다. 상기 배양에 있어 사용되는 배지에는 비타민 B12가 첨가될 수 있다.
상기의 배양조건은 사용된 숙주세포에 따라 적절히 조절할 수 있는데, 예를 들어 대장균의 경우 호기성(aerobic) 조건하에서 pH 6 ~ 7.6 내지 33 ~ 37℃의 온도에서 1 ~ 4 일간 수행될 수 있다. 상기 범위 내에서 배양하는 경우가 세포 성장이 활발하면서 효율적으로 3-하이드록시프로피온을 생산할 수 있다.
본 발명은 배치식, 패드-배치식, 또는 연속식으로 수행될 수 있고, 임의의 공지된 방식의 발효법도 적절하다. 또한, 세포는 기질 상에 고정화되어 발효될 수도 있다.
본 발명에 따르면, 일로박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus) 유래의 글리세롤 데하이드라타제(glycerol dehydratase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 3-하이드록시프로피온알데히드를 3-하이드록시프로피온산으로 전환시키는 데하이드로게나제(dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3-하이드록시프로피온산의 생합성에 관여하는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명의 또다른 일례는, ⅰ) (a) 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 6의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 (a)의 상보적 서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 글리세롤 데하이드라타제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 ⅱ) 3-하이드록시프로피온알데히드를 3-하이드록시프로피온산으로 전환시키는 (a) 서열번호 12의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 (a)의 상보적 서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 데하이드로게나제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3-하이드록시프로피온산의 생합성에 관여하는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명의 구체적인 태양 및 바람직한 태양에 대한 상세한 설명은 상기 3-HP의 생산방법에서 기술한 바와 동일하다.
본 발명에 사용되는 재조합 미생물은 상기 상술한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 형질전환카세트나 재조합 벡터 등을 만들고 이를 적정한 숙주세포에 도입하여 발현시켜서 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명의 상기 상술한 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자군(핵산분자)을 박테리움, 바이러스(박테리오파지 T17, M-13 파생파지 등), 코스미드, 효모, 식물 등의 적절한 벡터에 클로닝할 수 있으며, 상기 벡터는 적당한 숙주세포에 도입될 수 있다.
본 발명의 재조합 미생물을 얻기 위하여 사용할 수 있는 재조합 미생물은 해당 유전자를 발현할 수 있는 것이라면 제한되지 않으며, 박테리아, 효모 및 곰팡이로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 에쉬케리키아 (Escherichia), 시트로박터 (Citrobacter), 엔테로박터 (Enterobacter), 클로스트리듐 (Clostridium), 클렙시엘라 (Klebsiella), 락토바실러스 (Lactobacillus), 아스퍼질러스 (Aspergillus), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 시조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces), 지고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces), 피치아(Pichia), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 칸디다 (Candida), 한세눌라 (Hansenula), 살모넬라(Salmonella), 바실러스 (Bacillus), 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 및 슈도모나스 (Pseudomonas)로 구성된 속의 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 대장균이다.
재조합 벡터의 도입 방법 역시 공지의 기술, 즉 열 충격법, 전기충격법 등을 통해 도입할 수 있다. 상기의 숙주 세포 이외에도 발현의 목적에 따라 달라지는 벡터에 의존하여 다양한 균주를 용이하게 이용할 수 있음은 당업자에게 명백한 일이다.
본 발명에 따른 일로박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus)유래의 글리세롤 데하이드라타제는 기존에 보고된 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 유래의 글리세롤 데하이드라타제 보다 3-하이드록시프로피온산 생산능에 있어서 우수한 효과를 나타내고 1,3-프로판디올의 생산을 감소시키므로, 기존의 크렙시엘라 뉴모니아 유래의 글리세롤 데하이드라타제를 대체하여 3-하이드록시프로피온산 생산에 효과적으로 활용될 수 있음을 확인하였다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다.
[실시예 1]
<단계 1> 일로박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus) 유래 글리세롤 데하이드라타제 발현 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제작
일로박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus DSM 2926)로부터 게놈 DNA를 추출하고, 게놈 DNA로부터 dhaB123-gdrA 및 gdrB 유전자를 각각 하기의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하고 pET-Duet (Novagen)벡터의 NcoI-EcoRI 및 EcoRI-SacI 위치에 각각 삽입하여 ET-iBAB벡터를 제작하였다
1) dhaB1, dhaB2 및 dhaB3 유전자 증폭에 사용한 프라이머
정방향(서열번호 13: TCATGAAATCAAAAAGATTTGAAGTATTGAAG(BspHI))
역방향(서열번호 14: GGATCCCTAATCTTTTCTAAGTTGACCTCTTTGTTC (BamHI))
2) gdrA 및 gdrB 유전자 증폭에 사용한 프라이머
정방향(서열번호 15: GGATCCAAAGGTTCGGGGATAGTTATGAAG(BamHI))
역방향(서열번호 16: GAGCTCTTATCTAAGTGGCAGACCCTTTACAAG(SacI))
PCR 종료 후 BspHI과 BamHI으로 dhaB1, dhaB2 및 dhaB3를 절단하고, BamHI 과 SacI으로 gdrA 및 gdrB를 절단하였다.
