CN112575022A - 一种体外人工脚手架蛋白介导海藻糖多酶复合体的构建方法 - Google Patents

一种体外人工脚手架蛋白介导海藻糖多酶复合体的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种体外人工脚手架蛋白介导海藻糖多酶复合体的构建方法，主要包括如下步骤：构建自组装脚手架蛋白模块重组菌WB800n‑ScafCCR；构建自组装催化模块重组菌WB800n‑P43‑phoD‑treY‑Ccdoc；构建自组装催化模块重组菌WB800n‑P43‑phoD‑treZ‑Ctdoc；构建自组装催化模块重组菌WB800n‑P43‑phoD‑cgt‑Rfdoc；将所述重组菌分泌表达，在体外进行自组装，获得重组海藻糖多酶复合体；本发明构建的海藻糖多酶复合体催化制备海藻糖的效率要比混合游离酶的催化效率高；可以利用纤维素微球固定化后用于高品质海藻糖的生产。

Description

一种体外人工脚手架蛋白介导海藻糖多酶复合体的构建方法
技术领域
本发明涉及一种体外人工脚手架蛋白介导海藻糖多酶复合体的构建方法，属于生物技术领域。
背景技术
海藻糖是自然界中普遍存在的一种非还原性双糖，由葡萄糖残基通过α-1,1糖苷键连接，是一种极好的天然干燥剂和保鲜剂，是一种新型功能性低聚糖。在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下，能在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。这一独特的功能特性，使得海藻糖可以作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的优良活性保护剂。海藻糖特殊的生物学特性使其在食品、化妆品、医药和农业领域得到广泛应用。
海藻糖制备的方法有菌体提取法、发酵液中提取法、酶转化法等几类，但目前国内外规模化生产海藻糖的首要方法是利用麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)、麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)和葡萄糖基转移酶(CGTase)混合催化淀粉液化液(DE值7-9)来制备海藻糖。MTSase作用于淀粉液化液中直连淀粉或麦芽糊精的还原端，将还原端两个葡萄糖分子间的α-1,4-糖苷键异构成α-1,1-糖苷键，形成一个海藻糖基；然后利用MTHase特异性切割邻近海藻糖基的α-1,4-糖苷键，获得游离海藻糖和少一个海藻糖分子的麦芽寡糖。最后利用CGTase的歧化反应功能，在短链麦芽寡糖间重组，获得较长链的麦芽寡糖，再经MTSase和MTHase催化形成海藻糖，周而复始，不断将直连淀粉或麦芽糊精转化为海藻糖。
纤维小体是自然界中某些厌氧菌产生的一种蛋白质分子自组装体系，是致力于组织、协调多种酶组分协同高效催化降解木质纤维素的胞外蛋白复合体(Gilmore SPal.2015)。纤维小体主要由两部分组成：一部分是含有对接蛋白(dockerin)的多酶亚基，有催化作用；一部分是含多个粘连蛋白(cohesin)的脚手架蛋白，有组装作用。纤维素酶通过dockerin与脚手架蛋白上的cohesin特异性结合，组装成纤维素酶多酶复合体。其中脚手架蛋白上含有1个非催化纤维素结合结构域(CBM)，将多酶复合体结合于底物纤维素上发挥催化作用。通过利用重组的脚手架蛋白介导纤维素酶系来协同降解木质纤维素的方法已经得到了广泛的研究，而且得到的结果其催化效率比混合游离酶的催化效率要高。
中国文献《纤维素酶系在枯草芽孢杆菌中的分泌表达及高效协同作用的研究》(张炜炜,西北农林科技大学，硕士论文，2018年4月)为了探索纤维素酶多酶复合体在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达，利用了纤维小体的结构，分别将含dockersin的纤维素内切酶、纤维素外切酶和木聚糖酶与对应的脚手架蛋白结合，构建了由枯草芽孢杆菌分泌表达的纤维素酶多酶复合体。在现有技术中cohesin-dockerin的特异相互作用大都应用于纤维素的降解上，还没有拓展到非纤维素酶的其他领域。
中国专利文献CN111218467A(申请号：202010106831.2)公开一种同步分泌MTHase和MTSase重组枯草芽孢杆菌构建的方法，是利用多肽对spyCatcher/spyTag为媒介构建同步分泌MTHase和MTSase的重组枯草芽孢杆菌，并未涉及利用人工脚手架蛋白介导的MTHase、MTSase和CGTase三种酶，利用纤维小球固体制得的体外多酶复合体。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种体外人工脚手架蛋白介导海藻糖多酶复合体的构建方法。
本发明利用了纤维小体中粘连蛋白(cohesin)与对接蛋白(dockerin)的特异性相互作用机制。将麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)、麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)和葡萄糖基转移酶(CGTase)的C-端分别与对接蛋白(dockerin)基因融合构建成重组酶，再将含有对应类型的粘连蛋白(cohesin)重组拼接形成脚手架蛋白，通过粘连蛋白(cohesin)与对接蛋白(dockerin)一一对应关系，构建制备海藻糖的多酶复合体。
纤维小体中cohesin与dockerin具有种类和类型特异性相互作用机制，NCBI上已经公布了一些对接蛋白(dockerin)和粘连蛋白(cohesin)的基因序列。GenBankMH049738.1中公布了一个拼接脚手架蛋白基因：热纤维梭菌C.thermocellumde的纤维素结合域(CBM)基因，热纤维梭菌C.thermocellum的粘附域基因(Ctcoh)，解纤维梭菌C.cellulolyticum的粘附域基因(Cccoh)。运用合成生物学技术，构建脚手架蛋白，使人工脚手架体外组装多酶体系成为可能。
体外分泌组装的海藻糖多酶复合体的构建及按照不同的组装方式，形成不同比例不同顺序的可利用纤维小球固定的体外多酶复合体，通过筛选，选取了来源于BacillusCirculans 251菌株的葡萄糖基转移酶(GenBank:X78145.1)，利用CGTase来降低了由于MTSase和MTHase的级联催化后造成的浪费，大大提高利用率及催化效率，降低了生产成本。
本发明技术方案如下：
一种构建表达自组装三酶复合体重组菌种的方法，包括如下步骤：
步骤1、构建自组装脚手架蛋白模块重组菌WB800n-ScafCCR，包括如下步骤：
(1)以枯草芽孢杆菌WB800n基因组为模板，设计引物进行PCR扩增P43启动子的基因片段、phoD信号肽的基因片段；
(2)以生物合成的ScafCCR菌液为模板，设计引物PCR扩增Rfcoh-Ctcoh-CBM-Cccoh基因片段；所述Rfcoh-Ctcoh-CBM-Cccoh基因片段称为脚手架蛋白ScafCCR基因片段；
所述ScafCCR菌液由粘连蛋白Rfcoh、Ctcoh和Cccoh及纤维素结合域CBM的基因序列连接到PUC57质粒上构成；
所述重组脚手架蛋白ScafCCR基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(3)将游离型质粒pHT01经限制性内切酶Scal和BamHI进行双酶切；
(4)将步骤(1)中获得的P43启动子的基因片段、phoD信号肽的基因片段和步骤(2)中脚手架蛋白ScafCCR基因片段及步骤(3)中酶切的pHT01质粒测定浓度，然后利用多片段无缝克隆技术进行连接，转换到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，验证成功后，即可获得pHT01-P43-phoD-ScafCCR质粒，将制得的重组质粒命名为pHT01-ScafCCR；
(5)将步骤(4)中制得的重组质粒pHT01-ScafCCR转化进枯草芽孢杆菌WB800n菌体中，制得重组的枯草芽孢杆菌WB800n，将重组菌命名为WB800n-ScafCCR。
步骤2、构建自组装催化模块重组菌WB800n-P43-phoD-treY-Ccdoc，包括如下步骤：
a以枯草芽孢杆菌WB800n基因组为模板，设计引物进行PCR扩增P43启动子的基因片段、phoD信号肽的基因片段；
b以嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909基因组为模板，PCR扩增麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase基因片段treY；
c以生物合成的Ccdoc菌液为模板，设计引物进行PCR扩增对接蛋白Ccdoc基因片段；
所述Ccdoc菌液由对接蛋白Ccdoc基因序列连接到PUC57质粒上构成；
d将游离型质粒pHT01经限制性内切酶Scal和BamHI进行双酶切；
e将步骤a中获得的P43启动子的基因片段、phoD信号肽的基因片段和步骤b中获得的麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase基因片段treY，步骤c中对接蛋白Ccdoc基因片段及步骤d中酶切的pHT01质粒测定浓度，然后利用多片段无缝克隆技术进行连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，验证成功后，即可获得pHT01-P43-phoD-treY-Ccdoc质粒；
所述P43-phoD-treY-Ccdoc基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
f将步骤e中制得的重组质粒pHT01-P43-phoD-treY-Ccdoc转化进枯草芽孢杆菌WB800n菌体中，制得重组的枯草芽孢杆菌WB800n，将重组菌命名为WB800n-P43-phoD-treY-Ccdoc。
步骤3、构建自组装催化模块重组菌WB800n-P43-phoD-treZ-Ctdoc，包括如下步骤：
Ⅰ以枯草芽孢杆菌WB800n基因组为模板，设计引物进行PCR扩增P43启动子的基因片段；
Ⅱ以按常规技术构建的大肠菌株P43-phoD-MTHase基因组为模板设计引物PCR扩增phoD-麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase基因片段treZ，获得phoD-treZ基因片段；
Ⅲ以生物合成的Ctdoc菌液为模板，设计引物PCR扩增对接蛋白Ctdoc基因片段；
所述Ctdoc菌液由对接蛋白Ctdoc基因序列连接到PUC57质粒上构成；
Ⅳ将游离型质粒pHT01经限制性内切酶Scal和BamHI进行双酶切；
Ⅴ将步骤Ⅰ中获得的P43启动子的基因片段和步骤Ⅱ中获得的phoD-treZ基因片段，步骤Ⅲ中对接蛋白Ctdoc基因片段及步骤Ⅳ中酶切的pHT01质粒测定浓度，然后利用多片段无缝克隆技术进行连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，验证成功后，即可获得pHT01-P43-phoD-treZ-Ctdoc质粒；
所述P43-phoD-treZ-Ctdoc基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
Ⅵ将步骤Ⅴ中制得的重组质粒pHT01-P43-phoD-treZ-Ctdoc转化进枯草芽孢杆菌WB800n菌体中，制得重组的枯草芽孢杆菌WB800n，将重组菌命名为WB800n-P43-phoD-treZ-Ctdoc。
步骤4、构建自组装催化模块重组菌WB800n-P43-phoD-cgt-Rfdoc，包括如下步骤：
①以生物合成的CGTase-Rfdoc菌液为模板，设计引物PCR扩增葡萄糖基转移酶CGTase-对接蛋白Rfdoc基因片段ctg-Rfdoc；
所述CGTase-Rfdoc菌液由葡萄糖基转移酶CGTase与对接蛋白Rfdoc的基因序列连接到PUC57质粒上构成；
②以步骤3中获得的WB800n-P43-phoD-treZ-Ctdoc菌株为模板，设计引物反向PCR扩增pHT01-P43-phoD基因片段；
③将步骤①中获得的ctg-Rfdoc基因片段和步骤②中获得的pHT01-P43-phoD基因片段测定浓度，然后利用单片段无缝克隆技术进行连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，验证成功后，即可获得pHT01-P43-phoD-ctg-Rfdoc质粒；
所述P43-phoD-cgt-Rfdoc基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
④将步骤③中制得的重组质粒pHT01-P43-phoD-ctg-Rfdoc转化进枯草芽孢杆菌WB800n菌体中，制得重组的枯草芽孢杆菌WB800n，将重组菌命名为WB800n-P43-phoD-cgt-Rfdoc。
