CN106636156B

CN106636156B - 一种联产长链二元酸和1,3-丙二醇的工程菌及其构建方法

Info

Publication number: CN106636156B
Application number: CN201611219248.2A
Authority: CN
Inventors: 汪俊卿; 郭维伟; 彭健; 王瑞明; 杨晓慧; 石莹; 程成; 修翔
Original assignee: Qilu University of Technology
Current assignee: Qilu University of Technology
Priority date: 2016-12-26
Filing date: 2016-12-26
Publication date: 2021-03-19
Anticipated expiration: 2036-12-26
Also published as: CN106636156A

Abstract

本发明涉及一种联产长链二元酸和1,3‑丙二醇的工程菌及其构建方法，通过转化重组质粒制备，重组质粒通过PCR扩增获得甘油脱水酶基因，与PCR扩增获得的启动子pGAPg重叠连接，获得pGAPg‑GD片段；通过PCR扩增获得1,3‑丙二醇脱氢酶基因与PCR扩增获得的启动子pGAPp重叠连接，获得pGAPp‑PDE片段；通过PCR扩增获得的终止子基因，并制备双向终止子片段；分别连接上述片段，获得重组质粒。本发明构建的工程菌，实现多基因同时表达；并且长链二元酸的产量为10g/L，转化甘油产生的1,3‑丙二醇的产量为13g/L，显著高于现有已知的报道。

Description

一种联产长链二元酸和1,3-丙二醇的工程菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种联产长链二元酸和1,3-丙二醇的工程菌及其构建方法，特别涉及一种转化油脂联产长链二元酸和1,3-丙二醇热带假丝酵母工程菌及其构建方法与应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

长链二元酸是指碳链中含有10个以上碳原子的直链脂肪族二元羧酸。重要的精细化工中间体，可以合成香料、特种尼龙、聚酰胺热熔胶等一系列高附加值的特殊化学品，目前国内外生产长链二元酸主要有2种方法：化学法和发酵法。与微生物发酵法相比，化学法生产长链二元酸条件苛刻、工艺复杂、不够环保，且产品质量差，因此众多研究者将目标转向有广阔发展前景、工业价值大的微生物发酵上来。微生物发酵法是以正构烷烃为原料，利用热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)的氧化性能，在常温常压下氧化正构烷烃两端的甲基，生成基质烷烃相应链长的二元酸。由于长链二元酸的下游产品的开发潜力广阔，国内长链二元酸的需求量将不断增加，其市场潜力极大。国内已经实现了热带假丝酵母以烷烃为底物生成长链二元酸的发酵手段，如中国专利文献CN103074325A(申请号201310045582.0)中国专利文献CN102839133A(申请号201110168672X)中国专利文献CN102115766A(申请号2009102565871)中国专利文献CN102115766B(申请号2009102565871)中国专利文献CN1614004A(申请号200410096698.8)中国专利文献CN103805642A(申请号2012104397995)中国专利文献CN102115769A(申请号:2009102565907)中国专利文献CN102115765A(申请号2009102565867)中国专利文献CN1844404A(申请号200610038331X)。

1,3-丙二醇(1，3-propanediol，简称1，3-PD)是一种重要的化工原料，被广泛应用于印染、涂料、油墨、药物、抗冻剂、润滑剂等领域，尤其作为单体合成新型聚酯材料PTT(聚对苯二甲酸丙二醇酯)受到人们广泛关注。可用于多种药物、新型聚酯PTT、医药中间体及新型抗氧化剂的合成，还可用，溶剂，有机合成，气象色谱分析标准。1，3-PD的生产方法主要有化学合成和微生物发酵法，由于石化资源的短缺，近年来微生物发酵法生产1，3-PD成为国内外研究的热点。现在国内已实现了克雷伯氏菌以甘油为底物发酵生产1,3-丙二醇的方法如中国专利文献CN102604863A(申请号201210053231X)中国专利文献CN102604863B(申请号201210053231X)中国专利文献CN101633928B(申请号2008102282685)中国专利文献CN101260379B(申请号200810024000X)中国专利文献CN103497922A(申请号2013104091486)中国专利文献CN103497922B(申请号2013104091486)

虽然现在有热带假丝酵母发酵生产长链二元酸和克雷伯氏菌发酵产1,3-丙二醇的单独发酵方案，还没有通过同一菌株发酵同时生产长链二元酸和1,3-丙二醇相关报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种联产长链二元酸和1,3-丙二醇的工程菌及其构建方法。

本发明技术方案如下：

一种重组质粒，通过从丁酸梭菌中经PCR扩增获得甘油脱水酶基因，然后与从热带假丝酵母中经PCR扩增获得的启动子pGAPg重叠连接，获得pGAPg-GD片段；通过经PCR扩增获得的1,3-丙二醇脱氢酶基因与从热带假丝酵母中经PCR扩增获得的启动子pGAPp重叠连接，获得pGAPp-PDE片段；通过从质粒上PCR扩增获得的终止子基因，经反向连接，获得双向终止子片段；分别向质粒中插入pGAPg-GD片段、pGAPp-PDE片段、双向终止子片段及Kanr基因片段，获得重组质粒；

所述启动子pGAPg核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，启动子pGAPp核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所述的甘油脱水酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，1,3-丙二醇脱氢酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述终止子基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述的Kanr基因核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

上述重组质粒实现了甘油脱水酶和1,3-丙二醇脱氢酶分别连接在双向终止子两端的整合，同时重组质粒上获得抗生素标记Kanr的序列。

上述重组质粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)以热带假丝酵母基因组为模板，进行PCR扩增，获得启动子pGAPg片段；

所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：

pGAPg-up:5’-AGATCTAAGAAGAATTTAGTGGTTAGTCG-3’，

pGAPg--down:5’-ATCCTTTACTTATCATTGTTAAAATTTAATTTGTAAGTGATTTG-3’；

其中单下划线为酶切位点Bgl II；

(2)以热带假丝酵母基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到启动子pGAPp片段；

所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：

pGAPp-up:5’-AGATCTAAGAAGAATTTAGTGGTTAGTCG-3’；

pGAPp-down:5’-TCAAACATACGATAGCTCATTGTTAAAATTTAATTTGTAAGTGATTT G-3’；

其中单下划线为酶切位点Bgl II；

(3)以丁酸梭菌的基因组为模板，进行PCR扩增，得到甘油脱水酶GD片段；

所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：

GD-up:5’-CAAATTAAATTTTAACAATGATAAGTAAAGGATTTAGTACCC-3’，

GD-down:5’-GGATCCTTACATAACATGTTCAGTTCTTGC-3’；

其中单下划线为酶切位点BamH I；

(4)以克雷伯氏菌的基因组为模板，进行PCR扩增，得到1,3-丙二醇脱氢酶PDE片段；

所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：

PDE-up:5’-TTTAACAATGAGCTATCGTATGTTTGATT-3’，

PDE-down:5’-GATTTTCCGCCAGGCATTCTGAGGATCC-3’；

其中单下划线为酶切位点BamH I；

(5)以质粒Kanr9k为模板，进行PCR扩增，得到终止子pTTza片段；

所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：

pTTza-up:5’-AGATCTGTTTGTAGCCTTAGACATGACTG-3’；

pTTza-down:5’-GGATCCGCACAAACGAAGG-3’；

其中单下划线为酶切位点Bgl II；

(6)以大肠杆菌的基因组为模板，进行PCR扩增，得到抗性标记Kanr片段；

所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：

pKanr9k-up:5’-AGATCTTGAGGGAGCCACGGTTGAT-3’

pKanr9k-down:5’-GGATCCGGTTGAGGCCGTTGAGCA-3’