PCR 조건은 하기와 같다: Phusion high fidelity DNA 폴리머라아제 (Thermo scientific) 사용, Cycle I (98℃, 30 sec), Cycle Ⅱ (30 cycles/ 98℃, 10 sec/55℃, 1 min, 72℃, 2 min), Cycle Ⅲ (72℃, 5 min).
증폭된 양 DNA 단편을 pET-Duet (Novagen)벡터의 NcoI-EcoRI 및 EcoRI-SacI 위치에 각각 삽입하여 ET-iBAB를 제작하였다.
<단계 2> 알데히드 데하이드로게나제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제작
대장균 K-12로부터 게놈 DNA를 추출하고 하기의 프라이머를 사용하여 aldH 유전자를 증폭하고, NdeI 및 BglⅡ로 절단하였다.
정방향 프라이머(서열번호 17: TTTCATATGAATTTTCATCATCTGGCTTAC (NdeI))
역방향 프라이머(서열번호 18: TTTAGATCTTTCGGTCATTTCAGGCCTCCA (BglⅡ))
PCR 조건은 하기와 같았다: LA taq 폴리머라아제 (Takara, Japan) 사용, CycleⅠ (97℃, 5 min), CycleⅡ (31 cycles/ 97℃, 1 min/55℃, 1 min, 72℃, 3 min), CycleⅢ (72℃, 10 min). 증폭된 DNA를 동일 효소로 절단한 pETDuet 벡터(Novagen)에 도입하여 ET-H 벡터를 제작하였다
<단계 3> 3-HP 생산용 유전자를 포함한 재조합 벡터의 제조
상기 <단계 2>의 ET-H 벡터에 제한효소 SalI-HF와 AvrⅡ를 처리하여 ET-H 벡터에서aldH 를 함유한 DNA 단편을 얻고, 이것을 동일효소 처리가 된 <단계 1>의 ET-iBAB벡터에 도입하여 ET-iBAB-H벡터를 제작하였다(도 2 참조).
<단계 4> 재조합 벡터로 형질전환된 대장균의 제조
상기 <단계 3>에서 제작한 재조합 벡터 ET-iBAB-H를 대장균에 형질전환시켜 재조합 균주를 제작하였다.
[비교예 1]: 클렙시엘라 뉴모니에 유래 글리세롤 데하이드라타제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 미생물의 제작
클렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumonia DSM 2026)의 게놈 DNA를 추출하고 하기의 프라이머를 사용하여 dhaB123-gdrA 및 gdrB 유전자를 PCR 증폭하고 pET-Duet (Novagen)벡터의 NcoI-EcoRI 및 EcoRI-SalI 위치에 각각 삽입하여 ET-BAB벡터를 제작하였다.
1) dhaB123-gdrA 유전자 증폭을 위해 사용된 프라이머
정방향 프라이머(서열번호 19: ATATCATGAAAAGATCAAAACGATTT (BspHI))
역방향 프라이머(서열번호 20: AAAGAATTCCGCGAGCGCCCGTTTAATTC (EcoRI))
2) gdrB 유전자 증폭을 위해 사용된 프라이머
정방향 프라이머(서열번호 21: TTTGAATTCTAACGAGGGGACCGTCATGTC (EcoRI))
역방향 프라이머(서열번호 22: ATAGTCGACTCAGTTTCTCTCACTTAACGG (SalI))
이때, PCR은 Cycle Ⅰ (95℃, 5분), Cycle Ⅱ (30 cycles/ 95℃, 30초 / 55℃, 30초 / 72℃, 5분(dhaB123-gdrA) 혹은 30초(gdrB)), Cycle Ⅲ (72 ℃, 5분)의 과정으로 수행되었다.
aldH 유전자를 얻기 위해 대장균 K-12로부터 게놈 DNA를 추출하고 하기의 프라이머를 사용하여 aldH 유전자를 증폭하고, NdeI 및 BglⅡ로 절단하였다.
