CN113249234A

CN113249234A - 一种过表达cat和god的产葡萄糖酸钠的黑曲霉基因工程菌的构建方法

Info

Publication number: CN113249234A
Application number: CN202011412041.3A
Authority: CN
Inventors: 张雷达; 任倩; 何庆; 赵伟; 刘新茹; 杨倩
Original assignee: Shandong Fuyang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shandong Fuyang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-12-03
Filing date: 2020-12-03
Publication date: 2021-08-13

Abstract

本发明公开了一种过表达CAT和GOD的产葡萄糖酸钠的黑曲霉基因工程菌的构建方法，属于生物工程技术领域。本发明首先构建包含cox启动子和TtrpC终止子的重组质粒，然后将CAT和GOD基因通过不同的linker连接后，导入黑曲霉宿主菌株同时过表达CAT与GOD，实现工程菌CAT与GOD的胞外大量分泌，最终工程菌摇瓶水平葡萄糖酸钠产量最高可达20.5g/100mL发酵液，15L发酵罐中工程菌株发酵18h左右，葡萄糖酸钠产量可达34.7g/100mL发酵液。与野生型菌株FG‑2相比，工程菌发酵时间缩短了10％，为进一步提高工业化生产葡萄糖酸钠的产量奠定了基础。

Description

一种过表达CAT和GOD的产葡萄糖酸钠的黑曲霉基因工程菌的构建方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，更具体的说是涉及一种过表达CAT和GOD的产葡萄糖酸钠的黑曲霉基因工程菌的构建方法。

背景技术

近年来我国有机酸发酵产业发展迅速，已成为世界第一生产大国。柠檬酸、乳酸、葡萄糖酸产量位居世界前列，其中葡萄糖酸年产量60万吨以上，已超过乳酸成为第二大有机酸产品。葡萄糖酸钠的工业生产方法主要有两种：酶法和微生物发酵法。酶法生产葡萄糖酸钠具有得率高、反应快、产品纯度高等优势，但是酶价格高导致生产成本高且容易使企业受制于人。Blom等人1952年首次建立了利用微生物深层发酵生产葡萄糖酸的方法，通过控制pH和优化发酵温度，葡萄糖的消耗速率达到15g/L.h，成为现代工业发酵生产葡萄糖酸钠的里程碑。

葡萄糖氧化酶GOD可催化微生物体内葡萄糖向葡萄糖酸的转化。由于葡萄糖在GOD的作用下氧化为葡萄糖酸，过程中产生过氧化氢，过氧化氢有很强的氧化性，对GOD有一定的毒害作用，因此过氧化氢酶CAT就起到很重要的作用，它可以迅速分解过氧化氢，产物为水和氧气，使得GOD继续发挥作用，并可以补充部分氧气，使得氧化反应得以继续进行。

广东益多生物公司通过改造黑曲霉葡萄糖氧化酶并实现其在毕赤酵母中的表达，获得了一株高效稳定表达葡萄糖氧化酶的毕赤酵母工程菌株，其产酶水平可达714.9U/mL。罗时渝分别以黑曲霉SH2和HL1为宿主，将葡萄糖氧化酶基因通过密码子优化和信号肽替换，成功的构建了两种葡萄糖氧化酶重组菌株，摇瓶水平葡萄糖氧化酶产量分别可达到563.4U/mL和658.3U/mL的。以上研究虽然成功实现了葡萄糖氧化酶在各种表达宿主中的异源表达，但是表达量偏低、工业化生产成本高等问题没有得到妥善地解决。另外，GOD通常与CAT组成一个氧化还原酶系，因此在有机酸发酵生产中，研究构建能够同时过表达GOD和CAT的重组微生物更为迫切。此外，黑曲霉CAT主要存在于细胞内，可能是导致耗糖速率不能进一步提高的主要因素。

因此，提供一种过表达CAT和GOD的产葡萄糖酸钠的黑曲霉基因工程菌的构建方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种过表达CAT和GOD的产葡萄糖酸钠的黑曲霉基因工程菌的构建方法，对产葡萄糖酸钠的黑曲霉菌株进行改造，同时过表达含信号肽的CAT与GOD，实现工程菌GOD与CAT胞外的大量分泌，进一步缩短葡萄糖酸钠的发酵周期，对于工业化生产葡萄糖酸钠将产生积极的推动作用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种过表达CAT和GOD的产葡萄糖酸钠的黑曲霉基因工程菌，以黑曲霉FG-2为出发菌株，过表达CAT+linker+GOD获得的FG-cat-linker-god；所述linker为s3-1序列或a3-1序列；

所述s3-1序列如下：

s3-1：5’-GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGAGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATC-3’；SEQ ID NO.19；

所述a3-1序列如下：

a3-1：5’-GAAGCTGCGGCAAAAGAAGCAGCGGCTAAAGAAGCGGCGGCAAAA-3’；SEQ IDNO.20。

进一步，一种过表达CAT和GOD的产葡萄糖酸钠的黑曲霉基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：

(1)构建重组载体pAN7-1-cox-TtrpC(以质粒pAN7-1为原始载体，构建含cox启动子以及TtrpC终止子的重组载体pAN7-1-cox-TtrpC)

①以黑曲霉FG-2基因组为模板，PCR扩增黑曲霉cox启动子序列；所述cox启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

②以质粒pAN7-1为模板，PCR扩增TtrpC终止子序列；所述TtrpC终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

③将步骤①和步骤②获得的基因片段进行重叠PCR，得到cox+TtrpC基因片段；

④将步骤③获得的cox+TtrpC基因片段与pAN7-1载体骨架进行一步克隆连接，获得重组载体pAN7-1-cox-TtrpC；

(2)以黑曲霉FG-2为出发菌株，过表达CAT+linker+GOD

①重叠PCR扩增CAT+linker+GOD基因序列，将其与pAN7-1-cox-TtrpC载体骨架进行一步克隆连接，构建重组质粒pAN7-1-cox-CAT-linker-GOD-TtrpC；

②将重组质粒pAN7-1-cox-CAT-linker-GOD-TtrpC转化至黑曲霉FG-2菌株中，经转化子筛选和潮霉素抗性基因PCR验证获得过表达CAT+linker+GOD基因的工程菌株FG-cat-linker-god。

进一步，步骤(2)所述转化为CaCl₂-PEG介导的原生质体转化。

进一步，所述的过表达CAT和GOD的产葡萄糖酸钠的黑曲霉基因工程菌在高产葡萄糖酸钠中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种过表达CAT和GOD的产葡萄糖酸钠的黑曲霉基因工程菌的构建方法，以黑曲霉FG-2为出发菌株，同时过表达CAT与GOD，工程菌摇瓶水平葡萄糖酸钠产量最高可达20.5g/100mL发酵液，15L发酵罐中工程菌株发酵18h左右，葡萄糖酸钠产量可达34.7g/100mL发酵液。与野生型菌株FG相比，本发明工程菌发酵时间缩短了10％，为进一步提高工业化生产葡萄糖酸钠的产量奠定了基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明重组质粒pAN7-1-cox-TtrpC中cox启动子PCR验证结果；