其中单下划线分别为酶切位点Bgl II，酶切位点BamH I。

(7)将步骤(1)制得的启动子pGAPg片段与步骤(3)制得的甘油脱水酶片段GD进行PCR重叠连接，制得pGAPg-GD片段；

(8)将步骤(2)制得的启动子pGAPp片段与步骤(4)制得的1,3-丙二醇脱氢酶片段PDE进行PCR重叠连接，制得pGAPp-PDE片段；

(9)将步骤(5)制得的终止子pTTza片段进行终止子间的反向连接；

(10)将步骤(6)中得到的pKanr9k片段，步骤(7)中制得的pGAPg-GD片段，步骤(8)中制得的pGAPg-PDE片段，分别与Ptopo-Blunt-Vector载体连接，制得Ptopo-Blunt-pKanr9k，Ptopo-Blunt-pGAPg-GD，Ptopo-Blunt-pGAPg-PDE质粒；

(11)将步骤(10)制得的Ptopo-Blunt-pGAPg-GD质粒用限制性内切酶BamH I单酶切，然后将单酶切后的质粒去磷酸化；

(12)将步骤(10)制得的Ptopo-Blunt-pGAPp-PDE质粒进行双酶切，所用酶为限制性内切酶Bgl II和BamH I，并回收双酶切产物pGAPp-PDE；

(13)将步骤(9)制得的pTOPO-Blunt-pTTza-pTTza质粒进行双酶切，所用酶为限制性内切酶Bgl II和BamH I，并回收切下的pTTza-pTTz片段；

(14)将步骤(10)制得的Ptopo-Blunt-pKanr9k质粒进行双酶切，所用酶为限制性内切酶Bgl II和BamH I，并回收切下的pKanr9k片段；

(15)将步骤(13)制得的pTTza-pTTza片段连接到步骤(11)制得的磷酸化后的单酶切载体上，制得Ptopo-Blunt-pGAPg-GD-pTTza载体；

(16)将步骤(15)制得的Ptopo-Blunt-pGAPg-GD-pTTza载体进行单酶切，所用酶为限制性内切酶BamH I，将回收的单酶切产物去磷酸化；

(17)将步骤(12)制得的pGAPp-PDE片段连接到步骤(16)制得的磷酸化后的单酶切载体上；

(18)将步骤(17)所得的重组载体单酶切，所用酶为限制性内切酶Bgl II，将回收的单酶切产物去磷酸化；

(19)将步骤(14)所得的Kanr片段连接到步骤(18)中的单酶切载体上获得最终构建的基因重组载体Ptopo-GD-PDE-Kanr。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增的扩增体系如下，体系总体积50μl：

2×HiFi-PCR Master 25μl，10μmol/L上游引物2μl，10μmol/L下游引物2μl，模板2.5μl，用ddH₂O补足至50μl；

所述的PCR扩增的扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增的扩增体系如下，体系总体积50μl：

所述的PCR扩增的扩增程序如下：

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，PCR扩增的扩增体系如下，体系总体积50μl：

2×Taq PCR MasterMix 25μl，10μmol/L上游引物2μl，10μmol/L下游引物2μl，模板2.5μl，用ddH₂O补足至50μl；

所述的PCR扩增的扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸2.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中，PCR扩增的扩增体系如下，体系总体积50μl：

所述的PCR扩增的扩增程序如下：

根据本发明优选的，所述步骤(5)中，PCR扩增的扩增体系如下，体系总体积50μl：

2×Taq PCR MasterMi 25μl，10μmol/L上游引物2μl，10μmol/L下游引物2μl，模板2.5μl，用ddH₂O补足至50μl；

所述的PCR扩增的扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤(6)中，PCR扩增的扩增体系如下，体系总体积50μl：

2×HiFi PCR Master 25μl，10μmol/L上游引物2μl，10μmol/L下游引物2μl，模板2.5μl，用ddH₂O补足至50μl；

所述的PCR扩增的扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤(7)中，重叠PCR第一步扩增体系如下，体系总体积25μl：

2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，10μmol/L pGAPg片段回收产物2μl，10μmol/L GD片段回收产物2μl，用ddH₂O补足至25μl；

所述的重叠PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min，所得产物继续进行第二步PCR扩增。

所述第二步PCR扩增体系如下，体系总体积25μl：

2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，10μmol/L上游引物pGAPg-up 2μl，10μmol/L下游引物GD-down 2μl，用ddH₂O补足至25μl；

所述第二步PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸3.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤(8)中，重叠PCR第一步扩增体系如下，体系总体积25μl：

2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，10μmol/L pGAPp片段回收产物2μl，10μmol/LPDE片段回收产物2μl，用ddH₂O补足至25μl；

所述的重叠PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min，所得产物继续进行第二步PCR扩增。

所述第二步PCR扩增体系如下，体系总体积25μl：

2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，10μmol/L上游引物pGAPp-up 2μl，10μmol/L下游引物PDE-down 2μl，用ddH₂O补足至25μl；

所述第二步PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸3.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤(9)中，反向连接步骤如下：

将步骤(5)制得的pTTza片段连接到载体pTOPO-Blunt上，制得pTOPO-Blunt-pTTza；然后用限制性内切酶Bgl II和BamH I对pTOPO-Blunt-pTTza进行双酶切，将切下的短片段pTTza回收；用限制性内切酶BamH I再对pTOPO-Blunt-pTTza进行单酶切，并回收单酶切产物；将单酶切产物去磷酸化，然后与双酶切得到的pTTza短片段用T4连接酶连接，制得双向终止子结构pTOPO-Blunt-pTTza-pTTza；

进一步优选的，所述的去磷酸化的体系如下，总体系为50ul：

待去磷酸化的DNA片段25μl，10×Alkaline Phosphatase Buffer 5μl，CIAP(宝生物碱性磷酸酶)2μl，用ddH₂O补足至50μl；

所述的去磷酸化的条件如下：

37℃或50℃反应30分钟；或者先37℃反应15分钟，然后再50℃反应15分钟；添加5μl，3mol/L的醋酸钠，并加入125μl的冰乙醇在-20℃下保存30～60min；然后4℃、12000rpm离心15min回收沉淀，用200μl 70％冰乙醇洗净，4℃、12000rpm离心15min，用20μl以下的H₂O溶解沉淀，即得；

进一步优选的，所述连接的反应体系如下，体系总体积20μl：

单酶切长片段载体6μl，双酶切短片段2μl，T4DNA Ligase 1μl，10×T4DNA LigaseBuffer 2μl，ddH₂O补充至20μl；

所述连接的条件为:22℃连接10min。

根据本发明优选的，所述步骤(10)中，连接体系如下，体系总体积为10μl：

待连接片段4μl，Ptopo-Blunt-Vector载体1μl，10×Enhancer 1μl，ddH₂O补充至10μl；

所述连接的条件为：20℃-30℃连接5min。

根据本发明优选的，所述步骤(11)、步骤(16)和步骤(18)中，去磷酸化的体系如下，总体系为50ul：

所述的去磷酸化的条件如下：

37℃或50℃反应30分钟；或者先37℃反应15分钟，然后再50℃反应15分钟；添加5μl，3mol/L的醋酸钠，并加入125μl的冰乙醇在-20℃下保存30～60min；然后4℃、12000rpm离心15min回收沉淀，用200μl 70％冰乙醇洗净，4℃、12000rpm离心15min，用20μl以下的H₂O溶解沉淀，即得。

