CN111471636B - 表达人表皮生长因子的基因工程菌及其应用 - Google Patents
表达人表皮生长因子的基因工程菌及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111471636B CN111471636B CN202010298593.XA CN202010298593A CN111471636B CN 111471636 B CN111471636 B CN 111471636B CN 202010298593 A CN202010298593 A CN 202010298593A CN 111471636 B CN111471636 B CN 111471636B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- growth factor
- epidermal growth
- human epidermal
- genetically engineered
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 title claims abstract description 106
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 title claims abstract description 88
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 title claims abstract description 87
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 61
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims abstract description 15
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 51
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 47
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 18
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 17
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 17
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 16
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 13
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 13
- 101100159814 Escherichia coli (strain K12) yfbL gene Proteins 0.000 claims description 11
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims description 11
- 101150057158 yddE gene Proteins 0.000 claims description 11
- 101150017329 yjcF gene Proteins 0.000 claims description 11
- 101100181864 Escherichia coli (strain K12) lgoR gene Proteins 0.000 claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 8
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 5
- 108010087558 pectate lyase Proteins 0.000 claims description 5
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 claims description 3
- -1 arpA Proteins 0.000 claims description 3
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims description 2
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 claims description 2
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 claims description 2
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 claims description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 abstract description 53
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 abstract description 53
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 abstract description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 abstract description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 56
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 34
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 27
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 26
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 26
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 26
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 24
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 23
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 23
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 23
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 23
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 23
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 21
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 19
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 19
- 239000012526 feed medium Substances 0.000 description 18
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 17
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 16
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 16
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 16
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 16
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 15
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 15
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 14
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 12
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 8
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 8
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 8
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 8
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 8
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 8
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 8
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 8
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 101100136076 Aspergillus oryzae (strain ATCC 42149 / RIB 40) pel1 gene Proteins 0.000 description 7
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 101150040383 pel2 gene Proteins 0.000 description 7
- 101150050446 pelB gene Proteins 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 6
- 108020005210 Integrons Proteins 0.000 description 5