정방향 프라이머(서열번호 17: TTTCATATGAATTTTCATCATCTGGCTTAC (NdeI))
역방향 프라이머(서열번호 18: TTTAGATCTTTCGGTCATTTCAGGCCTCCA (BglⅡ))
PCR 조건은 하기와 같았다: LA taq 폴리머라아제 (Takara, Japan) 사용, Cycle I (97℃, 5 min), Cycle Ⅱ (31 cycles/ 97℃, 1 min/55℃, 1 min, 72℃, 3 min), Cycle Ⅲ(72℃, 10 min).
증폭된 DNA를 동일 효소로 절단한 pET-BAB 벡터에 도입하여 ET-BAB-H벡터를 제작하였다. 상기 단계에서 제작한 재조합 벡터 ET-BAB-H를 대장균에 형질전환시켜 재조합 균주를 제작하였다.
[실험예 1]: 3-하이드록시프로피온산(3-HP)의 합성
실시예 1 및 비교예 1에서 제조한 재조합 대장균의 배양을 위해, 각각 250㎖ 플라스크에 50㎖ LB 배지를 넣고 37℃ 회전배양기에서 12시간 전 배양을 하였다. 이후 250 ㎖ 플라스크에 50 ㎖ M9 배지를 넣고 35℃ 배양기에서 배양하여 OD(optical density)=0.8에서 0.03mM 이소프로필티오갈락토시드(Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)로 발현을 유도하였다. 24, 48시간째에 배양액 중 일부를 추출하여 흡광도(OD) 및 pH를 측정하고 HPLC (high performance liquid chromatography)를 이용하여 3-HP 생산을 확인하였다.
3-HP 분석시 Aminex HPX-87H (300mm*7.8mm) 컬럼을 사용하였고, 이동상은 0,5mM 황산용액에 9% 아세토나이트릴(acetonitrile)이 함유된 용액을 사용하여 유속 0.4 ㎖/min으로 흘려주었다. 컬럼의 온도는 35℃ 였으며, 검출기는 RI 및 UV/VIS (210 nm) 듀얼모드를 이용하였다. 3-HP는 총 35분의 분석 시간 중 17.5 분에 검출되었으며 3-HP의 생산은 LC/MS(Liquid chromatography/mass spectrometry)에 의해서도 확인하였다.
도 5 및 도 6에서 보는 바와 같이, OD값은 10시간까지는 두 균주에서 비슷하였으나, 10 시간 이후 실시예 1의 균주가 비교예 1의 균주보다 조금 높은 값을 보였으며, 배양액의 pH도 유사한 양상을 보였다.
한편, 3-HP 생산량의 경우, 비교예 1의 균주의 경우 24시간에 48.9mM, 48시간에 61.1mM 인 반면, 본 발명에 따른 실시예 1의 균주의 경우 24시간에 83.3mM, 48시간에 121mM의 높은 3-HP 생산량을 나타내었다(도 7).
부산물인 1,3-PDO 생산량의 경우, 비교예 1의 균주의 경우 24시간에 35.0mM, 48시간에 50.0mM인 반면, 본 발명에 따른 실시예 1의 균주의 경우 24시간에 11.6mM, 48시간에 18.0mM로 부산물 생성이 현저히 감소함을 확인하였다(도 8 참조).
글리세롤 데하이드라타제의 총 활성은 3-HP의 생성과 1,3-PDO 생성을 합하여 3-HPA의 양을 구함으로써 간접적으로 확인할 수 있다(도 9). 이를 측정하면, 비교예 1의 경우 24시간에 83.8mM, 48시간에 111.0mM인 반면, 본 발명에 따른 실시예 1의 균주의 경우 24시간에 94.9mM, 48시간에 139.0mM의 3-HPA를 생산하였다.