其中，M为DNA Marker；泳道1-3对应挑选的1-3号阳性子PCR结果；

图2附图为本发明重组质粒pAN7-1-cox-TtrpC中启动子cox+终止子TtrpC的长片段的PCR验证结果；

其中，M为DNA Marker；泳道1-3对应挑选的1-3号阳性子PCR结果；

图3附图为重组质粒pAN7-1-cox-GOD-TtrpC中GOD片段PCR验证结果；

其中，M为DNA Marker；泳道1-6对应挑选的1-6号阳性子PCR结果；

图4附图为重组质粒pAN7-1-cox-CAT-TtrpC中CAT片段PCR验证结果；

其中，M为DNA Marker；泳道1-6对应挑选的1-6号阳性子PCR结果；

图5附图为重组质粒pAN7-1-cox-CAT-linker-GOD-TtrpC中CAT片段PCR验证结果；

其中，M为DNA Marker；泳道1-4对应挑选的1-4号阳性子PCR结果；泳道5为以水为模板的阴性对照。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1重组载体pAN7-1-cox-TtrpC的构建

PCR模板来自本公司保藏菌株黑曲霉FG-2以及质粒pAN7-1。其中，基因组提取使用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒，具体步骤参照使用说明书；质粒提取使用DiaSpin柱式质粒DNA小量抽提试剂盒，具体步骤参照使用说明书。

(1)载体骨架与目的基因片段的获得：以黑曲霉FG-2提取的基因组为模板，利用引物组合cox-F和cox-R对cox启动子基因序列(cox基因的核苷酸序列见SEQ ID NO.1)进行PCR扩增；以质粒pAN7-1为模板，利用引物组合TtrpC-F和TtrpC-R PCR扩增TtrpC终止子序列(TtRPCTtrpC基因的核苷酸序列见SEQ ID NO.2)。PCR反应体系：10×Buffer 5μL；dNTPs(2.5mM each)4μL；Primer-F(10μM)2μL；Primer-R(10μM)2μL；模板1μL；Fastpfu polymerse(5U/μL)1μL；ddH₂O补足至50μL。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min/kb，35个循环；72℃延伸5min；4℃保温。

将上述得到的2段序列用引物组合cox-F和TtrpC-R进行重叠PCR，PCR反应体系：10×Buffer 5μL；dNTPs(2.5mM each)4μL；cox-F(10μM)2μL；TtrpC-R(10μM)2μL；模板分别为1μL；Fast pfu polymerse(5U/μL)1μL；ddH₂O补足50μL。反应程序：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸4min，35个循环；72℃延伸5min；4℃保温；经琼脂糖凝胶电泳验证后进行产物回收，得到目的片段cox+TtrpC。

质粒pAN7-1用引物组合pct-F和pct-R进行PCR扩增，得到用于连接目的片段cox+TtrpC的pAN7-1载体骨架。PCR反应体系：10×Buffer 5μL；dNTPs(2.5mM each)4μL；pct-F(10μM)2μL；pct-R(10μM)2μL；模板pAN7-1为1μL；Fast pfu polymerse(5U/μL)1μL；ddH₂O补足50μL。反应程序：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸4min 30s，35个循环；72℃延伸5min；4℃保温，经验证后进行产物回收。其中所用引物序列见表1。

表1引物序列

引物名称	序列(5’-3’)	序号
			cox-F	cctgcaggcatgcaagcttgAGGAAAACAAGAACTTGACGTGG	SEQ ID NO.3
cox-R	agtaacgttaagtggatccTGTCCTGGTGGGTGGGTTGCA	SEQ ID NO.4
			TtrpC-F	TGCAACCCACCCACCAGGACAggatccacttaacgttact	SEQ ID NO.5
TtrpC-R	tgtaaaacgacggccagtgctcgagtggagatgtggagtg	SEQ ID NO.6
			pct-F	gcactggccgtcgttttaca	SEQ ID NO.7
pct-R	caagcttgcatgcctgcag	SEQ ID NO.8

(2)通过一步克隆的方法，利用重组酶将回收的载体骨架pAN7-1与目的基因片段cox+TtrpC进行重组反应，然后将重组产物转化至E.coli DH5α感受态细胞后涂含有Amp⁺的LB平板，37℃培养过夜，挑取3个阳性克隆，提质粒分别用引物组合cox-F和cox-R、cox-F和TtrpC-R进行PCR验证；结果见图1与图2。图1为cox基因PCR产物验证的结果，图2为cox+TtrpC基因PCR产物验证的结果；cox基因大小为921bp，TtrpC基因大小为770bp，则cox+TtrpC基因大小为1691bp。经PCR验证挑选的3个阳性克隆菌正确。随后将PCR验证正确的菌液送生工测序，测序正确的重组质粒命名为pAN7-1-cox-TtrpC。

实施例2黑曲霉葡萄糖氧化酶基因GOD的过表达

(1)重组质粒pAN7-1-cox-GOD-TtrpC的构建

1)以黑曲霉FG-2提取的基因组为模板，利用引物组合G-F和G-R为上下游引物对含信号肽的GOD目的基因序列(GOD基因的核苷酸序列见SEQ ID NO.9)进行PCR扩增。PCR体系：10×Buffer 5μL；dNTPs(2.5mM each)4μL；G-F(10μM)2μL；G-R(10μM)2μL；模板1μL；Fastpfupolymerse(5U/μL)1μL；ddH₂O补足至50μL。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火20s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸5min；4℃保温，经凝胶电泳验证后进行产物回收，得到目的片段GOD的PCR产物。其中所用引物序列见表2。

2)质粒pAN7-1-cox-TtrpC用引物组合pcGt-F和pcGt-R进行PCR扩增，得到用于连接目的片段GOD的载体骨架pAN7-1-cox-TtrpC，电泳验证后进行产物回收；将其与目的片段GOD的PCR产物利用重组酶(Vazyme的ClonExpress II One Step Cloning Kit)进行重组反应，将重组产物转化E.coli DH5α感受态细胞后涂含有Amp⁺的LB平板，培养过夜，挑取阳性克隆，提取质粒利用引物G-F/G-R进行PCR验证，条带大小约为1818bp，电泳图见图3，结果显示挑选的6个阳性子均能扩出目的条带，随后将PCR验证正确的菌液选择其中的1、4号送生工测序，将测序正确的重组质粒命名为pAN7-1-cox-GOD-TtrpC，其中所用引物序列见表2。

表2引物序列

引物名称	序列(5’-3’)	序号
			G-F	CAACCCACCCACCAGGACAATGCAGACTCTCCTTGTGA	SEQ ID NO.10
G-R	agtaacgttaagtggatccTCACTGCATAGAAGCGTAGT	SEQ ID NO.11
			pcGt-F	ggatccacttaacgttactgaa	SEQ ID NO.12
pcGt-R	TGTCCTGGTGGGTGGGTTG	SEQ ID NO.13