- 108091008109 Pseudogenes Proteins 0.000 description 5
- 102000057361 Pseudogenes Human genes 0.000 description 5
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 5
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 241001447918 Baoris Species 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 208000002847 Surgical Wound Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 description 2
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 2
- YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]propan-1-one Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)CCC(=O)N1CCN(CC1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 208000028006 Corneal injury Diseases 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 206010056340 Diabetic ulcer Diseases 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000235342 Saccharomycetes Species 0.000 description 1
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 206010064996 Ulcerative keratitis Diseases 0.000 description 1
- 101100398653 Yersinia pestis lamB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003796 beauty Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 201000007717 corneal ulcer Diseases 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 208000000718 duodenal ulcer Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 201000005917 gastric ulcer Diseases 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 101150012518 lamB gene Proteins 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 101150073640 ompF gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种表达人表皮生长因子的基因工程菌及其应用。本发明提供一种表达人表皮生长因子的基因工程菌,所述基因工程菌染色体基因组中整合有人表皮生长因子构建物,所述人表皮生长因子构建物含有人表皮生长因子基因序列及其启动子序列。本发明提供的基因工程菌在发酵生产人表皮生长因子的过程中不需要添加抗生素来维持质粒稳定,避免质粒丢失带来的发酵风险,增加了发酵单位产量,并提高了发酵批间稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种表达人表皮生长因子的基因工程菌及其应用。
背景技术
人表皮生长因子(Human epidermal growth factor,简称hEGF),是由53个氨基酸组成的非糖基化的单链蛋白,有3个分子内二硫键,分子量为6216道尔顿,等电点为4.6,由于分子内含有三对二硫键,因此对酸、碱、热等理化因素较为稳定。
hEGF是人体中重要的细胞因子,具有多种生物功能,可促进外胚层和中胚层细胞如表皮细胞、成纤维细胞、神经细胞的增殖和生长,此外可促进肝细胞再生,可促进胃肠粘膜细胞生长和保护粘膜免受损伤等。
hEGF在临床上主要应用于,促进烧伤、各种外科创伤和手术伤口的愈合;促进外科溃疡的愈合,尤其是糖尿病性溃疡等愈合,用于角膜移植手术,治疗角膜损伤和溃疡,促进胃、十二指肠溃疡愈合。
基础研究表明,hEGF对于皮肤表皮基底层细胞有激活作用,对细胞进行修复和调整,促进皮肤细胞的新陈代谢,促进细胞间质的分泌,并调节细胞中色素的平衡,可以达到抗皱、延缓衰老的作用,因此近年来hEGF也比较多应用于美容行业。
目前hEGF生产多是采用基因工程的方法,所采用的表达系统包括大肠杆菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌。大肠杆菌表达系统由于具有发酵周期短,容易控制等优势被广泛使用,hEGF有三个分子内二硫键,是保证其结构稳定和生物活性的重要因素,因此引导肽链在周质中加工、折叠、形成二硫键是比较好的策略。
大肠杆菌表达系统广泛用于异源蛋白的表达,质粒稳定性是影响发酵产量的重要因素,一般情况下质粒增加了细胞的代谢负担,与含质粒的细胞相比,丢失质粒的空细胞通常具有较高的比生长速率,若空细胞出现在发酵初期,将会成为优势群体。外源基因表达后,由于代谢负担的增加,质粒稳定性迅速降低,丢失质粒的空细胞的出现导致所表达蛋白的产量下降。如中国专利申请号201110235048.7公开的一种采用温度诱导生产重组人表皮生长因子的方法,其是将PL启动子、OmpA信号肽、hEGF基因串联构建分泌表达质粒,将所述分泌表达质粒转化原核生产菌株,从而得到人表皮生长因子。该专利提供的菌株在发酵后期会出现质粒丢失的问题,导致所表达蛋白的产量下降。
发明内容
为此,本发明所解决的技术的问题是:现有技术中,在使用大肠杆菌表达系统时,质粒增加了细胞的代谢负担,与含质粒的细胞相比,丢失质粒的空细胞通常具有较高的比生长速率,若空细胞出现在发酵初期,将会成为优势群体。外源基因表达后,由于代谢负担的增加,质粒稳定性迅速降低,丢失质粒的空细胞的出现导致所表达蛋白的产量下降。
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种稳定分泌表达人表皮生长因子的基因工程菌。
具体来说,本发明提出了如下技术方案。
第一方面,本发明提供一种表达人表皮生长因子的基因工程菌,所述基因工程菌染色体基因组中整合有人表皮生长因子构建物,所述人表皮生长因子构建物含有人表皮生长因子基因序列及其启动子序列。
优选地,宿主细胞的假基因位点中的任一个或两个以上位点含有人表皮生长因子构建物。
优选地,宿主细胞的五个假基因位点含有人表皮生长因子构建物。
优选地,宿主细胞的yjjM、yddE、yfbL、arpA以及yjcF中的任一个或两个以上假基因位点含有人表皮生长因子构建物。
优选地,宿主细胞的yjjM、yddE、yfbL、arpA以及yjcF五个假基因位点含有人表皮生长因子构建物。
优选地,所述人表皮生长因子构建物包括启动子序列、信号肽序列、人表皮生长因子基因序列。
优选地,所述人表皮生长因子构建物包括启动子序列、信号肽序列、人表皮生长因子基因序列和终止子。
优选地,所述启动子选自T7启动子,T7lac启动子,phoA启动子,tac启动子,lac启动子,trp启动子,PL启动子中的一种或两种以上的组合。
优选地,所述信号肽选自PhoA,OmpA,OmpF,LamB,PelB中的一种或两种以上的组合。
优选地,所述终止子为T7终止子。
优选地,所述人表皮生长因子构建物包括T7lac启动子序列、果胶酸裂解酶B信号肽(PelB)序列和人表皮生长因子基因序列。
优选地,所述人表皮生长因子构建物包括T7lac启动子序列、果胶酸裂解酶B信号肽序列、人表皮生长因子基因序列和T7终止子序列。
优选地,所述人表皮生长因子基因序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地,所述人表皮生长因子构建物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地,所述基因工程菌的宿主细胞选自大肠杆菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌中的一种或两种以上的组合,优选地,所述基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌,更优选地,所述基因工程菌的宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。
优选地,所述基因工程菌保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:M 2019579。
优选地,所述基因工程菌表达人表皮生长因子的表达量为460-510mg/L。
第二方面,本发明提供所述基因工程菌的构建方法,所述基因工程菌是采用基因编辑技术和/或同源重组的方式对宿主细胞进行定向改造,使宿主细胞的假基因位点中的任一个或两个以上位点含有所述基因编辑技术和/或同源重组的构建物。
优选地,所述基因工程菌是采用基因编辑技术和/或同源重组的方式对宿主细胞进行定向改造,使宿主细胞的yjjM、yddE、yfbL、arpA以及yjcF中的任一个或两个以上假基因位点含有所述基因编辑技术和/或同源重组的构建物。
优选地,所述的基因编辑技术选自ZFN编辑、TALEN编辑或CRISPR/Cas9编辑中的一种或两种以上的组合,优选地,所述的同源重组选自λ-red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组或整合质粒介导的同源重组。
第三方面,本发明提供所述的基因工程菌在生产人表皮生长因子中的应用。
第四方面,本发明提供一种生产人表皮生长因子的方法,其通过培养本发明提供的基因工程菌进行发酵制备得到。
优选地,培养基因工程菌的培养基包含发酵培养基、第一补料培养基和第二补料培养基。
优选地,所述发酵培养基的成分包含以下成分:蛋白胨0.5-2质量%,酵母粉0.5-1质量%,磷酸氢二钾0.3-0.8质量%,磷酸二氢钾0.1-0.3质量%,硫酸镁0.1-0.3质量%,硫酸铵0.3-0.8质量%,葡萄糖0.5-2质量%,氯化钠0.1-0.3质量%和氯化钙0.01-0.03质量%。
优选的,所述发酵培养基的成分包含以下成分:蛋白胨1-2质量%,酵母粉0.8-1质量%,磷酸氢二钾0.41-0.8质量%,磷酸二氢钾0.16-0.3质量%,硫酸镁0.19-0.3质量%,硫酸铵0.5-0.8质量%,葡萄糖1-2质量%,氯化钠0.12-0.3质量%和氯化钙0.02-0.03质量%。
