CN103484513B - 一种酶法制备小分子寡聚透明质酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酶法制备小分子寡聚透明质酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明采用水蛭来源的透明质酸酶，通过水解高分子透明质酸，实现了高效制备四糖、六糖、八糖和十糖等特定小分子量的寡聚透明质酸。本发明为高效制备特定小分子的寡聚透明质酸奠定了一定的基础，适合于工业化生产应用。

Description

一种酶法制备小分子寡聚透明质酸的方法

技术领域

本发明涉及一种酶法制备小分子寡聚透明质酸的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

透明质酸(hyaluronic acid，简称HA)，俗称玻璃尿酸，是一种由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖为重复双糖单位，通过β(1-3)和β(1-4)糖苷键交替连接而成的大分子黏性多糖，1934年由Meyer等人从牛玻璃球眼中首次提取获得。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子，由于HA具有良好的保湿性、粘弹性、渗透性和延展性，同时无任何免疫原性和毒性，被广泛应用于化妆品、食品和医药等行业领域。

根据文献研究表明，分子量大小对HA的生物活性影响较大，不同分子量范围的HA却表现出截然不同的生理学功能。高分子量的HA(Mr>2×10⁶)由于具有较好的粘弹性、保湿性、抑制炎性反应、润滑等功能，可应用于高端化妆品行业、眼科手术黏弹剂和关节腔内注射治疗。中等分子量的HA（介于1×10⁶-10⁵）具有良好的保湿性、润滑和药物缓释作用，可广泛用于化妆品、滴眼液、皮肤烧伤愈合及术后防粘连。低分子量的HA（低于1×10⁴）和寡聚透明质酸，表现出非常强的生物活性，具有抑制肿瘤扩散、促进创伤愈合、促进骨和血管生成、免疫调节等作用，且易于渗透到真皮中，免疫细胞、细胞因子的激活剂。因此，小分子透明质酸在食品保健、化妆品以及临床医疗领域具有广阔的应用前景。

当前制备小分子量的方法主要集中在物理法和化学法。物理法主要为加热、机械剪切力、紫外线、超声波、⁶⁰Co照射、γ-射线辐射等方法促使HA发生降解。物理降解法处理过程简单，产品已于回收。但是，这些方法都会带来一定的影响，例如加热法易使HA变色，紫外和超声效率较低等，且产生的小分子分子量范围较大，产品稳定性较差。HA的化学降解方法有水解法和氧化降解法，水解法分酸水解（HCl）和碱水解（NaOH），氧化降解常用的氧化剂为次氯酸钠（NaClO）和过氧化氢（H₂O₂）。但化学降解法引入了化学试剂，反应条件复杂，易给HA性质产生影响和给产品的纯化带来困难，且产生大量的工业废水。

本发明为解决制备小分子HA的问题，采用生物酶法催化降解HA，产生分子量范围均一的小分子寡聚透明质酸。由于生物酶法反应条件温和、专一性高、且产品纯度高，易于实现工业化生产制备小分子透明质酸。

发明内容

本发明公开了一种酶法制备小分子寡聚透明质酸的方法，是向反应体系中添加一定浓度的高分子透明质酸溶液和一定浓度的透明质酸酶溶液，反应一定时间制备得到小分子寡聚透明质酸；编码所述透明质酸酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述高分子HA溶液中HA的分子量是10⁴kDa以上，优选10⁴-10⁷kDa。

所述高分子HA溶液是用50mM、pH5.5的柠檬酸缓冲液配置成1-100g/L的溶液，优选2g/L。

所述透明质酸酶溶液为纯酶液，不含其它盐，其中反应体系中添加酶活单位数（U）与HA质量（mg）比为100-13000。

所述反应体系溶液的pH值控制在4.0-8.0之间，优选pH5.5。

所述反应体系的温度在10℃-65℃之间，优选38℃。

所述反应体系的反应时间为4-8h。

在1ml反应体系中，加入HA溶液（2g/L）0.8ml，酶液（2.43×10⁵U/mL）8μl，其余用柠檬酸缓冲液补足至1ml体系，在38℃条件下反应4h，得到寡聚透明质酸八糖(HA-8)和十糖(HA-10)。

在1ml反应体系中，加入HA溶液（2g/L）0.8ml，加入酶液（2.43×10⁵U/mL）41μl，其余用柠檬酸缓冲液补足至1ml体系，在38℃条件下反应8h，得到寡聚透明质酸四糖(HA-4)和六糖(HA-6)。

在1ml反应体系中，加入HA溶液（2g/L）0.8ml，酶液（2.43×10⁵U/mL）8μl，其余用柠檬酸缓冲液补足至1ml体系，在38℃条件下反应6h，得到HA-4、HA-6、HA-8。

在1ml反应体系中，加入HA溶液（2g/L）0.8ml，酶液（2.43×10⁵U/mL）10μl，其余用柠檬酸缓冲液补足至1ml体系，在38℃条件下反应5h，得到HA-4、HA-6、HA-8、HA-10。

所述高分子透明质酸可水解为小分子量的寡聚透明质酸，分子量低于10000道尔顿。

本发明利用透明质酸酶直接降解HA制备寡聚糖小分子，具有直接的目的性。与其他方式相比，该发明具有非常大的应用优势。首先，反应条件极其简单，对仪器设备无要求，在常温常压下即可实施；其次酶水解工艺不需添加任何有机试剂，无任何污染废弃物产生；最后，小分子寡聚透明质酸的转化产率高达95%以上，产物在水溶液中比较单一，易于纯化回收。基于应用分析，本发明方法在工业上用于制备单一寡聚透明质酸及其衍生体具有潜在而非常广泛的价值。

附图说明

图1所示为透明质酸酶降解HA产物的LCMS-IT-TOF质谱总离子流峰图；

图2所示为透明质酸酶降解HA产物的LCMS-IT-TOF质谱总离子流峰图；

图3所示为透明质酸酶降解HA产物的LCMS-IT-TOF质谱总离子流峰图；

图4所示为透明质酸酶降解HA产物的LCMS-IT-TOF质谱总离子流峰图。

具体实施方式

水解产物检测分析方法：以岛津公司的LCMS-IT-TOF液质联用仪进行产物分析，质谱选择阴离子检测模式。流动相选择为：21min乙腈浓度线性递增至12%，至22min降为0。

实施例1透明质酸酶的表达

全化学合成经改造的透明质酸酶基因序列（SEQ ID NO.1），酶切连接至表达载体pPIC9K构建重组质粒pPIC9K-His-HaseA3887，转化至E.coil DH5α中，提取质粒测序验证。将重组质粒经SalI线性化后电转入表达宿主P.pastoris GS115中，重组克隆子经PCR验证正确。

重组P.pastoris GS115/pPIC9K-His-HaseA3887克隆子进行发酵培养表达。单克隆接种于5ml的YPD培养基（酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L），30℃、200rpm培养16h。按10%的接种量转接于100ml的诱导表达培养基BMGY（酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，3g/L K₂HPO₄，11.8g/L KH₂PO₄，10×YNB100ml/L(13.4g/L)，500×生物素1mL(4×10^-4g/L)，甘油10mL），30℃200rpm培养至OD₆₀₀值为4之间。离心收集菌体，更换至100mL诱导表达培养基BMMY（酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，3g/L K₂HPO₄，11.8g/L KH₂PO₄，100×YNB100mL/L(13.4g/L)，500×生物素1mL(4×10^-4g/L)，甲醇5mL），30℃200rpm培养，每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为1.0%（v/v）进行诱导表达，诱导表达96h。

实施例2重组透明质酸酶的纯化制备

SEQ ID NO.1所示的基因经转录翻译后在透明质酸酶N端融合了6个连续组氨酸标签，根据亲和层析原理，该标签能特异性与葡聚糖镍结合。葡聚糖镍先用pH6.0、50mM的磷酸盐缓冲液平衡30min，再加入经过0.45μm过滤的发酵液，在4℃孵育2h，依次用相同缓冲液配置的0、10、20、30、40、50mM的咪唑缓冲液进行洗脱杂质。最后用500mM的咪唑缓冲液洗脱目标蛋白。高浓度咪唑洗脱的目标蛋白进行过夜透析。获得单一条带的透明质酸酶纯蛋白，所得透明质酸酶纯蛋白，经测定，具有透明质酸酶活力。

实施例3寡聚透明质酸八糖(HA-8)和十糖(HA-10)的制备

以实施例2制备的透明质酸酶（纯酶水溶液，酶活2.43×10⁵U/mL），对大分子量（10⁴-10⁷kDa）透明质酸进行水解。透明质酸（HA）用50mM、pH5.5的柠檬酸缓冲液配置成2mg/ml。在1ml反应体系中，加入HA溶液0.8ml，酶液8μl，其余用柠檬酸缓冲液（pH6.0、50mM）补足至1ml体系，在38℃条件下反应4h。反应结束后，立即沸水浴使酶灭活。反应体系采用0.22μm的滤膜过滤，进行LCMS-IT-TOF质谱仪分析产物分子量大小。结果如图1所示，在质谱总离子流峰图上的17.5min出现的质谱峰在阴离子模式下M/Z为766.22，经分析比较为[M-2H]^2-,分析确认为透明质酸八糖分子寡聚糖。22.5min出现的质谱峰M/Z为955.78[M-2H]^2-，为透明质酸八糖分子寡聚糖。