根据本发明优选的，所述步骤(15)中，连接的反应体系如下，体系总体积20μl：

Ptopo-Blunt-GAPg-GD载体6μl，pTTza-pTTza片段2μl，T4DNA Ligase 1μl，10×T4DNA Ligase Buffer 2μl，ddH₂O补充至20μl；

所述的连接体系的连接条件为:22℃连接10min。

根据本发明优选的，所述步骤(17)中，连接的反应体系如下，体系总体积20μl：

Ptopo-Blunt-pGAPg-GD-pTTza载体6μl，pGAPp-PDE片段2μl，T4DNA Ligase 1μl，10×T4DNA Ligase Buffer 2μl，ddH₂O补充至20μl；

所述的连接体系的连接条件为:22℃连接10min；

根据本发明优选的，所述步骤(19)中，所述连接的反应体系如下，体系总体积20μl：

Ptopo-Blunt-pGAPg-GD-pTTza-PDE载体6μl，Kanr片段2ul，T4DNA Ligase 1μl，10×T4DNA Ligase Buffer:2μl，ddH₂O补充至20μl；

所述的连接体系的连接条件为:22℃连接10min。

一种转化油脂联产长链二元酸和1,3-丙二醇热带假丝酵母工程菌的制备方法，包括如下步骤：

(i)制备热带假丝酵母感受态细胞；

(ii)将步骤(i)制得的热带假丝酵母感受态细胞与线性化重组质粒Ptopo-GD-PDE-Kanr混合，冰浴5min后，在1500v电压转化5ms，然后与预冷的1mol/L山梨酸溶液混匀，30℃摇床1h后，筛选，制得转化油脂联产长链二元酸和1,3-丙二醇热带假丝酵母工程菌。

所述步骤(i)中，热带假丝酵母感受态细胞的制备可采用本领域常规技术，也可按如下步骤：

①将热带假丝酵母菌接种到YPD固体培养基平板上，30℃培养过夜，将平板上的单菌落接种到25mlYPD液体培养基中于30℃220rpm/min摇床中培养20h，制得种子液；

②取0.5ml上述种子液接种到25mlYPD液体培养基中，30℃220rpm/min摇床培养8h，使OD₆₀₀于1.3～1.5之间，制得扩大培养液；

③取1ml扩大培养液到1.5mlEP管中，用离心机3000rpm离心5min收集菌体，用1.5ml预冷的无菌水吹打悬浮细胞，重复离心、悬浮步骤一次；

④用离心机3000rpm离心5min收集菌体，用1ml山梨醇悬浮细胞；

⑤重复步骤④离心、悬浮步骤一次，用80μl预冷的山梨醇悬浮细胞，并于-80℃保存。

上述转化油脂联产长链二元酸和1,3-丙二醇热带假丝酵母工程菌在制备长链二元酸和1,3-丙二醇中的应用。

原理说明：

本发明将甘油脱水酶和1，3丙二醇脱氢酶基因转运到热带假丝酵母基因组中，构建成热带假丝酵母工程菌，使热带假丝酵母发酵产生长链二元酸的同时，对副产物甘油加以利用，将其转化成利用价值更高的1,3-丙二醇，提高工程菌的发酵效率。将从克雷伯氏菌中获得的1,3-丙二醇脱氢酶基因，从丁酸梭菌中获得的甘油脱水酶基因整合到热带假丝酵母基因组中。在甘油分解生物合成1,3-丙二醇的途径中，甘油脱水酶能催化甘油、1，2-丙二醇和乙醇分别生成三羟丙醛，丙醛和乙醛，是控制甘油分解和产生1,3-丙二醇的关键性限速酶。1,3-丙二醇脱氢酶又称1,3-丙二醇氧还酶，是产生1,3-丙二醇过程中的关键酶。它能将甘油氧化为二羟基丙酮过程中产生的质子传递到3-羟基丙醛，并释放出1,3-丙二醇。将甘油脱水酶基因和1,3-丙二醇脱氢酶基因整合到热带假丝酵母中，在保证其正常产生长链二元酸的同时，高效利用副产物甘油转化成1,3-丙二醇。

有益效果

1、本发明构建了一种承载甘油脱水酶和1,3-丙二醇脱氢酶以及卡那霉素的基因重组表达载体，实现多基因同时表达；并且本发明构建的热带假丝酵母工程菌发酵后的长链二元酸的产量为10g/L，转化甘油产生的1,3-丙二醇的产量为13g/L，显著高于现有已知的报道；

2、本发明构建了一种热带假丝酵母工程菌，该工程菌不仅能保证发酵生产长链二元酸，且能利用其副产物甘油将其转化成利用价值更高的1,3-丙二醇，降低生产成本，提高生产速率。

附图说明

图1、制备的启动子pGAPg的电泳结果照片；

图2、制备的启动子pGAPp的电泳结果照片；

图3、制备的甘油脱水酶GD的电泳结果照片；

图4、制备的1,3-丙二醇脱氢酶PDE的电泳结果照片；

图5、制备的终止子pTTza的电泳结果照片；

图6、制备的抗性标记Kanr的电泳结果照片；

图7、制备的重叠片段pGAPg-GD的电泳结果照片；

图8、制备的重叠片段pGAPg-PDE的电泳结果照片；

图9、制备的双向终止子片段pTTza-pTTza的电泳结果照片；

具体实施方式:

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

生物材料来源：

热带假丝酵母原始菌(Candida tropicalis)购自中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)；编号为CICC1798；

克雷伯氏菌(Klabsiella oxylaca)购自中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)；编号为CICC10781；

丁酸梭菌(Clostridium botulinum)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)；编号为CGMCC1336；

质粒Ptopo-Blunt-Vector购自北京艾德莱生物科技有限公司；

质粒pPIC9K购自购自宝生物有限公司。

实施例1

一种重组质粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)以热带假丝酵母(Candida tropicalis)基因组为模板，进行PCR扩增，获得启动子pGAPg片段，电泳结果如图1所示；

所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：

pGAPg-up:5’-AGATCTAAGAAGAATTTAGTGGTTAGTCG-3’，

pGAPg--down:5’-ATCCTTTACTTATCATTGTTAAAATTTAATTTGTAAGTGATTTG-3’；

其中单下划线为酶切位点Bgl II；

所述PCR扩增的扩增体系如下，体系总体积50μl：

所述的PCR扩增的扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

(2)以热带假丝酵母(Candida tropicalis)基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到启动子pGAPp片段，电泳结果如图2所示；

所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：

pGAPp-up:5’-AGATCTAAGAAGAATTTAGTGGTTAGTCG-3’；

pGAPp-down:5’-TCAAACATACGATAGCTCATTGTTAAAATTTAATTTGTAAGTGATTT G-3’；

其中单下划线为酶切位点Bgl II；

所述PCR扩增的扩增体系如下，体系总体积50μl：

所述的PCR扩增的扩增程序如下：

(3)以丁酸梭菌(Clostridium botulinum)的基因组为模板，进行PCR扩增，得到甘油脱水酶GD片段，电泳结果如图3所示；

所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：

GD-up:5’-CAAATTAAATTTTAACAATGATAAGTAAAGGATTTAGTACCC-3’，

GD-down:5’-GGATCCTTACATAACATGTTCAGTTCTTGC-3’；

其中单下划线为酶切位点BamH I；

所述PCR扩增的扩增体系如下，体系总体积50μl：

所述的PCR扩增的扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸2.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