优选地,所述第一补料培养基包含以下成分:蛋白胨5-15质量%和酵母粉5-15质量%,优选为蛋白胨10-15质量%和酵母粉8-15质量%。
优选地,所述第二补料培养基包含以下成分:葡萄糖40-60质量%,优选为50-60重量%。
优选地,在进行发酵前还包含进行种子培养的步骤,种子培养的条件为30-40℃培养4-8小时;优选的,所述的接种量为0.5-2重量%。
优选地,在种子培养4-8小时进行补料,所述第一补料培养基的流加速度为每升发酵液3-6ml/h,优选为4-6ml/h;所述第二补料培养基的流加速度以维持恒定pH是为7。
优选地,所述发酵的时间15-36小时,优选为24-36小时。
本发明所取得的有益效果是:
本发明提供的基因工程菌在发酵生产人表皮生长因子的过程中不需要添加抗生素来维持质粒稳定,避免质粒丢失带来的发酵风险,增加了发酵单位产量,并提高了发酵批间稳定性。
附图说明
图1是实施例1中pET30ahEGF中NdeI至BamHI的核苷酸序列示意图。
图2是pET30ahEGF质粒示意图。
图3是人表皮生长因子构建物核苷酸序列示意图。
图4是pCASsac质粒示意图。
图5是pTargetF示意图。
图6是转基因大肠杆菌菌落PCR检测电泳图,其中:
图6A是阳性菌株E.coli BL21(DE3)/pCASsac–yjjM菌落PCR验证电泳图,其中:1-以引物TEXT-gef-F和yjjM-TEXT-down-R进行PCR验证;2-以引物YjjM-TEXT-up-F和TEXT-gef-R进行PCR验证;3-Maker。
图6B是阳性菌株E.coli BL21(DE3)/pCASsac-yjjM-yddE菌落PCR验证电泳图,其中,1-以引物yddE-TEXT-up-F和TEXT-gef-R进行PCR验证;2-以引物TEXT-gef-F和yddE-TEXT-down-R进行PCR验证;3-Maker。
图6C是阳性菌株E.coli BL21(DE3)/pCASsac-yjjM-yddE-arpA菌落PCR验证电泳图,其中:1-以引物TEXT-gef-F和arpA-TEXT-down-R进行PCR验证;2-以引物arpA-TEXT-up-F和TEXT-gef-R进行PCR验证;3-Maker。
图6D是阳性菌株E.coli BL21(DE3)/pCASsac-yjjM-yddE-arpA-yjcF菌落PCR验证电泳图,其中,1-以引物yjcF-TEXT-up-F和TEXT-gef-R进行PCR验证;2-以引物TEXT-gef-F和yjcF-TEXT-down-R进行PCR验证;3-Maker。
图6E是阳性菌株E.coli BL21(DE3)/pCASsac-yjjM-yddE-arpA-yjcF-yfbL菌落PCR验证电泳图,其中,1-以引物yfbL-TEXT-up-F和TEXT-gef-R进行PCR验证;2-以引物TEXT-gef-F和yfbL-TEXT-down-R进行PCR验证;3-Maker。
图7是实施例2-1中基因工程菌的发酵曲线示意图。
菌株保藏信息
该大肠杆菌YT-1(Escherichia coli YT-1)于2019年7月24日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:M 2019579,保藏地址:中国.武汉.武汉大学,邮政编码:430072;电话:027-68754052。
具体实施方式
本发明提供了一种基因工程菌,其染色体基因组中整合有人表皮生长因子构建物,所述人表皮生长因子构建物含有人表皮生长因子基因序列及其启动子序列。
在本发明优选的一种具体实施方式中,所述的基因工程菌是以E.coli BL21(DE3)为宿主细胞,利用CRISPR/Cas基因编辑技术和同源重组的方法,将所述的人表皮生长因子构建物分别整合入E.coli BL21(DE3)基因组的五个不同位点得到。
在本发明优选的一种具体实施方式中,所述的五个不同位点为假基因位点,其分别为yjjM、yddE、yfbL、arpA以及yjcF位点。
在本发明优选的一种具体实施方式中,所述基因工程菌为大肠杆菌YT-1(Escherichia coli YT-1),所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:M 2019579。
在本发明优选的一种具体实施方式中,本发明提供了一种表达人表皮生长因子的构建物,其包含T7lac启动子序列、pelB信号肽序列、人表皮生长因子基因序列和终止子序列。
其中,所述pelB信号肽为果胶酸裂解酶B信号肽。
在本发明优选的一种具体实施方式中,其中,所述人表皮生长因子基因序列如SEQID NO.1所示。
在本发明优选的一种具体实施方式中,其中,所述人表皮生长因子构建物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明优选的一种具体实施方式中,其中,所述基因工程菌表达人表皮生长因子的表达量为460-510mg/L。
本发明提供了所述基因工程菌的构建方法,所述构建方法采用基因编辑技术和/或同源重组的方式对宿主细胞进行定向改造,使宿主细胞的假基因位点中的任一个或两个以上位点含有所述基因编辑技术和/或同源重组的构建物。
在本发明优选的一种具体实施方式中,所述构建方法包括如下步骤:
(一)人表皮生长因子构建物的制备;
(二)将人表皮生长因子构建物整合入宿主细胞基因组中。
优选地,所述的构建方法步骤(二)中还包括如下步骤:
(1)sgRNA载体构建;
(2)整合片段构建;
(3)hEGF构建物整合入基因组;
(4)整合子的筛选。
本发明还提供所述基因工程菌在生产人表皮生长因子中的应用。
本发明提供了一种生产人表皮生长因子的方法,其通过培养上述所述的基因工程菌进行发酵制备得到。
其中,培养基因工程菌的培养基包含发酵培养基、第一补料培养基和第二补料培养基。
在本发明优选的一种具体实施方式中,其中,所述发酵培养基的成分包含以下成分:蛋白胨0.5-2质量%,酵母粉0.5-1质量%,磷酸氢二钾0.3-0.8质量%,磷酸二氢钾0.1-0.3质量%、硫酸镁0.1-0.3质量%、硫酸铵0.3-0.8质量%、葡萄糖0.5-2质量%、氯化钠0.1-0.3质量%和氯化钙0.01-0.03质量%。
在本发明优选的一种具体实施方式中,其中,所述发酵培养基的成分包含以下成分:蛋白胨1-2质量%,酵母粉0.8-1质量%,磷酸氢二钾0.41-0.8质量%,磷酸二氢钾0.16-0.3质量%、硫酸镁0.19-0.3质量%、硫酸铵0.5-0.8质量%、葡萄糖1-2质量%、氯化钠0.12-0.3质量%和氯化钙0.02-0.03质量%。
在本发明优选的一种具体实施方式中,其中,所述第一补料培养基包含以下成分:蛋白胨5-15质量%和酵母粉5-15质量%。
在本发明优选的一种具体实施方式中,其中,所述第一补料培养基包含以下成分:蛋白胨10-15质量%和酵母粉8-15质量%。
在本发明优选的一种具体实施方式中,其中,所述第二补料培养基包含以下成分:葡萄糖40-60质量%。
在本发明优选的一种具体实施方式中,其中,所述第二补料培养基包含以下成分:葡萄糖50-60重量%。
在本发明较优选的具体实施方式中,所述发酵培养基包含以下成分:蛋白胨1质量%,酵母粉0.8质量%,磷酸氢二钾0.41质量%,磷酸二氢钾0.16质量%、硫酸镁0.19质量%、硫酸铵0.5质量%、葡萄糖1质量%、氯化钠0.12质量%和氯化钙0.02质量%;所述第一补料培养基包含以下成分:蛋白胨10质量%和酵母粉8质量%;所述第二补料培养基包含以下成分:葡萄糖50质量%。
在本发明优选的一种具体实施方式中,其中,在进行发酵前还包含进行种子培养的步骤,种子培养的条件为30-40℃培养4-8小时;优选的,所述的接种量为0.5-2重量%。
在本发明优选的一种具体实施方式中,其中,在种子培养4-8小时进行补料,所述第一补料培养基的流加速度为每升发酵液3-6ml/h;所述第二补料培养基的流加速度以维持恒定pH为7;优选的,所述发酵的时间为15-36小时,更优选为24-36小时。
在本发明较优选的一种具体实施方式中,其中,将种子按照1重量%接种量接种到发酵罐中,使用氨水和稀盐酸控制pH值7.0,37℃培养约6个小时,溶氧开始上升时补料,其中第一补料培养基的流加速度为每升发酵液4ml/h,第二补料培养基的流加速度以维持恒定pH为准,发酵到24个小时左右停止发酵。
下面对本实施例所用的原料及设备的生产厂家,以及产品分析使用的设备和分析方法进行说明如下,其中所述的化学物质没有标明的均为常规试剂的化学纯级别。实施例所用到的原料的信息如表1所示
表1实施例中所用到的原料的信息
原料信息 | 商品编号 | 生产厂家 |
NdeI | 1161A | 宝日医生物技术(北京)有限公司 |
BamHI | 1010S | 宝日医生物技术(北京)有限公司 |
表达载体pET30a | 默克化工技术(上海)有限公司 | |
pTargetF质粒 | 中国科学院上海分院 | |
DpnI | 1235S | 宝日医生物技术(北京)有限公司 |
pCASsac质粒 | 中国科学院上海分院 | |
E.coli BL21(DE3) | 宝日医生物技术(北京)有限公司 | |
E.coli DH5a | 宝日医生物技术(北京)有限公司 | |
质粒提取试剂盒 | B515109 | 生工生物工程(上海)股份有限公司 |
核酸胶回收试剂盒 | B515103 | 生工生物工程(上海)股份有限公司 |
下述实施例用于说明本发明,而非限制本发明的范围,本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言,在不背离本发明实质和范围的前提下,对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
下述实施例中所使用的材料和试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中涉及的DNA合成和测序工作均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
实施例1基因工程菌的构建
(一)表达人表皮生长因子的构建物的制备
根据pelB、hEGF氨基酸序列和大肠杆菌密码子偏好性优化基因序列,全基因合成该序列,hEGF基因序列如SEQ ID NO.1所示,pelB和hEGF串联基因序列如图1所示,然后将其克隆入载体pET30a的NdeI和BamHI酶切位点,构建表达载体命名为pET30ahEGF,图2所示为pET30ahEGF质粒示意图。其中pelB和hEGF串联基因与载体pET30a中的T7lac启动子,SD序列,T7终止子,LacI(乳糖操纵子阻遏蛋白)基因元件组成hEGF的构建物,hEGF构建物核苷酸序列如图3(SEQ ID NO.2)所示,SD序列为AGGAG。
(二)分别将hEGF构建物整合入E.coli BL21(DE3)基因组中
制备基因工程菌过程中所涉及的所有引物见表2。
表2引物序列表
1.hEGF构建物整合入E.coli BL21(DE3)基因组的yjjM位点
方法如下:
(1)sgRNAyjjM载体构建
sgRNAyjjM的核苷酸序列如SEQ ID NO.51所示,其为TAGCCGATGACGTTCGAGCATGG。