따라서, 본 발명에 따라 일리오박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus) 유래의 글리세롤 데하이드라타제를 사용한 경우 공지의 크렙시엘라 뉴모니아(klebsiella pneumoniae)유래의 글리세롤 데하이드라타제를 사용한 경우와 비교할 때, 3-HPA 생산량은 25% 향상되며 이에 따라 3-HP 생산량이 96% 향상됨을 확인하였다. 더욱이 부산물인 1,3-PDO의 생산량은 64% 감소하여 본 발명에 따르면 3-HP 생산을 증가시키고 1,3-PDO의 생산량은 감소시킴으로써 3-HP의 생산을 최대화할 수 있음을 알 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Samsung Petrochemical Co., LTD. <120> Genes Involving in 3-Hydroxypropionic Acid Biosynthesis, Recombinant Vector and Transformants containing the genes, and Producing Method of 3-Hydroxypropionic Acid Using thereof <130> P120210 <160> 22 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1665 <212> DNA <213> Ilyobacter polytropus <400> 1 atgaaatcaa aaagatttga agtattgaag gaacgtcctg taaataaaga tggctttata 60 agtgaatgga tagaagaagg actaatcgca atggaaagtc ctaacgatcc taatccaagt 120 ttgaaaatag aaaatggtca aataacagag ttagacggta aaagcagaga agaatttgac 180 atgatcgaca gatttatagc agattatgca ataaatatgg aaaatgctga aaaagctatg 240 aaaatgtcat ctatggaaat atctaaaaaa ctagtagaca taaatgtatc aagagatgaa 300 gtgctggaaa taacaacagg aattacccca gcaaaaataa ttaaagttat ggaacacatg 360 aatgttgtag agatgatgat ggccgtacaa aaaatgagag ccagaaaaac tccttccaat 420 cagtgtcatg taactaactt gagagacaat cctgtattaa ttgccgctga tgctgccgaa 480 gcgtcagtaa gaggttttga tgaacaggag actacaatcg gtatagtaag atatgcacct 540 ttcaatgcca tctcaatatt tgtaggttca 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Gln Cys His Val 130 135 140 Thr Asn Leu Arg Asp Asn Pro Val Leu Ile Ala Ala Asp Ala Ala Glu 145 150 155 160 Ala Ser Val Arg Gly Phe Asp Glu Gln Glu Thr Thr Ile Gly Ile Val 165 170 175 Arg Tyr Ala Pro Phe Asn Ala Ile Ser Ile Phe Val Gly Ser Gln Val 180 185 190 Gly Arg Gly Gly Ile Leu Thr Gln Cys Ser Val Glu Glu Ala Thr Glu 195 200 205 Leu Glu Leu Gly Met Lys Gly Phe Thr Ser Tyr Ala Glu Thr Val Ser 210 215 220 Val Tyr Gly Thr Glu Gln Val Phe Ile Asp Gly Asp Asp Thr Pro Trp 225 230 235 240 Ser Lys Ala Phe Leu Ala Ser Ala Tyr Ala Ser Arg Gly Leu Lys Met 245 250 255 Arg Phe Thr Ser Gly Thr Gly Ser Glu Ala Leu Met Gly Asn Ala Glu 260 265 270 Gly Lys Ser Met Leu Tyr Leu Glu Ala Arg Cys Ile Tyr Val Thr Arg 275 280 285 Gly Ser Gly Val Gln Gly Leu Gln Asn Gly Ser Val Ser Cys Ile Gly 290 295 300 Met Pro Gly Ser Leu Pro Gly Gly Ile Arg Ala Val Leu Ala Glu Asn 305 310 315 320 Leu Ile Ala Met Leu Leu Asp Leu Glu Cys Ala Ser Ala Asn Asp Gln 325 330 335 Thr Phe Ser His Ser Glu Tyr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Leu Met Gln 340 345 350 Met Leu Pro Gly Thr Asp Phe Ile Phe Ser Gly Tyr Ser Ala Val Pro 355 360 365 Asn Cys Asp Asn Met Phe Ala Gly Ser Asn Phe Asp Ala Glu Asp Phe 370 375 380 Asp Asp Tyr Asn Ala Leu Gln Arg Asp Leu Lys Ile Asp Gly Gly Leu 385 390 395 400 Lys Pro Val Thr Glu Asp Glu Ile Val Lys Val Arg Asn Lys Ala Ala 405 410 415 Arg Ala Ile Gln Gly Leu Phe Lys Glu Leu Asp Leu Pro Glu Ile Thr 420 425 430 Asp Glu Glu Val Glu Ala Ala Thr Tyr Ala His Gly Ser Val Asp Met 435 440 445 Pro Ala Arg Asn Val Val Glu Asp Leu Lys Ala Ala Glu Glu Leu Leu 450 455 460 Ser Ser Gly Ile Thr Gly Val Asp Leu Val Lys Gly Leu Ser Arg Ser 465 470 475 480 Gly Phe Asp Asp Val Ala Glu His Val Leu Gly Met Leu Lys Gln Arg 485 490 495 Val Ser Gly Asp Tyr Leu Gln Thr Ser Ala Ile Leu Asp Lys Gly Phe 500 505 510 Lys Ile Lys Ser Ala Ile Asn Asp