(4)以克雷伯氏菌(Klabsiella oxylaca)的基因组为模板，进行PCR扩增，得到1,3-丙二醇脱氢酶PDE片段，电泳结果如图4所示；

所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：

PDE-up:5’-TTTAACAATGAGCTATCGTATGTTTGATT-3’，

PDE-down:5’-GATTTTCCGCCAGGCATTCTGAGGATCC-3’；

其中单下划线为酶切位点BamH I。

所述PCR扩增的扩增体系如下，体系总体积50μl：

所述的PCR扩增的扩增程序如下：

(5)以质粒Kanr9k为模板，进行PCR扩增，得到终止子pTTza片段，电泳结果如图5所示；

所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：

pTTza-up:5’-AGATCTGTTTGTAGCCTTAGACATGACTG-3’

pTTza-down:5’-GGATCCGCACAAACGAAGG-3’

其中单下划线为酶切位点Bgl II。

所述PCR扩增的扩增体系如下，体系总体积50μl：

所述的PCR扩增的扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

(6)以大肠杆菌的基因组为模板，进行PCR扩增，得到抗性标记Kanr片段，电泳结果如图6所示；

所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：

pKanr9k-up:5’-AGATCTTGAGGGAGCCACGGTTGAT-3’

pKanr9k-down:5’-GGATCCGGTTGAGGCCGTTGAGCA-3’

其中单下划线分别为酶切位点Bgl II，酶切位点BamH I。

所述PCR扩增的扩增体系如下，体系总体积50μl：

所述的PCR扩增的扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

(7)将步骤(1)制得的启动子pGAPg片段与步骤(3)制得的甘油脱水酶片段GD进行PCR重叠连接，制得pGAPg-GD片段，电泳结果如图7所示；

所述的重叠PCR第一步扩增体系如下，体系总体积25μl：

所述的重叠PCR扩增程序如下：

所述第二步PCR扩增体系如下，体系总体积25μl：

所述第二步PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸3.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

(8)将步骤(2)制得的启动子pGAPp片段与步骤(4)制得的1,3-丙二醇脱氢酶片段PDE进行PCR重叠连接，制得pGAPp-PDE片段，电泳结果如图8所示；

所述的重叠PCR第一步扩增体系如下，体系总体积25μl：

所述的重叠PCR扩增程序如下：

所述第二步PCR扩增体系如下，体系总体积25μl：

所述第二步PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸3.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

(9)将步骤(5)制得的终止子pTTza片段进行终止子间的反向连接，电泳结果如图9所示；

单酶切的pTOPO-Blunt-pTTza长片段在加有T4连接酶后会发生自连，因此要将切口处进行去磷酸化；

所述的去磷酸化的体系如下，总体系为50ul：

所述的去磷酸化的条件如下：

所述连接的反应体系如下，体系总体积20μl：

单酶切长片段载体6μl，双酶切短片段2μl，T4DNA Ligase 1μl，10×T4DNA LigaseBuffer 2μl，ddH₂O补充至20μl。

所述连接的条件为:22℃连接10min。

(10)将步骤(6)中得到的pKanr9k片段，步骤(7)中制得的pGAPg-GD片段，步骤(8)中制得的pGAPg-PDE片段，分别与Ptopo-Blunt-Vector载体连接，制得Ptopo-Blunt-pKanr9k，Ptopo-Blunt-pGAPg-GD，Ptopo-Blunt-pGAPg-PDE质粒；连同步骤(9)中制得的pTOPO-Blunt-pTTza-pTTza质粒，分别转化到大肠杆菌DH5α中。

所述的连接体系如下，体系总体积为10μl：

重叠PCR回收产物4μl，Ptopo-Blunt Vector 1μl，10×Enhancer 1μl，ddH₂O补充至10μl。

所述连接的条件为：室温(20℃-30℃)连接5min。

所述的转化，步骤如下：

将大肠杆菌DH5α感受态冰浴融化，加入10μl连接产物，置于冰浴中30min，然后42℃水浴90sec，然后继续冰浴3min。加入500μl无抗生素LB培养基于37℃200rpm摇床培养45-60min。取200ul-300μl的转化产物涂到LB固体培养基平板中，作对照组，于37℃恒温箱培养12h。

挑取实验组平板长出的单菌落于LB培养基中培养12h。为排除片段未转化进大肠杆菌而吸附在菌体表面影响验证结果，需将菌体进行洗脱。分别取部分菌液于离心管中12000rpm，5min获取菌体，弃掉上清液后加入适量无菌水反复吹打至菌体悬浮，再次同样条件离心，弃掉上清液，加入适量无菌水至菌体悬浮。

将此悬浮液作为菌落PCR验证的模板。

如上所述菌落PCR验证体系如下，体系总体积为25μl：

2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，模板菌体悬浮液2μl，上游引物(10μmol/L)2μl，下游引物(10μmol/L)2ul，用ddH₂O补足25μl；(此处的上下游引物为各片段pcr扩增时所用引物)。

如上所述菌落PCR验证程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，退火30sec，72℃延伸，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；(此菌落PCR验证程序中的退火温度，延伸时间为各片段PCR扩增时所用的退火温度和延伸时间)。

将以上经菌落PCR验证后的各菌体挑选部分进行基因序列测定，分析反馈的测序结果，挑取测定结果良好的菌株培养，然后从各菌液中提取所含各个上述基因片段的质粒。

所述的去磷酸化的体系如下，总体系为50ul：

所述的去磷酸化的条件如下：

所述连接的反应体系如下，体系总体积20μl：

Ptopo-Blunt-GAPg-GD载体:6μl，pTTza-pTTza片段:2μl，T4DNA Ligase:1μl，10xT4DNA Ligase Buffer:2μl，ddH₂O补充到20μl；

所述的连接体系的连接条件为:22℃连接10min；

所述的去磷酸化的体系如下，总体系为50ul：

所述的去磷酸化的条件如下：

所述连接的反应体系如下，体系总体积20μl：

Ptopo-Blunt-pGAPg-GD-pTTza载体:6μl，pGAPp-PDE片段:2μl，T4DNA Ligase:1μl，10x T4DNA Ligase Buffer:2μl，ddH₂O补充到20μl。

所述的连接体系的连接条件为:22℃连接10min。

所述的去磷酸化的体系如下，总体系为50ul：

所述的去磷酸化的条件如下：

所述连接的反应体系如下，体系总体积20μl：

Ptopo-Blunt-pGAPg-GD-pTTza-PDE载体:6μl，Kanr片段:2ul，T4DNA Ligase:1μl，10x T4DNA Ligase Buffer:2μl，ddH₂O补充到20μl。

所述的连接体系的连接条件为:22℃连接10min。

制得的重组质粒中，所述启动子pGAPg核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，热带假丝酵母启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的甘油脱水酶基因核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，1,3-丙二醇脱氢酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述终止子基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述的Kanr基因核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

