CN106755205A - 一种酶法制备硫酸软骨素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酶法制备硫酸软骨素的方法，属生物医药领域。本发明制备硫酸软骨素是以软骨素为底物，经微生物细胞异源表达的软骨素4‑硫酸转移酶催化形成具有生物学活性的硫酸软骨素A或软骨素6‑硫酸转移酶催化形成具有生物学活性的硫酸软骨素C，并经酰基硫酸转移酶提供PAPS硫酸基供体及再生系统。本发明为生物学活性物质硫酸软骨素A和硫酸软骨素C的合成及工业化生产方式提供了新的途径。

Description

一种酶法制备硫酸软骨素的方法
技术领域
本发明涉及一种酶法制备硫酸软骨素的方法，属生物医药领域。
背景技术
硫酸软骨素(Chondroitin sulfate，CS)是由葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺以β1→3、β1→4糖苷键交替形成、并伴随N-乙酰半乳糖胺一定程度硫酸化修饰的粘多糖。其中N-乙酰半乳糖胺4号位发生硫酸化修饰的软骨素称为硫酸软骨素A(chondroitin sulfate A,CSA)，6号位发生硫酸化修饰的软骨素称为硫酸软骨素C(chondroitin sulfate C,CSC)。CSA和CSC广泛存在于细胞表面和胞外基质中，对维持神经干细胞稳定、神经元迁移、神经突起延长、树突再生等方面作用明显，广泛用于治疗骨关节炎等疾病。此外，CS口服液常用于治疗心脏疾病及乳腺癌、AIDS等。
目前临床上使用的CS从动物软骨组织中提取，但动物来源CS的硫酸化程度及硫酸化类型差异较大。此外，动物软骨组织中含有一定量的硫酸角质素，而硫酸角质素和CS在理化性质方面较为相近，故在工业化大规模CS提取过程中，会参杂一定量的硫酸角质素，而降低临床药效。且感染过疯牛病的动物软骨组织来源的CS易导致患者感染疯牛病(SubhashDhawan,FDA,2016)。
基于上述动物来源CS的限制，人们提出了酶法合成CS，此方法具有能得到专一性具有生物学活性的CS的优点。软骨素4-硫酸转移酶C4ST催化软骨素N-乙酰基葡萄糖胺4号位羟基硫酸化形成CSA，软骨素6-硫酸转移酶C6ST催化软骨素N-乙酰基葡萄糖胺6号位羟基硫酸化形成CSC。目前C4ST和C6ST主要从动物细胞中提取，但动物细胞培养复杂，成本高昂，不利于工业化生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备具有生物学活性的硫酸软骨素的方法，是以含软骨素为底物，经PAPS再生系统和软骨素4-硫酸转移酶(C4ST)硫酸化修饰形成不含其他糖胺聚糖的CSA；或者经PAPS再生系统和软骨素6-硫酸转移酶(C6ST)硫酸化修饰形成不含其他糖胺聚糖的CSC。
所述方法中，编码所述C4ST、C6ST的基因来源于动物，在微生物中异源表达得到。
在本发明的一种实施方式中，所述C4ST是将NCBI中Gene ID：58250的基因以pET系列载体为表达载体，在大肠杆菌中表达得到的；或者以pPIC系列载体为表达载体在毕赤酵母中表达得到。
在本发明的一种实施方式中，所述C6ST是将NCBI中Gene ID：53374的基因以pET系列载体为表达载体，在大肠杆菌中表达得到的；或者以pPIC系列载体为表达载体在毕赤酵母中表达得到。
在本发明的一种实施方式中，所述PAPS再生系统，是在1-200mM的pH 5-9的Tris-HCl溶液中，添加0.1-50mM PNPS、1-200μM PAP、0.1-100μgASST IV。
在本发明的一种实施方式中，所述酰基硫酸转移酶(aryl sulfotransferase,ASST IV)是将NCBI中Gene ID：83783的基因以pET系列载体为表达载体，在大肠杆菌进行表达得到的。
在本发明的一种实施方式中，制备硫酸软骨素时，向PAPS再生系统中添加0.1-100μgC4ST或C6ST。
在本发明的一种实施方式中，ASST IV的酶活为0.1-100nmol/min·mg·蛋白，C4ST的酶活为0.1-100pmol/min·mg·蛋白，C6ST的酶活为0.1-100pmol/min·mg·蛋白。
在本发明的一种实施方式中，制备硫酸软骨素时，酶催化反应温度为10-50℃。
在本发明的一种实施方式中，制备硫酸软骨素时，酶催化反应温度为25-50℃。
在本发明的一种实施方式中，制备硫酸软骨素时，酶促反应时间为1-50h。
在本发明的一种实施方式中，制备硫酸软骨素时，酶促反应时间为20-50h。
本发明首次采用微生物细胞表达动物来源的C4ST和C6ST，得到具有生物学活性的酶，整合软骨素及ASST，得到具有生物学活性的硫酸软骨素CSA及CSC，且转化率达到10-30％，具有巨大的工业应用价值。
附图说明