以pTargetF质粒为模板,图5所示为pTargetF质粒示意图,以pTarget-yjjMF(SEQID NO.3)和pTarget-R(SEQ ID NO.4)为引物进行PCR扩增,获得的片段以DpnI进行消化约1h后转E.coli DH5a,涂壮观霉素抗性平板,挑取单菌落接入到LB培养基中,于37℃过夜培养,提取质粒,即可得到sgRNA表达载体,命名为pTarget-yjjM质粒。
(2)整合片段构建
以E.coli BL21(DE3)基因组为模板,以donor-yjjM-upF(SEQ ID NO.5)和donor-yjjM-upR(SEQ ID NO.6)为引物进行扩增,琼脂糖凝胶电泳纯化产物后,胶回收约500bp的条带,得到片段1。
以pET30ahEGF质粒为模板,以donor-yjjM-egfF(SEQ ID NO.7)和donor-yjjM-egfR(SEQ ID NO.8)为引物进行扩增,琼脂糖凝胶电泳纯化产物后,胶回收约2k bp的条带,得到片段2。
以E.coli BL21(DE3)基因组为模板,以donor-yjjM-downF(SEQ ID NO.9)和donor-yjjM-downR(SEQ ID NO.10)为引物进行扩增,琼脂糖凝胶电泳纯化产物后,胶回收约500bp条带,得到片段3。
将上述三个PCR片段进行重叠PCR,以donor-yjjM-upF(SEQ ID NO.5)和donor-yjjM-downR(SEQ ID NO.10)作为引物,反应体系如表3所示。
表3重叠PCR反应体系
去离子水 | To 50μl |
10×Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus) | 5μl |
dNTP Mix(10mM each) | 1μl |
片段1(50ng/μl) | 2μl |
片段2(50ng/μl) | 2μl |
片段3(50ng/μl) | 2μl |
引物1(10μM) | 2μl |
引物2(10μM) | 2μl |
Tag DNA聚合酶 | 0.5μl |
反应程序设置:95℃变性30秒,60℃退火30秒,72℃延伸2分钟,依次进行30个循环,最后进行72℃延伸5分钟。
得到长度约为3kb的yjjM线性化整合片段。
(3)hEGF构建物整合入基因组
首先将pCASsac质粒以电转的方式进入E.coli BL21(DE3)中,图2所示为pCASsac质粒示意图,以卡那霉素抗性筛选;将得到的转化子接试管过夜活化获得的E.coli BL21(DE3)/pCASsac菌株接入含有50ml LB培养基的摇瓶中,并且加入终浓度为10mM的阿拉伯糖进行诱导;待菌液OD600长到0.6-0.8之间,放入冷冻离心机离心收集菌体;以10%的甘油洗涤菌体,再次离心收集菌体;得到的菌体用200μl 10%甘油重悬,得到感受态细胞,分装每支感受态100μl。将提前准备好的yjjM线性化整合片段和pTarget-yjjM质粒电转入感受态中,将电转好的菌液接入到LB培养基中培养,取800μl菌液,涂卡那霉素和壮观霉素平板,置于37℃培养箱中过夜培养。
(4)整合子的筛选:
将上述平板上的菌落分别接种于含有卡那霉素和壮观霉素的平板上,选取在卡那霉素平板上可以生长,在壮观霉素平板上不能生长的菌落进行菌落PCR验证。分别以YjjM-TEXT-up-F(SEQ ID NO.11)、TEXT-gef-R(SEQ ID NO.12)为引物和以TEXT-gef-F(SEQ IDNO.13)、yjjM-TEXT-down-R(SEQ ID NO.14)为引物,以上述在卡那霉素平板上可以生长、在壮观霉素平板上不能生长的菌落为模板进行筛选验证,具体验证方法如下:
挑取单菌落放入有50μl去离子水的离心管中,水浴100℃加热2分钟,离心沉淀取上清作为模板备用。按照表4所示反应体系加入PCR反应管。
表4菌落PCR反应体系
去离子水 | To 50μl |
10×Taq Buffer(Mg2+plus) | 5μl |
dNTP Mix(10mM each) | 1μl |
引物1(10μM) | 2μl |
引物2(10μM) | 2μl |
模板DNA | 2μl |
Tag DNA聚合酶 | 0.5μl |
反应程序设置:95℃变性30秒,60℃退火30秒,72℃延伸1分钟,依次进行30个循环,最后进行72℃延伸5分钟。
验证结果如图6A所示,其中,1泳道是以TEXT-gef-F(SEQ ID NO.13)、yjjM-TEXT-down-R(SEQ ID NO.14)为引物扩增的阳性条带,该条带应为1111bp;2泳道以YjjM-TEXT-up-F(SEQ ID NO.11)、TEXT-gef-R(SEQ ID NO.12)为引物扩增的阳性条带该条带应为1348bp,图6A所示与预期相符。
通过两轮PCR筛选出阳性菌株E.coli BL21(DE3)/pCASsac–yjjM。
2.hEGF构建物整合入yddE位点
方法如下:
(1)sgRNAyddE表达载体构建
选择的sgRNAyddE的核苷酸序列如SEQ ID NO.52所示,其为:AGAGCGTCGATATCCACTTC CGG。
以pTargetF质粒为模板,以pTarget-yddEF(SEQ ID NO.15)和pTarget-R(SEQ IDNO.4)为引物进行扩增,获得的片段以DpnI进行消化约1h后转E.coli DH5a,涂壮观霉素抗性平板,挑取单菌落接入到LB培养基中,于37℃过夜培养,提取质粒,即可得到pTarget-yddE质粒。
(2)整合片段构建
以E.coli BL21(DE3)基因组为模板,以donor-yddE-upF(SEQ ID NO.16)和donor-yddE-upR(SEQ ID NO.17)为引物进行扩增,琼脂糖凝胶电泳纯化产物后,胶回收约500bp条带。
以pET30ahEGF质粒为模板,以donor-yddE-egfF(SEQ ID NO.18)和donor-yddE-egfR(SEQ ID NO.19)为引物进行扩增,琼脂糖凝胶电泳纯化产物后,胶回收约2k的条带。
以E.coli BL21(DE3)基因组为模板,以donor-yddE-downF(SEQ ID NO.20)和donor-yddE-downR(SEQ ID NO.21)为引物进行扩增,琼脂糖凝胶电泳纯化产物后,胶回收约500bp条带。
将上述三个PCR片段进行重叠PCR,以donor-yddE-upF(SEQ ID NO.16)和donor-yddE-downR(SEQ ID NO.21)作为引物,以1(2)中所示的反应体系及反应程序进行反应,得到长度约为3kb的yddE线性化整合片段。
(3)hEGF构建物整合入基因组
将E.coli BL21(DE3)/pCASsac-yjjM划线,接LB试管过夜活化;活化后菌株接入含有50ml LB培养基的摇瓶中,并且加入终浓度为10mM的阿拉伯糖进行诱导;待菌液OD600长到0.6-0.8之间,放入冷冻离心机离心收集菌体;以10%的甘油洗涤菌体,再次离心收集菌体;得到的菌体用200μl 10%甘油重悬,得到感受态细胞,分装每支感受态100μl挑取菌落;将提前准备好的(2)中制备的得到的整合片段和pTargetF-yddE质粒电转入感受态中,将电转好的菌液接入到LB培养基中培养,取800μl菌液,涂卡那霉素和壮观霉素平板,置于37℃培养箱中过夜培养。
(4)整合子的筛选
将上述平板上的菌落分别接种于含有卡那霉素和壮观霉素的平板上,选取在卡那霉素平板上可以生长,在壮观霉素平板上不能生长的菌落进行菌落PCR验证。分别以yddE-TEXT-up-F(SEQ ID NO.22)、TEXT-gef-R(SEQ ID NO.12)为引物和以TEXT-gef-F(SEQ IDNO.13)和yddE-TEXT-down-R(SEQ ID NO.23)为引物,以上述在卡那霉素平板上可以生长、在壮观霉素平板上不能生长的菌落为模板进行筛选验证,具体验证方法如1(4)中所述。
结果如图6B所示,1泳道是以yddE-TEXT-up-F(SEQ ID NO.22)和TEXT-gef-R(SEQID NO.12)为引物,扩增的阳性条带应为1278bp;2泳道是以TEXT-gef-F(SEQ ID NO.13)和yddE-TEXT-down-R(SEQ ID NO.23)为引物,扩增的阳性条带应为1123bp,图6B所示与预期相符。
经过两轮PCR验证得到阳性菌株E.coli BL21(DE3)/pCASsac-yjjM-yddE。
3.hEGF构建物整合入arpA位点
方法如下:
(1)sgRNAarpA表达载体构建
选择的sgRNAarpA的核苷酸序列如SEQ ID NO.53所示,其为:ATTTTATCATTAGTTACATT AGG。
以pTargetF质粒为模板,以pTarget-arpAF(SEQ ID NO.24)和pTarget-R(SEQ IDNO.4)为引物进行扩增,获得的片段以DpnI进行消化约1h后转E.coli DH5a,涂壮观霉素抗性平板,挑取单菌落接入到LB培养基中,于37℃过夜培养,提取质粒,即可得到pTarget-arpA质粒。
(2)整合片段的构建
以E.coli BL21(DE3)基因组为模板,以donor-arpA-upF(SEQ ID NO.25)和donor-arpA-upR(SEQ ID NO.26)为引物进行扩增,琼脂糖凝胶电泳纯化产物后,胶回收约500bp片段。
以pET30ahEGF质粒为模板,以donor-arpA-egfF(SEQ ID NO.27)和donor-arpA-egfR(SEQ ID NO.28)为引物进行扩增,琼脂糖凝胶电泳纯化产物后,胶回收约2k的条带。
以E.coli BL21(DE3)基因组为模板,以donor-arpA-downF(SEQ ID NO.29)和donor-arpA-downR(SEQ ID NO.30)为引物进行扩增,琼脂糖凝胶电泳纯化产物后,胶回收约500bp条带。
将上述三个PCR片段进行重叠PCR,以donor-arpA-upF(SEQ ID NO.25)和donor-arpA-downR(SEQ ID NO.30)作为引物,以1(2)中所示的反应体系及反应程序进行反应,得到长度约为3kb的arpA线性化整合片段。
(3)hEGF构建物整合入基因组
将E.coli BL21(DE3)/pCASsac-yjjM-yddE划线,接LB试管过夜活化;活化后菌株接入摇瓶中(里面有50ml的LB培养基),并且加入终浓度为10mM的阿拉伯糖进行诱导;待菌液OD600长到0.6-0.8之间,放入冷冻离心机离心收集菌体;以10%的甘油洗涤菌体,再次离心收集菌体;得到的菌体用200μl10%甘油重悬,得到感受态细胞,分装每支感受态100μl挑取菌落;将提前准备好的(2)中制备得到的整合片段和pTargetF-arpA质粒电转入感受态中,将电转好的菌液接入到LB培养基中培养,取800μl菌液,涂卡那霉素和壮观霉素平板,置于37℃培养箱中过夜培养。
(4)整合子的筛选:
将上述平板上的菌落分别接种于含有卡那霉素和壮观霉素的平板上,选取在卡那霉素平板上可以生长,在壮观霉素平板上不能生长的菌落进行菌落PCR验证,分别以arpA-TEXT-up-F(SEQ ID NO.31)、TEXT-gef-R(SEQ ID NO.12)为引物和以TEXT-gef-F(SEQ IDNO.13)、arpA-TEXT-down-R(SEQ ID NO.32)为引物,以上述在卡那霉素平板上可以生长,在壮观霉素平板上不能生长的菌落为模板进行筛选验证,具体验证方法如1(4)中所述。