Arg Asn Asp Tyr Met Gly Pro Gly 515 520 525 Ser Gly Tyr Arg Ile Ser Glu Glu Arg Trp Glu Glu Ile Lys Asn Ile 530 535 540 Pro Ser Ala Ile Lys Pro Glu Ser Ile Glu 545 550 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aaagaaaaat ttttataacc aatgtactta gatcattaag gaaagtttct 1620 catacaaaaa atattaggga ttttgaattt gtagttattg ttggaggatc tgcattggat 1680 tttgaaatat ctcagatgat aactgaagct ttatctgagt atggaatagt agcaggatgc 1740 ggaaatataa gaggaacaga gggccctaga aatgctgtag ccactggact tgtaatgggg 1800 gtgaatgatg gacaacaggc ctaa 1824 <210> 8 <211> 607 <212> PRT <213> Ilyobacter polytropus <400> 8 Met Lys Ile Ile Val Gly Val Asp Ile Gly Asn Ala Thr Thr Glu Val 1 5 10 15 Ala Leu Ala Lys Val Asp Asn Ile Glu Cys Lys Phe Leu Ser Ser Ala 20 25 30 Leu His Glu Thr Thr Gly Leu Lys Gly Thr Lys Asp Asn Val Leu Gly 35 40 45 Ile Lys Arg Ala Ile Lys Lys Ala Met Lys Arg Ala Asp Leu Lys Asn 50 55 60 Ala Asp Leu Ser Leu Ile Arg Ile Asn Glu Ala Thr Pro Val Ile Gly 65 70 75 80 Asp Val Ser Met Glu Thr Ile Thr Glu Thr Ile Ile Thr Glu Ser Thr 85 90 95 Met Ile Gly His Asn Pro Ser Thr Pro Gly Gly Ile Gly Leu Gly Ile 100 105 110 Gly Glu Thr Ile Leu Phe Gln Glu Leu Gly Asn Phe Glu Asn Asp Lys 115 120 125 Asp Tyr Ile Val Ile Val Glu Lys Ser Phe Ser Phe Leu Glu Val Ala 130 135 140 His Arg Ile Asn Glu Ala Phe Lys Asn Gly Cys Lys Ile Lys Gly Ala 145 150 155 160 Ile Ile Gln Lys Asp Asp Gly Val Leu Ile Asn Asn Arg Leu Ile Asn 165 170 175 Lys Ile Pro Ile Val Asp Glu Val Leu Phe Val Lys Lys Val Pro Thr 180 185 190 Gly Met Lys Ala Ala Val Glu Val Ala Pro Gln Gly Lys Ile Ile Glu 195 200 205 Val Ile Ser Asn Pro Tyr Gly Ile Ala Thr Ile Phe Ser Leu Thr Ser 210 215 220 Glu Glu Thr Lys Lys Ile Val Pro Ile Ser Lys Ala Leu Ile Gly Asn 225 230 235 240 Arg Ser Gly Val Val Ile Lys Thr Pro His Gly Asp Val Lys Glu Lys 245 250 255 Val Ile Pro Ala Gly Arg Ile Gln Ile Asp Gly Asn Tyr Arg Ser Lys 260 265 270 Ser Val Asn Ile Glu Glu Gly Ser Lys Arg Ile Met Lys Ala Leu Gly 275 280 285 Ser Ile Glu His Val Gln Asp Ile Asn Gly Glu Ser Gly Thr Asn Ile 290 295 300 Gly Gly Met Leu Lys Asn Val Lys Ser Val Met Gly Asn Phe Thr Asn 305 310 315 320 Glu Ser Ile Asp Asn Ile Lys Ile Lys Asp Ile Leu Ala Val Asp Thr 325 330 335 Phe Val Pro Gln Lys Ile Lys Gly Gly Ile Ala Glu Glu Phe Val Phe 340 345 350 Glu Asn Ala Val Gly Ile Ala Ala Met Val Asn Thr Lys Lys Asn Gln 355 360 365 Met Ser Glu Val Ala Lys Glu Ile Glu Lys Glu Leu Gly Val Lys Val 370 375 380 Glu Val Gly Gly Val Glu Ala Asp Met Ala Ile Thr Gly Ala Leu Thr 385 390 395 400 Thr Pro Gly Thr Gly Thr Pro Leu Val Ile Val Asp Ile Gly Ala Gly 405 410 415 Ser Thr Asp Ala Cys Ser Ile Asp Arg Tyr Gly Asn Lys Glu Leu Val 420 425 430 His Leu Ala Gly Ala Gly Asn Met Thr Thr Leu Leu Ile Gln Lys Glu 435 440 445 Leu Gly Ile Glu Asp Phe Asn Leu Ala Glu Asp Ile Lys Lys Tyr Pro 450 455 460 Leu Ala Lys Val Glu Ser Leu Phe Tyr Ile Arg His Glu Asp Gly Asn 465 470 475 480 Val Gln Phe Phe Glu Asn Ser Leu Ser Pro Lys Val Phe Ala Lys Asn 485 490 495 Val Leu Ile Lys Glu Gly Glu Leu Ile Pro Ile Asp Leu Asp Met Ser 500 505 510 Leu Glu Lys Ile Arg Ile Ile Arg Arg Ser Ala Lys Arg Lys Ile Phe 515 520 525 Ile Thr Asn Val Leu Arg Ser Leu Arg Lys Val Ser His Thr Lys Asn 530 535 540 Ile Arg Asp Phe Glu Phe Val Val Ile Val Gly Gly Ser Ala Leu Asp 545 550 555 560 Phe Glu Ile Ser Gln Met Ile Thr