图1重组表达ASST IV的SDS-PAGE图，其中M：Marker；1：以pET系列载体构建的重组菌株的胞内全细胞SDS-PAGE图谱；2：以pUC系列载体构建的重组菌株的胞内全细胞SDS-PAGE图谱；3：以pET系列载体构建的重组菌株的胞内全细胞SDS-PAGE图谱；4：以pUC系列载体构建的重组菌株的胞内全细胞SDS-PAGE图谱。
图2重组表达C4ST、C6ST的SDS-PAGE图，其中M：Marker；1：以pPET系列载体构建的表达C4ST的重组菌株的胞外上清SDS-PAGE图谱；2：以pUC系列载体构建的表达C4ST的重组菌株的胞外上清SDS-PAGE图谱；3：以pPET系列载体构建的表达C6ST的重组菌株的胞外上清SDS-PAGE图谱；4：以pUC系列载体构建的表达C6ST的重组菌株的胞外上清SDS-PAGE图谱。
图3重组表达C4ST、C6ST的Western blot图谱，其中M：Marker；1：以pPIC系列载体构建的表达C4ST的重组菌株的胞外上清Western blot图谱；2：以pGAPZ系列载体构建的表达C4ST的重组菌株的胞外上清Western blot图谱；3：以pPIC系列载体构建的表达C6ST的重组菌株的胞外上清Western blot图谱；4：以pGAPZ系列载体构建的表达C6ST的重组菌株的胞外上清Westernblot图谱。
图4 C4ST及C6ST酶活，其中，两种酶催化反应都基于两种底物动物来源硫酸软骨素及微生物来源软骨素，C4ST(□)，C6ST(■)。
图5硫酸软骨素A、C二糖单位质谱图，其中，(a)C4ST催化产物二糖单位质谱图；(b)软骨素二糖单位质谱图；(c)C6ST催化产物二糖单位质谱图。
具体实施方式
ASST IV：酰基硫酸转移酶IV，编码该酶的基因序列参见NCBI中Gene ID：83783。
C4ST：软骨素4-硫酸转移酶，编码该酶的基因序列参见NCBI中Gene ID：58250。
C6ST：软骨素6-硫酸转移酶，编码该酶的基因序列参见NCBI中Gene ID：53374。
CS：硫酸软骨素
PNPS：对硝基苯磺酸
PNP：对硝基苯酚
PAP：3’5’-二磷酸腺苷
C4ST、C6ST的酶活测定方法：以软骨素为原料，构建催化反应体系，包括20mMTris-HCl(pH7.0)，3mM PNPS，20μM PAP，10mgASST IV，5mg/mL软骨素及20μg C4ST或C6ST，37℃，反应20h后100℃加热5min终止反应后在400nm波长下测定吸光值。
产物得率的计算公式：Y＝10-3*(18.83*(AC-AASSTIV)+0.38)；其中，AC为C4ST或C6ST酶活测定时的吸光值；AASSTIV为对照吸光值。
实施例1 PAPS再生系统
PAPS再生系统组分浓度为：PNPS的浓度为3mM，PAP的浓度为20μM，ASST IV 10mg，以1-200mM的pH 5-9的Tris-HCl为基底液。加入C4ST或C6ST作为软骨素硫酸化的硫酸基供体。
实施例2工具酶ASST IV、C4ST、C6ST的制备
(1)重组大肠杆菌的摇瓶表达
以诱导性载体pET系列载体pET26b为载体，分别构建pET26b-ASSTIV、pET26b-C4ST、pET26b-C6ST，转化大肠杆菌得到转化子。以pUC系列载体分别构建携带编码ASST IV、C4ST、C6ST的基因的重组表达载体，转化大肠杆菌得到转化子，作为对照。
挑取以pET系列载体构建的重组菌株单菌落于3mL LB培养基(加入终浓度为50μg/mL的氨苄青霉素)中，37℃，200rpm培养过夜。按1％(V/V)的比例转接50mLTB培养基(加入终浓度为50μg/mL的氨苄青霉素)，37℃，200rpm培养2h至OD600nm大约在0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，诱导48h。将上述培养物于8000rpm，4℃离心5min收集菌体，用预冷的Tris-HCl(pH 7.0)清洗、重悬菌体至50mL，冰浴超声，条件为：400W，工作2s，间歇3s，200个循环至菌液澄清，14000rpm，4℃离心20min，收集上清，即为粗酶液(图1、图2)。
从图1可以看出，以pET26b载体构建的重组菌株的胞内全细胞有明显的ASST IV条带。从图2可以看出，以pET26b载体构建的表达C4ST、C6ST的重组菌株的胞外上清中出现了相应目的条带，而以pUC系列载体构建的重组菌则未能成功表达两酶。
(2)重组毕赤酵母的摇瓶表达
以诱导性启动子pPIC系列载体构建pPIC3.5-C4ST、pPIC3.5-C6ST转化毕赤酵母得到转化子；以pGap系列载体构建重组表达载体后转化毕赤酵母得到转化子，作为对照。挑取以pPIC系列载体构建重组菌株单菌落于3mLYPD培养基中，30℃，200rpm培养过夜。按1％(V/V)的比例转接50mLBMMY培养基(加入终浓度为0.5g/L的甲醇)中，20℃，200rpm诱导5d。将上述培养物于8000rpm，4℃离心5min收集上清，即为粗酶液(图3)。
从图3可以看出，以pPIC系列载体构建的重组菌株实现了酶的分泌表达，而以pGap系列载体构建的重组菌则未能实现表达。
(3)ASST-IV、C4ST、C6ST工具酶的纯化
用BufferA(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，20mM咪唑，pH 7.4)平衡Ni-NTAAgaroseFastFlow柱子后，将粗酶液透过0.22μm滤膜后，上清液以3mL/min的速度通过Ni-NTAAgaroseFast Flow柱子，结合10min后，Buffer B(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，500mM咪唑，pH7.4)洗脱收集酶活性部分，浓缩，冷冻干燥，测算酶活(图4)。
实施例3 CSA的制备
以发酵得到的软骨素为原料，构建催化反应体系，包括20mM Tris-HCl(pH7.0)，3mMPNPS，20μM PAP，10mgASST IV(酶活单位0.1-100nmol/min·mg·protein)，5mg/mL软骨素及20μg C4ST(酶活单位0.1-100pmol/min·mg·protein)，37℃，反应20h后100℃加热5min终止反应。
实施例4 CSC的制备
以发酵得到的软骨素为原料，反应液包括20mM Tris-HCl(pH7.0)，3mM PNPS，20μMPAP，10mgASST IV，5mg/mL软骨素及20μg C6ST(酶活单位0.1-100pmol/min·mg·protein)，37℃，反应20h后100℃加热5min终止反应。
实施例5 CSA、CSC的检测
以CSA、CSC的制备液为底物，加入软骨素酶，37℃，反应5-20h后100℃加热5min终止反应，透过0.22μm的滤膜后进行LC-MS检测。LC的检测条件如下：流动相A(8mM乙酸)，流动相B(8mM乙酸，70％甲醇/水溶液)，柱子：C18Reverse phase column，0.3mm*250mm，洗脱条件见表1。MS的条件如下：雾化载气速度0.75L/min，雾化温度140℃，干燥载气N2速度1.2L/min，阴离子模式扫描M/Z范围40-2000，得到特征峰M/Z 397、458(图5)。
表1
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种制备硫酸软骨素的方法，其特征在于，是以含软骨素为底物，经PAPS再生系统和软骨素4-硫酸转移酶硫酸化修饰形成不含其他糖胺聚糖的CSA；或者经PAPS再生系统和软骨素6-硫酸转移酶硫酸化修饰形成不含其他糖胺聚糖的CSC；编码所述软骨素4-硫酸转移酶、软骨素6-硫酸转移酶的基因来源于动物，在微生物中异源表达得到；所述软骨素4-硫酸转移酶是将NCBI中Gene ID：58250的基因以pET系列载体为表达载体，在大肠杆菌进行表达得到的，或者以pPIC系列载体为表达载体在毕赤酵母中表达得到的；所述软骨素6-硫酸转移酶是将NCBI中Gene ID：53374的基因以pET系列载体为表达载体，在大肠杆菌中表达得到的；或者以pPIC系列载体为表达载体在毕赤酵母中表达得到。
2.根据权利要求1所述的一种制备硫酸软骨素的方法，其特征在于，所述PAPS再生系统，是在1-200mM的pH 5-9的Tris-HCl溶液中，添加0.1-50mM PNPS、1-200μM PAP、0.1-100μg酰基硫酸转移酶。
3.根据权利要求2所述的一种制备硫酸软骨素的方法，其特征在于，所述酰基硫酸转移酶是将NCBI中Gene ID：83783的基因以pET26b为表达载体，在大肠杆菌进行表达得到的。
4.根据权利要求2所述的一种制备硫酸软骨素的方法，其特征在于，制备硫酸软骨素时，向PAPS再生系统中添加0.1-100μg C4ST或C6ST。
5.根据权利要求1～4所述的一种制备硫酸软骨素的方法，其特征在于，制备硫酸软骨素时，酶催化反应温度为10-50℃，酶促反应时间为1-50h。
6.根据权利要求1～4所述的一种制备硫酸软骨素的方法，其特征在于，制备硫酸软骨素时，酶催化反应温度为25-50℃，酶促反应时间为20-50h。
7.一种重组大肠杆菌，其特征在于，在大肠杆菌以pET系列载体为表达载体表达NCBI中Gene ID：58250的基因编码的软骨素4-硫酸转移酶。
8.一种重组大肠杆菌，其特征在于，在大肠杆菌以pET系列载体为表达载体表达NCBI中Gene ID：53374的基因编码的软骨素6-硫酸转移酶。
9.一种重组毕赤酵母，其特征在于，在毕赤酵母中以pPIC系列载体为表达载体表达NCBI中Gene ID：58250的基因编码的软骨素4-硫酸转移酶。
10.一种重组毕赤酵母，其特征在于，在毕赤酵母中以pPIC系列载体为表达载体表达NCBI中Gene ID：53374的基因编码的软骨素6-硫酸转移酶。
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