实施例4寡聚透明质酸四糖(HA-4)和六糖(HA-6)的制备

取透明质酸（10⁴-10⁷kDa，用50mM、pH5.5的柠檬酸缓冲液配置成2mg/ml）0.8ml加入至1ml反应体系中，加入酶液（纯酶水溶液，酶活2.43×10⁵U/mL）41μl，其余用柠檬酸缓冲液（pH6.0、50mM）补足至1ml体系，在38℃条件下反应8h。反应结束后，立即沸水中放置灭活酶。反应体系采用0.22μm的滤膜过滤，进行LCMS-IT-TOF质谱仪分析产物分子量大小。结果如图2所示，在质谱总离子流峰图上的11-12min出现的质谱峰在阴离子模式下M/Z为775.22[M-H]^－,分析确认为透明质酸四糖分子寡聚糖。16.5-18min出现的质谱峰M/Z为576.66[M-2H]^2－，为透明质酸六糖分子寡聚糖。同时，该反应制备的水解产物中，未检测到透明质酸八糖或者十糖以及更多单位聚糖的水解产物。说明该反应制备的全部产物非常均一。

实施例5控制反应条件制备多种寡聚透明质酸的水解产物

根据反应条件，可以控制不同的酶量和反应时间以及底物的添加量来制备获取不同的透明质酸寡聚体。在1ml反应体系中，加入HA（10⁴-10⁷kDa，2g/L）0.8ml，酶液（纯酶水溶液，酶活2.43×10⁵U/mL）8μl，其余用柠檬酸缓冲液（pH6.0、50mM）补足至1ml体系，在38℃条件下反应6h。反应结束后，立即沸水中使酶灭活。反应体系采用0.22μm的滤膜过滤，进行LCMS-IT-TOF质谱仪分析产物分子量大小。从质谱图结果图3所示，质谱峰呈现出M/Z响应值的775.22[M-H]^－、576.66[M-2H]^2－、766.22[M-2H]^2－三个主峰，分别为HA-4、HA-6、HA-8。且不存在其他分子量的寡聚糖水解产物。

同理，在1ml反应体系中，加入HA（10⁴-10⁷kDa，2g/L）0.8ml，酶液（纯酶水溶液，酶活2.43×10⁵U/mL）10μl，其余用柠檬酸缓冲液（pH6.0、50mM）补足至1ml体系，在38℃条件下反应5h。反应结束后，立即沸水使酶灭活。同样进行质谱分析，获得了775.22[M-H]^－、576.66[M-2H]^2－、766.22[M-2H]^2－、955.78[M-2H]^2-，该四个质谱峰（如图4所示）分别对应HA-4、HA-6、HA-8、HA-10。

Claims (5)

1.一种酶法制备小分子寡聚透明质酸的方法，是向反应体系中添加一定浓度的高分子透明质酸(HA)溶液和一定浓度的透明质酸酶溶液，反应一定时间制备得到小分子寡聚透明质酸；编码所述透明质酸酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述高分子HA的分子量是10⁴kDa以上，配置成1-100g/L的溶液；反应体系中酶的添加量为100-13000U每毫克HA；所述反应体系溶液的pH为4.0-8.0，温度为10℃-65℃，反应时间为4-8h。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在1ml反应体系中，加入0.8ml 2g/L的HA溶液，加入2.43×10⁵U/mL的酶液8μl，其余用柠檬酸缓冲液补足至1ml体系，在38℃条件下反应4h，得到寡聚透明质酸八糖和十糖。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在1ml反应体系中，加入0.8ml 2g/L的HA溶液，加入2.43×10⁵U/mL的酶液41μl，其余用柠檬酸缓冲液补足至1ml体系，在38℃条件下反应8h，得到寡聚透明质酸四糖HA-4和六糖HA-6。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在1ml反应体系中，加入0.8ml 2g/L的HA溶液，加入2.43×10⁵U/mL的酶液8μl，其余用柠檬酸缓冲液补足至1ml体系，在38℃条件下反应6h，得到HA-4、HA-6、HA-8。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在1ml反应体系中，加入0.8ml 2g/L的HA溶液，加入2.43×10⁵U/mL的酶液10μl，其余用柠檬酸缓冲液补足至1ml体系，在38℃条件下反应5h，得到HA-4、HA-6、HA-8、HA-10。