实施例2

(i)制备热带假丝酵母感受态细胞；

所述热带假丝酵母感受态细胞的制备可采用本领域常规技术，也可按如下步骤：

④用离心机3000rpm离心5min收集菌体，用1ml山梨醇悬浮细胞；

(ii)将步骤(i)制得的热带假丝酵母感受态细胞与线性化重组质粒Ptopo-GD-PDE-Kanr混合，冰浴5min后，在1500v电压转化5ms，然后与预冷的1mol/L山梨酸溶液混匀，30℃摇床1h后，筛选，制得转化油脂联产长链二元酸和1,3-丙二醇热带假丝酵母工程菌；具体步骤如下：

①将80μl热带假丝酵母感受态细胞与10-20μl线性化重组质粒Ptopo-GD-PDE-Kanr混合，并将其转化至0.1cm点转杯。

②将装有混合液的转化杯冰浴5min。

③调整好基因导入仪的参数，1500v电压点击一次，时间为5ms。

④立即往转化杯中加入1ml预冷的1mol/L山梨酸溶液混匀，并将其转化至灭菌的离心管中，于30℃摇床1h。

⑤将混合液涂于YPD固体培养基平板上，每个平板涂200ul混合液，将平板置于30℃培养箱中过夜培养，挑取平板上的单菌落于5mlYPD液体培养基，于30℃摇床培养8h。

⑥取2μl培养液为模板作菌落PCR，筛选G418克隆，保存转化子。

实施例3热带假丝酵母工程菌的构建与发酵验证

将实施例2构建获得的热带假丝酵母工程菌接种于YPD培养基，培养条件为30℃摇床12h，然后按体积百分比10％的比例转接于热带假丝酵母发酵培养基中，在30℃摇床发酵验证。

所述YPD培养基组分如下：

蛋白胨20g，葡萄糖20g，氯化钠10g，水定容至1L。

所述发酵培养基组分如下：

葡萄糖62g，硫酸铵1g，酵母粉2g，维生素B1 0.2g，氯化钠2g，磷酸二氢钾8g，磷酸氢二钠10g，尿素3g，硫酸镁6g，水定容至1L。

热带假丝酵母工程菌发酵后的长链二元酸的产量为10g/L，转化甘油产生的1,3-丙二醇的产量为13g/L。

对比例1

目前利用酵母生产1,3-丙二醇仅有一篇报道(Zheng,et al.Curr Microbiol(2010)60:191–198.)，该对比文件将来自于克雷伯氏菌中的甘油脱水酶和1，3丙二醇脱氢酶基因克隆并转化至毕赤酵母中，进而完成甘油至1,3-丙二醇的转化，该工程菌在最佳发酵条件下，1,3-丙二醇的产量仅为1.2g/L。

结果分析

通过对比例1与本申请的工程菌对比可以看出，对比例1所采用的甘油脱水酶由3个亚基构成，克隆及异源表达难度高，限制了1,3-丙二醇的产量。而本发明采用了来源于丁酸梭菌中的仅包含1个亚基的甘油脱水酶基因，并在能够生产长链二元酸的菌株假丝酵母中同时实现了两种酶的表达，1,3-丙二醇的产量最高可达13g/L。从而使本发明实现将油脂中的两种高附加值成分(甘油和脂肪酸)利用同一菌株同时高效率转化生成的目得以实现。

SEQUENCE LISTING

<110> 齐鲁工业大学

<120> 一种联产长链二元酸和1,3-丙二醇的工程菌及其构建方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 978