结果如图6C所示,1泳道以TEXT-gef-F(SEQ ID NO.13)和arpA-TEXT-down-R(SEQID NO.32)为引物,扩增的阳性条带应为1140bp;2泳道以arpA-TEXT-up-F(SEQ ID NO.31)和TEXT-gef-R(SEQ ID NO.12)为引物,扩增阳性条带应为1266bp,图6C所示与预期相符。
经过两轮PCR验证得到阳性菌株E.coli BL21(DE3)/pCASsac-yjjM-yddE-arpA。
4.hEGF构建物整合入yjcF位点
方法如下:
(1)sgRNAyjcF表达载体构建
选择的sgRNAyjcF核苷酸序列如SEQ ID NO.54所示,其为:GAAATGGCAATTGCTTAAATTGG。
以pTargetF质粒为模板,以pTarget-yjcFF(SEQ ID NO.33)和pTarget-R(SEQ IDNO.4)为引物进行扩增,获得的片段以DpnI进行消化约1h后转E.coli DH5a,涂壮观霉素抗性平板,挑取单菌落接入到LB培养基中,于37℃过夜培养,提取质粒,即可得到pTarget-yjcF质粒。
(2)整合片段的构建
以E.COLI BL21(DE3)基因组为模板,以donor-yjcF-upF(SEQ ID NO.34)和donor-yjcF-upR(SEQ ID NO.35)为引物进行扩增,琼脂糖凝胶电泳纯化产物后,胶回收约500bp片段。
以pET30ahEGF质粒为模板,以donor-yjcF-egfF(SEQ ID NO.36)和donor-yjcF-egfR(SEQ ID NO.37)为引物进行扩增,琼脂糖凝胶电泳纯化产物后,胶回收约2k的条带。
以E.coli BL21(DE3)基因组为模板,以donor-yjcF-downF(SEQ ID NO.38)和donor-yjcF-downR(SEQ ID NO.39)为引物进行扩增,琼脂糖凝胶电泳纯化产物后,胶回收约500bp条带。
将上述三个PCR片段进行重叠PCR,以donor-yjcF-upF(SEQ ID NO.34)和donor-yjcF-downR(SEQ ID NO.39)作为引物,以1(2)中所示的反应体系及反应程序进行反应,长度约为3kb即为yjcF线性化整合片段。
(3)hEGF构建物整合入基因组
将E.coli BL21(DE3)/pCASsac-yjjM-yddE-arpA划线,接LB试管过夜活化;活化后菌株接入含有50ml的LB培养基的摇瓶中,并且加入终浓度为10mM的阿拉伯糖进行诱导;待菌液OD600长到0.6-0.8之间,放入冷冻离心机离心收集菌体;以10%的甘油洗涤菌体,再次离心收集菌体;得到的菌体用200μl 10%甘油重悬,得到感受态细胞,分装每支感受态100μl挑取菌落;将提前准备好的(2)中制备得到的整合片段和pTargetF-yjcF质粒电转入感受态中,将电转好的菌液接入到LB培养基中培养,取800μl菌液,涂卡那霉素和壮观霉素平板,置于37℃培养箱中过夜培养。
(4)整合子的筛选:
将上述平板上的菌落分别接种于含有卡那霉素和壮观霉素的平板上,选取在卡那霉素平板上可以生长,在壮观霉素平板上不能生长的菌落进行菌落PCR验证,分别以yjcF-TEXT-up-F(SEQ ID NO.40)、TEXT-gef-R(SEQ ID NO.12)为引物和以TEXT-gef-F(SEQ IDNO.13)和yjcF-TEXT-down-R(SEQ ID NO.41)为引物,以上述在卡那霉素平板上可以生长,在壮观霉素平板上不能生长的菌落为模板进行筛选验证,具体验证方法如1(4)中所述。
结果如图6D所示,1泳道以yjcF-TEXT-up-F(SEQ ID NO.40)和TEXT-gef-R(SEQ IDNO.12)为引物,扩增的阳性条带应为1206bp;2泳道以TEXT-gef-F(SEQ ID NO.13)和yjcF-TEXT-down-R(SEQ ID NO.41)为引物,扩增的阳性条带应为:1035bp,图6D所示与预期相符。
经过两轮PCR验证得到阳性菌株命名为E.coli BL21(DE3)/pCASsac-yjjM-yddE-arpA-yjcF。
5.hEGF表达组件整合入yfbL位点的
方法如下:
(1)sgRNAyfbL表达载体构建
选择的sgRNAyfbL的核苷酸序列如SEQ ID NO.55所示,其为:TCTCTGACCACCTGAATTAT TGG。
以pTargetF质粒为模板,以pTarget-yfbLF(SEQ ID NO.42)和pTarget-R(SEQ IDNO.4)为引物进行扩增,获得的片段以DpnI进行消化约1h后转E.coli DH5a,涂壮观霉素抗性平板,挑取单菌落接入到LB培养基中,于37℃过夜培养,提取质粒,即可得到pTarget-yfbL质粒。
(2)整合片段的构建
以E.coli BL21(DE3)基因组为模板,以donor-yfbL-upF(SEQ ID NO.43)和donor-yfbL-upR(SEQ ID NO.44)为引物进行扩增,琼脂糖凝胶电泳纯化产物后,胶回收约500bp条带。
以pET30ahEGF质粒为模板,以donor-yfbL-egfF(SEQ ID NO.45)和donor-yfbL-egfR(SEQ ID NO.46)为引物进行扩增,琼脂糖凝胶电泳纯化产物后,胶回收约2k bp条带。
以E.coli BL21(DE3)基因组为模板,以donor-yfbL-downF(SEQ ID NO.47)和donor-yfbL-downR(SEQ ID NO.48)为引物进行扩增,琼脂糖凝胶电泳纯化产物后,胶回收约500bp条带。
将上述三个PCR片段进行重叠PCR,以donor-yfbL-upF(SEQ ID NO.43)和donor-yfbL-downR(SEQ ID NO.48)作为引物,以1(2)中所示的反应体系及反应程序进行反应,得到长度约为3kb的yfbL线性化整合片段。
(3)hEGF构建物整合入基因组
将E.coli BL21(DE3)/pCASsac-yjjM-yddE-arpA-yjcF划线,接LB试管过夜活化;活化后菌株接入摇瓶中(里面有50ml的LB培养基),并且加入终浓度为10mM的阿拉伯糖进行诱导;待菌液OD600长到0.6-0.8之间,放入冷冻离心机离心收集菌体;以10%的甘油洗涤菌体,再次离心收集菌体;得到的菌体用200μl 10%甘油重悬,得到感受态细胞,分装每支感受态100μl挑取菌落;将提前准备好的(2)中得到的整合片段和pTarget-yfbL质粒电转入感受态中,将电转好的菌液接入到LB培养基中培养,取800μl菌液,涂卡那霉素和壮观霉素平板,置于37℃培养箱中过夜培养。
(4)整合子的筛选:
将上述平板上的菌落分别接种于含有卡那霉素和壮观霉素的平板上,选取在卡那霉素平板上可以生长,在壮观霉素平板上不能生长的菌落进行菌落PCR验证,以yfbL-TEXT-up-F(SEQ ID NO.49)和TEXT-gef-R(SEQ ID NO.12)为引物和以TEXT-gef-F(SEQ IDNO.13)和yfbL-TEXT-down-R(SEQ ID NO.50)为引物,以上述在卡那霉素平板上可以生长,在壮观霉素平板上不能生长的菌落为模板进行筛选验证,具体验证方法如1(4)中所述。
结果如图6E所示,1泳道以yfbL-TEXT-up-F(SEQ ID NO.49)和TEXT-gef-R(SEQ IDNO.12)为引物,扩增阳性条带应为1253bp;2泳道以TEXT-gef-F(SEQ ID NO.13)和yfbL-TEXT-down-R(SEQ ID NO.50)为引物,扩增阳性条带应为1078bp,图6E所示与预期相符。
经过两轮PCR验证得到阳性菌株命名为E.coli BL21(DE3)/pCASsac-yjjM-yddE-arpA-yjcF-yfbL。
6、pCASsac质粒的去除
将E.coli BL21(DE3)/pCASsac-yjjM-yddE-arpA-yjcF-yfbL培养过夜涂布于含有10g/L蔗糖的LB平板,通过蔗糖负筛挑选到去除pCASsac质粒的菌株,此菌株即为基因工程菌,命名为大肠杆菌YT-1。此工程菌不含有质粒,在基因组中包含有五个拷贝的hEGF表达元件,表达元件中有T7lac强启动子、pelB信号肽、hEGF基因、LacI基因。
实施例2-1基因工程菌表达人表皮生长因子的方法
将实施例1所得到的基因工程菌进行发酵,以得到人表皮生长因子。
发酵培养基:蛋白胨1质量%,酵母粉0.8质量%,磷酸氢二钾0.41质量%,磷酸二氢钾0.16质量%、硫酸镁0.19质量%、硫酸铵0.5质量%、葡萄糖1质量%、氯化钠0.12质量%,氯化钙0.02质量%;
第一补料培养基:蛋白胨10质量%,酵母粉8质量%;
第二补料培养基:葡萄糖50质量%。
发酵控制方法:
将基因工程菌以1%体积比的接种量接种50L发酵罐中,其中装液量为30L,使用氨水和稀盐酸控制pH值7.0,37℃培养约6个小时,溶氧开始上升,开始补料,其中第一补料培养基的补料速度为每升发酵液4ml/h,第二补料培养基的补料速度以维持恒定pH为准,发酵24小时,停止发酵,其发酵曲线如图7所示。
利用HPLC方法检测人表皮生长因子表达量,使用的仪器为Agilent 1100HPLC仪,操作温度为30℃,分析柱为安捷伦300SB-C18色谱柱(4.6x150mm),流动相A为0.1%TFA,流动相B为0.1%TFA/CAN,以初始90%A+10%B到100%B梯度洗脱30min,进样量为40μL,检测波长为280nm,流速为0.8ml/min。
从图7可以看出,使用实施例1制备得到的基因工程菌进行发酵,利用HPLC检测人表皮生长因子平均表达量为506mg/L。
实施例2-2基因工程菌表达人表皮生长因子的方法
将实施例1所得到的基因工程菌进行发酵,以得到人表皮生长因子。
发酵培养基:蛋白胨0.5质量%,酵母粉0.5质量%,磷酸氢二钾0.3质量%,磷酸二氢钾0.1质量%、硫酸镁0.1质量%、硫酸铵0.3质量%、葡萄糖0.5质量%、氯化钠0.1质量%和氯化钙0.01质量%;
第一补料培养基:蛋白胨5质量%,酵母粉5质量%;
第二补料培养基:葡萄糖40质量%。
发酵控制方法:
将基因工程菌以0.5%体积比的接种量接种50L发酵罐中,其中装液量为30L,使用氨水和稀盐酸控制pH值7.0,37℃培养约8个小时,溶氧开始上升,开始补料,其中第一补料培养基的补料速度为每升发酵液3ml/h,第二补料培养基的补料速度以维持恒定pH为准,发酵36小时,停止发酵。
利用HPLC方法检测人表皮生长因子表达量,使用的仪器为Agilent 1100HPLC仪,操作温度为30℃,分析柱为安捷伦300SB-C18色谱柱(4.6x150mm),流动相A为0.1%TFA,流动相B为0.1%TFA/CAN,以初始90%A+10%B到100%B梯度洗脱30min,进样量为40μL,检测波长为280nm,流速为0.8ml/min。利用HPLC检测人表皮生长因子平均表达量为465mg/L。
对比例1