Glu Ala Leu Ser Glu Tyr Gly Ile 565 570 575 Val Ala Gly Cys Gly Asn Ile Arg Gly Thr Glu Gly Pro Arg Asn Ala 580 585 590 Val Ala Thr Gly Leu Val Met Gly Val Asn Asp Gly Gln Gln Ala 595 600 605 <210> 9 <211> 324 <212> DNA <213> Ilyobacter polytropus <400> 9 atggacaaca ggcctaatat aacattattt tgctcagata atattgacag ggaatatatt 60 aatgaaattt tgtggggtat agaggaggaa gagataccat atcttctgaa aattgtacct 120 tctaaagaag ttgtcaaaga aaattatgtt tcaggaactc tagagatagg tatcggagta 180 ttagaaaatg gcgacgccct tctaacaaca aggaagtacg ataaggaata tatacaaaag 240 gcaaacattt ttgtagaaaa aaataaattg agagatttag gaagcaacgg agcaagactt 300 gtaaagggtc tgccacttag ataa 324 <210> 10 <211> 108 <212> PRT <213> Ilyobacter polytropus <400> 10 Met Met Asp Asn Arg Pro Asn Ile Thr Leu Phe Cys Ser Asp Asn Ile 1 5 10 15 Asp Arg Glu Tyr Ile Asn Glu Ile Leu Trp Gly Ile Glu Glu Glu Glu 20 25 30 Ile Pro Tyr Leu Leu Lys Ile Val Pro Ser Lys Glu Val Val Lys Glu 35 40 45 Asn Tyr Val Ser Gly Thr Leu Glu Ile Gly Ile Gly Val Leu Glu Asn 50 55 60 Gly Asp Ala Leu Leu Thr Thr Arg Lys Tyr Asp Lys Glu Tyr Ile Gln 65 70 75 80 Lys Ala Asn Ile Phe Val Glu Lys Asn Lys Leu Arg Asp Leu Gly Ser 85 90 95 Asn Gly Ala Arg Leu Val Lys Gly Leu Pro Leu Arg 100 105 <210> 11 <211> 1488 <212> DNA <213> E. coli K-12 <400> 11 atgaattttc atcatctggc ttactggcag gataaagcgt taagtctcgc cattgaaaac 60 cgcttattta ttaacggtga atatactgct gcggcggaaa atgaaacctt tgaaaccgtt 120 gatccggtca cccaggcacc gctggcgaaa attgcccgcg gcaagagcgt cgatatcgac 180 cgtgcgatga gcgcagcacg cggcgtattt gaacgcggcg actggtcact ctcttctccg 240 gctaaacgta aagcggtact gaataaactc gccgatttaa tggaagccca cgccgaagag 300 ctggcactgc tggaaactct cgacaccggc aaaccgattc gtcacagtct gcgtgatgat 360 attcccggcg cggcgcgcgc cattcgctgg tacgccgaag cgatcgacaa agtgtatggc 420 gaagtggcga ccaccagtag ccatgagctg gcgatgatcg tgcgtgaacc ggtcggcgtg 480 attgccgcca tcgtgccgtg gaacttcccg ctgttgctga cttgctggaa actcggcccg 540 gcgctggcgg cgggaaacag cgtgattcta aaaccgtctg aaaaatcacc gctcagtgcg 600 attcgtctcg cggggctggc gaaagaagca ggcttgccgg atggtgtgtt gaacgtggtg 660 acgggttttg gtcatgaagc cgggcaggcg ctgtcgcgtc ataacgatat cgacgccatt 720 gcctttaccg gttcaacccg taccgggaaa cagctgctga aagatgcggg cgacagcaac 780 atgaaacgcg tctggctgga agcgggcggc aaaagcgcca acatcgtttt cgctgactgc 840 ccggatttgc aacaggcggc aagcgccacc gcagcaggca ttttctacaa ccagggacag 900 gtgtgcatcg ccggaacgcg cctgttgctg gaagagagca tcgccgatga attcttagcc 960 ctgttaaaac agcaggcgca aaactggcag ccgggccatc cacttgatcc cgcaaccacc 1020 atgggcacct taatcgactg cgcccacgcc gactcggtcc atagctttat tcgggaaggc 1080 gaaagcaaag ggcaactgtt gttggatggc cgtaacgccg ggctggctgc cgccatcggc 1140 ccgaccatct ttgtggatgt ggacccgaat gcgtccttaa gtcgcgaaga gattttcggt 1200 ccggtgctgg tggtcacgcg tttcacatca gaagaacagg cgctacagct tgccaacgac 1260 agccagtacg gccttggcgc ggcggtatgg acgcgcgacc tctcccgcgc gcaccgcatg 1320 agccgacgcc tgaaagccgg ttccgtcttc gtcaataact acaacgacgg cgatatgacc 1380 gtgccgtttg gcggctataa gcagagcggc aacggtcgcg acaaatccct gcatgccctt 1440 gaaaaattca ctgaactgaa aaccatctgg ataagcctgg aggcctga 1488 <210> 12 <211> 495 <212> PRT <213> E. coli K-12 <400> 12 Met Asn Phe His His Leu Ala Tyr Trp Gln Asp Lys Ala Leu Ser Leu 1 5 10 15 Ala Ile Glu Asn Arg Leu Phe Ile Asn Gly Glu Tyr Thr Ala Ala Ala 20 25 30 Glu Asn Glu Thr Phe Glu Thr Val Asp Pro Val Thr Gln Ala Pro Leu 35 40 45 Ala Lys Ile