<212> DNA

<213> Candida tropicalis

<400> 1

agatctaaga agaatttagt ggttagtcgt tatggaggac aaaatagaga tcaataaatc 60

agtcgaatta ctccagtcgt caggatatct ccaataatcg gagtaattga ccccaattgt 120

ttgtttacta cgtcattcct ggcagtattc gagaaagatt agtccgacag agaagaaaaa 180

caaaattaaa agttcaaagt tgcaggagaa acggagcctt ctccagcagc agcaacagca 240

gcagcagtag cagcaacaga aaaaaaaaat aattgatctt catctaaggg ggaggggtga 300

gtcagagata tagggatgga tgtttaccga tggtgaatat attttattat aactttgaaa 360

aatgtgtcaa ataaagacca attgtatcaa ttgagtcgtt ttaaacaatt atctctacag 420

caattgtaac ctctacagga aacgtttttc tcaatggtcg taatattttg caatcggatg 480

gtatgggtta cagaacgtga catatttttc tttacctgtt ggatcaggtg tttttttttg 540

ttgatctatc caacgtttgg tgtaagctcg tggtgtgctc tgcaaaaatt ttttctctct 600

cttttttttt tagtagcctg cttgcgtgcg tgaatcgggc accttactca tttgaatcaa 660

tcagtaggtg agacaatgga tgatactgcc ccgggcgagg cgtgcccgac acaaaccact 720

attatgcaaa atgagaaaaa aaaaattagt gtgtctgtta actactggaa cacactcact 780

cacacaacac caccctatga ttttttttcc tttttccaac aatcaaaaaa atttctgaca 840

aattataaaa tagcccttaa atccccccct tgtttcattt tttttattct ccttttcttt 900

cttcttttct acatcaatca attgactttt tataactcaa ttaattaaat caaatcactt 960

acaaattaaa ttttaaca 978

<210> 2

<211> 998

<212> DNA

<213> Candida tropicalis

<400> 2

agatctaaga agaatttagt ggttagtcgt tatggaggac aaaatagaga tcaataaatc 60

agtcgaatta ctccagtcgt caggatatct ccaataatcg gagtaattga ccccaattgt 120

ttgtttacta cgtcattcct ggcagtattc gagaaagatt agtccgacag agaagaaaaa 180

caaaattaaa agttcaaagt tgcaggagaa acggagcctt ctccagcagc agcaacagca 240

gcagcagtag cagcaacaga aaaaaaaaat aattgatctt catctaaggg ggaggggtga 300

gtcagagata tagggatgga tgtttaccga tggtgaatat attttattat aactttgaaa 360

aatgtgtcaa ataaagacca attgtatcaa ttgagtcgtt ttaaacaatt atctctacag 420

caattgtaac ctctacagga aacgtttttc tcaatggtcg taatattttg caatcggatg 480

gtatgggtta cagaacgtga catatttttc tttacctgtt ggatcaggtg tttttttttg 540

ttgatctatc caacgtttgg tgtaagctcg tggtgtgctc tgcaaaaatt ttttctctct 600

cttttttttt tagtagcctg cttgcgtgcg tgaatcgggc accttactca tttgaatcaa 660

tcagtaggtg agacaatgga tgatactgcc ccgggcgagg cgtgcccgac acaaaccact 720

attatgcaaa atgagaaaaa aaaaattagt gtgtctgtta actactggaa cacactcact 780

cacacaacac caccctatga ttttttttcc tttttccaac aatcaaaaaa atttctgaca 840

aattataaaa tagcccttaa atccccccct tgtttcattt tttttattct ccttttcttt 900

cttcttttct acatcaatca attgactttt tataactcaa ttaattaaat caaatcactt 960

acaaattaaa ttttaacaat gagctatcgt atgtttga 998

<210> 3

<211> 2370

<212> DNA

<213> Clostridium botulinum

<400> 3

atgataagta aaggatttag tacccaaaca gaaagaataa atattttaaa ggctcaaata 60

ttaaatgcta aaccatgtgt tgaatcagaa agggcaatat taataacaga atcatttaaa 120

caaacagaag gccagccagc aattttaaga agagcattgg cattgaaaca catacttgaa 180

aatatcccta taacaattag agatcaagaa cttatagtgg gaagtttaac taaagaacca 240

aggtcttcac aagtatttcc tgagttttct aataagtggt tacaagatga attggataga 300

ttaaataaga gaactggaga tgcattccaa atttcagaag aaagtaaaga aaaattaaaa 360

gatgtctttg agtattggaa tggaaagaca acaagtgagt tagcaacttc atatatgaca 420

gaggaaacaa gagaggcagt aaattgtgat gtatttactg taggaaatta ctattataat 480

ggcgtaggac atgtatctgt agattatgga aaagtattaa gggttggatt taatgggatt 540

ataaatgagg ctaaggaaca attagaaaaa aacaggagta tagatcctga ttttataaag 600

aaagaaaaat tcctaaatag tgttattatc tcatgcgaag ctgcaataac atatgtaaat 660

agatatgcta aaaaggctaa agagattgca gataatacaa gtgatgcaaa aagaaaagct 720

gaattaaatg aaatagcaaa aatttgttca aaagtttcag gagagggagc taaatctttc 780

tatgaagcat gtcaattatt ttggtttatt catgcaataa taaatataga atctaatgga 840

cattctattt ctccagctag atttgatcaa tacatgtatc catattatga aaatgataaa 900

aatataacag ataagtttgc tcaagaatta atagattgta tctggattaa attaaatgat 960

attaataaag taagagatga gatttcaact aaacattttg gtggttaccc aatgtatcaa 1020

aacttaattg ttgggggtca aaattcagaa ggaaaagatg caactaataa agtatcatat 1080

atggcattag aagcagctgt ccatgtaaag ttgcctcagc catctttgtc agtaagaata 1140

tggaataaga ctccagatga atttttgctt agagcagcag aattaactag agaagggtta 1200

ggacttcctg cttattataa tgatgaagtt attattccag cattagtttc tagaggtctt 1260

acattagaag atgcaagaga ctacggaata attggatgtg ttgaaccaca aaagccagga 1320

aaaacagaag gatggcatga ttcagcattc tttaatcttg caagaatagt agagttaact 1380

ataaattctg gatttgataa aaataaacag attggaccta aaactcaaaa ttttgaagaa 1440

atgaaatcct ttgatgaatt catgaaagct tataaagccc aaatggagta ttttgtaaaa 1500

catatgtgct gtgctgataa ttgcatagat attgcacatg cagaaagagc tccattacct 1560

ttcttgtcat caatggttga taattgtatc ggaaaaggaa agagccttca agatggtggt 1620

gcagaatata acttcagtgg accacaaggt gttggagtag ctaatattgg agattcatta 1680

gttgcagtta aaaaaattgt gtttgatgaa aataagatta ctccttcaga attaaagaaa 1740

acattaaata atgattttaa aaattcagaa gaaatacaag ccttactaaa aaatgctcct 1800

aagtttggaa atgatattga tgaagttgat aatttagcta gagagggtgc cttagtatac 1860

tgtagagaag ttaataaata tacaaatcca aggggaggaa attttcaacc aggattatat 1920

ccatcttcaa ttaatgtata ttttggaagc ttaacaggtg ctactccaga tggaagaaaa 1980

tctggacaac cattagctga tggggtttct ccatcaagag gctgtgatgt atctggacct 2040

actgcagctt gtaattcagt tagtaaatta gatcatttta tagcttcaaa tggaacttta 2100

tttaatcaaa aattccatcc gtcagcatta aaaggtgata atggattaat gaatttatca 2160

tcattaataa gaagttattt tgatcaaaag ggatttcatg ttcaatttaa tgtaatagat 2220

aaaaaaatat tacttgcagc acaaaaaaat cctgaaaaat atcaagattt aattgttaga 2280

gttgcaggat atagtgcaca gttcatttct ttagataaat ctattcaaaa tgatattatt 2340

gcaagaactg aacatgttat gtaaggatcc 2370

<210> 4

<211> 1177

<212> DNA

<213> Klabsiella oxylaca

<400> 4

tttaacaatg agctatcgta tgtttgatta tctggtgcca aacgttaact tttttggccc 60

caacgccatt tccgtagtcg gcgaacgctg ccagctgctg ggggggaaaa aagccctgct 120

ggtcaccgac aaaggcctgc gggcaattaa agatggcgcg gtggacaaaa ccctgcatta 180

tctgcgggag gccgggatcg aggtggcgat ctttgacggc gtcgagccga acccgaaaga 240

caccaacgtg cgcgacggcc tcgccgtgtt tcgccgcgaa cagtgcgaca tcatcgtcac 300

cgtgggcggc ggcagcccgc acgattgcgg caaaggcatc ggcatcgccg ccacccatga 360