与实施例1中(一)相同的方法构建质粒pET30ahEGF,构建的质粒pET30ahEGF转化入E.coli BL21(DE3),经过筛选得到命名为E.coli BL21(DE3)/pET30ahEGF表达菌株。E.coli BL21(DE3)/pET30ahEGF菌株与大肠杆菌YT-1以同样的发酵方式进行发酵,种子培养基和发酵培养基中加入30ug/ml的卡那霉素至终浓度为30ug/ml。
发酵培养基:蛋白胨1质量%,酵母粉0.8质量%,磷酸氢二钾0.41质量%,磷酸二氢钾0.16质量%、硫酸镁0.19质量%、硫酸铵0.5质量%、葡萄糖1质量%、氯化钠0.12质量%,氯化钙0.02质量%,卡那霉素30ug/ml;
第一补料培养基:蛋白胨10质量%,酵母粉8质量%;
第二补料培养基:葡萄糖50质量%。
发酵控制方法:
将基因工程菌以1%体积比的接种量接种50L发酵罐中,其中装液量为30L,使用氨水和稀盐酸控制pH值7.0,37℃培养约6个小时,溶氧开始上升,开始补料,其中第一补料培养基的补料速度为每升发酵液4ml/h,第二补料培养基的补料速度以维持恒定pH为准,发酵24小时,停止发酵。
发酵期间取样进行质粒保存率检测,方法如下,发酵过程中取不同培养时间的含有菌体的发酵液稀释涂布于LB平板上,37℃过夜培养,再挑取一定数目(N1)的单菌落,接种于含有卡那霉素的LB平板上,37℃培养过夜,计算单菌落接种数N1和在抗性平板上的菌落数N2,则N2/N1为质粒保存率。
取样时间 | 2h | 6h | 12h | 18h | 24h |
质粒保存率 | 100% | 96% | 90% | 84% | 75% |
利用HPLC方法检测人表皮生长因子表达量,使用的仪器为Agilent 1100 HPLC仪,操作温度为30℃,分析柱为安捷伦300SB-C18色谱柱(4.6x150mm),流动相A为0.1%TFA,流动相B为0.1%TFA/CAN,以初始90%A+10%B到100%B梯度洗脱30min,进样量为40μL,检测波长为280nm,流速为0.8ml/min。
使用E.coli BL21(DE3)/pET30ahEGF基因工程菌进行发酵,利用HPLC检测人表皮生长因子平均表达量为350mg/L。
综上所述,本发明采用以E.coli BL21(DE3)为出发菌株,利用CRISPR/Cas基因编辑技术和同源重组的方法,把带有T7lac强启动子、pelB信号肽、hEGF基因、LacI基因、终止子等序列串联成的构建物分别整合入E.coli BL21(DE3)基因组的五个不同位点,所得到的基因工程菌表达人表皮生长因子的表达量较高,并且在发酵过程中不需要添加抗生素来维持质粒稳定,避免质粒丢失带来的发酵风险,提高了发酵批间稳定性。
以上所述,仅是本发明实施的较佳实施例,并非对本发明做任何形式上的限制,凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等,均需要包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 旖肽(上海)生物科技有限公司
范梅
<120> 表达人表皮生长因子的基因工程菌及其应用
<160> 55
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 159
<212> DNA
<213> human
<400> 1
aactctgact ctgaatgccc gctgtctcac gacggttact gcctgcacga cggtgtttgc 60
atgtacatcg aagctctgga caaatacgct tgcaactgcg ttgttggtta catcggtgaa 120
cgttgccagt accgtgacct gaaatggtgg gaactgcgt 159
<210> 2
<211> 2077
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaggctctca agggcatcgg tcgagatccc ggtgcctaat gagtgagcta acttacatta 60
attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa 120
tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgccaggg tggtttttct 180
tttcaccagt gagacgggca acagctgatt gcccttcacc gcctggccct gagagagttg 240
cagcaagcgg tccacgctgg tttgccccag caggcgaaaa tcctgtttga tggtggttaa 300
cggcgggata taacatgagc tgtcttcggt atcgtcgtat cccactaccg agatgtccgc 360
accaacgcgc agcccggact cggtaatggc gcgcattgcg cccagcgcca tctgatcgtt 420
ggcaaccagc atcgcagtgg gaacgatgcc ctcattcagc atttgcatgg tttgttgaaa 480
accggacatg gcactccagt cgccttcccg ttccgctatc ggctgaattt gattgcgagt 540
gagatattta tgccagccag ccagacgcag acgcgccgag acagaactta atgggcccgc 600
taacagcgcg atttgctggt gacccaatgc gaccagatgc tccacgccca gtcgcgtacc 660
gtcttcatgg gagaaaataa tactgttgat gggtgtctgg tcagagacat caagaaataa 720
cgccggaaca ttagtgcagg cagcttccac agcaatggca tcctggtcat ccagcggata 780
gttaatgatc agcccactga cgcgttgcgc gagaagattg tgcaccgccg ctttacaggc 840
ttcgacgccg cttcgttcta ccatcgacac caccacgctg gcacccagtt gatcggcgcg 900
agatttaatc gccgcgacaa tttgcgacgg cgcgtgcagg gccagactgg aggtggcaac 960
gccaatcagc aacgactgtt tgcccgccag ttgttgtgcc acgcggttgg gaatgtaatt 1020
cagctccgcc atcgccgctt ccactttttc ccgcgttttc gcagaaacgt ggctggcctg 1080
gttcaccacg cgggaaacgg tctgataaga gacaccggca tactctgcga catcgtataa 1140
cgttactggt ttcacattca ccaccctgaa ttgactctct tccgggcgct atcatgccat 1200
accgcgaaag gttttgcgcc attcgatggt gtccgggatc tcgacgctct cccttatgcg 1260
actcctgcat taggaagcag cccagtagta ggttgaggcc gttgagcacc gccgccgcaa 1320
ggaatggtgc atgcaaggag atggcgccca acagtccccc ggccacgggg cctgccacca 1380
tacccacgcc gaaacaagcg ctcatgagcc cgaagtggcg agcccgatct tccccatcgg 1440
tgatgtcggc gatataggcg ccagcaaccg cacctgtggc gccggtgatg ccggccacga 1500
tgcgtccggc gtagaggatc gagatcgatc tcgatcccgc gaaattaata cgactcacta 1560
taggggaatt gtgagcggat aacaattccc ctctagaaat aattttgttt aactttaaga 1620
aggagatata catatgaaat acctgctgcc gaccgctgct gctggtctgc tgctgctggc 1680
tgctcagccg gctatggcta actctgactc tgaatgcccg ctgtctcacg acggttactg 1740
cctgcacgac ggtgtttgca tgtacatcga agctctggac aaatacgctt gcaactgcgt 1800
tgttggttac atcggtgaac gttgccagta ccgtgacctg aaatggtggg aactgcgtta 1860
ataaggatcc gaattcgagc tccgtcgaca agcttgcggc cgcactcgag caccaccacc 1920
accaccactg agatccggct gctaacaaag cccgaaagga agctgagttg gctgctgcca 1980
ccgctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt 2040
tgctgaaagg aggaactata tccggattgg cgaatgg 2077
<210> 3
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtcctaggta taatactagt tagccgatga cgttcgagca gttttagagc tagaaatag 59
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
actagtatta tacctaggac tgagctagct gtcaaggatc 40
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aattgtttac gtaattgtgc attacg 26
<210> 6
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caacccagtc agctccttcc ggtgggcgtc ggcaatagct ttcgcatgtt ctcg 54
<210> 7
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgagaacatg cgaaagctat tgccgacgcc caccggaagg agctgactgg gttg 54
<210> 8
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcactttctc aacctgcctg atcatgatcg ggcgcgtccc attcgccaat ccgg 54
<210> 9
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccggattggc gaatgggacg cgcccgatca tgatcaggca ggttgagaaa gtgc 54
