CN111500479B

CN111500479B - 一种非甲醇诱导双启动子毕赤酵母工程菌的构建及其应用

Info

Publication number: CN111500479B
Application number: CN202010353981.3A
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 夏伟; 吴丹; 胡梦凯
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-04-29
Filing date: 2020-04-29
Publication date: 2022-12-27
Anticipated expiration: 2040-04-29
Also published as: CN111500479A

Abstract

本发明涉及一种非甲醇诱导双启动子毕赤酵母工程菌的构建及其应用，属于基因工程领域。本发明将Streptomyces sp.FA1来源木聚糖酶(XynA)基因的游离型质粒转入到含有整合型表达载体的毕赤酵母中，获得游离型和整合型组合双启动子模式毕赤酵母菌株，使其分泌木聚糖酶，在发酵过程中不需要添加甲醇，生产方法更加安全、无污染。所述工程菌发酵产酶可达3925U/mL，极大提高了木聚糖酶的生产活力，从而适用于工业化木聚糖的生产。

Description

一种非甲醇诱导双启动子毕赤酵母工程菌的构建及其应用

技术领域

本发明涉及一种非甲醇诱导双启动子毕赤酵母工程菌的构建及其应用，属于基因工程领域。

背景技术

毕赤酵母(Pichia pastoris)的表达系统具有外源基因遗传稳定，细胞生长速率快，产物表达效率高，不受内毒素和噬菌体影响，准确的完成糖基化、磷酸化、二硫键形成等翻译后加工修饰，更客观的表达天然蛋白质的结构和功能等优点。绝大多数的木聚糖酶基因是通过毕赤酵母表达系统表达。为了提高毕赤酵母中的异源蛋白表达，常用的手段有更换强启动子，密码子优化，伴侣蛋白的共表达，构建游离质粒增加基因拷贝数等。其中根据毕赤酵母的表达系统载体上启动子的不同，分为诱导型和组成型。目前常用的诱导型启动子醇氧化酶(AOX1)启动子是来自甲醇利用途径，通过甲醇诱导能够极大促进蛋白的表达，但在高密度发酵过程中存在许多问题，如发酵过程复杂，需要细胞达到一定浓度才能进行甲醇诱导；甲醇易挥发、有毒物质、有火灾隐患、不适用于药品和食品级蛋白的生产等。对于组成型表达载体来说，其蛋白的表达量与酵母自身的生长状态有着紧密的联系，而常用的组成型启动子是3-磷酸甘油醛脱氢酶(P_GAP)启动子，已有较多报道利用该启动子进行异源蛋白表达，但表达效率不高。

大多数情况下，外源蛋白的表达量会随着拷贝数的增加而相应增加，过去认为在毕赤酵母中整合到染色体表达比游离载体表达稳定，但研究发现整合区域都是相邻近的位点，稳定性差，在一定条件下可能通过同源重组而丢失。

因而，亟待寻找一种异源表达体系，使得蛋白能够稳定、高效表达。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种稳定的、可以大量分泌木聚糖酶的游离型与整合型组合双启动子表达毕赤酵母重组菌及其构建方法，工业应用前景广阔。

本发明以Streptomyces sp.FA1来源的木聚糖酶作为模型酶，通过构建一种非甲醇诱导整合型与游离型组合双启动子毕赤酵母表达系统，增加重组蛋白的基因拷贝数及启动强度，提升发酵水平。

毕赤酵母中的自主复制序列(PARS)是可进行自主复制的基因组序列。通过在载体中插入酵母自主复制序列(PARS)，可使载体在毕赤酵母基因组外进行多拷贝自我复制，从而构建获得游离型表达载体，增加外源蛋白的基因拷贝数，同时减少对酵母基因组的影响。

本发明提供了一种毕赤酵母工程菌，所述毕赤酵母工程菌中同时含有非甲醇诱导启动子P_GCW14和P_GAP以及表达载体。

在本发明的一种实施方式中，启动子P_GCW14整合在毕赤酵母基因组上，启动子P_GAP连接在游离型表达载体上。

在本发明的一种实施方式中，启动子P_GAP整合在毕赤酵母基因组上，启动子P_GCW14连接在游离型表达载体上。

在本发明的一种实施方式中，所述启动子P_GCW14的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述启动子P_GAP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体是以pGCW14ZαA或pGAPZαA为出发载体。