gggcgatctg taccagtatg ccggaatcga gaccctgacc aacccgctgc cgcctatcgt 420

cgcggtcaac accaccgccg gcaccgccag cgaggtcacc cgccactgcg tcctgaccaa 480

caccgaaacc aaagtgaagt ttgtgatcgt cagctggcgc aacctgccgt cggtctctat 540

caacgatccg ctgctgatga tcggtaaacc ggccgccctg accgcggcga ccgggatgga 600

tgccctgacc cacgccgtag aggcctatat ctccaaagac gctaacccgg tgacggacgc 660

cgccgccatg caggcgatcc gcctcatcgc ccgcaacctg cgccaggccg tggccctcgg 720

cagcaatctg caggcgcggg aaaacatggc ctatgcttct ctgctggccg ggatggcttt 780

caataacgcc aacctcggct acgtgcacgc catggcgcac cagctgggcg gcctgtacga 840

catgccgcac ggcgtggcca acgctgtcct gctgccgcat gtggcccgct acaacctgat 900

cgccaacccg gagaaattcg ccgatattgc tgaactgatg ggcgaaaata tcaccggact 960

gtccactctc gacgcggcgg aaaaagccat cgccgctatc acgcgtctgt cgatggatat 1020

cggtattccg cagcatctgc gcgatctggg ggtaaaagag gccgacttcc cctacatggc 1080

ggagatggct ctgaaagacg gcaatgcgtt ctcgaacccg cgtaaaggca acgagcagga 1140

gattgccgcg attttccgcc aggcattctg aggatcc 1177

<210> 5

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

agatctgttt gtagccttag acatgactgt tcctcagttc aagttgggca cttacgagaa 60

gaccggtctt gctagattct aatcaagagg atgtcagaat gccatttgcc tgagagatgc 120

aggcttcatt tttgatactt ttttatttgt aacctatata gtataggatt ttttttgtca 180

ttttgtttct tctcgtacga gcttgctcct gatcagccta tctcgcagct gatgaatatc 240

ttgtggtagg ggtttgggaa aatcattcga gtttgatgtt tttcttggta tttcccactc 300

ctcttcagag tacagaagat taagtgagac cttcgtttgt gcggatcc 348

<210> 6

<211> 1370

<212> DNA

<213> escherichia coli

<400> 6

agatcttgag ggagccacgg ttgatgagag ctttgttgta ggtggaccag ttggtgattt 60

tgaacttttg ctttgccacg gaacggtctg cgttgtcggg aagatgcgtg atctgatcct 120

tcaactcagc aaaagttcga tttattcaac aaagccgccg tcccgtcaag tcagcgtaat 180

gctctgccag tgttacaacc aattaaccaa ttctgattag aaaaactcat cgagcatcaa 240

atgaaactgc aatttattca tatcaggatt atcaatacca tatttttgaa aaagccgttt 300

ctgtaatgaa ggagaaaact caccgaggca gttccatagg atggcaagat cctggtatcg 360

gtctgcgatt ccgactcgtc caacatcaat acaacctatt aatttcccct cgtcaaaaat 420

aaggttatca agtgagaaat caccatgagt gacgactgaa tccggtgaga atggcaaaag 480

cttatgcatt tctttccaga cttgttcaac aggccagcca ttacgctcgt catcaaaatc 540

actcgcatca accaaaccgt tattcattcg tgattgcgcc tgagcgagac gaaatacgcg 600

atcgctgtta aaaggacaat tacaaacagg aatcgaatgc aaccggcgca ggaacactgc 660

cagcgcatca acaatatttt cacctgaatc aggatattct tctaatacct ggaatgctgt 720

tttcccgggg atcgcagtgg tgagtaacca tgcatcatca ggagtacgga taaaatgctt 780

gatggtcgga agaggcataa attccgtcag ccagtttagt ctgaccatct catctgtaac 840

atcattggca acgctacctt tgccatgttt cagaaacaac tctggcgcat cgggcttccc 900

atacaatcga tagattgtcg cacctgattg cccgacatta tcgcgagccc atttataccc 960

atataaatca gcatccatgt tggaatttaa tcgcggcctc gagcaagacg tttcccgttg 1020

aatatggctc ataacacccc ttgtattact gtttatgtaa gcagacagtt ttattgttca 1080

tgatgatata tttttatctt gtgcaatgta acatcagaga ttttgagaca caacgtggct 1140

ttcccccccc cccctgcagg tcggcatcac cggcgccaca ggtgcggttg ctggcgccta 1200

tatcgccgac atcaccgatg gggaagatcg ggctcgccac ttcgggctca tgagcgcttg 1260

tttcggcgtg ggtatggtgg caggccccgt ggccggggga ctgttgggcg ccatctcctt 1320

gcatgcacca ttccttgcgg cggcggtgct caacggcctc aaccggatcc 1370

Claims

1.一种转化油脂联产长链二元酸和1,3-丙二醇热带假丝酵母工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（i）制备热带假丝酵母感受态细胞；

（ii）将步骤（i）制得的热带假丝酵母感受态细胞与线性化重组质粒Ptopo-GD-PDE-Kanr混合，冰浴5min后，在1500v电压转化5ms，然后与预冷的1mol/L山梨酸溶液混匀，30℃摇床1h后，筛选，制得转化油脂联产长链二元酸和1,3-丙二醇热带假丝酵母工程菌；

所述重组质粒Ptopo-GD-PDE-Kanr通过从丁酸梭菌中经PCR扩增获得甘油脱水酶基因，然后与从热带假丝酵母中经PCR扩增获得的启动子pGAPg重叠连接，获得pGAPg-GD片段；通过经PCR扩增获得的1,3-丙二醇脱氢酶基因与从热带假丝酵母中经PCR扩增获得的启动子pGAPp重叠连接，获得pGAPp-PDE片段；通过从质粒上PCR扩增获得的终止子基因，经反向连接，获得双向终止子片段；分别向质粒中插入pGAPg-GD片段、pGAPp-PDE片段、双向终止子片段及Kanr基因片段，获得重组质粒；

所述启动子pGAPg核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，启动子pGAPp核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，所述的甘油脱水酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，1,3-丙二醇脱氢酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述终止子基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述的Kanr基因核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述重组质粒Ptopo-GD-PDE-Kanr步骤如下：

（1）以热带假丝酵母基因组为模板，进行PCR扩增，获得启动子pGAPg片段；

所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：

pGAPg-up:5’-AGATCTAAGAAGAATTTAGTGGTTAGTCG-3’，

pGAPg--down:5’-ATCCTTTACTTATCATTGTTAAAATTTAATTTGTAAGTGATTTG-3’；

（2）以热带假丝酵母基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到启动子pGAPp片段；

所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：

pGAPp-up:5’-AGATCTAAGAAGAATTTAGTGGTTAGTCG-3’；

pGAPp-down:5’-TCAAACATACGATAGCTCATTGTTAAAATTTAATTTGTAAGTGATTTG-3’；

（3）以丁酸梭菌的基因组为模板，进行PCR扩增，得到甘油脱水酶GD片段；

所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：

GD-up:5’-CAAATTAAATTTTAACAATGATAAGTAAAGGATTTAGTACCC-3’，

GD-down:5’-GGATCCTTACATAACATGTTCAGTTCTTGC-3’；

（4）以克雷伯氏菌的基因组为模板，进行PCR扩增，得到1,3-丙二醇脱氢酶PDE片段；

所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：

PDE-up:5’-TTTAACAATGAGCTATCGTATGTTTGATT-3’，

PDE-down:5’-GATTTTCCGCCAGGCATTCTGAGGATCC-3’；

（5）以大肠杆菌的基因组为模板，进行PCR扩增，得到终止子pTTza片段；

所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：

pTTza-up:5’-AGATCTGTTTGTAGCCTTAGACATGACTG-3’；

pTTza-down:5’-GGATCCGCACAAACGAAGG-3’；

（6）以质粒pPIC9K为模板，进行PCR扩增，得到抗性标记Kanr片段；

所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：

pKanr9k-up:5’-AGATCTTGAGGGAGCCACGGTTGAT-3’ ；

pKanr9k-down:5’-GGATCCGGTTGAGGCCGTTGAGCA-3’ ；

（7）将步骤（1）制得的启动子pGAPg片段与步骤（3）制得的甘油脱水酶片段GD进行PCR重叠连接，制得pGAPg-GD片段；

（8）将步骤（2）制得的启动子pGAPp片段与步骤（4）制得的1,3-丙二醇脱氢酶片段PDE进行PCR重叠连接，制得pGAPp-PDE片段；

（9）将步骤（5）制得的终止子pTTza片段进行终止子间的反向连接；

（10）将步骤（6）中得到的抗性标记Kanr片段，步骤（7）中制得的pGAPg-GD片段，步骤（8）中制得的pGAPp-PDE片段，分别与Ptopo-Blunt-Vector载体连接，制得Ptopo-Blunt-Kanr，Ptopo-Blunt-pGAPg-GD，Ptopo-Blunt-pGAPp-PDE质粒；

（11）将步骤（10）制得的Ptopo-Blunt-pGAPg-GD质粒用限制性内切酶BamH I 单酶切，然后将单酶切后的质粒去磷酸化；

（12）将步骤（10）制得的Ptopo-Blunt-pGAPp-PDE质粒进行双酶切，所用酶为限制性内切酶Bgl II和BamH I，并回收双酶切产物pGAPp-PDE；

（13）将步骤（9）制得的pTOPO-Blunt-pTTza-pTTza质粒进行双酶切，所用酶为限制性内切酶Bgl II和BamH I，并回收切下的pTTza-pTTza片段；