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttgatgatat ggcgcggggt catatcc 27
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cttcacgaat cgttaaattt gctac 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctgtctcggc gcgtctgcgt ctggc 25
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gttactgttt acccctgtga caaaag 26
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
catcgtagac atgattcggc tctcc 25
<210> 15
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gtcctaggta taatactagt agagcgtcga tatccacttc gttttagagc tagaaatag 59
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
taccgtggat gagttagcgc tggtg 25
<210> 17
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gccttcaacc cagtcagctc cttccggtgg gcgccgctat cagttaacag attggctg 58
<210> 18
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cagccaatct gttaactgat agcggcgccc accggaagga gctgactggg ttgaaggc 58
<210> 19
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cgatattctg ccgggtttgc cgatccaggt cgcgggcgcg tcccattcgc caatccgg 58
<210> 20
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ccggattggc gaatgggacg cgcccgcgac ctggatcggc aaacccggca gaatatcg 58
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tgatagttct ccagtcacag gagaacg 27
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gccgccattt gccggacggc ggcaag 26
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gtcagagatg ctcaacggcg tagcg 25
<210> 24
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gtcctaggta taatactagt attttatcat tagttacatt gttttagagc tagaaatag 59
<210> 25
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
taaatccaaa caggcgtgca tggttag 27
<210> 26
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gccttcaacc cagtcagctc cttccggtgg gcggaatatt aaacactatt ctctgatgg 59
<210> 27
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ccatcagaga atagtgttta atattccgcc caccggaagg agctgactgg gttgaaggc 59
<210> 28
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ggctaagaat aaagaacaca actgaaggat gtacgggcgc gtcccattcg ccaatccgg 59
<210> 29
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ccggattggc gaatgggacg cgcccgtaca tccttcagtt gtgttcttta ttcttagcc 59
<210> 30
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
acacttactc aaaccattgc cccaatattt g 31
<210> 31
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gggttatccg taaagccaaa gctttc 26
<210> 32
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cagacaaatg aacaccaaac cctgag 26
<210> 33
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gtcctaggta taatactagt gaaatggcaa ttgcttaaat gttttagagc tagaaatag 59
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tgctgaactt taccacctgc gcgccacg 28
<210> 35
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gccttcaacc cagtcagctc cttccggtgg gcggatgttt aatatccgtc tctatcgtg 59
<210> 36
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
cacgatagag acggatatta aacatccgcc caccggaagg agctgactgg gttgaaggc 59
<210> 37
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
cgaaatggtt atatgtaccg gctctaatat ggcgggcgcg tcccattcgc caatccgg 58
<210> 38
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ccggattggc gaatgggacg cgcccgccat attagagccg gtacatataa ccatttcg 58
<210> 39
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ttatccaatt cgaattttgc aggttgc 27
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gtcgtcgcgc cgatggacgt aacg 24
<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gtcgccatcc ataataatac tatc 24
<210> 42
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
gtcctaggta taatactagt tctctgacca cctgaattat gttttagagc tagaaatag 59
<210> 43
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
aacactcata actcattata aataatg 27
<210> 44
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gccttcaacc cagtcagctc cttccggtgg gcgccatggg gcattcatag aataaacag 59
<210> 45
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ctgtttattc tatgaatgcc ccatggcgcc caccggaagg agctgactgg gttgaaggc 59
<210> 46
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
cgataaaaag cggtgtcagt aatcattacg gggcgcgtcc cattcgccaa tccgg 55
<210> 47
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
ccggattggc gaatgggacg cgccccgtaa tgattactga caccgctttt tatcg 55
<210> 48
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ttccaggtca atcccaggaa gccatc 26
<210> 49
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ccctcagagt tctgccccct gtcaac 26
<210> 50
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
catatcaagc atgatcgagg caaagag 27
<210> 51
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
tagccgatga cgttcgagca tgg 23
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
agagcgtcga tatccacttc cgg 23
<210> 53
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
attttatcat tagttacatt agg 23
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
gaaatggcaa ttgcttaaat tgg 23
<210> 55
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