(2)制备黑曲霉原生质体菌体培养

1)用黑曲霉FG-2孢子悬液接种CM培养基，总孢子数达到2x10⁸个(大约挑取一个培养皿上的黑曲霉孢子)，37℃过夜培养，然后收集菌丝体备用。

2)菌丝体酶解：于50mL无菌离心管中配制10mL酶解液(10mL酶解液中含有：100mg溶壁酶(sigma)+25mg纤维素酶(Solarbio)+25mg蜗牛酶(Solarbio))，过滤除菌，以10：1的比例加入湿菌丝体，将其置于25℃、75rpm的摇床中进行酶解3h，显微镜检查原生质体生成情况，纱布过滤，收集原生质体(滤液)。

(3)过表达GOD的黑曲霉工程菌的构建

1)收集的原生质体3000×g 10℃离心4min，去上清，用STC洗涤2次。

2)去上清后，加入STC溶液重悬原生质体(根据后面转化，一个样品50μl STC)。

3)取无菌的离心管依次加入：50μl原生质体悬液，10μl pAN7-1-cox-GOD-TtrpC(8-10μg，体积可视情况变化)，12.5μl PEG溶液，轻柔混匀，冰上放置20min后加入250μlPEG溶液，混合均匀。

室温静置5min，加入500μl STC溶液混匀，分开涂布2-3个再生平板。经转化子筛选和潮霉素抗性基因PCR验证获得过表达GOD基因黑曲霉工程菌株FG-god。

实施例3黑曲霉过氧化酶基因CAT的过表达

(1)重组质粒pAN7-1-cox-CAT-TtrpC的构建

1)黑曲霉FG-2提取的基因组为模板，利用引物组合C-F和C-R为上下游引物对含信号肽的CAT目的基因序列(CAT基因的核苷酸序列见SEQ ID NO.14)进行PCR扩增。PCR反应体系：10×Buffer 5μL；dNTPs(2.5mM each)4μL；C-F(10μM)2μL；C-R(10μM)2μL；模板1μL；Fastpfu polymerse(5U/μL)1μL；ddH₂O补足至50μL。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸2min 30s，35个循环；72℃延伸5min；4℃保温；其中所涉及引物序列见表3。

2)质粒pAN7-1-cox-TtrpC用引物组合pcCt-F和pcCt-R进行PCR扩增，得到用于连接目的片段CAT的载体骨架pAN7-1-cox-TtrpC；将pAN7-1-cox-TtrpC载体骨架与目的片段CAT的PCR产物分别进行割胶回收，然后利用重组酶进行重组反应，将重组产物转化E.coliDH5α感受态细胞后涂含有Amp⁺的LB平板，挑取阳性克隆，提取质粒利用引物C-F/C-R进行PCR验证，条带大小约为2193bp，电泳图见图4，泳道1-6分别为1-6号阳性子的PCR结果，图中结果显示均能扩出目的条带，随后将PCR验证正确的菌液选取其中4个送生工测序，测序正确的重组质粒命名为pAN7-1-cox-CAT-TtrpC；其中所用引物序列见表3。

表3引物序列

引物名称	序列(5’-3’)	序号
			C-F	GCAACCCACCCACCAGGACAATGCGTCATTTCTGGCTTTT	SEQ ID NO.15
C-R	cagtaacgttaagtggatccTTACTCATCCAGCGCAAACC	SEQ ID NO.16
			pcCt-F	GGTTTGCGCTGGATGAGTAA	SEQ ID NO.17
pcCt-R	TGTCCTGGTGGGTGGGTTGC	SEQ ID NO.18

(2)过表达CAT的黑曲霉工程菌的构建

利用原生质体转化的方法(参见实施例2步骤(2)-(3))将上述质粒pAN7-1-cox-CAT-TtrpC转化至黑曲霉宿主菌株，经转化子筛选和潮霉素抗性基因PCR验证获得过表达基因CAT的黑曲霉工程菌株FG-cat。

实施例4黑曲霉过氧化酶基因CAT和葡萄糖氧化酶基因GOD的同时过表达

(1)CAT-GOD融合基因linker序列的选择及linker重叠引物设计

1)linker序列的选择。柔性肽是由一系列串联重复的极性氨基酸(Gly，Ser)组成，最常用的柔性肽是[GGGGS]n(1≤n≤6)，其中[GGGGS]3序列，具有较合适的氨基酸长度，同时具有疏水性和伸展性可保持功能蛋白较好的稳定性和生物活性，因此该连接肽已经成为通用连接肽，并广泛用于融合蛋白的构建；刚性肽是由可形成稳定二级结构氨基酸组成，使用频率最高的α-螺旋刚性连接肽为[EAAAK]n(n≤6)。根据黑曲霉密码子偏好性自行设计了柔性肽中的s3-1序列以及α-螺旋刚性肽中的a3-1序列作为基因CAT与GOD的linker。其中s3-1序列以及a3-1序列如下：

s3-1：5’-GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGAGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATC-3’；SEQ ID NO.19；

a3-1：5’-GAAGCTGCGGCAAAAGAAGCAGCGGCTAAAGAAGCGGCGGCAAAA-3’；SEQ IDNO.20。

2)重叠引物设计。CAT基因上游引物为A-1，GOD下游引物为G-4；融合相应linker的中间重叠引物：A-s3-1-2，s3-1-G-3；A-a3-1-2，a3-1-G-3。构建柔性肽连接的CAT-s3-1-GOD以及α-螺旋刚性肽融合的CAT-a3-1-GOD，所涉及引物序列见表4。

表4引物序列

引物名称	序列(5’-3’)	序号
			A-1	CAACCCACCCACCAGGACAATGCGTCATTTCTGGCTTTTG	SEQ ID NO.21
A-s3-1-2	CCGCCCGAGCCACCGCCACCTTACTCATCCAGCGCAAACC	SEQ ID NO.22
			s3-1-G-3	GGTCGGGTGGCGGCGGATCTGCAGACTCTCCTTGTGA	SEQ ID NO.23
A-a3-1-2	GCTTCTTTTGCCGCAGCTTCTTACTCATCCAGCGCAAACC	SEQ ID NO.24
			a3-1-G-3	TAAAGAAGCGGCGGCAAAATGCAGACTCTCCTTGTGA	SEQ ID NO.25
G-4	tgtaaaacgacggccagtgctcgagtggagatgtggagtgg	SEQ ID NO.26

(2)表达载体pAN7-1-cox-CAT-linker-GOD-TtrpC构建

1)目的基因CAT的扩增与回收：以黑曲霉FG-2基因组为模板，分别用引物A-1/A-s3-1-2、A-1/A-a3-1-2进行单重PCR扩增，得到含有信号肽的CAT基因以及部分linker基因(Ls、La)的目的片段，进行产物回收，得到目的片段ALs、ALa。

2)目的基因GOD的扩增与回收：以黑曲霉FG-2基因组为模板，分别用引物s3-1-G-3/G-4、a3-1-G-3/G-4进行单重PCR扩增，得到含有信号肽的GOD基因以及部分linker基因(Ls’、La’)的目的片段，进行产物回收，得到目的片段LsG、LaG。