在本发明的一种实施方中，所述pGCW14ZαA记载于公布号为CN110184291A的专利中。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体上还含有自主复制序列，自主复制序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了一种提高基因表达量或蛋白合成量的方法，利用非甲醇诱导的启动子P_GCW14和P_GAP诱导基因的表达。

在本发明的一种实施方式中，将启动子P_GAP与编码蛋白的基因整合至宿主细胞，获得整合型宿主细胞；将编码蛋白的基因插入至含启动子P_GCW14的表达载体，获得重组表达载体；将重组表达载体转化至整合型宿主细胞，获得重组细胞，再将重组细胞培养。

在本发明的一种实施方式中，将启动子P_GCW14与基因编码蛋白的基因整合至宿主细胞，获得整合型宿主细胞；将编码蛋白的基因的核苷酸序列插入至含启动子P_GAP的表达载体；将表达载体转化至整合型宿主细胞，获得重组细胞，再将重组细胞培养。

在本发明的一种实施方式中，所述蛋白为来源于Streptomyces sp.FA1的木聚糖酶，编码所述木聚糖酶核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为毕赤酵母。

在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母为KM71。

在本发明的一种实施方式中，所述反应体系为BSM培养基。

在本发明的一种实施方式中，所述BSM培养基组分为：85％磷酸20～30mL/L，CaSO₄0.5～1.0g/L，K₂SO₄15～20g/L，MgSO₄·7H₂O 13～18g/L，KOH 4～5g/L，甘油35～40g/L，PTM1 4～5mL/L。

本发明提供了一种双启动子的毕赤酵母表达系统的构建方法，具体步骤为：

(1)将pGAPZαA载体中的抗性基因替换成G418抗性基因，构建得到表达载体pGAPZαA-Kan；

(2)在表达载体pGAPZαA-Kan中插入启动子P_GCW14序列片段，构建得到表达载体pGCW14ZαA-GAP-Kan；

(3)将木聚糖酶基因XynA酶切、连接至表达载体pGCW14ZαA-GAP-Kan，将连接后得到产物转化至E.coli JM109中，涂布于含G418抗性的LB平板，在30～40℃下培养6～14h，至平板上长出单菌落，挑取平板上的单菌落进行验证，得到pGCW14ZαA-GAP-Kan-XynA的阳性转化子；

(4)得到的阳性转化子pGCW14ZαA-GAP-Kan-XynA摇菌后提取质粒，并将质粒进行酶切线性化，将线性化后的pGCW14ZαA-GAP-Kan-XynA转入毕赤酵母KM71中，得到含有双启动子的KM71/pGCW14ZαA-GAP-Kan-XynA的重组菌；

(5)将菌株KM71/pGAPZαA-Kan-XynA制作成感受态细胞KM71/pGAPZαA-Kan-XynA，将重组质粒pGCW14ZαA-PARS2-XynA转化至感受态细胞KM71/pGAPZαA-Kan-XynA，涂布于含有G418抗性的YPD平板上于25～35℃下培养40～72h，得到含双启动子的KM71/pGCW14ZαA-PARS2-XynA-pGAPZαA-Kan-XynA的重组单菌落。

在本发明的一种实施方式中，所述木聚糖酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

在本发明的一种实施方式中，所述G418抗性基因核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

在本发明的一种实施方式中，质粒pGCW14ZαA-PARS2-XynA记载于公布号为CN110184291A的专利中。

本发明提供了一种提高木聚糖酶产量的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)以毕赤酵母重组菌KM71/pGCW14ZαA-PARS2-XynA-pGAPZαA-Kan-XynA为生产菌株，活化后，25～35℃、150～250rpm条件下培养18～30h，得一级种子发酵液；