Ala Arg Gly Lys Ser Val Asp Ile Asp Arg Ala Met Ser 50 55 60 Ala Ala Arg Gly Val Phe Glu Arg Gly Asp Trp Ser Leu Ser Ser Pro 65 70 75 80 Ala Lys Arg Lys Ala Val Leu Asn Lys Leu Ala Asp Leu Met Glu Ala 85 90 95 His Ala Glu Glu Leu Ala Leu Leu Glu Thr Leu Asp Thr Gly Lys Pro 100 105 110 Ile Arg His Ser Leu Arg Asp Asp Ile Pro Gly Ala Ala Arg Ala Ile 115 120 125 Arg Trp Tyr Ala Glu Ala Ile Asp Lys Val Tyr Gly Glu Val Ala Thr 130 135 140 Thr Ser Ser His Glu Leu Ala Met Ile Val Arg Glu Pro Val Gly Val 145 150 155 160 Ile Ala Ala Ile Val Pro Trp Asn Phe Pro Leu Leu Leu Thr Cys Trp 165 170 175 Lys Leu Gly Pro Ala Leu Ala Ala Gly Asn Ser Val Ile Leu Lys Pro 180 185 190 Ser Glu Lys Ser Pro Leu Ser Ala Ile Arg Leu Ala Gly Leu Ala Lys 195 200 205 Glu Ala Gly Leu Pro Asp Gly Val Leu Asn Val Val Thr Gly Phe Gly 210 215 220 His Glu Ala Gly Gln Ala Leu Ser Arg His Asn Asp Ile Asp Ala Ile 225 230 235 240 Ala Phe Thr Gly Ser Thr Arg Thr Gly Lys Gln Leu Leu Lys Asp Ala 245 250 255 Gly Asp Ser Asn Met Lys Arg Val Trp Leu Glu Ala Gly Gly Lys Ser 260 265 270 Ala Asn Ile Val Phe Ala Asp Cys Pro Asp Leu Gln Gln Ala Ala Ser 275 280 285 Ala Thr Ala Ala Gly Ile Phe Tyr Asn Gln Gly Gln Val Cys Ile Ala 290 295 300 Gly Thr Arg Leu Leu Leu Glu Glu Ser Ile Ala Asp Glu Phe Leu Ala 305 310 315 320 Leu Leu Lys Gln Gln Ala Gln Asn Trp Gln Pro Gly His Pro Leu Asp 325 330 335 Pro Ala Thr Thr Met Gly Thr Leu Ile Asp Cys Ala His Ala Asp Ser 340 345 350 Val His Ser Phe Ile Arg Glu Gly Glu Ser Lys Gly Gln Leu Leu Leu 355 360 365 Asp Gly Arg Asn Ala Gly Leu Ala Ala Ala Ile Gly Pro Thr Ile Phe 370 375 380 Val Asp Val Asp Pro Asn Ala Ser Leu Ser Arg Glu Glu Ile Phe Gly 385 390 395 400 Pro Val Leu Val Val Thr Arg Phe Thr Ser Glu Glu Gln Ala Leu Gln 405 410 415 Leu Ala Asn Asp Ser Gln Tyr Gly Leu Gly Ala Ala Val Trp Thr Arg 420 425 430 Asp Leu Ser Arg Ala His Arg Met Ser Arg Arg Leu Lys Ala Gly Ser 435 440 445 Val Phe Val Asn Asn Tyr Asn Asp Gly Asp Met Thr Val Pro Phe Gly 450 455 460 Gly Tyr Lys Gln Ser Gly Asn Gly Arg Asp Lys Ser Leu His Ala Leu 465 470 475 480 Glu Lys Phe Thr Glu Leu Lys Thr Ile Trp Ile Ser Leu Glu Ala 485 490 495 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tcatgaaatc aaaaagattt gaagtattga ag 32 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ggatccctaa tcttttctaa gttgacctct ttgttc 36 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ggatccaaag gttcggggat agttatgaag 30 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gagctcttat ctaagtggca gaccctttac aag 33 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 tttcatatga attttcatca tctggcttac 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 tttagatctt tcggtcattt caggcctcca 30 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 atatcatgaa aagatcaaaa cgattt 26 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 aaagaattcc gcgagcgccc gtttaattc 29 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 tttgaattct aacgagggga ccgtcatgtc 30 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplying gdrB. backward <400> 22 atagtcgact cagtttctct cacttaacgg 30

Claims (12)

  1. 일로박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus) 유래의 글리세롤 데하이드라타제(glycerol dehydratase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 3-하이드록시프로피온알데히드를 3-하이드록시프로피온산으로 전환시키는 데하이드로게나제(dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 3-하이드록시프로피온산의 생산방법.