3)融合蛋白基因CAT-linker-GOD的扩增和回收

以上述扩增后的回收产物ALs、LsG以及ALa、LaG混合物为模板，用引物A-1、G-4进行重叠PCR扩增，得到融合蛋白基因片段CAT-s3-1-GOD(CAT-s3-1-GOD基因的核苷酸序列见SEQ ID NO.27)、CAT-a3-1-GOD(CAT-a3-1-GOD基因的核苷酸序列见SEQ ID NO.28)，进行产物回收。

4)重组质粒pAN7-1-cox-CAT-linker-GOD-TtrpC的构建与鉴定

质粒pAN7-1-cox-TtrpC用引物组合pct-F(SEQ ID NO.7)和pct-R(SEQ ID NO.8)进行PCR扩增，得到用于连接目的片段的载体骨架pAN7-1-cox-TtrpC，进行产物回收；将pAN7-1-cox-TtrpC载体骨架与目的片段的回收产物利用重组酶进行重组反应，将重组产物转化E.coli DH5α感受态细胞后涂含有Amp⁺的LB平板，挑取阳性克隆，提取质粒后，利用引物A-1和G-4进行PCR验证，条带大小约4.1kb，电泳图见图5，泳道1-4分别为1-4号阳性子的PCR结果，图中结果显示只有1和2号阳性子均能扩出目的条带，随后将PCR验证正确的菌液送生工测序，测序正确的重组质粒命名为pAN7-1-cox-CAT-linker-GOD-TtrpC。

(3)CAT与GOD同时过表达的工程菌FG-cat-(linker)-god的构建

利用原生质体转化的方法(参见实施例2步骤(2)-(3))将上述验证成功的重组质粒pAN7-1-cox-CAT-linker-GOD-TtrpC转化至黑曲霉宿主菌株，经转化子筛选和潮霉素抗性基因PCR验证分别获得过表达基因CAT与GOD的工程菌株FG-cat-(s3-1)-god、FG-cat-(a3-1)-god。

实施例5工程菌摇瓶水平验证

挑取野生型FG-2、重组菌株FG-god、FG-cat、FG-cat-(s3-1)-god以及FG-cat-(a3-1)-god，分别将其孢子悬液(孢子数为1.0x10⁷个/mL)按10％的接种量接种到装有100mL摇瓶发酵培养基(葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾0.013g/L，玉米浆0.1g/L，尿素0.02g/L，硫酸镁0.002g/L，碳酸钙4g/L)的500mL摇瓶中，在37℃、220r/min条件下培养48h，获得发酵液。

酶活力测定及葡萄糖酸钠产量测定：取1mL发酵液于5mL离心管中，10000rpm，4℃离心5min，取上清液为胞外GOD或CAT酶活及葡萄糖酸钠产量的测定样品。检测结果见表5。

表5不同菌株的酶活测定及葡萄糖酸钠产量

表5结果显示，黑曲霉单独过表达GOD，其GOD酶活力基本与野生型菌株相比，虽有提高，但其葡萄糖酸钠产量提高幅度不大，这可能由于黑曲霉代谢产生的GOD催化底物葡萄糖，导致大量的过氧化氢积累，过氧化氢有很强的氧化性，对葡萄糖氧化酶有一定的毒害作用，从而抑制其产生葡萄糖酸钠；而单独过表达CAT时，CAT酶活力有一定的提高，且葡萄糖酸钠产量也相较于野生型有一定的提高，但葡萄糖酸钠的产量提高幅度同样也不大，这说明黑曲霉工程菌虽可以过表达CAT，实现CAT的胞外大量分泌，但由于GOD表达量不高，产生的葡糖糖酸量不高，从而影响葡萄糖酸钠的合成。在此基础上，考虑同时在黑曲霉中过表达CAT与GOD。融合蛋白的设计中，经常需要用连接肽将不同功能的蛋白进行连接融合，连接肽的设计和选择对融合蛋白的表达、稳定性及功能活性至关重要。结果显示，构建的两株同时过表达CAT与GOD的工程菌中，以s3-1柔性肽构建的工程菌效果较好，该工程菌摇瓶水平葡萄糖酸钠产量最高可达20.5g/100mL发酵液。

实施例6工程菌15L发酵罐培养验证

取一支黑曲霉工程菌FG-cat-(s3-1)-god，刮取上层孢子，接入改良马丁琼脂培养基(青岛海博生物技术有限公司)中，在30℃培养至长满孢子后配制成菌悬液备用。

在5L培养罐中加入葡萄糖0.6kg、麸皮0.66g、磷酸二氢钾0.6g、硫酸镁0.6g、磷酸氢二铵1.86g、消泡剂0.78ml，定容至3L，115℃灭菌20min，然后降至36℃，加入菌悬液(孢子数为1.0x10⁷个/mL)，控制种子液的温度为30℃；保持种子液的pH为5.2；控制溶解氧(DO)≥30％，发酵20h，得到种子液(菌浓约1.4-1.8g/L)。

在15L发酵罐中(一级发酵罐)加入葡萄糖3.5kg、磷酸二氢钾0.79g、硫酸镁0.53g、尿素0.41g、磷酸氢二铵0.012g、消泡剂2.6ml，定容至10L，115℃灭菌20min，然后降至37℃，接入种子液，接种量为12％，用浓度为350g/L的NaOH调节pH控制在5.2，控制发酵液的温度为30℃，使黑曲霉菌丝长度控制在10～15pm的范围内，溶氧控制在20％～30％之间，每2h测定酶活、葡萄糖及葡萄糖酸钠含量，当发酵罐中的葡萄糖含量低于3g/L的时候结束发酵。结果表明：工程菌株FG-cat-(s3-1)-god发酵18h左右，葡萄糖酸钠产量就可达到34.7g/100mL发酵液，相比野生型菌株FG，其发酵时间可以至少缩短10％。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 山东福洋生物科技股份有限公司

<120> 一种过表达CAT和GOD的产葡萄糖酸钠的黑曲霉基因工程菌的构建方法

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 921

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

aggaaaacaa gaacttgacg tggaagcaaa ttgcagactt cttcccgggc cgaacgagcg 60

gcaccttgca agtccgatac tgcaccaagc tgaaggctaa ggatgtagct tggagtgacg 120

aaatggttcg attttctcct gatgtatttc tacggctgtc tcacacatgc taatgaaggg 180

aataggtaca aaggctgcag cgggcaatgc acgagtacga gaacgatcgg tggcgcatca 240

ttgcagggaa ggttggaaat ggcttcaccc cagctgcttg ccgcgagaaa gccatgcagc 300

tccatgagta aaaccgttgg ggaattttca tatttatatc tactgtcgcc agattcggcc 360

ctgcttggac cctctgatct ccttactctc catattggtt caaatgtcgg gtctccgata 420

gggctggtgg tgcaggcttg ttgtaggcac gggaggatga tcagcataac tctgattcac 480

tatagggacg ggttgatgta aggtattaag tgatgtatga taattcattt tagcccgggg 540

gaacatatgg cgccggcatt tgttcgttcg caatgaaccg acactagcgt ccgctctcgc 600

agtttagcac cggctgatcc cgggctgaac gcggccattg ctcggccggg gcatgtgttc 660

cttaatctac ggcagaccgc agaagaccac tggcgcagat tgtagaccct aagccctaag 720

acggacaccc aatcgagtag gtctgcggac caggtcactg cgggcagccg gagaagctcc 780

gcaaccaatc aatccccggc gctgactaag ggcaggcgac cacgggccga agcggcttca 840

aactcacctc aacctccaaa ctccctcatc tccaaacgtc cttgccttgt ctgccgtcat 900

tgcaacccac ccaccaggac a 921

<210> 2

<211> 770

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ggatccactt aacgttactg aaatcatcaa acagcttgac gaatctggat ataagatcgt 60

tggtgtcgat gtcagctccg gagttgagac aaatggtgtt caggatctcg ataagatacg 120

ttcatttgtc caagcagcaa agagtgcctt ctagtgattt aatagctcca tgtcaacaag 180

aataaaacgc gttttcgggt ttacctcttc cagatacagc tcatctgcaa tgcattaatg 240

cattgactgc aacctagtaa cgccttncag gctccggcga agagaagaat agcttagcag 300

agctattttc attttcggga gacgagatca agcagatcaa cggtcgtcaa gagacctacg 360

agactgagga atccgctctt ggctccacgc gactatatat ttgtctctaa ttgtactttg 420

acatgctcct cttctttact ctgatagctt gactatgaaa attccgtcac cagcncctgg 480

gttcgcaaag ataattgcat gtttcttcct tgaactctca agcctacagg acacacattc 540

atcgtaggta taaacctcga aatcanttcc tactaagatg gtatacaata gtaaccatgc 600

atggttgcct agtgaatgct ccgtaacacc caatacgccg gccgaaactt ttttacaact 660

ctcctatgag tcgtttaccc agaatgcaca ggtacacttg tttagaggta atccttcttt 720

ctagaagtcc tcgtgtactg tgtaagcgcc cactccacat ctccactcga 770

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

cctgcaggca tgcaagcttg aggaaaacaa gaacttgacg tgg 43

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

agtaacgtta agtggatcct gtcctggtgg gtgggttgca 40

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

tgcaacccac ccaccaggac aggatccact taacgttact 40

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

tgtaaaacga cggccagtgc tcgagtggag atgtggagtg 40

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

gcactggccg tcgttttaca 20

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

caagcttgca tgcctgcag 19

<210> 9

<211> 1818

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

atgcagactc tccttgtgag ctcgctcgtg gtctcccttg ctgcggccct gccacactac 60

atcaggagca atggcattga agccagcctc ctgactgacc ccaaggatgt ctccggccgc 120

acggtcgact acatcatcgc tggtggaggt ctgactggac tcaccaccgc tgctcgtctg 180

acggagaacc ccaacatcag tgtgctcgtc atcgaaagtg gctcctacga gtcggacaga 240

ggtcctatca ttgaggacct gaacgcctac ggcgacattt ttggcagcag tgtagaccac 300

gcctacgaga ccgttgagct cgctaccaac aatcaaaccg cgctgatccg ctccggaaat 360

ggtctcggtg gctctactct agtgaatggt ggcacctgga ctcgccccca caaggcacag 420

gttgattctt gggagactgt ctttggaaat gagggctgga actgggacaa tgtggccgcc 480

tactccctcc aggctgagcg tgctcgcgca ccaaatgcca aacagatcgc tgctggccac 540

tacttcaacg catcctgtca tggtaccaat ggtactgtcc atgccggacc ccgtgacacc 600

ggcgatgact attcccccat cgtcaaggct ctcatgagcg ctgtcgaaga ccggggcgtt 660

cccaccaaga aggacttcgg atgcggtgac cctcatggtg tgtccatgtt ccccaacacc 720

ttgcacgaag accaagttcg ctccgatgcc gctcgcgaat ggctccttcc caactaccaa 780

cgtcccaacc tgcaagtcct gaccggacaa tatgttggta aggtgctcct tagccagaac 840

ggcaccaccc ctcgtgccgt cggcgtggaa ttcggcaccc acaagggcaa cacccacaac 900

gtttacgcta agcacgaggt cctcctggct gctggctcgg ctgtctctcc caccatcctc 960

gaatattccg gtatcggaat gaagtccatc ctggaacccc ttggtatcga caccgtcgtt 1020

gacctgcccg tcggcctgaa cctgcaggac cagaccaccg ctaccgtccg ctcccgcatc 1080

acctctgctg gtgccggaca gggacaggcc gcttggttcg ccaccttcaa cgagaccttt 1140

ggtgactatg ccgaaaaggc acacgagctg ctcaacacca agctggagca gtgggccgaa 1200

gaggccgtcg cccgtggcgg attccacaac accaccgcct tgctcatcca gtacgagaac 1260

tatcgcgact ggattgtcaa tcacaacgtc gcgtactcgg aactcttcct cgacactgcc 1320

ggagtggcca gcttcgatgt gtgggacctt ctgcccttca cgagaggata cgtccacatc 1380

ctcgacaagg acccctacct ccaccacttt gcctacgacc ctcagtactt cctcaacgag 1440

ctcgacctgc tcggtcaggc tgccgctact cagctggccc gtaacatctc caactccggt 1500

gctatgcaga cctacttcgc tggcgagact atccccggtg ataacctcgc gtatgatgcc 1560

gatttgagcg cctggactga gtacatcccg taccacttcc gtcctaacta ccatggcgtg 1620

ggtacttgct ccatgatgcc gaaggagatg ggcggtgttg tcgataatgc tgcccgtgtg 1680

tacggtgtgc agggactgcg tgtcattgat ggttctattc cccctacgca gatgtcgtcc 1740

catgtcatga ctgtgttcta cgccatggcg ttgaagattg cggatgctat tttggaggac 1800

tacgcttcta tgcagtga 1818

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

caacccaccc accaggacaa tgcagactct ccttgtga 38

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

agtaacgtta agtggatcct cactgcatag aagcgtagt 39

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

ggatccactt aacgttactg aa 22

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

tgtcctggtg ggtgggttg 19

<210> 14

<211> 2193

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

atgcgtcatt tctggctttt gccagctgtt gctggtatcg ctggggctca atgcccctac 60

ctgtcgggtg aaatgagttt cacccaggag caggacaatg ctggcgatac cattgaggtc 120

acggagcagc ccattgacaa caccctgtat gtcaatgaca ctggtagcta catgactacc 180

gactttggca ctccgatctc cgaccagacc agtctcaagg ctggaccccg tggtcctact 240

ctgttggagg actttatctt ccgtcagaag cttcagcggt tcgaccatga gcgtgtcccc 300

gagcgcgtcg tccacgcccg tggtgcaggt gcatatggta ctttcaaatc ctacgccgac 360

tggtcgaacg tcacggctgc cgatttcttg agtgccaacg acaaggagac ccctatgttc 420

tgtcgcttct ctactgtggt cggtttccgt ggtagtgttg acactgcgcg tgatgttcac 480

ggtcacgctt gtcggttcta cactgacgag ggtaactatg acatcgtcgg tatcaacttc 540

gcccccttct tcatccagga cgccatccag ttccccgatc ttgtccacgc catcaagccc 600

atgcccaaca atgagatccc ccaagccgca actgcacaca cttccgcttg ggacttcttc 660

agccagcaga gcactgccct tcacagtgcc ttgtggctga tgtctggtaa cggtattcct 720

cgttctttcc gccacatgaa cggctacgga gtccacagct tccgctttgt cgctgccaat 780

ggcacttcca aggtggttcg ctaccgctgg aagtcccagc agggtgttgc cagtctggtg 840

tgggatgaag ctcaggccgc tgctggtaag aacagtgact accaccgcca ggatctgtac 900

aatgcgatcg ccaatggcca ctacccgaaa tacgagctcc aagcccagat catggatgag 960

gctgacatgc ttcgtttcgg cttcgacctt ctggatccca ccaagttggt ccccgaggag 1020

gttgtccctt acactcctct cggaatgatg gagctcaatg ccaaccccac caactacttt 1080

gctgaagttg aacaggctgg tttccaaccc ggtcacgtcg ttcctggcat tgacttcacc 1140

gatgaccccc tgctgcaagg tcgtctcttc tcctacttgg acacccagtt gacccgtcac 1200

ggcggtccca actttgagca aatccctgtc aaccgtcctc gcaagcccgt tcacaacaac 1260

aaccgtgacg gcttcggcca gcagcagatc cccaccaaca actgggccta cacccccaac 1320

agcatgagca acggttaccc catgcaagcc aaccagaccc agggccacgg tttcttcacc 1380

gctccctacc gctacgcttc cggccatctc gtccgccaaa ccagcccgac cttcaatgac 1440

cactggtccc agcccgccat gttctggaac tctctgatcc ccgctgagca gcagatggtt 1500

gtcaacgcca ttgtctttga gaactccaag gttaacagcc cccacgttcg caagaacgtt 1560

gtcaaccagc tgaacatggt caacaacaac ctcgccgtcc gtgtcgctcg tggtcttggt 1620

ctcgatgagc cctcccccaa cccgacctac tacacctcca acaagacctc caacgtcggt 1680

accttcggca agcccctcct cagcatcgag ggtctgcagg tcggcttcct ggcctcgaac 1740

