CN112708569B - 发酵生产硫酸软骨素的酵母工程菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了发酵生产硫酸软骨素的酵母工程菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明利用合成生物学技术和基因工程手段，以毕赤酵母GS115和酿酒酵母S.cerevisiae CEN.PK2‑1C为出发菌株，在细胞内异源表达了硫酸软骨素合成途径相关基因：来自大肠杆菌K4的基因kfoC，kfoA，来自小鼠的软骨素硫酸转移酶基因C4ST，C6ST，来自枯草芽孢杆菌的UDP‑葡萄糖脱氢酶基因tuaD，来自酿酒酵母的ATP硫酸化酶基因MET13，得到合成硫酸软骨素A(CSA)、硫酸软骨素C(CSC)和硫酸软骨素E(CSE)的生产菌株。本发明首次实现了利用微生物发酵碳源合成不同构型的硫酸软骨素。

Description

发酵生产硫酸软骨素的酵母工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及发酵生产硫酸软骨素的酵母工程菌及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
硫酸软骨素(Chondroitin sulfate，CS)是广泛分布在软骨组织中的一种蛋白聚糖，有着重要的生物学功能。其骨架是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺经过交替连接而成的线性多糖。硫酸软骨素是软骨素经过硫酸转移酶的硫酸化修饰所形成的，根据硫酸化修饰位置的不同，硫酸软骨素可以被分为以下四种类型：硫酸软骨素A(4-O-硫酸化)、硫酸软骨素C(6-O- 硫酸化)、硫酸软骨素D(2,6-di-O-硫酸化)和硫酸软骨素E(4,6-di-O-硫酸化)。由于CS有着优良的生物相容性，其应用范围非常广泛，例如医疗健康，保健品，食品及化妆品领域。硫酸化的形式与其生物活性及应用领域息息相关。硫酸软骨素A和硫酸软骨素C常被用于治疗关节炎，硫酸软骨素E可促进原代神经元的神经突向外生长。
目前商品化的硫酸软骨素严重依赖于动物组织提取。该方法存在许多问题，比如原料周期长，潜在动物病毒传染，环境污染，组织提取的硫酸软骨素结构高度不均一，存在潜在的致病因子，且含有过硫酸角质素，降低医药活性甚至导致失活等。为了得到结构均一性较好、生物安全的硫酸软骨素，利用微生物进行硫酸软骨素的合成可以有效避免上述问题。然而，目前国内外没有在微生物细胞中直接通过微生物利用碳源进行硫酸软骨素合成的报道。
发明内容
本发明的目的在于为了克服现有技术中的问题，实现微生物法定向生产硫酸软骨素，克服了传统的组织提取法带来的各种弊端，及常规酶法催化合成硫酸软骨素过程的低效和繁琐。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明的第一个目的是提供一种产硫酸软骨素的基因工程菌，所述基因工程菌以酵母为宿主，表达(a)、(b)或(c)；或含有(d)、(e)或(f)的核苷酸序列；其中，
(a)软骨素合酶、UDP-N-乙酰葡萄糖胺C4异构酶、UDP-葡萄糖脱氢酶、软骨素4-O-硫酸转移酶C4ST、ATP硫酸化酶；
(b)软骨素合酶、UDP-N-乙酰葡萄糖胺C4异构酶、UDP-葡萄糖脱氢酶、软骨素6-O-硫酸转移酶C6ST、ATP硫酸化酶；
(c)软骨素合酶、UDP-N-乙酰葡萄糖胺C4异构酶、UDP-葡萄糖脱氢酶、软骨素4-O-硫酸转移酶C4ST、软骨素6-O-硫酸转移酶C6ST和ATP硫酸化酶；
(d)含有kfoC、kfoA、tuaD、C4ST和MET13的DNA序列；
(e)含有kfoC、kfoA、tuaD、C6ST和MET13的DNA序列；
(f)含有kfoC、kfoA、tuaD、C4ST、C6ST和MET13的DNA序列。
在一种实施方式中，所述kfoC是编码软骨素合酶(Genbank登录号为BAC00523.1)的基因；所述KfoA是编码UDP-N-乙酰葡萄糖胺C4异构酶(Genbank登录号为BAC00525.1) 的基因；所述tuaD是编码UDP-葡萄糖脱氢酶(Genbank登录号为NP_391438.1)的基因；所述C4ST是编码软骨素4-O-硫酸转移酶(Genbank登录号为NP_067414.2)的基因，所述 C6ST是编码软骨素6-O-硫酸转移酶(Genbank登录号为BAA29054.1)的基因；所述MET13 是编码ATP硫酸化酶(Genbank登录号为NP_011390.2)的基因。
在一种实施方式中，所述KfoC、KfoA来源于大肠杆菌K4；所述tuaD来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168；所述C4ST、C6ST来自家鼠(Mus musculus)；所述ATP硫酸化酶MET13来自酿酒酵母。
在一种实施方式中，所述kfoC、kfoA、tuaD、C4ST、C6ST的基因序列分别如SEQ IDNO.1～5 所示。
在一种实施方式中，所述酵母为毕赤酵母或酿酒酵母及其突变或诱变菌株。
在一种实施方式中，所述酵母为毕赤酵母GS115或酿酒酵母S-CA。
在一种实施方式中，所述基因通过质粒表达，或整合在宿主的基因组上表达。
在一种实施方式中，所述质粒包括但不限于：pGAPZB、pAO815、pRS303、pRS304或pRS303。
本发明的第二个目的是提供构建所述生产硫酸软骨素的基因工程菌的方法，所述方法将 (a)、(b)或(c)连接在酵母的基因组上；其中，
(a)含有：kfoC、kfoA、tuaD和C4ST的DNA序列；
(b)含有kfoC、kfoA、tuaD和C6ST基因的DNA序列；
(c)含有kfoC、kfoA、tuaD、C4ST和C6ST的DNA序列。
在一种实施方式中，生产硫酸软骨素的毕赤酵母的构建方法包括如下步骤：其具体步骤如下：
(1)将kfoC，kfoA，tuaD基因利用Gibson组装连接到pGAPZB载体上，构建成pGAPZB-kfoC-T2A-kfoA-T2A2-tuaD质粒，其中T2A、T2A2的序列分别如SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7所示；
(2)将步骤(1)制备的pGAPZB-kfoC-T2A-kfoA-T2A2-tuaD线性化后转化至毕赤酵母 GS115感受态细胞，筛选阳性菌株，命名为GS115/CAD；
(3)扩增潮霉素基因，将pGAPZB质粒上的博来霉素抗性基因替换为潮霉素基因，得到改造后的质粒命名为GAPHyg。扩增MET13基因，通过一步克隆组装连接到GAPHyg载体上，构建成GAPHyg-MET13质粒；
(4)将步骤(3)的质粒GAPHyg-MET13线性化后转化至GS115/CAD的感受态细胞，筛选阳性克隆，命名为GS115/CADM；
(5)C4ST和C6ST的表达优化：对C4ST和C6ST原始基因序列从N端分别取不同长度进行截短(20个氨基酸，40个氨基酸，60个氨基酸，80个氨基酸)，将其中截短得到酶活最高菌株的N端融合不同标签蛋白(SUMO，TrxA，MBP)进行优化表达；
(6)分别将SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的优化后的基因序列C4ST，C6ST同源重组连接到pAO815载体上，构建成pAO815-C4ST和pAO815-C6ST质粒；
(7)将步骤(6)构建的质粒pAO815-C4ST和pAO815-C6ST线性化后分别转入感受态细胞GS115/CADM中，筛选阳性克隆，得到新的菌株命名为GS115/CADMC4和 GS115/CADMC6；或将步骤(6)优化的基因序列C4ST，C6ST利用Gibson组装连接到pAO815 载体上，构建成pAO815-C4ST-P2A-C6ST质粒，其中P2A序列如SEQ ID NO.8所示；筛选阳性克隆，得到新的菌株命名为GS115/CADMC4C6。
在一种实施方式中，生产硫酸软骨素的酿酒酵母的构建方法包括如下步骤：其具体步骤如下：
(1)将kfoC，kfoA利用Gibson组装连接到pRS305载体上，构建成pRS305-kfoC-P2A-kfoA 质粒，其中P2A序列如SEQ ID NO.8所示；
(2)获得的质粒pRS305-kfoC-P2A-kfoA转化到S.cerevisiae CEN.PK2-1C单倍体酿酒酵母感受态细胞，筛选阳性克隆，命名为酿酒酵母S-CA；
(3)将MET13和外源基因tuaD利用Gibson组装连接到pRS303载体上，构建成pRS303-tuaD-F2A-MET13质粒，其中F2A序列如SEQ ID NO.9所示；
(4)将制备的pRS303-tuaD-F2A-MET13质粒整合到酿酒酵母S-CA菌株的感受态细胞基因组中，筛选阳性克隆，命名为酿酒酵母S-CADM；
(5)将SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示的基因C4ST，C6ST分别同源重组连接到pRS304 载体上，构建成pRS304-C4ST和pRS304-C6ST质粒，再性化后分别转入酿酒酵母S-CADM 感受态细胞中，筛选阳性克隆，命名为S-CADMC4和S-CADMC6；或将优化后的基因C4ST，C6ST通过Gibson组装连接到pRS305载体上，构建成pRS305-C4ST-T2A-C6ST质粒，其中 T2A序列如SEQ ID NO.6所示，分别转入酿酒酵母S-CADM感受态细胞中，筛选阳性克隆，命名为S-CADMC4C6。
本发明的第三个目的是提供所述菌株在生产硫酸软骨素或其衍生产品方面的应用。
在一种实施方式中，所述应用是以含40～60g/L葡萄糖的培养基为发酵培养基，将所述基因工程菌接种至发酵培养基中，25～35℃发酵80-120h。
在一种实施方式中，所述发酵培养基还含有酵母提取物、蛋白胨、磷酸钾缓冲液、MnSO4和氨基酸混合液。
在一种实施方式中，所述发酵还控制如下条件：1-5vvm通气量、300-900rpm保证溶氧不低于30％，pH维持在5～7，发酵48h后恒速流加无菌500g/L葡萄糖溶液，保证残糖维持在1-2g/L。
本发明还要求保护含有所述基因工程菌的组合物。
在一种实施方式中，所述组合物包括但不限于细胞保护剂。
本发明的有益效果：
1、本发明首次以酵母为宿主，通过整合表达硫酸软骨素合成途径中的基因，强化PAPS 供应系统，实现了硫酸软骨素在酵母中的一步合成。
2、本发明的毕赤酵母和酿酒酵母基因工程菌通过代谢甘油，甲醇或者葡萄糖直接合成硫酸软骨素，实现了特定结构的硫酸软骨素A、C、E在微生物中的合成；基因工程菌GS115/CADMC4硫酸软骨素A产量为125mg/L，基因工程菌GS115/CADMC6硫酸软骨素 C产量为54mg/L，基因工程菌GS115/CADMC4C6硫酸软骨素E产量为36mg/L；基因工程菌S-CADMC4硫酸软骨素A产量为75mg/L，基因工程菌S-CADMC6硫酸软骨素C产量为 48mg/L，基因工程菌S-CADMC4C6硫酸软骨素E产量为34mg/L。
3、本发明利用微生物细胞直接合成的硫酸软骨素，与传统组织提取法获得的硫酸软骨素相比，产品结构均一，无潜在致病因子，产品的质量安全性得以保证。
4.本发明利用微生物直接合成硫酸软骨素，与其他体外酶法催化合成硫酸软骨素相比，简化了操作的繁琐性，避免了体外进行酶的提取纯化及后催化过程，显著的提高了生产效率，降低了成本。
附图说明
图1是基因工程菌株GS115/CADMC4硫酸软骨素的代谢网络示意图。
图2是部分构建重组质粒图谱，2-1：pGAPZB-kfoC-T2A-kfoA-T2A2-tuaD，2-2：pGAPHyg-MET13，2-3：pAO815-C4ST，2-4：pAO815-C6ST，2-5：pAO815-C4ST-P2A-C6ST。
图3是毕赤酵母表达不同截短长度的C4ST和C6ST的酶活；其中1～5分别表示原始长度、截短20个氨基酸、截短40个氨基酸、截短60个氨基酸和截短80个氨基酸。
图4为不同融合蛋白对毕赤酵母表达C4ST和C6ST酶活的影响；其中，CK表示对照。
图5是重组菌GS115/CADMC4生产硫酸软骨素CSA的LC-MS图。
图6为重组菌GS115/CADMC6生产CSC的LC-MS图。
图7为重组菌GS115/CADMC4C6生产CSE的LC-MS图。
图8为重组菌S-CADMC4生产CSA的LC-MS图。
图9为重组菌S-CADC6生产CSC的LC-MS图。
图10为重组菌S-CADMC4C6生产CSE的LC-MS图。
具体实施方式
材料：
1.毕赤酵母GS115和酿酒酵母S.cerevisiae CEN.PK2-1C(编号又为S288C)购自NTCC 典型培养物保藏中心。
2.PrimeSTAR DNA聚合酶、磷酸化酶、DNA Marker、Solution I、AvrII等酶类试剂购自 TaKaRa(大连)。
3.ClonExpress一步法定向克隆试剂盒购自Vazyme Biotech(南京)。
4.胶回收试剂盒，EcoRI，NotI，KpnI等快切酶购自Thermo fisher Scientific公司。
5.质粒抽提试剂盒购自生物工程(上海)有限公司。
6.各种分析纯试剂购自国药集团。
7.GS115感受态制备方法及转化步骤参照Thermo Fisher Invitrogen's PichiaEasyCompo Kit，S.cerevisiae CEN.PK2-1C酿酒酵母菌株感受态的制备和转化步骤参考科学出版社《酵母遗传学方法实验指南(第二版)》第98～99页。
8.培养基：LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，琼脂粉20。
LB液体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10。
种子培养基(g/L)：蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20。
缺陷型培养基平板(g/L)：酵母无机氮源培养基6.7，葡萄糖20；根据需要添加组氨酸、色氨酸、亮氨酸及尿嘧啶，使其在培养基中终浓度为50μg/mL，自然pH。准备固体培养基时添加琼脂粉20g/L。
毕赤酵母基因工程菌发酵培养基(g/L)：甘油40，K2SO4 18，MgSO4·7H2O 14.9，KOH4.13，85％H3PO4 26.7mL L–1，CaSO4·2H2O 0.93，4.35mL·L–1PTM1微量元素；
其中PTM1(g·L–1)：CuSO4·5H2O 6，KI 0.09，MnSO4·H2O 3，H3BO3 0.02，MoNa2O4·2H2O 0.2，CoCl2·6H2 O 0.5，ZnCl2 20，FeSO4·7H2O 65，生物素0.2，H2SO45.0mL。
酿酒酵母基因工程菌发酵培养基(g/L)：酵母粉10；蛋白胨20；葡萄糖40；磷酸钾缓冲液100mmol/L，pH6.0，MnSO4 2，100×氨基酸混合液10ml/L。
其中100×氨基酸混合液为：L-组氨酸，L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、 L-亮氨酸和L-异亮氨酸各0.5g共同溶于100ml水中，过滤除菌。
实施例中设计的引物具体如表1所示。
表1引物序列表
Figure BDA0002246635570000041
Figure BDA0002246635570000051
实施例1：构建pGAPZB-kfoC-T2A-kfoA-T2A2-tuaD质粒和菌株GS115/CAD
(1)以合成的基因kfoC，kfoA和tuaD(序列分别如SEQ ID NO.1～3所示)为模板，以引物kfoC-F/kfoC-R，kfoA-F/kfoA-R，tuaD-F/tuaD-R分别进行PCR扩增3个基因，利用Gibson 组装连接到pGAPZB载体上，构建成pGAPZB-kfoC-T2A-kfoA-T2A2-tuaD质粒，其中T2A， T2A2序列设计在引物上，其完整序列为SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7；
(2)制备毕赤酵母GS115感受态细胞，将上述获得的质粒 pGAPZB-kfoC-T2A-kfoA-T2A2-tuaD用快切酶AvrII线性化后转化到感受态细胞中，通过博来霉素抗性平板筛选阳性克隆，得到整合了基因kfoC，kfoA和tuaD的，菌株命名为GS115/CAD。
实施例2：pGAPHyg-MET13质粒的构建
提取酿酒酵母GS115/CAD基因组，设计引物MET13-F/MET13-R扩增内源基因MET13，利用一步克隆组装连接到GAPZB改造后载体GAPHyg上，构建成GAPHyg-MET13质粒。
实施例3：GS115/CADM菌株的构建
制备GS115/CAD重组菌感受态细胞，将实施例2获得的GAPHyg-MET13质粒用快切酶AvrII线性化后转化到GS115/CAD重组菌感受态细胞中，用潮霉素抗性平板筛选得到阳性克隆子即为GS115/CADM重组菌株。
实施例4：C4ST和C6ST的表达优化
将基因C4ST，C6ST序列的N端以20氨基酸为一个长度进行截短，分别截短长度为20氨基酸，40氨基酸，60氨基酸，80氨基酸。以C4ST，C6ST全长序列为模板，以引物C4ST-F，20C4ST-F，40C4ST-F，60C4ST-F，80C4ST-F,C4ST-R，C6ST-F，20C6ST-F，40C6ST-F，60C6ST-F，80 C6ST-F，C6ST-R分别进行PCR扩增截短不同长度的两个基因，一步克隆连接到pAO815 载体上，构建成一系列质粒，对构建的质粒电转进毕赤酵母，发酵培养后纯化获得的酶进行酶活测定。得到的酶活最高的菌株为pAO815-60C4ST和pAO815-20C6ST，即C4ST蛋白N 端截短60个氨基酸和C6ST蛋白N端截短20个氨基酸时，相应的酶活最高，分别为26U/L， 10.5U/L(图3)。
再以所构建得到的pAO815-60C4ST和pAO815-20C6ST质粒为基础，在该基因序列N端分别融合SUMO(Genbank登录号为NP_010798.1)，TrxA(Genbank登录号为AFG42725.1)，MBP蛋白(Genbank登录号为NP_418458.1)。将构建获得的菌株在30℃条件下发酵96h，按照(参照A microbial–enzymatic strategy for producing chondroitin sulfateglycosaminoglycans 中公开的纯化步骤)进行纯化。将纯化获得的酶进行酶活测定。结果如图4所示，其中当C4ST 融合SUMO蛋白时有最高酶活，其酶活别为63.5U/L。当C6ST融合MBP蛋白时酶活最高，其酶活为33.5U/L。
实施例5：pAO815-C4ST-P2A-C6ST质粒的构建
以C4ST，C6ST(序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5)为模板，以引物2C4ST-F/2C4ST-R， 2C6ST-F/2C6ST-R，分别进行PCR扩增C4ST和C6ST基因，使得C4ST基因的C端和C6ST 基因的N端分别加上P2A短肽的一段，然后利用Gibson组装连接到pAO815载体上，用氨苄抗性平板筛选，挑选菌落PCR验证正确的菌株进行测序，构建成含有P2A序列的 pAO815-C4ST-P2A-C6ST质粒。其中P2A序列设计在引物上，其完整序列为SEQ ID NO.8。
实施例6：GS115/CADMC4、GS115/CADMC6和GS115/CADMC4C6菌株的构建
按Thermo Fisher Invitrogen's Pichia EasyCompo Kit所述方法制备GS115/CADM重组菌感受态细胞，将上述质粒pAO815-SUMO-60C4ST、pAO815-MBP-20C6ST和 pAO815-C4ST-P2A-C6ST用快切酶SalI线性化回收后分别转入感受态细胞GS115/CADM中，用组氨酸缺陷平板筛选阳性克隆子得到GS115/CADMC4、GS115/CADMC6和 GS115/CADMC4C6菌株。
实施例7：毕赤酵母工程菌发酵产硫酸软骨素
将重组菌株GS115/CADMC4，GS115/CADMC6及GS115/CADMC4C6进行3-L分批补料发酵。首先分区划线得到单菌落，挑取单菌落接种于5ml YPD液体培养基中，在30℃ 220rpm条件下培养16-18h，然后按10％接种量转接至三瓶50mLYPD液体培养基中，于30℃ 220rpm培养24h左右，然后按15％接种于含有1L发酵培养基的3-L发酵罐中，控制发酵温度为28℃，pH为5.5，通气量为4.0vvm，搅拌转速和溶氧相关联，控制溶氧在30％，搅拌转速在300-1000rpm。待发酵培养基中的甘油被消耗殆尽继续饥饿培养2-3h后，以恒速流加方式进行50％(v/v)甘油(含12mL/L PTM1)补料，补料速率为20mL·h-1·L-1，补料结束后继续饥饿培养2h，进入甲醇诱导阶段，转速不变。含12mL·L-1PTM1的甲醇用于流加诱导并且终浓度控制在18g/L，甲醇流加速率和培养基中甲醇终浓度由甲醇检测器实时在线控制。
收集发酵得到的菌体，用去离子水洗涤菌体两遍后重悬菌体，采用高压匀浆破壁后离心得到胞内上清。将胞内上清置于70℃水浴锅中加热沉淀部分蛋白，离心后收集上清。向上清中加入3倍预冷的无水乙醇沉淀硫酸软骨素，搅拌均匀后离心得到沉淀。沉淀复溶于去离子水中，再次加入3倍预冷的无水乙醇沉淀硫酸软骨素。离心得到沉淀烘干后复溶于于20mM Tris-HCl(pH8.0)中即为硫酸软骨素样品。取500μl硫酸软骨素样品，加入5μl硫酸软骨素裂解酶ABCI，置于37℃水浴锅中处理12h。将裂解后的溶液置于90℃加热10min使蛋白失活变性，离心后取上清进行LC-MS检测。
LC-MS检测使用Acquity UPLC BEH Amide色谱柱(1.7μm，2.1×100mm，Waters,MA,USA)。洗脱液A为乙腈，洗脱液B为超纯水，使用氨水将pH值调节至10.4。所用的洗脱梯度设定如下：0-2分钟，5％B；2-3分钟，5-30％B；3-6分钟，30-60％B；6-8分钟，60％ B。柱温保持在40℃，流速为0.2mL/min。在负离子模式下对m/z 100-800的质量范围进行扫描监测。硫酸软骨素A和硫酸软骨素C的二糖分子在负离子模式下质荷比应为458，硫酸软骨素E的二糖分子在负离子模式下质荷比应为538。从质谱结果可以看出实现了硫酸软骨素A，硫酸软骨素C及硫酸软骨素E的合成。
经测定，基因工程菌GS115/CADMC4硫酸软骨素A产量为125mg/L，基因工程菌GS115/CADMC6硫酸软骨素C产量为54mg/L，基因工程菌GS115/CADMC4C6硫酸软骨素 E产量为36mg/L。
实施例8：构建pRS305-kfoC-P2A-kfoA质粒和酿酒酵母S-CA的构建
(1)以合成的基因kfoC和kfoA为模板，以引物skfoC-F/skfoC-R，skfoA-F/skfoA-R，分别进行PCR扩增两个基因，采用Gibson组装连接到载体pRS305上，构建成 pRS305-kfoC-P2A-kfoA质粒，其中P2A序列设计在引物上，其完整序列同SEQ ID NO.8；用氨苄抗性平板筛选，挑选菌落PCR验证正确的菌株进行测序，获得测序正确的 pRS305-kfoC-P2A-kfoA质粒。
制备S.cerevisiae CEN.PK2-1C单倍体酿酒酵母感受态细胞，将上述获得的质粒pRS305-kfoC-P2A-kfoA转化到感受态细胞中，通过亮氨酸缺陷平板筛选阳性克隆，得到整合了基因kfoC和kfoA的菌株命名为S-CA。
实施例9：pRS303-tuaD-F2A-MET13质粒和S-CADM菌株的构建
以酿酒酵母S288C基因组和合成的基因tuaD(SEQ ID NO.3所示)为模板，以引物sMET13-F/sMET13-R，stuaD-F/stuaD-R，分别进行PCR扩增内源基因MET13和外源基因tuaD，采用Gibson组装连接到表达载体pRS303上，用氨苄抗性平板筛选，挑选菌落PCR验证正确的菌株进行测序，最终构建成pRS303-tuaD-F2A-MET13质粒，其中F2A序列设计在引物上，其完整序列为SEQ ID NO.9。
提取酿酒酵母S288C株基因组，以引物sMET13-F/sMET13-R，stuaD-F/stuaD-R，扩增内源基因MET13和外源基因tuaD，利用Gibson组装连接到pRS303载体上，构建成 pRS303-tuaD-F2A-MET13质粒。
制备实施例6构建的菌株S-CA的感受态细胞，将质粒pRS303-tuaD-F2A-MET13线性化后整合到酿酒酵母S-CA的基因组中，用亮氨酸，色氨酸双重缺陷平板筛选阳性克隆子即为 S-CADM菌株。
实施例10：S-CADMC4和S-CADMC6菌株的构建
以实施例4所获得的优化后的C4ST和C6ST基因(序列如SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5) 为模板，以引物sC4ST-F/sC4ST-R，sC6ST-F/sC6ST-R，分别进行PCR扩增C4ST，C6ST两个基因，同源重组连接到pRS304载体上，构建成pRS304-C4ST和pRS304-C6ST质粒；
制备S-CADM重组菌感受态细胞，将质粒pRS304-C4ST和pRS304-C6ST线性化后，分别转化至S-CADM感受态细胞中，用色氨酸缺陷平板筛选阳性克隆子得到S-CADMC4和 S-CADMC6菌株。
实施例11：pRS304-C4ST-T2A-C6ST质粒和S-CADMC4C6菌株的构建
以实施例4所获得的优化后的C4ST和C6ST基因(序列如SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5) 为模板，以引物s2C4ST-F/s2C4ST-R，s2C6ST-F/s2C6ST-R，分别进行PCR扩增C4ST和C6ST 基因，采用Gibson组装连接到表达载体pRS304上，用氨苄抗性平板筛选，挑选菌落PCR验证正确的菌株进行测序，最终构建成pRS304-C4ST-T2A-C6ST质粒(其中T2A序列设计在引物上，其完整序列为SEQ ID NO.6)。
制备S-CADM重组菌感受态细胞，将pRS304-C4ST-T2A-C6ST质粒线性化后，转化至S-CADM重组菌感受态细胞，用尿嘧啶缺陷平板筛选阳性克隆子得到S-CADMC4C6菌株。
实施例12 ：硫酸软骨素生产菌株上罐发酵
将重组菌株S-CADMC4，S-CADMC6及S-CADMC4C6进行3-L分批补料发酵。首先分区划线得到单菌落，挑取单菌落接种于50ml YPD液体培养基中，在30℃220rpm条件下培养16-18h至菌体OD600达到6左右，以初始OD600＝0.4转接于新鲜的250mlYPD液体培养基中，于30℃220rpm培养12h左右至菌体OD600在12左右，然后按15％接种于含有1L发酵培养基的3-L发酵罐中，控制发酵温度为30℃，pH为6，通气量为2vvm，搅拌转速和溶氧相关联，控制溶氧在30％，搅拌转速在300-900rpm。每隔6h取样测定葡萄糖浓度，并根据葡萄糖的消耗速度及时调整葡萄糖的流加量，使葡萄糖浓度稳定在1-2g/L。发酵周期为96h。其中，调节pH的酸液为10％的磷酸，碱液为20％的氨水。
按照实施例5的方法对发酵液中的硫酸软骨素进行检测。经测定，发酵96h的基因工程菌S-CADMC4硫酸软骨素A产量为75mg/L，基因工程菌S-CADMC6硫酸软骨素C产量为48mg/L，基因工程菌S-CADMC4C6硫酸软骨素E产量为34mg/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 华熙生物科技股份有限公司
江南大学
<120> 发酵生产硫酸软骨素的酵母工程菌及其应用
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2061
<212> DNA
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ttgtgccaga cagcgttgaa cctctccgaa gaggtcgata aacttaaccg caaggcagtt 180
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gaagataacg agttcggata ccggttatat cgggaaggat gttatttccg gagcgttgaa 1140
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agaagaggtt cttctagatc tttgtgtgaa gatccagttt gtactccatt tgttaaaaaa 1680
gttttcgaaa agtaccattg tagaaacaga agatgtggtc cattgaatgt tactttggct 1740
ggtgaagctt gtagaagaaa ggatcatgtt gctttgaaag ctgttagaat tagacaattg 1800
gaattcttgc aaccattggt tgaagatcca agattggatt tgagagttat tcaattggtt 1860
agagatccta gagctgtttt ggcttctaga attgttgctt tcgctggtaa gtacgaaaat 1920
tggaagaagt ggttgtctga aggtcaagat caattgtctg aagatgaagt tcaaagattg 1980
agaggtaatt gtgaatctat tagattgtct gctgaattgg gtttgagaca accagcttgg 2040
ttgagaggta gatatatgtt ggttagatac gaagatgttg ctagaagacc tttgcaaaaa 2100
gctagagaaa tgtattcttt cgctggtatt cctttgactc cacaagttga agattggatt 2160
caaaagaata ctcaagctac tagagattct tctgatgttt attctactca aaaaaattct 2220
tctgaacaat tcgaaaaatg gagattctct atgccattca aattggctca agttgttcaa 2280
gctgcttgtg gtcctactat gcatttgttc ggttataaat tggctagaga tgctgcttct 2340
ttgactaata gatctatttc tttgttggaa gaaagaggta ctttctgggt tacttaa 2397
<210> 6
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gaaggtcgtg gttctcttct gacttgtggt gatgttgaag aaaacccagg tcca 54
<210> 7
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gaaggtcgtg gatccctact tacttgcggt gacgtagagg aaaaccctgg tccg 54
<210> 8
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggatccggag aaggtcgtgg atccctactt acttgcggtg acgtagagga aaaccctggt 60
ccg 63
<210> 9
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggatccggag ccacgaactt ctctctgtta aagcaagcag gagacgtgga agaaaacccc 60
ggtcct 66

Claims (9)

1.一种产硫酸软骨素的酵母，其特征在于，表达（a）、（b）或（c）；其中，
（a）软骨素合酶、UDP-N-乙酰葡萄糖胺C4异构酶、UDP-葡萄糖脱氢酶、软骨素4-O-硫酸转移酶C4ST和ATP硫酸化酶；
（b）软骨素合酶、UDP-N-乙酰葡萄糖胺C4异构酶、UDP-葡萄糖脱氢酶和软骨素6-O-硫酸转移酶C6ST、ATP硫酸化酶；
（c）软骨素合酶、UDP-N-乙酰葡萄糖胺C4异构酶、UDP-葡萄糖脱氢酶、软骨素4-O-硫酸转移酶C4ST、软骨素6-O-硫酸转移酶C6ST和 ATP硫酸化酶；
编码所述软骨素合酶的基因kfoC，编码所述UDP-N-乙酰葡萄糖胺C4异构酶的基因kfoA，编码所述UDP-葡萄糖脱氢酶的基因tuaD，编码所述软骨素4-O-硫酸转移酶的基因C4ST，编码所述软骨素6-O-硫酸转移酶的基因C6ST的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1~5所示；
所述酵母以毕赤酵母或酿酒酵母为宿主。
2.根据权利要求1所述的酵母，其特征在于，所述酵母以毕赤酵母GS115或酿酒酵母CEN.PK2-1C为宿主。
3.一种发酵剂，其特征在于，含有细胞浓度≥1×105CFU/g或1×105CFU/mL的权利要求1或2所述的酵母。
4.一种构建权利要求1所述酵母的方法，其特征在于，将（a）、（b）或（c）连接在酵母的基因组上；其中，
（a）kfoC、kfoA、tuaD和C4ST；
（b）kfoC、kfoA、tuaD和C6ST；
（c）kfoC、kfoA、tuaD、C4ST和C6ST；
所述kfoC、kfoA、tuaD、C4ST、C6ST的基因序列分别如SEQ ID NO.1~5所示。
5.权利要求1或2所述的酵母在生产硫酸软骨素或其衍生产品方面的应用。
6.一种生产硫酸软骨素的方法，其特征在于，以含40~60 g/L葡萄糖的培养基为发酵培养基，将权利要求1或2所述的酵母或权利要求3所述的发酵剂接种至发酵培养基中，25~35℃发酵80-120 h。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵还控制如下条件：1-5 vvm通气量、溶氧不低于30%，pH维持在5~7。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，发酵46~48 h后流加葡萄糖溶液，使发酵过程残糖维持在1-2 g/L。
9.权利要求1或2所述的酵母，或权利要求3所述的发酵剂在制备含硫酸软骨素或其衍生产品的药品中的应用。
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