将上述构建的重组菌WB800n-ScafCCR、WB800n-P43-phoD-treY-Ccdoc、WB800n-P43-phoD-treZ-Ctdoc、WB800n-P43-phoD-cgt-Rfdoc分泌表达，在体外进行自组装，获得重组海藻糖多酶复合体。
根据本发明优选的：所述步骤(1)中启动子P43的基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
P43-F：5’-AGTGAATTCGAGCTCAGCTTCGTGCATGCAGGCCGG-3’SEQ ID NO.6；
P43-R：5’-TCAAAACGACTGTCGTATGCCATAAGCTTCTGTTATTAATTCTTGTCT-3’SEQ IDNO.7。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中分泌信号肽PhoD基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
phoD-F：5’-AATAACAGAAGCTTATGGCATACGACAGTCGTTTTGATGAATG-3’SEQ ID NO.8；
Scaf-phoD-R：5’-GCCTGTTGTTGTCATTACTTCAAAGGCCCCAA-3’SEQ ID NO.9。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中由Rfcoh-Ctcoh-CBM-Cccoh组成的脚手架蛋白ScafCCR基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
ScafCCR-F:5’-GGGGCCTTTGAAGTAATGACAACAACAGGCGGC-3’SEQ ID NO.10；
ScafCCR-R:5’-CGACTCTAGAGGATCCTTAATGATGGTGATGATGATGTTGTGTGC-3’SEQ IDNO.11。
根据本发明优选的，所述步骤(1)或(2)中PCR扩增体系如下：
10μmol/L上游引物2.5μl，10μmol/L下游引物2.5μl，基因模板2.5μl，2×PhantaMax Master Mix 25μl，加ddH2O到50μl；
扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec/kb，30个循环；72℃延伸5min。
所述72℃延伸30sec/kb，是指在72℃时DNA聚合酶扩增速度30sec/kb，由于扩增的基因长度不同，所以扩增30个循环，72℃延伸的时间不同。
根据本发明优选的，步骤(4)中，所述测定浓度是利用超微光分光光度计测定浓度。
根据本发明优选的，所述步骤(5)中质粒整合到枯草芽孢杆菌WB800n菌株的筛选：将转化子涂布于含100ug/mL氯霉素抗性的LB平板，37℃培养12h，用牙签挑取氯霉素抗性的LB平板上的转化子，分别接种到含有100ug/mL氯霉素抗性的LB液体培养基，37℃培养12h，分别以上述菌液为模板进行PCR扩增验证，经过琼脂糖凝胶电泳获得相应的目的条带(见图7)，即得到整合型重组菌株。
根据本发明优选的：所述步骤a中启动子P43的基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
P43-F：5’-AGTGAATTCGAGCTCAGCTTCGTGCATGCAGGCCGG-3’SEQ ID NO.6；
P43-R：5’-TCAAAACGACTGTCGTATGCCATAAGCTTCTGTTATTAATTCTTGTCT-3’SEQ IDNO.7。
根据本发明优选的，所述步骤a中分泌信号肽PhoD基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
phoD-F：5’-AATAACAGAAGCTTATGGCATACGACAGTCGTTTTGATGAATG-3’SEQ ID NO.8；
phoD-R：5’-GGTTGCTGATATCACTACTTCAAAGGCCCCA-3’SEQ ID NO.12。
根据本发明优选的，所述步骤b中麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase基因片段treY的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
Sase-F：5’-GGTTGGGGCCTTTGAAGTAGTGATATCAGCAACCTAC-3’SEQ ID NO.13；
Sase-R：5’-ATCGCCATTAACATCGCCCAGCAGTTTTTCCGGACCCTGGTCCGGCATTCTAACTAGTATCCTA-3’SEQ ID NO.14。
根据本发明优选的，所述步骤c中对接蛋白Ccdoc基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
ccdoc-F：5’-TACTAGTTAGAATGCCGGACCAGGGTCCGGAAAAACTGCTGGGCGATGTTAATGGCGATGAAACAG-3’SEQ ID NO.15；
ccdoc-R：5’-GACTCTAGAGGATCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTGAATGCTCAGCAGTGCTTTTTTC-3’SEQ ID NO.16。
根据本发明优选的，所述步骤a、b或c中PCR扩增体系如下：
10μmol/L上游引物2.5μl，10μmol/L下游引物2.5μl，基因模板2.5μl，2×PhantaMax Master Mix 25μl，加ddH2O到50μl；
扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec/kb，30个循环；72℃延伸5min。
所述72℃延伸30sec/kb，是指在72℃时DNA聚合酶扩增速度30sec/kb，由于扩增的基因长度不同，所以扩增30个循环，72℃延伸的时间不同。
根据本发明优选的，步骤e中，所述测定浓度是利用超微光分光光度计测定浓度。
根据本发明优选的，所述步骤f中的质粒整合到枯草芽孢杆菌WB800n菌株筛选：将转化子涂布于含100ug/mL氯霉素抗性的LB平板，37℃培养12h，用牙签挑取氯霉素抗性的LB平板上的转化子，分别接种到含有100ug/mL氯霉素抗性的LB液体培养基，37℃培养12h，分别以上述菌液为模板进行PCR扩增验证，经过琼脂糖凝胶电泳获得相应的目的条带(见图7)得到整合型重组菌株。
根据本发明优选的，所述步骤Ⅰ中启动子P43的基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
P43-F：5’-AGTGAATTCGAGCTCAGCTTCGTGCATGCAGGCCGG-3’SEQ ID NO.6；
P43-R：5’-TCAAAACGACTGTCGTATGCCATAAGCTTCTGTTATTAATTCTTGTCT-3’SEQ IDNO.7。
根据本发明优选的，所述步骤Ⅱ中基因片段phoD-treZ的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
phoD-Hase-F:5’-GAATTAATAACAGAAGCTTATGGCATACGACAGTCGTTTTGATG-3’SEQ IDNO.17；
phoD-Hase-R:5’-TGCCCGGAACTTTATACGTTTCTAATTGATATACCCCAACACCT-3’SEQ IDNO.18。
根据本发明优选的，所述步骤Ⅲ中Ctdoc基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
ctdoc-F：5’-GTTGGGGTATATCAATTAGAAACGTATAAAGTTCCGGGCACACCGA-3’SEQ IDNO.19；
ctdoc-R：5’-GTCGACTCTAGAGGATCCTTAATGATGATGGTGATGATGATTTTT-3’SEQ IDNO.20。
根据本发明优选的，所述步骤Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ中PCR扩增体系如下：
10μmol/L上游引物2.5μl，10μmol/L下游引物2.5μl，基因模板2.5μl，2×PhantaMax Master Mix 25μl，加ddH2O到50μl；
扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec/kb，30个循环；72℃延伸5min。
所述72℃延伸30sec/kb，是指在72℃时DNA聚合酶扩增速度30sec/kb，由于扩增的基因长度不同，所以扩增30个循环，72℃延伸的时间不同。
根据本发明优选的，步骤Ⅴ中，所述测定浓度是利用超微光分光光度计测定浓度。
根据本发明优选的，所述步骤Ⅵ中质粒整合到枯草芽孢杆菌WB800n菌株筛选：将转化子涂布于含100ug/mL氯霉素抗性的LB平板，37℃培养12h，用牙签挑取氯霉素抗性的LB平板上的转化子，分别接种到含有100ug/mL氯霉素抗性的LB液体培养基，37℃培养12h，分别以上述菌液为模板进行PCR扩增验证，经过琼脂糖凝胶电泳获得相应的目的条带(见图7)得到整合型重组菌株。
根据本发明优选的：所述步骤①中ctg-Rfdoc基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
ctg-rfdoc-F:5’-CGGTTGGGGCCTTTGAAGTAATGGGATCCGGCGACAG-3’SEQ ID NO.21；
ctg-rfdoc-R:5’-TCGACTCTAGAGGATCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTGAGGAA
GTGTGATGAG-3’SEQ ID NO.22。
根据本发明优选的，所述步骤②中pHT01-P43-phoD基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
反向pHT01-P43-phoD-F：5’-GCACCACCACCACCACCACTAAGGATCCTCTAGAGTCGACGT-3’SEQ ID NO.23；
反向pHT01-P43-phoD-R：5’-CGCCGGATCCCATTACTTCAAAGGCCCCAACCGACTGGGCAA-3’SEQ ID NO.24。
根据本发明优选的，所述步骤①或②中PCR扩增体系如下：
10μmol/L上游引物2.5μl，10μmol/L下游引物2.5μl，基因模板2.5μl，2×PhantaMax Master Mix 25μl，加ddH2O到50μl；
扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec/kb，30个循环；72℃延伸5min。
所述72℃延伸30sec/kb，是指在72℃时DNA聚合酶扩增速度30sec/kb，由于扩增的基因长度不同，所以扩增30个循环，72℃延伸的时间不同。
根据本发明优选的，步骤③中，所述测定浓度是利用超微光分光光度计测定浓度。
根据本发明优选的，所述步骤④中质粒整合到枯草芽孢杆菌WB800n菌株筛选：将转化子涂布于含100ug/mL氯霉素抗性的LB平板，37℃培养12h，用牙签挑取氯霉素抗性的LB平板上的转化子，分别接种到含有100ug/mL氯霉素抗性的LB液体培养基，37℃培养12h，分别以上述菌液为模板进行PCR扩增验证，经过琼脂糖凝胶电泳获得相应的目的条带(见图7)得到整合型重组菌株。
上述重组菌种在海藻糖生产中的应用。
根据本发明优选的，所述重组菌种在海藻糖生产中的应用，包括如下步骤：
(i)将上述枯草芽孢杆菌工程菌WB800n-P43-phoD-treY-Ccdoc、WB800n-P43-phoD-treZ-Ctdoc、WB800n-P43-phoD-cgt-Rfdoc、WB800n-ScafCCR分别经活化培养、扩大培养后，在35～38℃发酵40-50h，发酵液作为粗酶液；
(ii)将步骤(i)WB800n-ScafCCR菌株的脚手架蛋白粗酶液利用纤维小球进行回收；
(iii)将步骤(ii)中回收的脚手架蛋白粗酶液与步骤(i)中WB800n-P43-phoD-treY-Ccdoc、WB800n-P43-phoD-treZ-Ctdoc、WB800n-P43-phoD-cgt-Rfdoc菌株的粗酶液在30～70℃、pH4.0～8.0条件下进行混合；
(iv)将步骤(iii)中混合溶液通过过滤来分离纤维小球，并将纤维小球充分洗涤，干燥后回收纤维小球。
(v)将步骤(iv)制得的纤维小球用于催化制备海藻糖。
根据本发明优选的，所述步骤(i)中，活化培养条件为35～38℃、180～220rpm培养12h，活化培养基为液体LB培养基，组份如下：
10g/L蛋白胨，5g/L酵母浸粉，10g/LNaCl，pH 7.0。
根据本发明优选的，所述步骤(i)中，扩大培养条件为35～38℃、180～220rpm培养12h，扩大培养培养基为TB培养基，组份如下：
丙三醇15mL/L，胰蛋白胨12g/L，酵母浸粉24g/L，MgCl22.5 g/L，17mM KH2PO4，72mMK2HPO4。
根据本发明优选的，所述步骤(ii)中纤维小球制备是参考了华南理工大学李冰洁的硕士学位论文《壳聚糖/纤维素复合微球的制备及其吸附性能的研究》，利用离子液体1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐([EMIM]Ac)溶解纤维素，配成3％浓度的溶液，在80℃条件下于恒温锅中完全溶解，溶解过程中保持均匀的磁力搅拌，直至得到透明的液体，然后分别以无水乙醇作为凝固浴，采用挤球法制备复合微球，最后用去离子水清洗3次，得到湿态纤维素小球。
根据本发明优选的，所述步骤(iv)中，真空冷冻干燥条件为冷阱温度-54℃，真空度8Pa下干燥。
人工脚手架体外组装三个酶催化制备海藻糖，通过向pHT01质粒中插入P43启动子基因、phoD信号肽基因以及麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)treY基因/麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)treZ基因/葡萄糖基转移酶(CGTase)cgt基因和对接蛋白(dockerin)ccdoc/ctdoc/rfdoc基因片段，构建重组表达质粒pHT01-P43-phoD-treY-ccdoc，pHT01-P43-phoD-treZ-ctdoc，pHT01-P43-phoD-cgt-rfdoc，在末端加上一个His纯化标签，然后转化枯草芽孢杆菌WB800n中分别表达融合酶MTSase-CcDoc、MTHase-CtDoc和CGTase-RfDoc；通过向pHT01质粒中插入P43启动子基因、phoD信号肽基因以及与对接蛋白ccdoc、ctdoc、rfdoc基因特异性结合的粘连蛋白Cccoh、Ctcoh、Rfcoh基因(带有连接序列)片段，构成重组表达质粒pHT01-scafCCR，5’-端连接一个CBM基因粘连蛋白基因组合，末端加上一个His纯化标签，转化枯草芽孢杆菌WB800n中分泌表达，最后将融合酶与脚手架蛋白在体外进行自组装，获得重组海藻糖多酶复合体。
本发明技术方案的有益效果
1、本发明首次以人工脚手架蛋白来介导三个酶实现海藻糖的制备，其中催化淀粉液化液制备海藻糖的麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)、麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)和葡萄糖基转移酶(CGTase)为催化的关键酶，通过融合表达含有CBM的人工脚手架蛋白来实现介导完成海藻糖多酶复合体的构建，实验发现本发明构建的海藻糖多酶复合体催化制备海藻糖的效率要比混合游离酶的催化效率高，通过调控多酶体系的化学计量比，还可以进一步提高催化效率。
2、本发明所述的人工脚手架蛋白来介导三个酶实现海藻糖的制备可以利用纤维素微球固定化后用于高品质海藻糖的生产。
3、本发明构建的人工脚手架蛋白，在不影响麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)、麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)和葡萄糖基转移酶(CGTase)最初酶活的基础上，改善了三酶的酶学性质，提高了耐温耐酸性，同时还能提高催化制备海藻糖的效率。
附图说明
图1是pHT01-P43-phoD-treY-ccdoc载体构建示意图；
图2是pHT01-P43-phoD-treZ-ctdoc载体构建示意图；
图3是pHT01-P43-phoD-cgt-rfdoc载体构建示意图；
图4是pHT01-scafCCR载体构建示意图；
图5是P43启动子、phoD信号肽基因、脚手架ScafCCR基因、对接蛋白Ctdoc及Ccdoc基因的琼脂糖凝胶电泳图；麦芽寡糖基海藻糖合酶(MTSase)treY基因、麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)phoD-treZ基因、葡萄糖基转移酶(CGTase)ctg-rfdoc基因的琼脂糖凝胶电泳图；
图6是多片段克隆基因P43-phoD-treY-ccdoc、P43-phoD-treZ-ctdoc、P43-phoD-cgt-rfdoc、scafCCR的琼脂糖凝胶电泳图；
图7是WB800n-ScafCCR、WB800n-P43-phoD-treY-Ccdoc、WB800n-P43-phoD-treZ-Ctdoc、WB800n-P43-phoD-cgt-Rfdoc的转化验证电泳图；
图8是人工脚手架蛋白体外组装三个酶的示意图；
图9是纤维小球表面吸附固定海藻糖多酶复合体示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明的保护范围不限于此。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品；实施例中涉及的实验操作，若无特殊说明，均为本领域常规操作。
生物材料来源：
枯草芽孢杆菌WB800N购自杭州宝赛生物有限公司；
游离型质粒pHT01购自优宝生物技术有限公司；
嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909实验室保藏；
Sase2-Ccdoc菌液购自上海生工公司；
按常规技术构建的大肠菌株P43-phoD-MTHase；
Hase2-Ctdoc菌液购自上海生工公司；
CGTase-rfdoc菌液购自上海生工公司；
ScafCCR菌液购自上海生工公司；
大肠杆菌DH5α实验室保存，也可购买市售产品。
实施例1
构建重组菌WB800n-ScafCCR
(1)克隆得到ScafCCR基因片段
以上海生工公司合成的ScafCCR菌液为模板，设计引物PCR扩增Rfcoh-Ctcoh-CBM-Cccoh基因片段：以枯草芽孢杆菌WB800n基因组为模板，设计引物进行PCR扩增P43启动子的基因片段、phoD信号肽的基因片段，凝胶电泳图如图5所示；
所述ScafCCR蛋白基因序列的PCR引物如下：
ScafCCR-F:5’-GGGGCCTTTGAAGTAATGACAACAACAGGCGGC-3’SEQ ID NO.10；
ScafCCR-R:5’-CGACTCTAGAGGATCCTTAATGATGGTGATGATGATGTTGTGTGC-3’SEQ IDNO.11。
PCR反应体系如下：
2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物ScafCCR-F 2.5μL，10μmol/L下游引物ScafCCR-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH2O补足至50μL；
上述PCR反应按照如下程序进行：
95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火1min10s，72℃延伸15s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
PCR结束后通过1％的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短，根据片段大小切下目的条带，使用上海生工胶回收试剂盒回收切胶。
所述P43启动子基因序列的PCR引物如下：
P43-F：5’-AGTGAATTCGAGCTCAGCTTCGTGCATGCAGGCCGG-3’SEQ ID NO.6；
P43-R：5’-TCAAAACGACTGTCGTATGCCATAAGCTTCTGTTATTAATTCTTGTCT-3’SEQ IDNO.7。
所述PCR反应体系如下：
2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物P43-F 2.5μL，10μmol/L下游引物P43-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH2O补足至50μL；
上述PCR反应按照如下程序进行：
95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸15s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
所述phoD信号肽的基因序列的PCR引物如下：
phoD-F：5’-AATAACAGAAGCTTATGGCATACGACAGTCGTTTTGATGAATG-3’SEQ ID NO.8；
Scaf-phoD-R：5’-GCCTGTTGTTGTCATTACTTCAAAGGCCCCAA-3’SEQ ID NO.9。
所述PCR反应体系如下：
2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物phoD-F 2.5μL，10μmol/L下游引物phoD-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH2O补足至50μL；
上述PCR反应按照如下程序进行：
95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火10s，72℃延伸15s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
(2)将游离型质粒pHT01经Scal和BamHI双酶切
所述pHT01质粒酶切体系为：
pHT01质粒16μL；ScaI 1μL；BamHI 1μL；10×buffer 2.5μL；ddH2O 4.5μL；
反应条件：金属浴37℃反应2h。
质粒双酶切后的产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，并使用DNA胶回收试剂盒进行回收。
(3)利用超微光分光光度计(MD2000H)仪器测定：步骤(1)制得的P43启动子基因片段、phoD信号肽基因片段、ScafCCR基因片段和步骤(2)回收的双酶切pHT01质粒分别测定浓度，进行多片段无缝克隆连接，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中；鉴定成功并测序正确后，将制得的重组载体命名为pHT01-ScafCCR。经检测，含有P43启动子基因、phoD信号肽基因和ScafCCR基因的融合基因的载体pHT01-ScafCCR，ScafCCR基因片段的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，载体构建示意图如图4所示；
所述无缝克隆连接体系为：
pHT01质粒160ng；P43120 ng；phoD 120ng；ScafCCR 120ng；Exnase 2μL；5×CEbuffer 4μL；ddH2O补足至20μL。
反应条件：金属浴37℃反应30min。
将无缝克隆连接产物转化导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，验证ScafCCR的琼脂糖凝胶电泳图如图6所示。
(4)枯草芽孢杆菌WB800n电转感受态细胞的制备
挑取新鲜LB固体培养基表面的枯草芽孢杆菌WB800n单菌落于5mL LB培养基中，过夜培养。取1mL过夜培养物接入50mL GM培养基(LB+0.5M山梨醇)中，37℃振荡培养至OD600为1.0。将菌液冰水浴10min，5000rpm，4℃离心8min，收集菌体。用20mL预冷的ETM培养基(0.5M山梨醇+0.5M甘露醇+10％甘油)重悬菌体，5000rpm，4℃离心8min，去上清，如此洗涤3次。将洗涤后的菌体重悬于500μL ETM培养基中，分装与EP管中，每管分装60μL。
(5)将重组质粒pHT01-ScafCCR转入枯草芽孢杆菌WB800n中
将5μL重组质粒pHT01-ScafCCR加入到50μL感受态细胞WB800n中，冰上孵育5min，加入预冷的电转杯(2mm)中，在2500V、5ms条件下进行电转化。电击完毕后，立即在电转杯中加入1mL 37℃预热的RM培养基(LB+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇)，37℃振荡复苏培养3h，涂布于含100ug/ml氯霉素的LB平板上。37℃倒置培养，筛选抗氯霉素的菌株。
(6)阳性重组菌WB800n的培养基鉴定
将上述阳性重组菌落接种到LB液体培养基(含100ug/ml氯霉素)中培养过夜，利用上海生物工程有限公司提供的试剂盒提取基因组DNA，以获得的基因组DNA为模板，以P43-F和ScafCCR-R为引物进行PCR扩增。
所述菌落PCR扩增体系为20μL：
上游引物1μL；下游引物1μL；模板1μL；2×Phanta Max Master Mix 10μL；ddH2O 7μL；
所述菌落PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15s，70℃退火1min10 s，72℃延伸80min，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存；
琼脂糖凝胶电泳证明外源片段P43-phoD-ScafCCR已转入枯草芽孢杆菌WB800n中，如图7所示，将重组菌命名为WB800n-ScafCCR。
实施例2
构建重组菌WB800n-P43-phoD-treY-Ccdoc
(1)克隆得到麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)基因片段treY和Ccdoc基因片段
以枯草芽孢杆菌WB800n基因组为模板，设计引物进行PCR扩增P43启动子的基因片段、phoD信号肽的基因片段，以嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909基因组为模板，PCR扩增麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)treY基因片段，以上海生工公司合成的Sase2-Ccdoc菌液为模板，设计引物进行PCR扩增对接蛋白Ccdoc基因片段，凝胶电泳图如图5所示。
所述P43启动子基因序列的PCR引物如下：
P43-F：5’-AGTGAATTCGAGCTCAGCTTCGTGCATGCAGGCCGG-3’SEQ ID NO.6；
P43-R：5’-TCAAAACGACTGTCGTATGCCATAAGCTTCTGTTATTAATTCTTGTCT-3’SEQ IDNO.7。
所述PCR反应体系如下：
2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物P43-F 2.5μL，10μmol/L下游引物P43-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH2O补足至50μL；
上述PCR反应按照如下程序进行：
95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸15s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
所述phoD信号肽的基因序列的PCR引物如下：
phoD-F：5’-AATAACAGAAGCTTATGGCATACGACAGTCGTTTTGATGAATG-3’SEQ ID NO.8；
phoD-R：5’-GGTTGCTGATATCACTACTTCAAAGGCCCCA-3’；SEQ ID NO.12
所述PCR反应体系如下：
2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物phoD-F 2.5μL，10μmol/L下游引物phoD-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH2O补足至50μL；
上述PCR反应按照如下程序进行：
95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火10s，72℃延伸15s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)treY基因序列的PCR引物如下：
Sase-F：5’-GGTTGGGGCCTTTGAAGTAGTGATATCAGCAACCTAC-3’SEQ ID NO.13
Sase-R：5’-ATCGCCATTAACATCGCCCAGCAGTTTTTCCGGACCCTGGTCCGGCATTCTAACTAGTATCCTA-3’SEQ ID NO.14
所述PCR反应体系如下：
2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物Sase-F 2.5μL，10μmol/L下游引物Sase-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH2O补足至50μL；
上述PCR反应按照如下程序进行：
95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火1min10s，72℃延伸15s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
所述对接蛋白Ccdoc基因序列的PCR引物如下：
ccdoc-F：5’-TACTAGTTAGAATGCCGGACCAGGGTCCGGAAAAACTGCTGGGCGATGTTAATGGCGATGAAACAG-3’SEQ ID NO.15；
ccdoc-R：5’-GACTCTAGAGGATCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTGAATGCTCAGCAGTGCTTTTTTC-3’SEQ ID NO.16；
所述PCR反应体系如下：
2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物ccdoc-无-F 2.5μL，10μmol/L下游引物ccdoc-无-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH2O补足至50μL；
上述PCR反应按照如下程序进行：
95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸15s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
(2)将游离型质粒pHT01经Scal和BamHI双酶切
所述pHT01质粒酶切体系为：
pHT01质粒16μL；ScaI 1μL；BamHI 1μL；10×buffer 2.5μL；ddH2O 4.5μL；
反应条件：金属浴37℃反应2h。
质粒双酶切后的产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，并使用DNA胶回收试剂盒进行回收。
(3)利用超微光分光光度计(MD2000H)仪器测定：步骤(1)制得的P43启动子基因片段、phoD信号肽基因片段、麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)treY基因片段以及对接蛋白Ccdoc基因片段和步骤(2)回收的双酶切pHT01质粒分别测定浓度，进行多片段无缝克隆连接，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中；鉴定成功并测序正确后，将制得的重组载体命名为pHT01-P43-phoD-treY-ccdoc。经检测，含有P43启动子基因、phoD信号肽基因、麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)treY和对接蛋白ccdoc融合基因的载体pHT01-P43-phoD-treY-ccdoc，所述P43-phoD-treY-Ccdoc基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，载体构建示意图如图1所示。
所述无缝克隆连接体系为：
pHT01质粒160ng；P43 120 ng；phoD 120ng；(MTSase)treY 120ng；ccdoc 120ng；Exnase 2μL；5×CE buffer 4μL；ddH2O补足至20μL.
反应条件：金属浴37℃反应30min。
将无缝克隆连接产物转化导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，验证P43-phoD-treY-ccdoc的琼脂糖凝胶电泳图如图6所示。
(4)枯草芽孢杆菌WB800n电转感受态细胞的制备
挑取新鲜LB固体培养基表面的枯草芽孢杆菌WB800n单菌落于5mL LB培养基中，过夜培养。取1mL过夜培养物接入50mL GM培养基(LB+0.5M山梨醇)中，37℃振荡培养至OD600为1.0。将菌液冰水浴10min，5000rpm，4℃离心8min，收集菌体。用20mL预冷的ETM培养基(0.5M山梨醇+0.5M甘露醇+10％甘油)重悬菌体，5000rpm，4℃离心8min，去上清，如此洗涤3次。将洗涤后的菌体重悬于500μL ETM培养基中，分装与EP管中，每管分装60μL。
(5)将重组质粒pHT01-P43-phoD-treY-ccdoc转入枯草芽孢杆菌WB800n中
将5μL重组质粒pHT01-P43-phoD-treY-ccdoc加入到50μL感受态细胞WB800n中，冰上孵育5min，加入预冷的电转杯(2mm)中，在2500V、5ms条件下进行电转化。电击完毕后，立即在电转杯中加入1mL 37℃预热的RM培养基(LB+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇)，37℃振荡复苏培养3h，涂布于含100ug/ml氯霉素的LB平板上，37℃倒置培养，筛选抗氯霉素的菌株。
(6)阳性重组菌WB800n的培养基鉴定
将上述阳性重组菌落接种到LB液体培养基(含100ug/ml氯霉素)中培养过夜，利用上海生物工程有限公司提供的试剂盒提取基因组DNA，以获得的基因组DNA为模板，以P43-F和Ccdoc-R为引物进行PCR扩增。
所述菌落PCR扩增体系为20μL：
上游引物1μL；下游引物1μL；模板1μL；2×Phanta Max Master Mix 10μL；ddH2O 7μL；
所述菌落PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15s，70℃退火1min35 s，72℃延伸80min，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存；
琼脂糖凝胶电泳证明外源片段P43-phoD-treY-ccdoc已转入枯草芽孢杆菌WB800n中，如图7所示，将重组菌命名为WB800n-P43-phoD-treY-Ccdoc。
实施例3
构建重组菌WB800n-P43-phoD-treZ-Ctdoc
(1)克隆得到麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)基因片段treZ和Ctdoc基因片段
以本实验室构建的大肠菌株P43-phoD-MTHase基因组为模板设计引物PCR扩增phoD-麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)treZ的基因序列，以上海生工公司合成Hase2-Ctdoc菌为模板，设计引物PCR扩增对接蛋白Ctdoc基因片段，凝胶电泳图如图5所示；
所述phoD-treZ基因序列的PCR引物如下：
phoD-Hase-F:5’-GAATTAATAACAGAAGCTTATGGCATACGACAGTCGTTTTGATG-3’SEQ IDNO.17；
phoD-Hase-R:5’-TGCCCGGAACTTTATACGTTTCTAATTGATATACCCCAACACCT-3’SEQ IDNO.18。
PCR反应体系如下：
2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物phoD-Hase-F 2.5μL，10μmol/L下游引物phoD-Hase-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH2O补足至50μL；
上述PCR反应按照如下程序进行：
95℃预变性3min；95℃变性15s，70℃退火1min，72℃延伸70s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
PCR结束后通过1％的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短，根据片段大小切下目的条带，使用上海生工胶回收试剂盒回收切胶。
所述对接蛋白Ctdoc基因序列的PCR引物如下：
ctdoc-F：5’-GTTGGGGTATATCAATTAGAAACGTATAAAGTTCCGGGCACACCGA-3’SEQ IDNO.19；
ctdoc-R：5’-GTCGACTCTAGAGGATCCTTAATGATGATGGTGATGATGATTTTT-3’SEQ IDNO.20。
所述PCR反应体系如下：
2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物ctdoc-F 2.5μL，10μmol/L下游引物ctdoc-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH2O补足至50μL；
上述PCR反应按照如下程序进行：
95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸15s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
(2)利用超微光分光光度计(MD2000H)仪器测定：实施例2制得的P43启动子基因片段、步骤(1)制得的phoD-treZ基因片段以及对接蛋白Ctdoc基因片段和实施例2中步骤(2)回收的双酶切pHT01质粒分别测定浓度，进行多片段无缝克隆连接，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中；鉴定成功并测序正确后，将制得的重组载体命名为pHT01-P43-phoD-treZ-ctdoc。经检测，含有P43启动子基因、phoD-treZ和对接蛋白ctdoc融合基因的载体pHT01-P43-phoD-treZ-ctdoc，所述P43-phoD-treZ-Ctdoc基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，载体构建示意图如图2所示。
所述无缝克隆连接体系为：
pHT01质粒160ng；P43 120 ng；phoD-treZ 120ng；ctdoc 120ng；Exnase 2μL；5×CE buffer 4μL；ddH2O补足至20μL。
反应条件：金属浴37℃反应30min。
将无缝克隆连接产物转化导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，验证P43-phoD-treZ-ctdoc的凝胶电泳图如图6所示。
(3)将重组质粒pHT01-P43-phoD-treZ-ctdoc转入感受态枯草芽孢杆菌WB800n中
将5μL重组质粒pHT01-P43-phoD-treY-ccdoc加入到50μL实施例2制得的感受态细胞WB800n中，冰上孵育5min，加入预冷的电转杯(2mm)中，在2500V、5ms条件下进行电转化。电击完毕后，立即在电转杯中加入1mL 37℃预热的RM培养基(LB+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇)，37℃振荡复苏培养3h，涂布于含100ug/ml氯霉素的LB平板上。37℃倒置培养，筛选抗氯霉素的菌株。
(4)阳性重组菌WB800n的培养基鉴定
将上述阳性重组菌落接种到LB液体培养基(含100ug/ml氯霉素)中培养过夜，利用上海生物工程有限公司提供的试剂盒提取基因组DNA，以获得的基因组DNA为模板，以P43-F和Ctdoc-R为引物进行PCR扩增。
所述菌落PCR扩增体系为20μL：
上游引物1μL；下游引物1μL；模板1μL；2×Phanta Max Master Mix 10μL；ddH2O 7μL；
所述菌落PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15s，70℃退火1min20 s，72℃延伸80min，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存；
琼脂糖凝胶电泳证明外源片段P43-phoD-treZ-ctdoc已转入枯草芽孢杆菌WB800n中，如图7所示，将重组菌命名为WB800n-P43-phoD-treZ-Ctdoc。
实施例4
构建重组菌WB800n-P43-phoD-cgt-Rfdoc
(1)克隆得到葡萄糖基转移酶(CGTase)cgt-Rfdoc基因片段
以上海生工公司合成的CGTase-rfdoc菌液为模板，设计引物PCR扩增葡萄糖基转移酶(CGTase)ctg-rfdoc基因片段；以实施例3中获得的WB800n-P43-phoD-treZ-Ctdoc菌株为模板，设计引物反向PCR扩增pHT01-P43-phoD基因片段，ctg-rfdoc基因片段的凝胶电泳图如图5所示；
所述葡萄糖基转移酶(CGTase)ctg-Rfdoc基因片段的PCR引物如下：
ctg-rfdoc-F:5’-CGGTTGGGGCCTTTGAAGTAATGGGATCCGGCGACAG-3’SEQ ID NO.21；
ctg-rfdoc-R:5’-TCGACTCTAGAGGATCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTGAGGAAGTGTGATGAG-3’SEQ ID NO.22。
PCR反应体系如下：
2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物ctg-rfdoc-F 2.5μL，10μmol/L下游引物ctg-rfdoc-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH2O补足至50μL；
上述PCR反应按照如下程序进行：
95℃预变性3min；95℃变性15s，62℃退火15s，72℃延伸80s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
PCR结束后通过1％的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短，根据片段大小切下目的条带，使用上海生工胶回收试剂盒回收切胶。
所述pHT01-P43-phoD基因片段的反向PCR引物如下：
反向pHT01-P43-phoD-F：5’-GCACCACCACCACCACCACTAAGGATCCTCTAGAGTCGACGT-3’SEQ ID NO.23；
反向pHT01-P43-phoD-R：5’-CGCCGGATCCCATTACTTCAAAGGCCCCAACCGACTGGGCAA-3’SEQ ID NO.24。
PCR反应体系如下：
2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物反向pHT01-P43-phoD-F2.5μL，10μmol/L下游引物反向pHT01-P43-phoD-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH2O补足至50μL；
上述PCR反应按照如下程序进行：
95℃预变性3min；95℃变性15s，62℃退火15s，72℃延伸80s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
PCR结束后通过1％的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短，根据片段大小切下目的条带，使用上海生工胶回收试剂盒回收切胶。
(2)利用超微光分光光度计(MD2000H)仪器测定：步骤(1)制得的pHT01-P43-phoD基因片段、ctg-rfdoc基因片段分别测定浓度，进行单片段无缝克隆连接，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中；鉴定成功并测序正确后，将制得的重组载体命名为pHT01-P43-phoD-ctg-rfdoc。经检测，融合基因的载体pHT01-P43-phoD-ctg-rfdoc，所述P43-phoD-cgt-Rfdoc基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，载体构建示意图如图3所示。
所述无缝克隆连接体系为：
pHT01-P43-phoD片段160ng；cgt-rfdoc 120ng；Exnase 2μL；5×CE buffer 4μL；ddH2O补足至20μL。
反应条件：金属浴37℃反应30min。
将无缝克隆连接产物转化导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，验证P43-phoD-ctg-rfdoc的凝胶电泳图如图6所示。
(3)将重组质粒pHT01-P43-phoD-ctg-rfdoc转入感受态枯草芽孢杆菌WB800n中
将5μL重组质粒pHT01-P43-phoD-ctg-rfdoc加入到50μL实施例2制得的感受态细胞WB800n中，冰上孵育5min，加入预冷的电转杯(2mm)中，在2500V、5ms条件下进行电转化。电击完毕后，立即在电转杯中加入1mL 37℃预热的RM培养基(LB+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇)，37℃振荡复苏培养3h，涂布于含100ug/ml氯霉素的LB平板上。37℃倒置培养，筛选抗氯霉素的菌株。
(4)阳性重组菌WB800n的培养基鉴定
将上述阳性重组菌落接种到LB液体培养基(含100ug/ml氯霉素)中培养过夜，利用上海生物工程有限公司提供的试剂盒提取基因组DNA，以获得的基因组DNA为模板，以P43-phoD-F和cgt-rfdoc-R为引物进行PCR扩增。
所述菌落PCR扩增体系为20μL：
上游引物1μL；下游引物1μL；模板1μL；2×Phanta Max Master Mix 10μL；ddH2O 7μL；
所述菌落PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15s，70℃退火1min20 s，72℃延伸80min，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存；
琼脂糖凝胶电泳证明外源片段P43-phoD-ctg-rfdoc已转入枯草芽孢杆菌WB800n中，如图7所示，将重组菌命名为WB800n-P43-phoD-cgt-Rfdoc。
实施例5
阳性重组菌WB800n-ScafCCR、WB800n-P43-phoD-treY-Ccdoc、WB800n-P43-phoD-treZ-Ctdoc、WB800n-P43-phoD-cgt-Rfdoc的发酵
(1)将实施例1-4构建好的4个重组菌WB800n-ScafCCR、WB800n-P43-phoD-treY-Ccdoc、WB800n-P43-phoD-treZ-Ctdoc、WB800n-P43-phoD-cgt-Rfdoc分别接种于LB固体培养基中，37℃恒温培养12h；
(2)将LB固体培养基中重组菌接种于LB液体培养基中，37℃、200r/min恒温摇床培养12h，制得初始种子液；
(3)将步骤(2)制得的种子液按体积百分比1％的比例转接到TB液体培养基中，37℃、200r/min恒温摇床培养10h，制得接种种子液；
(4)将步骤(3)制得的接种种子液按体积百分比10％的比例转接到50L发酵培养基中，在转速500rpm，温度37℃，发酵48h。将发酵液利用陶瓷膜进行过滤，即得去除菌体的发酵液清液。
上述培养基配方为：
LB固体培养基：蛋白胨1g/L，酵母浸粉0.5g/L，NaCl 1g/L，琼脂粉2g/L，余量水；
LB液体培养基：蛋白胨1g/L，酵母浸粉0.5g/L，NaCl 1g/L，余量水，pH 7.0；
TB发酵培养基：胰蛋白胨12g/L，酵母浸粉24g/L，甘油4ml/L，KH2PO4 2.4g/L，K2HPO4 16.5g/L，余量水；
发酵培养基：胰蛋白胨12g/L，酵母浸粉24g/L，蔗糖12g/L，KH2PO4 0.6g/L，K2HPO44g/L，余量水。
实施例6
纤维小球回收脚手架蛋白
利用离子液体1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐([EMIM]Ac)溶解纤维素，配成3％浓度的溶液，在80℃条件下于恒温锅中完全溶解，溶解过程中保持均匀的磁力搅拌，直至得到透明的液体，然后分别以无水乙醇作为凝固浴，采用挤球法制备复合微球。最后用去离子水清洗3次，得到湿态纤维素小球。纤维小球制备是参考了华南理工大学李冰洁的硕士学位论文《壳聚糖/纤维素复合微球的制备及其吸附性能的研究》。
纤维小球通过支架蛋白中的CBM来回收WB800n-ScafCCR菌中的脚手架蛋白。将纤维小球用去离子水清洗后置于WB800n-ScafCCR的纯酶液中，25℃恒温吸附3h，过滤得到湿态的回收支架蛋白。
实施例7
体外组装多酶复合体
将实施例5中的4个阳性重组菌进行分泌表达，将实施例6中回收的支架蛋白与融合酶MTSase-CcDoc、MTHase-CtDoc和CGTase-RfDoc在体外进行混合，即进行脚手架蛋白介导的三酶复合体的体外组装。重组的MTSase-CcDoc、MTHase-CtDoc和CGTase-RfDoc均含有6-His标签，采用Ni-Nat亲和层析柱进行纯化，获得纯酶液。在多酶复合体组装时，调整MTSase-CcDoc、MTHase-CtDoc和CGTase-RfDoc的蛋白体积含量比为1:1:1，反应液中加入CaCl2至终浓度10mM，37℃孵育2h，形成MTSase:MTHase:CGTase＝1:1:1多酶复合体，完成纤维小球多酶复合体的体外组装，脚手架蛋白体外组装三个酶的示意图如图8所示。
实施例8
分离回收海藻糖多酶复合物
利用实施例6回收制备的脚手架蛋白通过实施例7的方式体外组装多酶复合体，过滤并洗涤回收此纤维小球，纤维小球表面吸附固定海藻糖多酶复合体的示意图如图9所示。
对比例1
使用麦芽寡糖基海藻糖合酶(MTSase)、麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)和葡萄糖基转移酶(CGTase)三种酶单纯的混合，同样以P43为启动子、phoD为信号肽构建质粒pHT01-P43-phoD-MTSase、pHT01-P43-phoD-MTHase、pHT01-P43-phoD-CGTase分别转入B.subtilis WB800n菌中，制得阳性重组菌，命名为WB800n-P43-phoD-MTSase、WB800n-P43-phoD-MTHase、WB800n-P43-phoD-CGTase。
采用实施例5的发酵方法对阳性重组菌进行发酵，所述阳性重组菌进行分泌表达，并在体外进行混合，形成游离混合发酵液。
对比例2
设计不同数量的粘连蛋白基因组合，将海藻糖多酶复合体中脚手架蛋白基因序列为Rfcoh-Ctcoh-CBM-Cccoh-Cccoh的质粒pHT01-P43-phoD-Rfcoh-Ctcoh-CBM-Cccoh-Cccoh转入到B.subtilis WB800n菌中，制得阳性重组菌，命名为WB800n-P43-phoD-Scaf-2。
采用实施例5的发酵方法对阳性重组菌进行发酵，所述阳性重组菌进行分泌表达，并进行MTSase-MTHase-CGTase多酶复合体的体外组装，发酵上清液中形成MTSase：MTHase：CGTase＝2:1:1的多酶复合体。
对比例3
将海藻糖多酶复合体中脚手架蛋白基因序列为Rfcoh-Ctcoh-Ctcoh-CBM-Cccoh的质粒pHT01-P43-phoD-Rfcoh-Ctcoh-Ctcoh-CBM-Cccoh转入到B.subtilis WB800n菌中，制得阳性重组菌，命名为WB800n-P43-phoD-Scaf-3。
采用实施例5的发酵方法对阳性重组菌进行发酵，所述阳性重组菌进行分泌表达，并进行MTSase-MTHase-CGTase多酶复合体的体外组装，发酵上清液中形成MTSase：MTHase：CGTase＝1:2:1的多酶复合体。
对比例4
将海藻糖多酶复合体中脚手架蛋白基因序列为Rfcoh-Rfcoh-Ctcoh-CBM-Cccoh的质粒pHT01-P43-phoD-Rfcoh-Rfcoh-Ctcoh-CBM-Cccoh转入到B.subtilis WB800n菌中，制得阳性重组菌，命名为WB800n-P43-phoD-Scaf-4。
采用实施例5的发酵方法对阳性重组菌进行发酵，所述阳性重组菌进行分泌表达，并进行MTSase-MTHase-CGTase多酶复合体的体外组装，发酵上清液中形成MTSase：MTHase：CGTase＝1:1:2的多酶复合体。
对比例5
将海藻糖多酶复合体中脚手架蛋白基因序列为Rfcoh-Rfcoh-Ctcoh-CBM-Cccoh-Cccoh-Cccoh的质粒pHT01-P43-phoD-Rfcoh-Rfcoh-Ctcoh-CBM-Cccoh-Cccoh-Cccoh转入到B.subtilis WB800n菌中，制得阳性重组菌，命名为WB800n-P43-phoD-Scaf-5。
采用实施例5的发酵方法对阳性重组菌进行发酵，所述阳性重组菌进行分泌表达，并进行MTSase-MTHase-CGTase多酶复合体的体外组装，发酵上清液中形成MTSase：MTHase：CGTase＝3:1:2的多酶复合体。
对比例6
设计不同排列顺序的粘连蛋白基因组合，将海藻糖多酶复合体中脚手架蛋白基因序列为Cccoh-Ctcoh-Cccoh-Ctcoh-Cccoh-Ctcoh-CBM-Rfcoh转入到B.subtilis WB800n菌中，制得阳性重组菌，命名为WB800n-P43-phoD-Scaf-6。
采用实施例5的发酵方法对阳性重组菌进行发酵，所述阳性重组菌进行分泌表达，并进行MTSase-MTHase-CGTase多酶复合体的体外组装，发酵上清液中形成MTSase：MTHase：MTSase：MTHase：MTSase：MTHase：CGTase排列顺序的多酶复合体。
对比例7
设计利用与源自不同于Bacillus Circulans 251菌株的葡萄糖基转移酶，采用源自Bacillus lehensis G1菌株的葡萄糖基转移酶基因序列(Genbank：AY770576)，构建P43-phoD-Bsctg-Rfdoc质粒转入枯草芽孢杆菌WB800n中，将重组菌命名为WB800n-P43-phoD-Bsctg-rfdoc；
所述P43-phoD-Bscgt-Rfdoc基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示
采用实施例5的发酵方法对阳性重组菌进行发酵，所述阳性重组菌进行分泌表达，并进行MTSase-MTHase-BsCGTase多酶复合体的体外组装，发酵上清液中形成MTSase：MTHase：CGTase＝1:1:1的多酶复合体。
对比例8
通过将麦芽寡糖基海藻糖合酶(MTSase)、麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)和葡萄糖基转移酶(CGTase)三种酶单纯的混合，测定组合型游离酶的酶学性质，包括最适作用温度、最适pH。
效果例
检测实施例7形成的多酶复合物与对比例1-7形成的多酶复合体的转化率。
检测方法：向实施例7形成的多酶复合物与对比例1-7游离混合发酵液上清液中加入20％的麦芽糊精控制温度55℃、pH 5.5、100rpm/min转速搅拌进行转化，转化8h加入0.1％的α-淀粉酶，55℃处理12h，100℃处理10min，使酶失活，检测反应液(糖化液)中海藻糖的含量。转化率对比见分析表1、分析表2和分析表3。
反应液中海藻糖含量检测方法如下：
通过高效液相色谱测定反应液(糖化液)中所生成的海藻糖的浓度，测定过程中采用氨基柱；柱温为40℃；流动相采用乙腈与水的混合溶液，二者体积比为3:1；流速为1mL/min；检测器为示差检测器；检测时间为20min。
Figure BDA0002857966780000231
分析表1
Figure BDA0002857966780000232
分析表2
实验组 MTSase：MTHase：CGTase比例 海藻糖的转化率％
实施例7 1:1:1 62.4％
对比例2 2:1:1 68.3％
对比例3 1:2:1 62.8％
对比例4 1:1:2 67.2％
对比例5 3:1:2 78.3％
分析表3
Figure BDA0002857966780000233
Figure BDA0002857966780000241
分析表4
实验组 最适pH值 最适温度
实施例7 5.5 65℃
对比例8 6.0 60℃
结果分析
通过实施例7和对比例1的海藻糖转化率结果可以看出，脚手架介导的三酶复合体比三个酶的混合游离酶转化率显著提高，实施例7即本发明涉及的阳性重组菌发酵上清液，形成MTSase:MTHase:CGTase＝1:1:1的多酶复合体转化率最高为62.4％，说明采用这种脚手架可以提高MTSase、MTHase和CGTase三个酶的利用率，达到更好的催化效果，降低成本。
通过实施例7和对比例2和4的海藻糖转化率结果可以看出随着MTSase/CGTase比例的增加，转化率逐渐有所提高，实施例7即本发明涉及的阳性重组菌发酵上清液，形成MTSase:MTHase:CGTase＝1:1:1的多酶复合体转化率最高为62.4％，但是当MTSase:MTHase:CGTase＝2:1:1和MTSase:MTHase:CGTase＝1:1:2时的转化率提高为68.3％和67.2％。
对比例3中的MTHase酶量的增加并没有明显的提高，与实施例7中的转化率仅差0.4％。通过对比例6运用了不同顺序的MTSase:MTHase:CGTase的转化率为74.2％，比对比例5的转化率略微的降低了，是由于多个酶之间的空间结构影响与底物的结合能力造成的。由实施例7和对比例2、4的转化率结果可以看出，MTSase和CGTase的酶添加量决定了转化率的大小，是多酶复合物转化生产海藻糖过程中的限制性因素。由实施例7和对比例7的转化率结果可以看出，不同来源的葡萄糖基转移酶会对海藻糖的转化率产生一定的影响，选择的CGTase应该与MTSase和MTHase的反应温度和pH相匹配，通过实施例7和对比例8的结果看出，当连接到脚手架之后MTSase、MTHase和CGTase的多酶复合物耐温耐酸性能有所提高，最适温度65℃，最适pH＝5.5条件下能较好的进行催化反应。
MTSase的比例决定了转化率的大小，是多酶复合物转化生产海藻糖过程中的限制性因素。本发明以脚手架蛋白为支架，将多酶联级反应过程中的MTSase、MTHase和CGTase通过cohesin-dockerin特异相互作用结合在一起，形成具有底物通道效应的MTSase-MTHase-CGTase多酶复合体，提高级联酶催化的效率，克服多酶联级反应效率较低的问题，为工业化生产海藻糖提供了一种新的途径。同时cohesin-dockerin特异相互作用是脚手架介导多酶复合物生产海藻糖主要限制性因素，因此通过对催化模块中dockerin间linker或脚手架蛋白中cohesin间linker进行改造提高催化淀粉液化液来生产海藻糖的效率是解决生产瓶颈的关键技术。
SEQUENCE LISTING
<110> 齐鲁工业大学
<120> 一种体外人工脚手架蛋白介导海藻糖多酶复合体的构建方法
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2834
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agcttcgtgc atgcaggccg gggcatatgg gaaacagcgc ggacgcagcg gaatttccaa 60
tttcatgccg cagccgcctg cgctgttctc atttgcggct tccttgtaga gctcagcatt 120
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ttataggtaa gagaggaatg tacacatgaa cagacaagaa ttaataacag aagcttatgg 480
catacgacag tcgttttgat gaatgggtac agaaactgaa agaggaaagc tttcaaaaca 540
atacgtttga ccgccgcaaa tttattcaag gagcggggaa gattgcagga ctttctcttg 600
gattaacgat tgcccagtcg gttggggcct ttgaagtaat gacaacaaca ggcggccaga 660
caagcaatgc ggattttaaa tttagctttg ttgatgataa aggccaaagc acagtcaacg 720
caaaagcagg cgatgaaatt acagtttgtg tgcaggtaga tgcaggaaat aatacatgcg 780
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caagcacagg cacagatggc gaaccgatga aagttagcaa tggcaaagat gcgtttacgt 960
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cagctacacc gacaagacca agcgtgccga cgaacacacc tacaaacaca atggtgccgt 1260
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aaatgatcaa caaaacctct ttcaccacaa tggcggaaca gatttctctt catatgaaga 1500
tagcatttac agaaacttat atgatctggc agactatgat ttaaacaaca cagtcatgga 1560
tcaatattta aaagagtcga ttaagttctg gttagataaa gggattgatg gcattcgagt 1620
agatgccgtt aagcatatgt cagaagggtg gcaaacctct ttaatgagcg aaatctattc 1680
gcataaacct gttttcacat ttggagaatg gtttttagga tcaggagaag ttgatcccca 1740
aaatcatcac ttcgctaatg aaagtggtat gagtttatta gatttccaat tcggtcaaac 1800
cattcgtaac gtcttaaaag atcgcacaag caactggtat gattttaatg aaatgattac 1860
cagtacagaa aaagagtata acgaggtcat tgatcaagta acctttattg ataatcacga 1920
catgagtcgt ttttcggtag gatcatcttc aaaccgtcag acagatatgg ccctagctgt 1980
cttgcttact tctcgtggtg taccaacgat ttactacggg acagagcagt atgtaacagg 2040
tggcaacgac cctgaaaatc gcaaaccatt gaaaacattt gatcggtcta ccaactccta 2100
tcaaatcatc agtaaacttg cttcactacg ccaaacaaat tccgccttag gctatggcac 2160
tacaactgaa cgttggctga acgaagacat ttatatttat gaaagaacgt ttggcaatag 2220
tattgtatta actgctgtaa atagcagtaa tagtaaccag acgatcacta atttaaacac 2280
ctctttacct caagggaact atacagatga actacagcaa cgtttagatg gaaacacgat 2340
tactgttaac gccaatggag ccgtaaattc ctttcaatta cgagcaaata gcgtagcggt 2400
ttggcaagta agcaacccct ctacgtctcc tctaatcggc caagtgggtc ctatgatggg 2460
taagtccggg aataccataa cagtaagcgg tgaaggattt ggtgatgaga gaggaagcgt 2520
tctctttgat tcaacctctt ctgaaattat ttcttggtca aatacagaaa taagcgtaaa 2580
ggtgcctaat gtagcaggcg gttattatga tctatccgtc gtaactgcag caaacttaaa 2640
aagccctact tacaaagagt ttgaagtatt gtcaggcaat caagtcagtg tccgctttgg 2700
tgttaacaat gccacaacga gcccaggaac caatttatat atcgttggga atgtgagcga 2760
gctggggaat tgggatgctg ataaagcaat tggacctatg tttaaccaag tgatgtacca 2820
atacccaaca tggtactatg atattagcgt tcctgccgga aaaaaccttg aatacaaata 2880
cattaaaaaa gatcagaacg gtaacgttgt ctggcaaagt ggcaacaatc gaacctatac 2940
gtcgcctact accggaacag atacggttat gattaattgg taacgaaaga gtagatacaa 3000
ccccattttc aattgtagaa aatggggttg attgatagag aaaatcctat aatactttcc 3060
tttctaatca aaccatttta ttgagttgcg tagatgttga taaatagttc attttgccaa 3120
aaccaattga aggaaaataa tagtacgtta caataataag tagcaattag agactctcat 3180
aaaagaggct gggacataac gaaaagtagt atttgaaaag acgaatagtc taaaatatgc 3240
tgagtagcac cgctacagga gaatccttcg ctttccaggg acacggcctc agcctcctcc 3300
gtggaaaacc gccacttcag agtcttcaga cacgtgctga tccccggacc agggtccgga 3360
aaaactgctg actgtaacaa ctcctcagcc cggcacaaag ctcgttccta catggggcga 3420
tacaaactgc gacggcgttg taaatgttgc tgacgtagta gttcttaaca gattcctcaa 3480
cgatcctaca tattctaaca ttactgatca gggtaaggtt aacgcagacg ttgttgatcc 3540
tcaggataag tccggcgcag cagttgatcc tgcaggcgta aagctcacag tagctgactc 3600
tgaggcaatc ctcaaggcta tcgttgaact catcacactt cctcagcacc accaccacca 3660
ccactaa 3667
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
agtgaattcg agctcagctt cgtgcatgca ggccgg 36
<210> 7
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tcaaaacgac tgtcgtatgc cataagcttc tgttattaat tcttgtct 48
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aataacagaa gcttatggca tacgacagtc gttttgatga atg 43
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gcctgttgtt gtcattactt caaaggcccc aa 32
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggggcctttg aagtaatgac aacaacaggc ggc 33
<210> 11
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cgactctaga ggatccttaa tgatggtgat gatgatgttg tgtgc 45
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ggttgctgat atcactactt caaaggcccc a 31
<210> 13
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ggttggggcc tttgaagtag tgatatcagc aacctac 37
<210> 14
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
atcgccatta acatcgccca gcagtttttc cggaccctgg tccggcattc taactagtat 60
ccta 64
<210> 15
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tactagttag aatgccggac cagggtccgg aaaaactgct gggcgatgtt aatggcgatg 60
aaacag 66
<210> 16
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gactctagag gatccttagt ggtggtggtg gtggtgttga atgctcagca gtgctttttt 60
c 61
<210> 17
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gaattaataa cagaagctta tggcatacga cagtcgtttt gatg 44
<210> 18
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tgcccggaac tttatacgtt tctaattgat ataccccaac acct 44
<210> 19
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gttggggtat atcaattaga aacgtataaa gttccgggca caccga 46
<210> 20
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gtcgactcta gaggatcctt aatgatgatg gtgatgatga ttttt 45
<210> 21
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cggttggggc ctttgaagta atgggatccg gcgacag 37
<210> 22
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
tcgactctag aggatcctta gtggtggtgg tggtggtgct gaggaagtgt gatgag 56
<210> 23
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gcaccaccac caccaccact aaggatcctc tagagtcgac gt 42
<210> 24
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
cgccggatcc cattacttca aaggccccaa ccgactgggc aa 42

Claims (10)

1.一种构建表达自组装三酶复合体重组菌种的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、构建自组装脚手架蛋白模块重组菌WB800n-ScafCCR，包括如下步骤：
(1)以枯草芽孢杆菌WB800n基因组为模板，设计引物进行PCR扩增P43启动子的基因片段、phoD信号肽的基因片段；
(2)以生物合成的ScafCCR菌液为模板，设计引物PCR扩增Rfcoh-Ctcoh-CBM-Cccoh基因片段；所述Rfcoh-Ctcoh-CBM-Cccoh基因片段称为脚手架蛋白ScafCCR基因片段；
所述ScafCCR菌液由粘连蛋白Rfcoh、Ctcoh和Cccoh及纤维素结合域CBM的基因序列连接到PUC57质粒上构成；
所述重组脚手架蛋白ScafCCR基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(3)将游离型质粒pHT01经限制性内切酶Scal和BamHI进行双酶切；
(4)将步骤(1)中获得的P43启动子的基因片段、phoD信号肽的基因片段和步骤(2)中脚手架蛋白ScafCCR基因片段及步骤(3)中酶切的pHT01质粒测定浓度，然后利用多片段无缝克隆技术进行连接，转换到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，验证成功后，即可获得pHT01-P43-phoD-ScafCCR质粒，将制得的重组质粒命名为pHT01-ScafCCR；
(5)将步骤(4)中制得的重组质粒pHT01-ScafCCR转化进枯草芽孢杆菌WB800n菌体中，制得重组的枯草芽孢杆菌WB800n，将重组菌命名为WB800n-ScafCCR；
步骤2、构建自组装催化模块重组菌WB800n-P43-phoD-treY-Ccdoc，包括如下步骤：
a以枯草芽孢杆菌WB800n基因组为模板，设计引物进行PCR扩增P43启动子的基因片段、phoD信号肽的基因片段；
b以嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909基因组为模板，PCR扩增麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase基因片段treY；
c以生物合成的Ccdoc菌液为模板，设计引物进行PCR扩增对接蛋白Ccdoc基因片段；
所述Ccdoc菌液由对接蛋白Ccdoc基因序列连接到PUC57质粒上构成；
d将游离型质粒pHT01经限制性内切酶Scal和BamHI进行双酶切；
e将步骤a中获得的P43启动子的基因片段、phoD信号肽的基因片段和步骤b中获得的麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase基因片段treY，步骤c中对接蛋白Ccdoc基因片段及步骤d中酶切的pHT01质粒测定浓度，然后利用多片段无缝克隆技术进行连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，验证成功后，即可获得pHT01-P43-phoD-treY-Ccdoc质粒；
所述P43-phoD-treY-Ccdoc基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
f将步骤e中制得的重组质粒pHT01-P43-phoD-treY-Ccdoc转化进枯草芽孢杆菌WB800n菌体中，制得重组的枯草芽孢杆菌WB800n，将重组菌命名为WB800n-P43-phoD-treY-Ccdoc；
步骤3、构建自组装催化模块重组菌WB800n-P43-phoD-treZ-Ctdoc，包括如下步骤：
Ⅰ以枯草芽孢杆菌WB800n基因组为模板，设计引物进行PCR扩增P43启动子的基因片段；
Ⅱ以按常规技术构建的大肠菌株P43-phoD-MTHase基因组为模板设计引物PCR扩增phoD-麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase基因片段treZ，获得phoD-treZ基因片段；
Ⅲ以生物合成的Ctdoc菌液为模板，设计引物PCR扩增对接蛋白Ctdoc基因片段；
所述Ctdoc菌液由对接蛋白Ctdoc基因序列连接到PUC57质粒上构成；
Ⅳ将游离型质粒pHT01经限制性内切酶Scal和BamHI进行双酶切；
Ⅴ将步骤Ⅰ中获得的P43启动子的基因片段和步骤Ⅱ中获得的phoD-treZ基因片段，步骤Ⅲ中对接蛋白Ctdoc基因片段及步骤Ⅳ中酶切的pHT01质粒测定浓度，然后利用多片段无缝克隆技术进行连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，验证成功后，即可获得pHT01-P43-phoD-treZ-Ctdoc质粒；
所述P43-phoD-treZ-Ctdoc基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
Ⅵ将步骤Ⅴ中制得的重组质粒pHT01-P43-phoD-treZ-Ctdoc转化进枯草芽孢杆菌WB800n菌体中，制得重组的枯草芽孢杆菌WB800n，将重组菌命名为WB800n-P43-phoD-treZ-Ctdoc；
步骤4、构建自组装催化模块重组菌WB800n-P43-phoD-cgt-Rfdoc，包括如下步骤：
①以生物合成的CGTase-Rfdoc菌液为模板，设计引物PCR扩增葡萄糖基转移酶CGTase-对接蛋白Rfdoc基因片段ctg-Rfdoc；
所述CGTase-Rfdoc菌液由葡萄糖基转移酶CGTase与对接蛋白Rfdoc的基因序列连接到PUC57质粒上构成；
②以步骤3中获得的WB800n-P43-phoD-treZ-Ctdoc菌株为模板，设计引物反向PCR扩增pHT01-P43-phoD基因片段；
③将步骤①中获得的ctg-Rfdoc基因片段和步骤②中获得的pHT01-P43-phoD基因片段测定浓度，然后利用单片段无缝克隆技术进行连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，验证成功后，即可获得pHT01-P43-phoD-ctg-Rfdoc质粒；
所述P43-phoD-cgt-Rfdoc基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
④将步骤③中制得的重组质粒pHT01-P43-phoD-ctg-Rfdoc转化进枯草芽孢杆菌WB800n菌体中，制得重组的枯草芽孢杆菌WB800n，将重组菌命名为WB800n-P43-phoD-cgt-Rfdoc；
将上述构建的重组菌WB800n-ScafCCR、WB800n-P43-phoD-treY-Ccdoc、WB800n-P43-phoD-treZ-Ctdoc、WB800n-P43-phoD-cgt-Rfdoc分泌表达，在体外进行自组装，获得重组海藻糖多酶复合体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中启动子P43的基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列为P43-F和P43-R，分别为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7；
优选的，所述步骤(1)中分泌信号肽PhoD基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列为phoD-F和Scaf-phoD-R，分别为SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9；
优选的，所述步骤(2)中由Rfcoh-Ctcoh-CBM-Cccoh组成的脚手架蛋白ScafCCR基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列为ScafCCR-F和ScafCCR-R，分别为SEQ ID NO.10和SEQ IDNO.11；
优选的，所述步骤(1)或(2)中PCR扩增体系如下：
10μmol/L上游引物2.5μl，10μmol/L下游引物2.5μl，基因模板2.5μl，2×PhantaMaxMaster Mix 25μl，加ddH2O到50μl；
扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec/kb，30个循环；72℃延伸5min；
优选的，步骤(4)中，所述测定浓度是利用超微光分光光度计测定浓度；
优选的，所述步骤(5)中质粒整合到枯草芽孢杆菌WB800n菌株的筛选：将转化子涂布于含100ug/mL氯霉素抗性的LB平板，37℃培养12h，用牙签挑取氯霉素抗性的LB平板上的转化子，分别接种到含有100ug/mL氯霉素抗性的LB液体培养基，37℃培养12h，分别以上述菌液为模板进行PCR扩增验证，经过琼脂糖凝胶电泳获得相应的目的条带，即得到整合型重组菌株。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a中启动子P43的基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列为P43-F和P43-R，分别为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7；
优选的，所述步骤a中分泌信号肽PhoD基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列为phoD-F和phoD-R，分别为SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.12；
优选的，所述步骤b中麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase基因片段treY的PCR扩增引物核苷酸序列为Sase-F和Sase-R，分别为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；
优选的，所述步骤c中对接蛋白Ccdoc基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列为ccdoc-F和ccdoc-R，分别为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；
优选的，所述步骤a、b或c中PCR扩增体系如下：
10μmol/L上游引物2.5μl，10μmol/L下游引物2.5μl，基因模板2.5μl，2×PhantaMaxMaster Mix 25μl，加ddH2O到50μl；
扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec/kb，30个循环；72℃延伸5min；
优选的，步骤e中，所述测定浓度是利用超微光分光光度计测定浓度；
优选的，所述步骤f中的质粒整合到枯草芽孢杆菌WB800n菌株筛选：将转化子涂布于含100ug/mL氯霉素抗性的LB平板，37℃培养12h，用牙签挑取氯霉素抗性的LB平板上的转化子，分别接种到含有100ug/mL氯霉素抗性的LB液体培养基，37℃培养12h，分别以上述菌液为模板进行PCR扩增验证，经过琼脂糖凝胶电泳获得相应的目的条带得到整合型重组菌株。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤Ⅰ中启动子P43基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列为P43-F和P43-R，分别为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7；
优选的，所述步骤Ⅱ中基因片段phoD-treZ的PCR扩增引物核苷酸序列为phoD-Hase-F和phoD-Hase-R，分别为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18；
优选的，所述步骤Ⅲ中Ctdoc基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列为ctdoc-F和ctdoc-R，分别为SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；
优选的，所述步骤Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ中PCR扩增体系如下：
10μmol/L上游引物2.5μl，10μmol/L下游引物2.5μl，基因模板2.5μl，2×PhantaMaxMaster Mix 25μl，加ddH2O到50μl；
扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec/kb，30个循环；72℃延伸5min；
优选的，步骤Ⅴ中，所述测定浓度是利用超微光分光光度计测定浓度；
优选的，所述步骤Ⅵ中质粒整合到枯草芽孢杆菌WB800n菌株筛选：将转化子涂布于含100ug/mL氯霉素抗性的LB平板，37℃培养12h，用牙签挑取氯霉素抗性的LB平板上的转化子，分别接种到含有100ug/mL氯霉素抗性的LB液体培养基，37℃培养12h，分别以上述菌液为模板进行PCR扩增验证，经过琼脂糖凝胶电泳获得相应的目的条带得到整合型重组菌株。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤①中ctg-Rfdoc基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列为ctg-rfdoc-F和ctg-rfdoc-R，分别为SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22；
优选的，所述步骤②中pHT01-P43-phoD基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列为反向pHT01-P43-phoD-F和反向pHT01-P43-phoD-R，分别为SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24；
优选的，所述步骤①或②中PCR扩增体系如下：
10μmol/L上游引物2.5μl，10μmol/L下游引物2.5μl，基因模板2.5μl，2×PhantaMaxMaster Mix 25μl，加ddH2O到50μl；
扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec/kb，30个循环；72℃延伸5min；
优选的，步骤③中，所述测定浓度是利用超微光分光光度计测定浓度；
优选的，所述步骤④中质粒整合到枯草芽孢杆菌WB800n菌株筛选：将转化子涂布于含100ug/mL氯霉素抗性的LB平板，37℃培养12h，用牙签挑取氯霉素抗性的LB平板上的转化子，分别接种到含有100ug/mL氯霉素抗性的LB液体培养基，37℃培养12h，分别以上述菌液为模板进行PCR扩增验证，经过琼脂糖凝胶电泳获得相应的目的条带得到整合型重组菌株。
6.权利要求1-5任一项构建的自组装三酶复合体重组菌在海藻糖生产中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(i)将上述枯草芽孢杆菌工程菌WB800n-P43-phoD-treY-Ccdoc、WB800n-P43-phoD-treZ-Ctdoc、WB800n-P43-phoD-cgt-Rfdoc、WB800n-ScafCCR分别经活化培养、扩大培养后，在35～38℃发酵40-50h，发酵液作为粗酶液；
(ii)将步骤(i)WB800n-ScafCCR菌株的脚手架蛋白粗酶液利用纤维小球进行回收；
(iii)将步骤(ii)中回收的脚手架蛋白粗酶液与步骤(i)中WB800n-P43-phoD-treY-Ccdoc、WB800n-P43-phoD-treZ-Ctdoc、WB800n-P43-phoD-cgt-Rfdoc菌株的粗酶液在30～70℃、pH4.0～8.0条件下进行混合；
(iv)将步骤(iii)中混合溶液通过过滤来分离纤维小球，并将纤维小球充分洗涤，干燥后回收纤维小球；
(v)将步骤(iv)制得的纤维小球用于催化制备海藻糖。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤(i)中，活化培养条件为35～38℃、180～220rpm培养12h，活化培养基为液体LB培养基。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤(i)中，扩大培养条件为35～38℃、180～220rpm培养12h，扩大培养培养基为TB培养基，组份如下：
丙三醇15mL/L，胰蛋白胨12g/L，酵母浸粉24g/L，MgCl22.5 g/L，17mM KH2PO4，72mMK2HPO4。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤(iv)中，干燥条件为冷阱温度-54℃，真空度8Pa下干燥。
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