tcccaccctg aatccatcaa gcagggccag gccatggccg cgcagttctc tgccgctggc 1800

gtcgacctga acattgtcac cgaggcctat gccgatggtg tcaacaccac ctacgccctg 1860

tctgatgcca tcgactttga cgccctcatc atcgccgatg gtgtgcagag cctctttgcc 1920

tccccggctc tcgctaacca gatgaactct accgccacct ctactctcta ccctcctgcc 1980

agacctttcc agatcctggt cgattctttc aggtacggta agcccgtggc tgctgtcggc 2040

agtggcagtg ttgcgcttaa gaacgccggt attgattcct cccgctctgg tgtgtacact 2100

ggctcgagcg agacgacgga gaagatcgcc aaggaggtct tggagggact ctacactttc 2160

cgttttgtgg accggtttgc gctggatgag taa 2193

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

gcaacccacc caccaggaca atgcgtcatt tctggctttt 40

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

cagtaacgtt aagtggatcc ttactcatcc agcgcaaacc 40

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

ggtttgcgct ggatgagtaa 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

tgtcctggtg ggtgggttgc 20

<210> 19

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

ggtggcggtg gctcgggcgg aggtgggtcg ggtggcggcg gatc 44

<210> 20

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

gaagctgcgg caaaagaagc agcggctaaa gaagcggcgg caaaa 45

<210> 21

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

caacccaccc accaggacaa tgcgtcattt ctggcttttg 40

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

ccgcccgagc caccgccacc ttactcatcc agcgcaaacc 40

<210> 23

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

ggtcgggtgg cggcggatct gcagactctc cttgtga 37

<210> 24

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

gcttcttttg ccgcagcttc ttactcatcc agcgcaaacc 40

<210> 25

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 25

taaagaagcg gcggcaaaat gcagactctc cttgtga 37

<210> 26

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 26

tgtaaaacga cggccagtgc tcgagtggag atgtggagtg g 41

<210> 27

<211> 4055

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 27

atgcgtcatt tctggctttt gccagctgtt gctggtatcg ctggggctca atgcccctac 60

ctgtcgggtg aaatgagttt cacccaggag caggacaatg ctggcgatac cattgaggtc 120

acggagcagc ccattgacaa caccctgtat gtcaatgaca ctggtagcta catgactacc 180

gactttggca ctccgatctc cgaccagacc agtctcaagg ctggaccccg tggtcctact 240

ctgttggagg actttatctt ccgtcagaag cttcagcggt tcgaccatga gcgtgtcccc 300

gagcgcgtcg tccacgcccg tggtgcaggt gcatatggta ctttcaaatc ctacgccgac 360

tggtcgaacg tcacggctgc cgatttcttg agtgccaacg acaaggagac ccctatgttc 420

tgtcgcttct ctactgtggt cggtttccgt ggtagtgttg acactgcgcg tgatgttcac 480

ggtcacgctt gtcggttcta cactgacgag ggtaactatg acatcgtcgg tatcaacttc 540

gcccccttct tcatccagga cgccatccag ttccccgatc ttgtccacgc catcaagccc 600

atgcccaaca atgagatccc ccaagccgca actgcacaca cttccgcttg ggacttcttc 660

agccagcaga gcactgccct tcacagtgcc ttgtggctga tgtctggtaa cggtattcct 720

cgttctttcc gccacatgaa cggctacgga gtccacagct tccgctttgt cgctgccaat 780

ggcacttcca aggtggttcg ctaccgctgg aagtcccagc agggtgttgc cagtctggtg 840

tgggatgaag ctcaggccgc tgctggtaag aacagtgact accaccgcca ggatctgtac 900

aatgcgatcg ccaatggcca ctacccgaaa tacgagctcc aagcccagat catggatgag 960

gctgacatgc ttcgtttcgg cttcgacctt ctggatccca ccaagttggt ccccgaggag 1020

gttgtccctt acactcctct cggaatgatg gagctcaatg ccaaccccac caactacttt 1080

gctgaagttg aacaggctgg tttccaaccc ggtcacgtcg ttcctggcat tgacttcacc 1140

gatgaccccc tgctgcaagg tcgtctcttc tcctacttgg acacccagtt gacccgtcac 1200

ggcggtccca actttgagca aatccctgtc aaccgtcctc gcaagcccgt tcacaacaac 1260

aaccgtgacg gcttcggcca gcagcagatc cccaccaaca actgggccta cacccccaac 1320

agcatgagca acggttaccc catgcaagcc aaccagaccc agggccacgg tttcttcacc 1380

gctccctacc gctacgcttc cggccatctc gtccgccaaa ccagcccgac cttcaatgac 1440

cactggtccc agcccgccat gttctggaac tctctgatcc ccgctgagca gcagatggtt 1500

gtcaacgcca ttgtctttga gaactccaag gttaacagcc cccacgttcg caagaacgtt 1560

gtcaaccagc tgaacatggt caacaacaac ctcgccgtcc gtgtcgctcg tggtcttggt 1620

ctcgatgagc cctcccccaa cccgacctac tacacctcca acaagacctc caacgtcggt 1680

accttcggca agcccctcct cagcatcgag ggtctgcagg tcggcttcct ggcctcgaac 1740

tcccaccctg aatccatcaa gcagggccag gccatggccg cgcagttctc tgccgctggc 1800

gtcgacctga acattgtcac cgaggcctat gccgatggtg tcaacaccac ctacgccctg 1860

tctgatgcca tcgactttga cgccctcatc atcgccgatg gtgtgcagag cctctttgcc 1920

tccccggctc tcgctaacca gatgaactct accgccacct ctactctcta ccctcctgcc 1980

agacctttcc agatcctggt cgattctttc aggtacggta agcccgtggc tgctgtcggc 2040

agtggcagtg ttgcgcttaa gaacgccggt attgattcct cccgctctgg tgtgtacact 2100

ggctcgagcg agacgacgga gaagatcgcc aaggaggtct tggagggact ctacactttc 2160

cgttttgtgg accggtttgc gctggatgag taaggtggcg gtggctcggg cggaggtggg 2220

tcgggtggcg gcggatcatg cagactctcc ttgtgagctc gctcgtggtc tcccttgctg 2280

cggccctgcc acactacatc aggagcaatg gcattgaagc cagcctcctg actgacccca 2340

aggatgtctc cggccgcacg gtcgactaca tcatcgctgg tggaggtctg actggactca 2400

ccaccgctgc tcgtctgacg gagaacccca acatcagtgt gctcgtcatc gaaagtggct 2460

cctacgagtc ggacagaggt cctatcattg aggacctgaa cgcctacggc gacatttttg 2520

gcagcagtgt agaccacgcc tacgagaccg ttgagctcgc taccaacaat caaaccgcgc 2580

tgatccgctc cggaaatggt ctcggtggct ctactctagt gaatggtggc acctggactc 2640

gcccccacaa ggcacaggtt gattcttggg agactgtctt tggaaatgag ggctggaact 2700

gggacaatgt ggccgcctac tccctccagg ctgagcgtgc tcgcgcacca aatgccaaac 2760

agatcgctgc tggccactac ttcaacgcat cctgtcatgg taccaatggt actgtccatg 2820

ccggaccccg tgacaccggc gatgactatt cccccatcgt caaggctctc atgagcgctg 2880

tcgaagaccg gggcgttccc accaagaagg acttcggatg cggtgaccct catggtgtgt 2940

ccatgttccc caacaccttg cacgaagacc aagttcgctc cgatgccgct cgcgaatggc 3000

tccttcccaa ctaccaacgt cccaacctgc aagtcctgac cggacaatat gttggtaagg 3060

tgctccttag ccagaacggc accacccctc gtgccgtcgg cgtggaattc ggcacccaca 3120

agggcaacac ccacaacgtt tacgctaagc acgaggtcct cctggctgct ggctcggctg 3180

tctctcccac catcctcgaa tattccggta tcggaatgaa gtccatcctg gaaccccttg 3240

gtatcgacac cgtcgttgac ctgcccgtcg gcctgaacct gcaggaccag accaccgcta 3300

ccgtccgctc ccgcatcacc tctgctggtg ccggacaggg acaggccgct tggttcgcca 3360

ccttcaacga gacctttggt gactatgccg aaaaggcaca cgagctgctc aacaccaagc 3420

tggagcagtg ggccgaagag gccgtcgccc gtggcggatt ccacaacacc accgccttgc 3480

tcatccagta cgagaactat cgcgactgga ttgtcaatca caacgtcgcg tactcggaac 3540

tcttcctcga cactgccgga gtggccagct tcgatgtgtg ggaccttctg cccttcacga 3600