  2. ⅰ) (a) 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 6의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 (a)의 상보적 서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 글리세롤 데하이드라타제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및
    ⅱ) 3-하이드록시프로피온알데히드를 3-하이드록시프로피온산으로 전환시키는, (a) 서열번호 12의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 (a)의 상보적 서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 데하이드로게나제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 3-하이드록시프로피온산의 생산방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 글리세롤 데하이드라타제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 5 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 3-하이드록시프로피온산의 생산방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 데하이드로게나제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 11인 것을 특징으로 하는 3-하이드록시프로피온산의 생산방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 재조합 미생물은 (a) 서열번호 8 및 서열번호 10 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 (a)의 상보적 서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 글리세롤 데하이드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 3-하이드록시프로피온산의 생산방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 글리세롤 데하이드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 7 및 서열번호 9 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 3-하이드록시프로피온산의 생산방법.
  7. 일로박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus) 유래의 글리세롤 데하이드라타제(glycerol dehydratase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 3-하이드록시프로피온알데히드를 3-하이드록시프로피온산으로 전환시키는 데하이드로게나제(dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3-하이드록시프로피온산의 생합성에 관여하는 재조합 미생물.
  8. ⅰ) (a) 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 6의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 (a)의 상보적 서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 글리세롤 데하이드라타제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및
    ⅱ) 3-하이드록시프로피온알데히드를 3-하이드록시프로피온산으로 전환시키는, (a) 서열번호 12의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 (a)의 상보적 서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 데하이드로게나제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3-하이드록시프로피온산의 생합성에 관여하는 재조합 미생물.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    상기 글리세롤 데하이드라타제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 5 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 3-하이드록시프로피온산의 생합성에 관여하는 재조합 미생물.
  10. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    상기 데하이드로게나제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 11인 것을 특징으로 하는 3-하이드록시프로피온산의 생합성에 관여하는 재조합 미생물.
  11. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    상기 재조합 미생물은 (a) 서열번호 8 및 서열번호 10 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 (a)의 상보적 서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 글리세롤 데하이드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 3-하이드록시프로피온산의 생합성에 관여하는 재조합 미생물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 글리세롤 데하이드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 7 및 서열번호 9 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 3-하이드록시프로피온산의 생합성에 관여하는 재조합 미생물.
KR1020120071367A 2012-06-29 2012-06-29 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산의 생산방법 KR20140003258A (ko)

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