(2)以2.5％接种量接种一级种子发酵液至种子培养基中，25～35℃、150～250rpm条件下培养18～30h，得二级种子发酵液；

(3)以10％的接种量将二级种子发酵液接种至发酵培养基中25～35℃、150～250rpm条件下进行发酵18～30h。

在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基为YPD培养基；所述发酵培养基为BSM培养基。

在本发明的一种实施方式中，用氨水控制pH在4.0～6.0。

本发明保护所述双启动子表达载体在饲料、食品、纺织或化工领域制备木聚糖酶中的应用。

本发明保护所述含有所述双启动子表达载体的宿主细胞在饲料、食品、纺织或化工领域制备木聚糖酶中的应用。

本发明保护所述提高基因表达量或蛋白合成量的方法在饲料、食品、纺织或化工领域制备木聚糖酶中的应用。

本发明保护所述木聚糖酶产量的方法在饲料、食品、纺织或化工领域制备木聚糖酶中的应用。

本发明的有益效果：本发明将Streptomycessp.FA1来源木聚糖酶(XynA)基因的游离型质粒转入到含有整合型表达载体的毕赤酵母中，获得游离型和整合型组合双启动子模式毕赤酵母菌株，使其分泌木聚糖酶，在发酵过程中不需要添加甲醇，生产方法更加安全、无污染。同整合型KM71/pGAPZαA-XynA表达菌株相比，高密度发酵后，采用游离型和整合型组合双启动子模式的重组菌表达木聚糖酶产量是整合型KM71/pGAPZαA-XynA表达菌株的16.7倍，同时发酵上清的蛋白含量是整合型KM71/pGAPZαA-XynA表达菌株的4.85倍，从而显著降低了工业化生产木聚糖酶的生产成本。

附图说明

图1是重组质粒pGAPZαA-Kan-XynA的构建过程。

图2是重组质粒pGCW14ZαA-GAP-Kan的构建过程。

图3是KM71/pGAPZαA-PARS-XynA-pGCW14ZαA-GAP-Kan-XynA重组菌3.6L发酵罐发酵上清实时SDS-PAGE图。

图4是菌株KM71/pGAPZαA-PARS-XynA-pGCW14ZαA-GAP-Kan-XynA和KM71/pGCW14ZαA-PARS2-XynA-pGAPZαA-Kan-XynA示意图。

具体实施方式

酶活的测定方法：采用DNA法：将0.5g的木聚糖溶于100mL，50mmol/L，pH 5.5的磷酸缓冲液充分混匀，取1mL底物，在55℃预热10min，加入1mL的酶液，反应10min后加入3mLDNS，煮沸10min迅速冷却，加蒸馏水定容至20ml，540nm下测吸光度(以灭活的酶液为催化剂同样操作作为空白对照)。

在上述条件下，将每分钟水解木聚糖生成1μmol的木糖所需酶量定义为木聚糖酶的一个单位的酶活力(U)。

重组质粒pGCW14ZαA-PARS2-XynA的构建方法即为公布号为CN110184291A的专利中的。

游离型质粒pGAPZαA-PARS-XynA的构建记载于潘阳,吴丹,吴敬.利用游离型表达质粒强化毕赤酵母表达木聚糖酶[J].生物工程学报,2018,v.34；No.233(05):88-97

BSM培养基：85％磷酸26.7mL/L，CaSO₄0.93g/L，K₂SO₄18.2g/L，MgSO₄·7H₂O 14.9g/L，KOH4.13g/L，甘油40.0g/L，PTM1 4.35mL/L，上述成分均溶于水中形成所述BSM培养基。

YPD培养基：蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，葡萄糖20g/L。

DTT缓冲液：用20mL 0.01mol/L乙酸钠溶液(pH5.2)溶解3.09g DTT。

回收试剂盒购自天根生化科技有限公司。

实施例1：整合型毕赤酵母重组菌的构建

(1)整合型载体pGAPZαA-Kan的构建

根据商业载体pPIC9k中G418遗传抗性基因序列，设计序列如SEQIDNO.3所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.4所示的反向引物。以商业载体pPIC9k为模板，通过PCR反应扩增获得遗传抗性基因G418序列片段。

将回收得到遗传抗性基因G418片段，设计序列SEQ ID NO.5所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.6所示的反向引物，通过Takara的In-Fusion HD cloning kit试剂盒，将基因G418片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)和SEQ ID NO.5所示的正向引物、序列如SEQID NO.6所示的反向引物和商业载体pGAPZαA载体质粒加入反应试剂中，将pGAPZαA载体中的Zeocin抗性基因替换成G418抗性基因，构建得到G418抗性的表达载体pGAPZαA-Kan。

(2)整合型载体pGCW14ZαA-GAP-Kan的构建

设计序列如SEQ ID NO.9所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.10所示的反向引物。通过PCR反应以酵母基因组DNA为模板获得启动子P_GCW14序列片段(核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示)。通过上述载体pGAPZαA-Kan，设计序列如SEQ ID NO.11所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.12所示的反向引物。通过Takara的In-Fusion HD cloning kit试剂盒将序列如SEQ ID NO.11所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.12所示的反向引物、启动子P_GCW14序列片段和pGAPZαA-Kan载体质粒加入反应试剂中，pGAPZαA-Kan载体中插入启动子P_GCW14，构建得到表达载体pGCW14ZαA-GAP-Kan。

(3)重组菌的构建

以质粒pMD18-T-XynA(质粒记载于文献：A xylanase fromStreptomycessp.FA1:heterologousexpression,characterization,anditsapplicationinChinesesteamedbread，YangXu，Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology，May2016，Volume43，Issue5，pp663–670)为模板，设计序列如SEQIDNO.13所示的正向引物和序列如SEQIDNO.14所示的反向引物。通过聚合酶链式反应获得具有NotI和EcoRI酶切位点的XynA片段。

PCR反应体系(50μL)：

PCR程序：94℃，4min(预变性)；98℃，10s(变性)；60℃，5s(退火)；72℃，90s(延伸)；设置30个循环；72℃，10min(保温)后设置保藏温度为4℃。

将PCR产物进行胶回收、酶切回收目的基因后将其与表达载体pGAPZαA-Kan和pGCW14ZαA-GAP-Kan进行双酶切，并于16℃酶连过夜，转化E.coli JM109，涂布含G418抗性的LB平板，37℃培养8-10h，挑取转化子，提取重组质粒并双酶切验证，然后对验证正确的重组质粒测定DNA序列，得到阳性克隆子即pGAPZαA-Kan-XynA和pGCW14ZαA-GAP-Kan-XynA。

重组质粒pGAPZαA-Kan-XynA和pGCW14ZαA-GAP-Kan-XynA的转化：

重组质粒经AvrII内切酶线性化，酶切体系如下：

混匀上述溶液，37℃酶切2h，采用琼脂糖凝胶电泳验证酶切得到产物，并将产物进行回收。

毕赤酵母KM71感受态制备与转化步骤如下：

①从毕赤酵母KM71甘油管中吸取30μL菌液接种于10mL液体YPD培养基，在30℃摇床中200rpm培养24h，然后从中吸取100μL接种于100mL液体YPD培养基30℃恒温振荡培养16h；

②在无菌环境中，将菌液分装至三管事先预冷的50mL离心管中，4℃条件下5000rpm离心5min后弃上清收集菌体；

③在无菌环境中，用4mL ddH₂O重悬菌体，之后将其合并为一管，并相继加入2mL的TE缓冲液、2mL的LiAc缓冲液和0.5mL的DTT缓冲液，轻轻吹吸混匀，将离心管置于30℃水浴摇床中50rpm培养45～50min，以上试剂都要预冷处理；

④在无菌环境中，向离心管加入事先预冷的13.5mL ddH₂O，4℃条件下5000rpm离心5min后弃上清收集菌体；

⑤在无菌环境中，用25mL ddH₂O重悬菌体，4℃条件下5000rpm离心5min后弃上清收集菌体，之后换用25mL，1M山梨醇重复完成重悬、收集菌体操作两次；

⑥向离心管中加入1mL预冷的山梨醇(1M，182.17g山梨醇溶于1L水中)并轻轻重悬菌体，按照每管80μL分装至1.5mL的EP管中并暂时存放在-80℃低温冰箱中。

质粒转化步骤如下：

①从乙醇中取出电转杯，置于超净台中吹干，并置于冰中预冷备用；

②在冰上进行以下操作：将线性化后的pGAPZαA-Kan-XynA和pGCW14ZαA-GAP-Kan-XynA预冷，吸取5μL快速与80μL酵母感受态混匀，转移到0.2cm经过紫外照射的的电转杯，冰浴5min，电击条件为：电压1500V，时间控制4-10ms；

③迅速向电击杯中加入1mL 1mol/L预冷的山梨醇，轻轻吹打均匀，然后将其转移至冰冷的1.5mL无菌EP管中，30℃、50rpm培养1-2h；

④离心菌体，重新悬浮均匀后吸取200μL-300μL涂布上含有不同浓度G418抗性(1.0-2.0mg·mL^-1).的YPD平板上，于30℃恒温条件下培养，至长出单菌落，即获得含有非甲醇诱导启动子的整合型毕赤酵母菌株KM71/pGAPZαA-Kan-XynA和KM71/pGCW14ZαA-GAP-Kan-XynA的单菌落。

⑤使用无菌牙签挑取YPD平板上的单菌落，接种到YPD培养基中。

⑥对上述含有非甲醇诱导启动子的整合型毕赤酵母菌株KM71/pGAPZαA-Kan-XynA和KM71/pGCW14ZαA-GAP-Kan-XynA进行摇瓶发酵，具体方法为：从平板上挑取阳性转化子单酵母菌落转接于装有10mL YPD培养基的50mL三角瓶中培养24h后转入装有50mL YPD培养基的500mL三角瓶在30℃、180rpm下培养表达3-4天，培养物经离心后得到含木聚糖酶的上清，利用DNS法对其进行酶活检测，选取酶活最高的转化子，即获得整合型毕赤酵母重组菌株。

实施例2：非甲醇诱导整合型和游离型双启动子毕赤酵母菌株的构建及摇瓶发酵

将实施例1中的整合型菌株KM71/pGAPZαA-Kan-XynA制作成感受态。

感受态KM71/pGAPZαA-Kan-XynA的制备步骤：

(1)在10mLYPD液体培养基中接种30μL KM71/pGAPZαA-Kan-XynA菌体，然后将摇瓶置于30℃恒温摇床培养24h，吸取100μL培养后的菌体到100mL大YPD培养基中，继续培养直至最终OD₆₀₀在1.3-1.5之间(培养时间16h左右)；

(2)将上述培养后OD₆₀₀在1.3-1.5之间的菌体转移到50mL提前预冷的离心管中，并于4℃、5000rpm离心5min，弃掉无用上清，收集菌体备用；

(3)向以上菌体中加入4mL预冷灭菌的无菌水，用灭菌的5mL枪头吹吸混匀，然后将提前除菌的2mL 10×LiAc缓冲液、2mL 10×TE缓冲液和0.5mL 1mol/L DTT缓冲液倒入管中，充分摇匀，在30℃水浴摇床中培养45min，转速为50rpm；

(4)培养后的菌体中加入预冷的无菌水直至终体积为30mL，用枪头吹吸重悬菌体，然后4℃、5000rpm离心5min，弃上清，收集菌体；

(5)使用25mL预冷的无菌水重悬细胞，然后4℃和5000rpm的条件下，离心5min，弃掉无用上清液，收集菌体；

(6)再通过20mL预冷的1M的山梨醇洗涤两次。每次重悬均剧烈吹打，使细胞分散；

(7)向离心管中加入1mL预冷的山梨醇重悬菌体，分装至1.5mL的EP管中，每管分装80μL，现做现用。

将重组质粒pGCW14ZαA-PARS2-XynA转化至感受态细胞KM71/pGAPZαA-Kan-XynA：

(1)从纯乙醇中取出电转杯，置于超净台中吹干，并置于冰中预冷备用；

(2)在冰上进行以下操作：将线性化后回收的pGAPZαA-XynA预冷，吸取5μL快速与80μL KM71/pGAPZαA-Kan-XynA酵母感受态中混匀，转移到0.2cm经过紫外照射的的电转杯，冰浴5min，电击条件为：电压1500V，时间控制4-10ms；

(3)迅速向电击杯中加入1mL 1mol/L预冷的山梨醇，轻轻吹打均匀，然后将其转移至冰冷的1.5mL无菌EP管中，30℃、50rpm培养1-2h；

(4)离心菌体，重新悬浮均匀后吸取200μL-300μL涂布上含有G418抗性的YPD平板上，于30℃下培养48h，即得到含有游离型非甲醇诱导启动子P_GCW14和整合型非甲醇诱导启动子P_GAP的双启动子毕赤酵母菌株KM71/pGCW14ZαA-PARS2-XynA-pGAPZαA-Kan-XynA的单菌落。

使用无菌牙签从平板上挑取阳性转化子单酵母菌落转接于装有10mLYPD培养基的50mL三角瓶中培养24h后转入装有50mL YPD培养基的500mL三角瓶培养表达3～4天，培养物经离心后得到含重木聚糖酶的上清，并进行酶活的测定。

同理，将实施例1中的整合型菌株KM71/pGCW14ZαA-GAP-Kan-XynA制作成感受态。将游离型质粒pGAPZαA-PARS-XynA转化至KM71/pGCW14ZαA-GAP-Kan-XynA感受态中，获得含有游离型非甲醇诱导启动子P_GAP和整合型非甲醇诱导启动子P_GCW14的双启动子毕赤酵母菌株KM71/pGAPZαA-PARS-XynA-pGCW14ZαA-GAP-Kan-XynA。

实施例3：非甲醇诱导双启动子毕赤酵母菌株

KM71/pGCW14ZαA-PARS2-XynA-pGAPZαA-Kan-XynA在3.6L发酵罐的发酵

重组毕赤酵母工程菌在3.6L发酵罐生产木聚糖酶的方法，过程分为三阶段进行：

第一阶段：接种实施例2中的毕赤酵母菌株

KM71/pGCW14ZαA-PARS2-XynA-pGAPZαA-Kan-XynA单菌落至装有10mL YPD培养基的50mL三角瓶中，200rpm，30℃振荡培养24h，作为一级种子发酵液；

第二阶段：取上述一级种子发酵液2.5mL接种于装有100mLBSM发酵培养基的500mL三角瓶中，200rpm，30℃振荡培养24h，至菌浓为OD₆₀₀至少为10，作为二级种子发酵液；

第三阶段：将100mL的二级种子发酵液接种到装有900mL BSM培养基中的3.6L发酵罐中，200rpm，30℃的条件下培养，全程用25％氨水进行pH值的调节，pH保持在5.0。

通过转速和通入纯氧两种方式将发酵罐内的DO值(溶解氧含量)控制在30％，温度恒定在30℃，通过100％氨水和20％(w/v)磷酸将发酵罐内的pH控制在5.0左右，接种至发酵罐中培养18h左右待DO值迅速上升时，进行补料。补料配方为80％(v/v)甘油；1.25％(w/v)PTM1；甘油和PTM1溶于水中形成所述补料。不同时间段取样，甘油补料速率为17.3g/L。

双启动子毕赤酵母菌株KM71/pGCW14ZαA-PARS2-XynA-pGAPZαA-Kan-XynA获得的木聚糖酶在发酵102h后达到最大酶活力3925U/mL，蛋白含量13.58g/L。此外，KM71/pGCW14ZαA-PARS2-XynA-pGAPZαA-Kan-XynA重组菌所产酶的蛋白电泳结果显示在50kDa处有一条与理论分子量(含N糖基化修饰)一致的条带(结果如图3所示)。

表1 菌株在3.6L发酵罐实时发酵结果

实施例4：非甲醇诱导双启动子毕赤酵母菌株

KM71/pGAPZαA-PARS-XynA-pGCW14ZαA-GAP-Kan-XynA在3.6L发酵罐的发酵

具体实施方式参见实施例3，区别在于，本实施例使用的发酵菌株为非甲醇诱导双启动子毕赤酵母菌株KM71/pGAPZαA-PARS-XynA-pGCW14ZαA-GAP-Kan-XynA。结果显示：双启动子重组菌株KM71/pGAPZαA-PARS-XynA-pGCW14ZαA-GAP-Kan-XynA，在高密度发酵培养78h后，发酵上清的酶活为1055.7U/mL，蛋白含量为5.44g/L，比活为193.7U/mg，生物量OD₆₀₀为570。

表2 菌株在3.6L发酵罐实时发酵结果

对比例1

具体实施方式参见实施例3，区别在于，将实施例3中的双启动子毕赤酵母菌株KM71/pGCW14ZαA-PARS2-XynA-pGAPZαA-Kan-XynA替换为整合型菌株pGAPZαA-XynA(记载于文献潘阳等《利用游离型表达质粒强化毕赤酵母表达木聚糖酶》，公开日为2018年)，和游离型菌株pGCW14ZαA-PARS2-XynA(记载于专利《一种游离型非甲醇诱导毕赤酵母表达载体的构建及其应用》，公布号为CN110184291A)。

表3 不同启动子重组菌酶活和蛋白含量比较

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种非甲醇诱导双启动子毕赤酵母工程菌的构建及其应用

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 492

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttggtctcca gcttgcaaat tagtgctgat tatgatcata ttaacataac atgtatataa 60

acgtcaagta aattttagtt caaggaccga cactcctacc aaatatatat atgtaatata 120

cccattatac caccaatata gttaaatcaa tctttcctat tagcagatat ctaatttgtt 180

tttttgttct taacctctgg tgagttatta aaagataaaa tataaaaaca tcatttaatt 240

aaatgtcatt aattagttta atatttgttt ctatatatta aagtgtatta gtattcttaa 300

tgaacgtcgg gaagaacaaa agtttaaaga tatctaatat tgatgtttaa cttcatcata 360

agtgcattct ttccatcaat atcagttgct tactaaagaa gtgcaaagag ctcaccaaaa 420

aacgtacgag aaagaacaga tacgcaattc tgatattatc caaagatgtt gcgctggcct 480

tttgctcaca tg 492

<210> 2

<211> 822

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caggtgaacc cacctaacta tttttaactg ggatccagtg agctcgctgg gtgaaagcca 60

accatctttt ggaaaaaaaa attaacttta cggggcgagc acggttcccc gaaaccgcgc 120

agctttaatc tttcggcaga gaaggcgttt tcatcgtagc gtgggaacag aataatcagt 180

tcatgtgcta tacaggcaca tggcagcatg cctagtggca ttgatacctt tttttgggtg 240

ttgtcctgga aaccactgaa cgtatctgcg agatacaaaa gtatttttag ataagtggca 300

aatgcaaaaa atctgattgg tcagttaatg attgatgaac gactttaagg ttaaaaagca 360

aaatagtgac gtcggtttta tttttggtca cccacgcaaa gaagcaccca cctcttttag 420

gttttaagtt gtgggaacag taacaccgcc tagagcttca ggaaaaacca gtacctgtga 480

ccgcaattca ccatgatgca gaatgttaat cgtacggcac caggcgaaaa gctataaaca 540

aacctttttc gcggtatatt tgtttatatt tcctatttta aactcaaaat ctgccctaat 600

ctggactttt catgcaaagt tatgcacctg aggcaggaat gaagcaggct cgacgacgaa 660

aaggctggaa tgggtaacta tggatcgatt gatttgtctg ttgaaatctt gatttggcac 720

tcgtttaagt ataaatacat actctcctcc cccccctggt tctctttttc ttttgttact 780

tacattttac cgttccgtca ctcgcttcac tcaaacaaca aa 822

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acaaggtgag gaactaaacc atgagccata ttcaacggga a 41

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cacgaagtgc acgcagtttt agaaaaactc atcgagca 38

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aactgcgtgc acttcgtg 18

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggtttagttc ctcaccttgt cg 22

<210> 7

<211> 1311

<212> DNA

<213> Streptomyces sp.

<400> 7

atggccgaga acacccttgg cgccgcggcg gcgcagagcg gccgctactt cggcgtcgcc 60

atcgcctcgg gcaagctggg cgactcgacg tacacctcga tcgcgaaccg cgagttcaac 120

tcggtgaccg ccgagaacga gatgaagatc gacgccaccg agcccaaccg gggccagttc 180

aacttcagtt cggccgaccg cgtctacaac tgggccgtgc agaacggcaa gcaggtgcgc 240

ggccacacgc tcgcctggca ctcccagcag cccggctgga tgcagagtct cagcggcagc 300

tcgctgcgcc aggccatgat cgaccacatc aacggcgtga tggcccacta caagggcaag 360

atcgcccagt gggacgtcgt gaacgaggcg ttcgccgaag gcagttcggg cgcccgccgc 420

gactccaacc tccagcgcac cggcaacgac tggatcgagg tcgccttccg caccgcgcgc 480

gccgccgacc cgtcggccaa gctctgctac aacgactaca acgtcgagaa ctggacctgg 540

gcgaagaccc aggccatgta caacatggtc aaggacttca agtcgcgcgg cgtgccgatt 600

gactgcgtcg gcttccagtc gcacttcaac agcggcagcc cctacaacag caacttccgc 660

accaccctgc agaacttcgc ggccctcggc gtcgacgtcg ccgtcaccga actcgacatc 720

cagggcgcct cgtcctcgac gtacgccgcc gtggtcaacg actgcctggc cgtctcccgc 780

tgcctcggcg tcaccgtctg gggcgtccgc gacagcgact cctggcgcgc cagtgacacg 840

ccgctgctgt tcaacaacga cggcagcaag aaggccgcgt actccgccgt cctgaacgcg 900

ctcaacggcg gcacgaccac gcccccgccg accggtgacg gcggccagat caagggcgtc 960

gcctcgggcc gctgcctgga cgtccccaac gcctccacca ccgacggcac ccagatccag 1020

ctgtacgact gccactccaa cagcaaccag cagtgggccg tgaccgactc cggtgagatc 1080

cgggtctacg gcgacaagtg cctggacgcc gccggcaccg gcaacggcgc cccggtccag 1140

atctacagct gctggggcgg cgacaaccag aagtggcgcc tgaactccga cggttcgatc 1200

gtcggcgtcc agtccggccg ctgcctggac gcggccggca ccggcaacgg cgccaggatc 1260

cagctctact cctgctcggg cggctccaac caacgctgga cccgcacctg a 1311

<210> 8

<211> 816

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgagccata ttcaacggga aacgtcttgc tcgaggccgc gattaaattc caacatggat 60

gctgatttat atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc 120

tatcgattgt atgggaagcc cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc 180

gttgccaatg atgttacaga tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct 240

cttccgacca tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg 300

atccccggga aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt 360

gttgatgcgc tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct 420

tttaacagcg atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg 480

gttgatgcga gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa 540

gaaatgcata agcttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca 600

cttgataacc ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc 660

ggaatcgcag accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct 720

ccttcattac agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa 780

ttgcagtttc atttgatgct cgatgagttt ttctaa 816

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caatctcgaa tttgttgttt gagtgaaccc acctaactat 40

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tctcatcgta tgagatccag gtgatgagtg aagcg 35

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ttcgatgcat gaccatttcc 20

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atagttgaaa cgatgagatt tctaggga 28

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ccggaattca tggccgagaa caccctt 27

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

atttgcggcc gctcaggtgc gggtccagcg tt 32

Claims

1.一种毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述毕赤酵母工程菌的宿主细胞为含有整合型表达载体pGAPZαA-Kan-目的基因的毕赤酵母KM71；所述毕赤酵母工程菌中还含有游离表达载体，所述游离表达载体为：pGCW14ZαA-PARS2-目的基因；

所述pGAPZαA-Kan-目的基因是将目的基因连接至pGAPZαA-Kan重组载体上得到的，所述pGAPZαA-Kan重组载体是将pGAPZαA载体中的Zeocin抗性基因替换成G418抗性基因得到的；

所述pGCW14ZαA-PARS2-目的基因是将目的基因连接至pGCW14ZαA-PARS2重组载体上得到的；所述pGCW14ZαA-PARS2是将pGAPZαA载体中的PGAP启动子替换成启动子PGCW14，再将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示PARS2复制子连接至载体中制备得到。

2.如权利要求1所述的毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述目的基因为编码木聚糖酶的基因。

3.一种提高目的基因表达量或目的蛋白合成量的方法，其特征在于，所述方法为采用权利要求1所述的毕赤酵母工程菌表达目的基因，或采用权利要求1所述的毕赤酵母工程菌合成目的蛋白。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述目的蛋白为木聚糖酶，编码所述木聚糖酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

5.权利要求1或2所述工程菌或权利要求3或4所述方法在饲料、食品、纺织或化工领域制备木聚糖酶中的应用。