gaggatacgt ccacatcctc gacaaggacc cctacctcca ccactttgcc tacgaccctc 3660

agtacttcct caacgagctc gacctgctcg gtcaggctgc cgctactcag ctggcccgta 3720

acatctccaa ctccggtgct atgcagacct acttcgctgg cgagactatc cccggtgata 3780

acctcgcgta tgatgccgat ttgagcgcct ggactgagta catcccgtac cacttccgtc 3840

ctaactacca tggcgtgggt acttgctcca tgatgccgaa ggagatgggc ggtgttgtcg 3900

ataatgctgc ccgtgtgtac ggtgtgcagg gactgcgtgt cattgatggt tctattcccc 3960

ctacgcagat gtcgtcccat gtcatgactg tgttctacgc catggcgttg aagattgcgg 4020

atgctatttt ggaggactac gcttctatgc agtga 4055

<210> 28

<211> 4056

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 28

atgcgtcatt tctggctttt gccagctgtt gctggtatcg ctggggctca atgcccctac 60

ctgtcgggtg aaatgagttt cacccaggag caggacaatg ctggcgatac cattgaggtc 120

acggagcagc ccattgacaa caccctgtat gtcaatgaca ctggtagcta catgactacc 180

gactttggca ctccgatctc cgaccagacc agtctcaagg ctggaccccg tggtcctact 240

ctgttggagg actttatctt ccgtcagaag cttcagcggt tcgaccatga gcgtgtcccc 300

gagcgcgtcg tccacgcccg tggtgcaggt gcatatggta ctttcaaatc ctacgccgac 360

tggtcgaacg tcacggctgc cgatttcttg agtgccaacg acaaggagac ccctatgttc 420

tgtcgcttct ctactgtggt cggtttccgt ggtagtgttg acactgcgcg tgatgttcac 480

ggtcacgctt gtcggttcta cactgacgag ggtaactatg acatcgtcgg tatcaacttc 540

gcccccttct tcatccagga cgccatccag ttccccgatc ttgtccacgc catcaagccc 600

atgcccaaca atgagatccc ccaagccgca actgcacaca cttccgcttg ggacttcttc 660

agccagcaga gcactgccct tcacagtgcc ttgtggctga tgtctggtaa cggtattcct 720

cgttctttcc gccacatgaa cggctacgga gtccacagct tccgctttgt cgctgccaat 780

ggcacttcca aggtggttcg ctaccgctgg aagtcccagc agggtgttgc cagtctggtg 840

tgggatgaag ctcaggccgc tgctggtaag aacagtgact accaccgcca ggatctgtac 900

aatgcgatcg ccaatggcca ctacccgaaa tacgagctcc aagcccagat catggatgag 960

gctgacatgc ttcgtttcgg cttcgacctt ctggatccca ccaagttggt ccccgaggag 1020

gttgtccctt acactcctct cggaatgatg gagctcaatg ccaaccccac caactacttt 1080

gctgaagttg aacaggctgg tttccaaccc ggtcacgtcg ttcctggcat tgacttcacc 1140

gatgaccccc tgctgcaagg tcgtctcttc tcctacttgg acacccagtt gacccgtcac 1200

ggcggtccca actttgagca aatccctgtc aaccgtcctc gcaagcccgt tcacaacaac 1260

aaccgtgacg gcttcggcca gcagcagatc cccaccaaca actgggccta cacccccaac 1320

agcatgagca acggttaccc catgcaagcc aaccagaccc agggccacgg tttcttcacc 1380

gctccctacc gctacgcttc cggccatctc gtccgccaaa ccagcccgac cttcaatgac 1440

cactggtccc agcccgccat gttctggaac tctctgatcc ccgctgagca gcagatggtt 1500

gtcaacgcca ttgtctttga gaactccaag gttaacagcc cccacgttcg caagaacgtt 1560

gtcaaccagc tgaacatggt caacaacaac ctcgccgtcc gtgtcgctcg tggtcttggt 1620

ctcgatgagc cctcccccaa cccgacctac tacacctcca acaagacctc caacgtcggt 1680

accttcggca agcccctcct cagcatcgag ggtctgcagg tcggcttcct ggcctcgaac 1740

tcccaccctg aatccatcaa gcagggccag gccatggccg cgcagttctc tgccgctggc 1800

gtcgacctga acattgtcac cgaggcctat gccgatggtg tcaacaccac ctacgccctg 1860

tctgatgcca tcgactttga cgccctcatc atcgccgatg gtgtgcagag cctctttgcc 1920

tccccggctc tcgctaacca gatgaactct accgccacct ctactctcta ccctcctgcc 1980

agacctttcc agatcctggt cgattctttc aggtacggta agcccgtggc tgctgtcggc 2040

agtggcagtg ttgcgcttaa gaacgccggt attgattcct cccgctctgg tgtgtacact 2100

ggctcgagcg agacgacgga gaagatcgcc aaggaggtct tggagggact ctacactttc 2160

cgttttgtgg accggtttgc gctggatgag taagaagctg cggcaaaaga agcagcggct 2220

aaagaagcgg cggcaaaaat gcagactctc cttgtgagct cgctcgtggt ctcccttgct 2280

gcggccctgc cacactacat caggagcaat ggcattgaag ccagcctcct gactgacccc 2340

aaggatgtct ccggccgcac ggtcgactac atcatcgctg gtggaggtct gactggactc 2400

accaccgctg ctcgtctgac ggagaacccc aacatcagtg tgctcgtcat cgaaagtggc 2460

tcctacgagt cggacagagg tcctatcatt gaggacctga acgcctacgg cgacattttt 2520

ggcagcagtg tagaccacgc ctacgagacc gttgagctcg ctaccaacaa tcaaaccgcg 2580

ctgatccgct ccggaaatgg tctcggtggc tctactctag tgaatggtgg cacctggact 2640

cgcccccaca aggcacaggt tgattcttgg gagactgtct ttggaaatga gggctggaac 2700

tgggacaatg tggccgccta ctccctccag gctgagcgtg ctcgcgcacc aaatgccaaa 2760

cagatcgctg ctggccacta cttcaacgca tcctgtcatg gtaccaatgg tactgtccat 2820

gccggacccc gtgacaccgg cgatgactat tcccccatcg tcaaggctct catgagcgct 2880

gtcgaagacc ggggcgttcc caccaagaag gacttcggat gcggtgaccc tcatggtgtg 2940

tccatgttcc ccaacacctt gcacgaagac caagttcgct ccgatgccgc tcgcgaatgg 3000

ctccttccca actaccaacg tcccaacctg caagtcctga ccggacaata tgttggtaag 3060

gtgctcctta gccagaacgg caccacccct cgtgccgtcg gcgtggaatt cggcacccac 3120

aagggcaaca cccacaacgt ttacgctaag cacgaggtcc tcctggctgc tggctcggct 3180

gtctctccca ccatcctcga atattccggt atcggaatga agtccatcct ggaacccctt 3240

ggtatcgaca ccgtcgttga cctgcccgtc ggcctgaacc tgcaggacca gaccaccgct 3300

accgtccgct cccgcatcac ctctgctggt gccggacagg gacaggccgc ttggttcgcc 3360

accttcaacg agacctttgg tgactatgcc gaaaaggcac acgagctgct caacaccaag 3420

ctggagcagt gggccgaaga ggccgtcgcc cgtggcggat tccacaacac caccgccttg 3480

ctcatccagt acgagaacta tcgcgactgg attgtcaatc acaacgtcgc gtactcggaa 3540

ctcttcctcg acactgccgg agtggccagc ttcgatgtgt gggaccttct gcccttcacg 3600

agaggatacg tccacatcct cgacaaggac ccctacctcc accactttgc ctacgaccct 3660

cagtacttcc tcaacgagct cgacctgctc ggtcaggctg ccgctactca gctggcccgt 3720

aacatctcca actccggtgc tatgcagacc tacttcgctg gcgagactat ccccggtgat 3780

aacctcgcgt atgatgccga tttgagcgcc tggactgagt acatcccgta ccacttccgt 3840

cctaactacc atggcgtggg tacttgctcc atgatgccga aggagatggg cggtgttgtc 3900

gataatgctg cccgtgtgta cggtgtgcag ggactgcgtg tcattgatgg ttctattccc 3960

cctacgcaga tgtcgtccca tgtcatgact gtgttctacg ccatggcgtt gaagattgcg 4020

gatgctattt tggaggacta cgcttctatg cagtga 4056

Claims

1.一种过表达CAT和GOD的产葡萄糖酸钠的黑曲霉基因工程菌，其特征在于，以黑曲霉FG-2为出发菌株，过表达CAT+linker+GOD获得的FG-cat-linker-god；所述linker为s3-1序列或a3-1序列；

所述s3-1序列如下：

s3-1：5’-GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGAGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATC-3’；SEQ ID NO.19；

所述a3-1序列如下：

a3-1：5’-GAAGCTGCGGCAAAAGAAGCAGCGGCTAAAGAAGCGGCGGCAAAA-3’；SEQ ID NO.20。

2.一种过表达CAT和GOD的产葡萄糖酸钠的黑曲霉基因工程菌的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)构建重组载体pAN7-1-cox-TtrpC

(2)以黑曲霉FG-2为出发菌株，过表达CAT+linker+GOD

3.根据权利要求2所述的一种过表达CAT和GOD的产葡萄糖酸钠的黑曲霉基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述转化为CaCl₂-PEG介导的原生质体转化。

4.权利要求1-3任一项所述的过表达CAT和GOD的产葡萄糖酸钠的黑曲霉基因工程菌在高产葡萄糖酸钠中的应用。