（14）将步骤（10）制得的Ptopo-Blunt- Kanr质粒进行双酶切，所用酶为限制性内切酶Bgl II和BamH I，并回收切下的Kanr片段；

（15）将步骤（13）制得的pTTza-pTTza片段连接到步骤（11）制得的去磷酸化后的单酶切载体上，制得Ptopo-Blunt-pGAPg-GD-pTTza载体；

（16）将步骤（15）制得的Ptopo-Blunt-pGAPg-GD-pTTza载体进行单酶切，所用酶为限制性内切酶BamH I，将回收的单酶切产物去磷酸化；

（17）将步骤（12）制得的pGAPp-PDE片段连接到步骤（16）制得的去磷酸化后的单酶切载体上；

（18）将步骤（17）所得的重组载体单酶切，所用酶为限制性内切酶Bgl II ，将回收的单酶切产物去磷酸化；

（19）将步骤（14）所得的Kanr片段连接到步骤（18）中的单酶切载体上获得最终构建的基因重组载体Ptopo-GD-PDE-Kanr。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中， PCR扩增的扩增体系如下，体系总体积50μl：

2×HiFi-PCR Master 25μl，10μmol/L上游引物 2μl，10μmol/L下游引物 2μl，模板2.5μl，用ddH₂O补足至50μl；

所述的PCR扩增的扩增程序如下：

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，PCR扩增的扩增体系如下，体系总体积50μl：

所述的PCR扩增的扩增程序如下：

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，PCR扩增的扩增体系如下，体系总体积50μl：

2×Taq PCR MasterMix 25μl，10μmol/L上游引物 2μl，10μmol/L下游引物 2μl，模板2.5μl，用ddH₂O补足至50μl；

所述的PCR扩增的扩增程序如下：

6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，PCR扩增的扩增体系如下，体系总体积50μl：

所述的PCR扩增的扩增程序如下：

7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中，PCR扩增的扩增体系如下，体系总体积50μl：

2×Taq PCR MasterMi 25μl，10μmol/L上游引物 2μl，10μmol/L下游引物 2μl，模板2.5μl，用ddH₂O补足至50μl；

所述的PCR扩增的扩增程序如下：

8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（6）中，PCR扩增的扩增体系如下，体系总体积50μl：

2×HiFi PCR Master 25μl，10μmol/L上游引物 2μl，10μmol/L下游引物 2μl，模板2.5μl，用ddH₂O补足至50μl；

所述的PCR扩增的扩增程序如下：

9.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（7）中，重叠PCR第一步扩增体系如下，体系总体积25μl：

2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，10μmol/L pGAPg片段回收产物 2μl，10μmol/L GD片段回收产物 2μl，用ddH₂O补足至25μl；

所述的重叠PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min，所得产物继续进行第二步PCR扩增；

所述第二步PCR扩增体系如下，体系总体积25μl：

2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，10μmol/L上游引物pGAPg-up 2μl，10μmol/L下游引物GD-down 2μl，用ddH₂O补足至25μl；然后与第一步扩增后的产物混合；

所述第二步PCR扩增程序如下：

10.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（8）中，重叠PCR第一步扩增体系如下，体系总体积25μl：

2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，10μmol/L pGAPp片段回收产物 2μl，10μmol/L PDE片段回收产物 2μl，用ddH₂O补足至25μl；

所述的重叠PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min，所得产物继续进行第二步PCR扩增；

所述第二步PCR扩增体系如下，体系总体积25μl：

2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，10μmol/L 上游引物pGAPp-up 2μl，10μmol/L 下游引物PDE-down 2μl，用ddH₂O补足至25μl；然后与第一步扩增后的产物混合；

所述第二步PCR扩增程序如下：

11.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（9）中，反向连接步骤如下：

将步骤（5）制得的pTTza片段连接到载体pTOPO-Blunt上，制得pTOPO-Blunt-pTTza;然后用限制性内切酶Bgl II和BamH I对pTOPO-Blunt-pTTza进行双酶切，将切下的短片段pTTza回收；用限制性内切酶BamH I再对pTOPO-Blunt-pTTza进行单酶切，并回收单酶切产物；将单酶切产物去磷酸化，然后与双酶切得到的pTTza短片段用T4连接酶连接，制得双向终止子结构pTOPO-Blunt-pTTza-pTTza。

12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述的去磷酸化的体系如下，总体系为50ul：

待去磷酸化的DNA片段25μl，10×Alkaline Phosphatase Buffer 5μl，CIAP 2μl，用ddH₂O补足至50μl；

所述的去磷酸化的条件如下：

37℃或 50℃反应30分钟；或者先37℃反应15分钟，然后再50℃反应15分钟；添加5μl，3mol/L的醋酸钠，并加入125μl的冰乙醇在-20℃下保存30～60min；然后4℃、12000rpm离心15min回收沉淀，用200μl 70%冰乙醇洗净，4℃、12000rpm离心15min，用20μl以下的H₂O溶解沉淀，即得。

13.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述连接的反应体系如下，体系总体积20μl：

单酶切长片段载体 6μl，双酶切短片段 2μl，T4 DNA Ligase 1μl，10×T4 DNA LigaseBuffer 2μl，ddH₂O补充至20μl；

所述连接的条件为:22℃连接10min。

14.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（10）中，连接体系如下，体系总体积为10μl：

待连接片段 4μl，Ptopo-Blunt-Vector载体 1μl，10×Enhancer 1μl，ddH₂O补充至10μl；

所述连接的条件为： 20℃-30℃连接5min。

15.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（11）、步骤（16）和步骤（18）中，去磷酸化的体系如下，总体系为50ul：

待去磷酸化的DNA片段25μl，10×Alkaline Phosphatase Buffer 5μl，CIAP宝生物碱性磷酸酶 2μl，用ddH₂O补足至50μl；

所述的去磷酸化的条件如下：

37℃或50℃反应30分钟；或者先37℃反应15分钟，然后再50℃反应15分钟；添加5μl，3mol/L的醋酸钠，并加入125μl的冰乙醇在-20℃下保存30～60min；然后4℃、12000rpm离心15min回收沉淀，用200μl 70%冰乙醇洗净，4℃、12000rpm离心15min，用20μl以下的H₂O溶解沉淀，即得。

16.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（15）中，连接的反应体系如下，体系总体积20μl：

Ptopo-Blunt-GAPg-GD载体 6μl，pTTza-pTTza片段 2μl，T4 DNA Ligase 1μl，10×T4DNA Ligase Buffer 2μl，ddH₂O补充至20μl；

所述的连接体系的连接条件为：22℃连接10min。

17.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（17）中，连接的反应体系如下，体系总体积20μl：

Ptopo-Blunt-pGAPg-GD-pTTza载体 6μl，pGAPp-PDE片段 2μl，T4 DNA Ligase 1μl，10×T4 DNA Ligase Buffer 2μl，ddH₂O补充至20μl；

所述的连接体系的连接条件为:22℃连接10min。

18.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（19）中，所述连接的反应体系如下，体系总体积20μl：

Ptopo-Blunt-pGAPg-GD-pTTza-PDE载体 6μl，Kanr片段 2ul，T4 DNA Ligase 1μl，10×T4 DNA Ligase Buffer:2μl，ddH₂O补充至20μl；

所述的连接体系的连接条件为:22℃连接10min。

19.权利要求1所述转化油脂联产长链二元酸和1,3-丙二醇热带假丝酵母工程菌在制备长链二元酸和1,3-丙二醇中的应用。