tctctgacca cctgaattat tgg 23
Claims (11)
1.一种表达人表皮生长因子的基因工程菌,其特征在于,所述基因工程菌染色体基因组中整合有人表皮生长因子构建物,所述人表皮生长因子构建物含有人表皮生长因子基因序列及其启动子序列;
其中,宿主细胞的yjjM、yddE、yfbL、arpA以及yjcF五个假基因位点含有人表皮生长因子构建物;
所述人表皮生长因子构建物包括T7lac启动子序列、果胶酸裂解酶B信号肽序列和人表皮生长因子基因序列;
所述人表皮生长因子构建物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;
所述基因工程菌的宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌,其特征在于, 所述人表皮生长因子构建物包括T7lac启动子序列、果胶酸裂解酶B信号肽序列、人表皮生长因子基因序列和终止子序列。
3.根据权利要求2所述的基因工程菌,其特征在于,所述人表皮生长因子基因序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求1所述的基因工程菌,其特征在于,所述基因工程菌保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO: M 2019579 。
5.根据权利要求1-4任一项所述的基因工程菌,其特征在于,所述基因工程菌表达人表皮生长因子的表达量为460-510mg/L。
6.权利要求1-5任一项所述基因工程菌的构建方法,其特征在于,所述基因工程菌是采用基因编辑技术对宿主细胞进行定向改造,使宿主细胞的yjjM、yddE、yfbL、arpA以及yjcF中的含有所述基因编辑技术的构建物。
7.权利要求6所述的构建方法,其特征在于,所述基因工程菌是采用同源重组的方式对宿主细胞进行定向改造,使宿主细胞的yjjM、yddE、yfbL、arpA以及yjcF中的含有所述同源重组的构建物。
8.根据权利要求6所述的构建方法,其特征在于,所述的基因编辑技术选自ZFN编辑、TALEN编辑或CRISPR/Cas9编辑中的一种或两种以上的组合。
9.根据权利要求7所述的构建方法,其特征在于,所述的同源重组选自λ-red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组或整合质粒介导的同源重组。
10.权利要求1-5任一项所述基因工程菌在生产人表皮生长因子中的应用。
11.一种生产人表皮生长因子的方法,其通过培养权利要求1-5任一项所述的基因工程菌进行发酵制备得到。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010298593.XA CN111471636B (zh) | 2020-04-16 | 2020-04-16 | 表达人表皮生长因子的基因工程菌及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010298593.XA CN111471636B (zh) | 2020-04-16 | 2020-04-16 | 表达人表皮生长因子的基因工程菌及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111471636A CN111471636A (zh) | 2020-07-31 |
CN111471636B true CN111471636B (zh) | 2023-03-31 |
Family
ID=71753661
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010298593.XA Active CN111471636B (zh) | 2020-04-16 | 2020-04-16 | 表达人表皮生长因子的基因工程菌及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111471636B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112941132B (zh) * | 2021-05-17 | 2021-07-23 | 烟台市华昕生物医药科技有限公司 | 一种利用大肠杆菌表达寡肽-1的方法 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102952817A (zh) * | 2011-08-16 | 2013-03-06 | 上海昊海生物科技股份有限公司 | 一种采用温度诱导生产重组人表皮生长因子的方法 |
JP2014209872A (ja) * | 2013-04-18 | 2014-11-13 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 大腸菌において偽遺伝子を利用してポリペプチド又はrnaを生産する方法 |
CN104293724A (zh) * | 2014-09-22 | 2015-01-21 | 上海工业生物技术研发中心 | 一种高效生产n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌 |
CN108949706A (zh) * | 2018-06-29 | 2018-12-07 | 天津科技大学 | 一种l-脯氨酸-4-羟化酶及其基因工程菌、构建方法与应用 |
CN109266592A (zh) * | 2018-08-23 | 2019-01-25 | 天津科技大学 | 一种l-酪氨酸基因工程菌及其生产l-酪氨酸的方法 |
CN109777763A (zh) * | 2019-03-29 | 2019-05-21 | 天津科技大学 | 一株用于l-茶氨酸生产的基因工程菌及其构建与应用 |
-
2020
- 2020-04-16 CN CN202010298593.XA patent/CN111471636B/zh active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102952817A (zh) * | 2011-08-16 | 2013-03-06 | 上海昊海生物科技股份有限公司 | 一种采用温度诱导生产重组人表皮生长因子的方法 |
JP2014209872A (ja) * | 2013-04-18 | 2014-11-13 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 大腸菌において偽遺伝子を利用してポリペプチド又はrnaを生産する方法 |
CN104293724A (zh) * | 2014-09-22 | 2015-01-21 | 上海工业生物技术研发中心 | 一种高效生产n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌 |
CN108949706A (zh) * | 2018-06-29 | 2018-12-07 | 天津科技大学 | 一种l-脯氨酸-4-羟化酶及其基因工程菌、构建方法与应用 |
CN109266592A (zh) * | 2018-08-23 | 2019-01-25 | 天津科技大学 | 一种l-酪氨酸基因工程菌及其生产l-酪氨酸的方法 |
CN109777763A (zh) * | 2019-03-29 | 2019-05-21 | 天津科技大学 | 一株用于l-茶氨酸生产的基因工程菌及其构建与应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN111471636A (zh) | 2020-07-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7297924B2 (ja) | ゲンチオオリゴ糖の製造における耐熱性β-グルコシダーゼの使用 | |
CN108949706B (zh) | 一种l-脯氨酸-4-羟化酶及其基因工程菌、构建方法与应用 | |
CN111321102B (zh) | 一种生产l-组氨酸的基因工程菌及其应用 | |
CN114874964A (zh) | 一种高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用 | |
CN111471636B (zh) | 表达人表皮生长因子的基因工程菌及其应用 | |
CN109234299B (zh) | 一种表达制备乳二糖磷酸化酶的方法 | |
CN113106112B (zh) | 一种异源表达黄原胶内切酶的基因工程菌及应用 | |
CN111471693B (zh) | 一种产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用 | |
CN113073074A (zh) | 一种高效合成核黄素的基因工程菌及其应用 | |
CN112813012A (zh) | 一种基因工程菌及其制备方法和在生产半胱氨酸中的应用 | |
US20210324391A1 (en) | Recombinant microorganism, preparation method therefor and application thereof in producing coenzyme q10 | |
CN114181288B (zh) | 制备l-缬氨酸的方法及其所用的基因与该基因编码的蛋白质 | |
CN116769808A (zh) | 一种专一生产2′-岩藻糖基乳糖的菌株及应用 | |
CN107236680B (zh) | 一种表达Streptomyces sp.FA1来源木聚糖酶的毕氏酵母重组菌 | |
CN108103049B (zh) | 一种嗜热l-天冬酰胺酶突变体及其筛选和发酵方法 | |
CN111500479B (zh) | 一种非甲醇诱导双启动子毕赤酵母工程菌的构建及其应用 | |
CN116024150A (zh) | 一种生产乙偶姻基因工程菌株及其构建方法与应用 | |
CN114107358B (zh) | 一种增加应激性海藻糖含量的耐热性黑曲霉工程菌的构建方法 | |
CN112779236B (zh) | 一种反式丁烯酸转氨酶工程菌及其高密度发酵方法和应用 | |
CN114672525A (zh) | N-乙酰基-5-甲氧基色胺的生物合成方法及其应用 | |
CN113249234A (zh) | 一种过表达cat和god的产葡萄糖酸钠的黑曲霉基因工程菌的构建方法 | |
CN114349831A (zh) | aspA基因突变体、重组菌及制备L-缬氨酸的方法 | |
CN112575022A (zh) | 一种体外人工脚手架蛋白介导海藻糖多酶复合体的构建方法 | |
CN112646831A (zh) | 一种穿梭质粒及构建方法及其在集胞藻转化外源基因中的应用 | |
CN115011537B (zh) | 一株双厌氧启动子诱导产高光学纯l-乳酸的工程菌及其制备方法与应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |