CN110951714B

CN110951714B - 一种透明质酸水解酶及其编码序列和利用其制备寡聚透明质酸盐的方法

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Publication number: CN110951714B
Application number: CN201911377014.4A
Authority: CN
Inventors: 李斌; 余允东; 徐飞; 祝俊; 邵凡涛
Original assignee: Jiangsu Chengxin Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Jiangsu Chengxin Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2019-12-27
Filing date: 2019-12-27
Publication date: 2023-02-03
Anticipated expiration: 2039-12-27
Also published as: WO2021129353A1; CN110951714A

Abstract

本发明提供了一种透明质酸水解酶及其编码序列和利用其制备寡聚透明质酸盐的方法。本发明提供的带有编码透明质酸水解酶的核苷酸序列可以通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节所述编码基因的表达，高效表达透明质酸水解酶，为寡聚透明质酸的生产提供有效途径。使用所述透明质酸水解酶水解透明质酸，操作简单，条件温和，效率较高，得到的寡聚透明质酸的纯度较高，同时发酵来源的透明质酸水解酶成本较低，适合大规模的工业化生产。

Description

一种透明质酸水解酶及其编码序列和利用其制备寡聚透明质酸盐的方法

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，尤其涉及一种透明质酸水解酶及其编码序列和利用其制备寡聚透明质酸盐的方法。

背景技术

透明质酸(HyaluroIlic acid，简称HA)又名玻璃酸，是一种大分子粘多糖，由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖重复单元构成的无分支高分子糖胺聚糖，N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸通过β-1,3和β-1,4糖苷键反复交替连接，分子中两种单糖按等摩尔比组成，分子式为(C₁₄H₂₁NO₁₁)_n。其结构式为：

透明质酸存在于动物组织间质或某些细菌的荚膜中，广泛用于医药、化妆品、食品等领域，分子量一般为1×10⁵-10⁷Da。研究表明，分子量对透明质酸的活性有很大影响，不同分子量的透明质酸甚至表现出截然相反的活性。

寡聚透明质酸是分子量小于10000Da的透明质酸，其在体内具有促血管生成作用，在体外可促进内皮细胞的增生，促进创伤愈合。此外，寡聚透明质酸分子中的羟基、羧基和其他极性基团可与水分子形成氢键而结合大量的水分，保水效果明显，因此寡聚透明质酸可用于防晒、抗衰老、保湿化妆品中。

目前，透明质酸降解的方法主要有物理降解、化学降解、生物降解三大类。物理降解法包括加热、超声波降解、紫外线、机械剪切力降解、γ-射线辐射降解、⁶⁰Co射线和微波降解等。物理降解法不需要化学试剂，不污染环境，后处理过程简单，且得到产品的相对分子质量分布范围窄，热稳定性好，但是此法降解时间较长，不利于大规模生产，为降低成本，则多使用化学降解法。化学降解法主要有碱水解、酸水解和氧化降解。

化学降解法通过控制化学试剂的加入量和反应时间即可控制产品的相对分子质量，降解时间短，降低了生产成本，但是其缺点在于需要较剧烈的反应条件(如较高的酸碱浓度等)才能达到最大程度的降解。此时，不但糖链上的糖苷键断裂，单糖(葡糖醛酸和乙酰氨基葡糖)残基的结构也遭到破坏，如乙酰基被水解掉，单糖六元环断裂等(表现在红外图谱上是与欧洲药典标准图谱不一致)，对制得的寡聚透明质酸的生物学活性产生一定影响。化学降解法制备的寡聚透明质酸还容易褐变，生产过程会污染环境。

CN101429255A公开了一种低分子透明质酸钠的制备方法，即透明质酸钠固体粉末在含有酸(如硫酸、盐酸等)的有机溶剂中，有机溶剂浓度70-100％，进行酸催化降解，制备分子量5000-900000Da的低分子透明质酸钠。但该方法需要脱除有机溶剂，工艺繁琐。

生物降解中酶解法反应条件温和，不用强酸强碱，制备的寡聚透明质酸不会发生褐变，不会造成环境污染，并且酶解法制备的寡聚透明质酸的双糖结构完整，红外图谱与欧洲药典一致，因此酶解法最适合制备寡聚透明质酸。但是，现有的透明质酸酶活性较差，成本较高，不适用于工业化生产。

因此，需要提供一种活性较高、能够高效水解透明质酸的透明质酸水解酶来制备寡聚透明质酸。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种透明质酸水解酶及其编码序列和利用其制备寡聚透明质酸盐的方法。所述透明质酸水解酶活性较高，利用该水解酶制备寡聚透明质酸时操作简单，效率较高。为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种透明质酸水解酶，所述透明质酸水解酶具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中的任意一个：

(I)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(II)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有≥90％同源性的氨基酸序列；

(III)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加至少一个氨基酸获得的氨基酸序列。

以上所述的氨基酸序列均具有透明质酸水解酶的活性，且本发明提供的透明质酸水解酶活性较高，能够高效水解透明质酸，将其水解为分子量较低的寡聚透明质酸，且产物的含量较高。对生物酶法制备寡聚透明质酸的效率有较大的提升，有利于工业化生产。同时，本发明提供的透明质酸水解酶还能够应用于医疗、美容等领域。

本发明中，所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列来自迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)，包括1233个氨基酸，其分子量为138.14KDa。

作为本发明的优选技术方案，所述透明质酸水解酶具有与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有≥95％(例如可以是95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％等)同源性的氨基酸序列。

其中，SEQ ID NO.1的序列为：

SDSQPLLNTSFEETEKANTGWDELGASKWSVWKPTGSPVVSISNDASYTGDYGLKISANDNGRAAVSQDVSVEGGKSYALSTWVRTEDIVSSQGARMRVVLYEGDQQLDLLYSNRLTGTHDWSQIKMEVKVPVNVDSIRVQLFFETGTGTAMFDDVSLELINPAQAIAMEQSEMVLKKGETTLLNVQVDPVDTSSLISWTSTDGTVATVENGTVTGLAVGETLITASTDNGLSASTLVKVVEKDGIEGPSIGEIELHPKELKLESGQVRLLKASTTPENANTEKLIWGSSNKEVASVQGGMVEAHFAGTATITVETEDGKIKGESQITVIDTEQDEYDQLRNRWESQITSLDYFDATNERMVEVIENKTKTAEKLWKSMVKNENRSYLWIDFTSKDDSADIRANYRNLTAMAHAFANEHSSLYRNPALFQDILSALEWLYQNQYNENIVQYSNWWHWEIGVPNELNNIMVLLYDYMDKETVHRYLKVVDHFQPDPTKSGATTPGNYREAVGANRIDVSKVVGVRGVIVKDADKIASARDALSQTFENVTEGDGFYKDGSFVQHENIAYNGSYGIVLIEGLTVLLDLLSDSTWDVTDPKVSNVYEWIENAYEPFMYKGALMDMVRGRAISRSFLQDHTAGHTIIKSVIRMAQFAPEPFAEKYERMAKYWLQEDTFSNYMENEGNFRDMTLAKQLLDNQQVTARGDLDFHKTFAAMDRVVHRKTGYAFGISMYSARIQNYEDMNNENRKGWYTGEGMTYLYNVDLGQYSNDFWPTVDPYRMPGTTIDTMKRVDGSGEHTSSETWVGGSTLNDRFGTTGMSYKGWNSSLTAKKSWFMFDDEIVALGSGIHSDEERNIETIVENRKIHDDGSNKLVINGETPDLSDTNDQTFDADWAFLEGNVKGADIGYYFPEGKALTVKKEERTGAWKDINYGEPADRIKRSYATMWFNHGIKPNNDTYSYVLLPGRSEKQTEKYAKQPDVQILRNDPAVQAVQDVKKNLIGANFWNDEKQTVGPLTAYQKASVTFQEKDGVLEIAVSDPTMKNKGVIEIDIDGEMAKLLKADENIKIEQVNKVLKLEVNVNQAQGETFTAKLQMTSDSIEPIKPGITIQANGHVELLKSLHTGKKVHIHSKWTTGADNNLVGKASIHITPQGMRLDLKEAELLRLDEDHAEIRAKAFDQNNNMYTVQLIMNIVSKSSSQLSVHVWTGEAEDRKSVIAINDQAFQGSLKISNFKE。

第二方面，本发明提供编码第一方面所述的透明质酸水解酶的核苷酸，所述核苷酸具有(I)、(II)或(III)所示的核苷酸序列中的任意一个：

(I)编码第一方面所述的透明质酸水解酶的核苷酸序列；

(II)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

(III)与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有≥85％同源性的核苷酸序列。

作为本发明的优选技术方案，所述透明质酸水解酶具有与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有≥90％(例如可以是90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％等)同源性的核苷酸序列。

其中，SEQ ID NO.2的序列为：

TCTGATTCTCAACCATTGTTGAACACTTCTTTTGAAGAAACTGAAAAGGCTAACACTGGTTGGGATGAATTGGGTGCTTCTAAGTGGTCTGTTTGGAAGCCAACTGGTTCTCCAGTTGTTTCTATTTCTAACGATGCTTCTTACACTGGTGATTACGGTTTGAAGATTTCTGCTAACGATAACGGTAGAGCTGCTGTTTCTCAAGATGTTTCTGTTGAAGGTGGTAAGTCTTACGCTTTGTCTACTTGGGTTAGAACTGAAGATATTGTTTCTTCTCAAGGTGCTAGAATGAGAGTTGTTTTGTACGAAGGTGATCAACAATTGGATTTGTTGTACTCTAACAGATTGACTGGTACTCATGATTGGTCTCAAATTAAGATGGAAGTTAAGGTTCCAGTTAACGTTGATTCTATTAGAGTTCAATTGTTTTTTGAAACTGGTACTGGTACTGCTATGTTTGATGATGTTTCTTTGGAATTGATTAACCCAGCTCAAGCTATTGCTATGGAACAATCTGAAATGGTTTTGAAGAAGGGTGAAACTACTTTGTTGAACGTTCAAGTTGATCCAGTTGATACTTCTTCTTTGATTTCTTGGACTTCTACTGATGGTACTGTTGCTACTGTTGAAAACGGTACTGTTACTGGTTTGGCTGTTGGTGAAACTTTGATTACTGCTTCTACTGATAACGGTTTGTCTGCTTCTACTTTGGTTAAGGTTGTTGAAAAGGATGGTATTGAAGGTCCATCTATTGGTGAAATTGAATTGCATCCAAAGGAATTGAAGTTGGAATCTGGTCAAGTTAGATTGTTGAAGGCTTCTACTACTCCAGAAAACGCTAACACTGAAAAGTTGATTTGGGGTTCTTCTAACAAGGAAGTTGCTTCTGTTCAAGGTGGTATGGTTGAAGCTCATTTTGCTGGTACTGCTACTATTACTGTTGAAACTGAAGATGGTAAGATTAAGGGTGAATCTCAAATTACTGTTATTGATACTGAACAAGATGAATACGATCAATTGAGAAACAGATGGGAATCTCAAATTACTTCTTTGGATTACTTTGATGCTACTAACGAAAGAATGGTTGAAGTTATTGAAAACAAGACTAAGACTGCTGAAAAGTTGTGGAAGTCTATGGTTAAGAACGAAAACAGATCTTACTTGTGGATTGATTTTACTTCTAAGGATGATTCTGCTGATATTAGAGCTAACTACAGAAACTTGACTGCTATGGCTCATGCTTTTGCTAACGAACATTCTTCTTTGTACAGAAACCCAGCTTTGTTTCAAGATATTTTGTCTGCTTTGGAATGGTTGTACCAAAACCAATACAACGAAAACATTGTTCAATACTCTAACTGGTGGCATTGGGAAATTGGTGTTCCAAACGAATTGAACAACATTATGGTTTTGTTGTACGATTACATGGATAAGGAAACTGTTCATAGATACTTGAAGGTTGTTGATCATTTTCAACCAGATCCAACTAAGTCTGGTGCTACTACTCCAGGTAACTACAGAGAAGCTGTTGGTGCTAACAGAATTGATGTTTCTAAGGTTGTTGGTGTTAGAGGTGTTATTGTTAAGGATGCTGATAAGATTGCTTCTGCTAGAGATGCTTTGTCTCAAACTTTTGAAAACGTTACTGAAGGTGATGGTTTTTACAAGGATGGTTCTTTTGTTCAACATGAAAACATTGCTTACAACGGTTCTTACGGTATTGTTTTGATTGAAGGTTTGACTGTTTTGTTGGATTTGTTGTCTGATTCTACTTGGGATGTTACTGATCCAAAGGTTTCTAACGTTTACGAATGGATTGAAAACGCTTACGAACCATTTATGTACAAGGGTGCTTTGATGGATATGGTTAGAGGTAGAGCTATTTCTAGATCTTTTTTGCAAGATCATACTGCTGGTCATACTATTATTAAGTCTGTTATTAGAATGGCTCAATTTGCTCCAGAACCATTTGCTGAAAAGTACGAAAGAATGGCTAAGTACTGGTTGCAAGAAGATACTTTTTCTAACTACATGGAAAACGAAGGTAACTTTAGAGATATGACTTTGGCTAAGCAATTGTTGGATAACCAACAAGTTACTGCTAGAGGTGATTTGGATTTTCATAAGACTTTTGCTGCTATGGATAGAGTTGTTCATAGAAAGACTGGTTACGCTTTTGGTATTTCTATGTACTCTGCTAGAATCCAAAACTACGAAGATATGAACAACGAAAACAGAAAGGGTTGGTACACTGGTGAAGGTATGACTTACTTGTACAACGTTGATTTGGGTCAATACTCTAACGATTTTTGGCCAACTGTTGATCCATACAGAATGCCAGGTACTACTATTGATACTATGAAGAGAGTTGATGGTTCTGGTGAACATACTTCTTCTGAAACTTGGGTTGGTGGTTCTACTTTGAACGATAGATTTGGTACTACTGGTATGTCTTACAAGGGTTGGAACTCTTCTTTGACTGCTAAGAAGTCTTGGTTTATGTTTGATGATGAAATTGTTGCTTTGGGTTCTGGTATTCATTCTGATGAAGAAAGAAACATTGAAACTATTGTTGAAAACAGAAAGATTCATGATGATGGTTCTAACAAGTTGGTTATTAACGGTGAAACTCCAGATTTGTCTGATACTAACGATCAAACTTTTGATGCTGATTGGGCTTTTTTGGAAGGTAACGTTAAGGGTGCTGATATTGGTTACTACTTTCCAGAAGGTAAGGCTTTGACTGTTAAGAAGGAAGAAAGAACTGGTGCTTGGAAGGATATTAACTACGGTGAACCAGCTGATAGAATTAAGAGATCTTACGCTACTATGTGGTTTAACCATGGTATTAAGCCAAACAACGATACTTACTCTTACGTTTTGTTGCCAGGTAGATCTGAAAAGCAAACTGAAAAGTACGCTAAGCAACCAGATGTTCAAATTTTGAGAAACGATCCAGCTGTTCAAGCTGTTCAAGATGTTAAGAAGAACTTGATTGGTGCTAACTTTTGGAACGATGAAAAGCAAACTGTTGGTCCATTGACTGCTTACCAAAAGGCTTCTGTTACTTTTCAAGAAAAGGATGGTGTTTTGGAAATTGCTGTTTCTGATCCAACTATGAAGAACAAGGGTGTTATTGAAATTGATATTGATGGTGAAATGGCTAAGTTGTTGAAGGCTGATGAAAACATTAAGATTGAACAAGTTAACAAGGTTTTGAAGTTGGAAGTTAACGTTAACCAAGCTCAAGGTGAAACTTTTACTGCTAAGTTGCAAATGACTTCTGATTCTATTGAACCAATTAAGCCAGGTATTACTATTCAAGCTAACGGTCATGTTGAATTGTTGAAGTCTTTGCATACTGGTAAGAAGGTTCATATTCATTCTAAGTGGACTACTGGTGCTGATAACAACTTGGTTGGTAAGGCTTCTATTCATATTACTCCACAAGGTATGAGATTGGATTTGAAGGAAGCTGAATTGTTGAGATTGGATGAAGATCATGCTGAAATTAGAGCTAAGGCTTTTGATCAAAACAACAACATGTACACTGTTCAATTGATTATGAACATTGTTTCTAAGTCTTCTTCTCAATTGTCTGTTCATGTTTGGACTGGTGAAGCTGAAGATAGAAAGTCTGTTATTGCTATTAACGATCAAGCTTTTCAAGGTTCTTTGAAGATTTCTAACTTTAAGGAATAA。

第三方面，本发明提供一种载体，所述载体含有至少一个拷贝的如第二方面所述核苷酸。

本发明中，所述载体的获得为本领域的常规技术手段，只要能够获得带有所述核苷酸序列的载体的方法都是可行的，在此不做特殊限定，本领域技术人员可以根据需要选择合适的载体制备方法。

第四方面，本发明提供一种重组的宿主细胞，包含如第三方面所述的载体和/或编码第一方面所述的透明质酸水解酶的核苷酸。

根据本发明，所述宿主细胞为真核细胞和/或原核细胞。

优选地，所述真核细胞包括酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞中的任意一种或两种以上的组合，优选为毕赤酵母。

优选地，所述原核生物包括大肠杆菌和/或枯草芽孢杆菌。

第五方面，本发明提供一种制备如第一方面所述的透明质酸水解酶的方法，包括如下步骤：

制备重组的宿主细胞，所述宿主细胞包含编码第一方面所述的透明质酸水解酶的核苷酸，培养所述宿主细胞，并收集所述宿主细胞表达的透明质酸水解酶。

本发明中，制备重组宿主细胞的方法为本领域的常规技术手段，例如当宿主细胞是真核细胞，可用电穿孔、DNA转染、显微镜注射等方法；当宿主细胞是原核细胞时，可用电穿孔等方法进行制备。

本发明中可以将收集得到的透明质酸水解酶制备成冻干粉、片剂或液体进行使用。

第六方面，本发明还提供一种利用如第一方面所述的透明质酸水解酶合成寡聚透明质酸盐的方法，包括如下步骤：

(1)配制含透明质酸和/或透明质酸盐的溶液，将使用第六方面所述的方法制备得到的透明质酸水解酶与所述溶液混合，酶解后得到酶解液；

(2)将所述酶解液灭活，加入无机盐，搅拌至完全溶解，过滤，向滤液中加入醇和/或酮，析出所述寡聚透明质酸盐。

根据本发明，步骤(1)所述透明质酸和/或透明质酸盐的质量浓度为1-20％，例如可以是1％、2％、5％、8％、10％、12％、14％、16％、18％或20％等。

优选地，所述酶解的温度为30-50℃，例如可以是30℃、32℃、35℃、38℃、40℃、42℃、45℃或50℃等，pH为4-9，例如可以是4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、8、8.5或9等。

优选地，所述灭活的温度为60-100℃，例如可以是60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃或100℃等；时间为10-100min，例如可以是10min、15min、20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min或100min等。

本发明中，所述无机盐为易溶性无机盐，所述无机盐为钠盐，优选为氯化钠。

优选地，所述醇和/或酮与所述滤液的体积比为(3-10):1，例如可以是3:1、3.5:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1等。

本发明所述的数值范围不仅包括上述例举的点值，还包括没有例举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的透明质酸水解酶酶活高，经检测其酶活可达8.0×10⁶IU/mg。采用该酶透明质酸生成寡聚透明质酸，高效率较高，解决了现有技术中使用的透明质酸水解酶活性低的缺点。

(2)本发明中提供的制备寡聚透明质酸的方法操作简单，条件温和，对产品结构无破坏，无环境污染，而且发酵来源的水解透明质酸酶成本低、适合大规模工业化生产，相比于从动物来源获取透明质酸，其生产成本大大降低，利于工业化生产。

附图说明

图1为实施例3制备的寡聚透明质酸钠的核磁共振氢谱。

图2为实施例3制备的寡聚透明质酸钠的核磁共振碳谱。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

以下实施例中LB液体培养基(Luria-Bertani Medium)的配方为：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，调节pH到7.0，加水定容至1L；

YPD液体培养基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)的配方为：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加水定容至1L；

YPD固体培养基(YPD平板)的配方为：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，加水定容至1L；

BMGY液体培养基(Buffered Glycerol-complex Medium)的配方为：酵母粉10g，蛋白胨10g，YNB(无氨基酵母氮源，Yeast Nitrogen Base without Amino Acid)13.4g，甘油10g，生物素0.004g，用磷酸盐缓冲液(0.1M)调节pH至6.0，加水定容至1L。

MD(Minimal Dextrase Medium)固体培养基的配方为：YNB 13.4g、生物素0.4mg、葡萄糖20g，琼脂粉20g，加水定容至1L；

发酵培养基的配方为：七水硫酸镁14.9g、硫酸钾18.2g、二水硫酸钙0.93g、甘油40g、85％磷酸26.7mL、氢氧化钾4.13g，加水定容至1L。

以下实施例中中，所用限制性内切酶EcoRⅠ、NotⅠ和SacⅠ购自New EnglandBiolabs公司，使用时按照限制性内切酶使用说明书进行操作。

实施例1

本实施例用于制备含有透明质酸水解酶核苷酸序列的基因工程菌株。

1.将全基因合成的含有序列SEQ ID NO.1(由常州基宇生物科技有限公司合成)的序列经限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ酶切后重组到酵母表达载体pPIC9k(购自invitrogen公司)，并转化到E.coli Top10感受态(购自北京全式金生物技术有限公司)中；

将E.coli Top10置于LB液体培养基中，37℃、160rpm转振荡培养过夜，提取重组质粒；

利用限制性内切酶SacⅠ将重组质粒线性化。

2.将线性化重组质粒导入毕赤酵母

将Pichia Pastoris GS115(巴斯德毕赤酵母GS115，购自invitrogen公司)单菌落挑入YPD培养基中活化，活化的GS115按0.5％的接种量接入50mL YPD培养基中30℃培养至对数期，离心获得的菌体用20mL无菌水洗2次，再用20mL无菌1M山梨醇洗2次，加入1mL 1M山梨醇溶液重悬菌体获得GS115感受态细胞；

将上一步中SacⅠ线性化的重组质粒片段加入到80μL GS115感受态细胞中冰浴5分钟，电转化后加入800μL山梨醇将细胞移至1.5mL无菌离心管中，25℃温育2小时后，离心涂MD平板，30℃培养至长出菌落后，划线分离出单菌落；

将单菌落挑入无菌水中加入适量溶壁酶(Lyticase，购自sigma公司)后37℃温育1小时消化细胞壁，取部分消化产物加入PCR体系挑选阳性克隆，所述阳性克隆即为含有所述透明质酸水解酶核苷酸序列的重组工程菌株。

将阳性克隆挑入YPD液体培养基后转接入BMGY液体培养基中，培养至OD₆₀₀为1.0时接入1％甲醇诱导，诱导72小时，每24小时补加一次甲醇用于诱导表达所述透明质酸水解酶。

实施例2

本实施例使用实施例1制备得到的重组工程菌株制备透明质酸水解酶。

取实施例1制备得到的重组工程菌在YPD平板上划线，30℃，倒置培养过夜；平板上挑取直径1mm的单菌落接种至50mL YPD液体培养基中，30℃，200rpm振荡培养24h，OD₆₀₀达到5，以10％的接种量接种到300mL YPD液体培养基中，所用摇瓶为容量1L三角瓶，30℃、200rpm摇床振荡培养，当OD₆₀₀达到12时停止培养。

将发酵培养基按每升料配置好后，倒入30L发酵罐，121℃灭菌30min；降温后控制温度30℃，使用氨水调节pH值至5.0。将长好的种子液接种进罐，接种量5％。根据溶氧调节转速和通气，控制溶氧量在30％以上；

培养24小时，待溶氧量突变上升，此时湿重约为140g/L，开始补料50％甘油(w/v)，补料速度为每小时在每升发酵液中补充15mL甘油，补料时控制溶氧保持在30％以上；待菌种湿重长至180g/L左右，停止补加甘油，以7.2mL/L发酵液/小时流速流加100％甲醇并保持，诱导10小时后，pH值调节为6.0，诱导24小时，pH调节为7.0，补料速度保持不变，根据溶氧调节转速和通气，保持溶氧在30％以上。诱导96小时菌体湿重为340g/L，放罐，离心，收集上清液。

将上清液中加入硫酸铵，使其浓度为15％，过滤除去产生的沉淀，然后缓缓加入硫酸铵，使其浓度达到50％为止，得到的沉淀即为透明质酸酶，将得到的透明质酸酶沉淀溶于磷酸缓冲溶液(pH 6.0，50mmol/L)中，透析过夜，以去除残留的硫酸铵，最后经过1×10⁴Da的超滤膜除去小分子杂质，得到纯化后透明质酸酶。采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活力为1.0×10⁵IU/mL，纯化后的透明质酸酶活力为8.0×10⁶IU/mg。

实施例3

本实施例提供一种寡聚透明质酸钠的制备方法。

向100L不锈钢溶解罐中加入100L纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为1.2×10⁶Da的透明质酸钠1kg，待完全溶解后，用氢氧化钠调节PH至6.0，并升温至45℃，加入实施例2中的制备得到的透明质酸水解酶1L，使用乌氏粘度计，采用特性粘度法测酶解溶解液中产物分子量，当酶解至分子量小于10000Da时，将温度升高至65℃，维持30min，加入1kg NaCl，用0.45μm的尼龙滤膜过滤酶解液，然后经过膜过滤、使用500L乙醇沉淀得到透明酸钠沉淀，再将沉淀使用乙醇脱水，然后真空干燥即得寡聚透明质酸钠。

该寡聚透明质酸为白色颗粒0.89kg，采用咔唑法，通过分光光度计测定530nm处葡萄糖醛酸的吸光度值与葡萄糖醛酸含量，计算出透明质酸的含量为97.5％，分子量为9800Da，pH 6.8。

本实施例制备的寡聚透明质酸钠的核磁共振图谱，其中图1为核磁共振氢谱，D-葡萄糖醛酸¹H NMR(300MHz,D₂O+NaOD)δ/ppm：4.46-4.469(1H,H-1)，3.437(1H,H-2)，3.552-3.580(1H,H-3)，3.692-3.742(1H,H-4)，3.692-3.742(1H,H-5)；N-乙酰氨基葡萄糖¹H NMR(300MHz,D₂O+NaOD)δ/ppm：4.520(1H,H-1)，3.692-3.742(1H,H-2)，3.692-3.742(1H,H-3)，3.437(1H,H-4)，3.437(1H,H-5)，3.692-3.742(1H,H-6proR)，3.937-3.974(1H,H-6proS)，1.962(1H,H-Me)；

图2为核磁共振碳谱，D-葡萄糖醛酸¹³C NMR(300MHz,D₂O+NaOD)δ/ppm：104.460(C-1)，73.246(C-2)，76.443(C-3)，82.708(C-4)，80.026(C-5)，176.815(C＝O)，N-乙酰氨基葡萄糖¹³C NMR(300MHz,D₂O+NaOD)δ/ppm：103.534(C-1)，56.857(C-2)，83.432(C-3)，72.696(C-4)，79.470(C-5)，63.941(C-6)，25.130(C-Me)，177.353(C＝O)。

综合核磁共振氢谱和碳谱的图谱数据可得，该结果与理论寡聚透明质酸钠的图谱基本吻合，证明所得产物为寡聚透明质酸钠。

实施例4

本实施例提供一种寡聚透明质酸钠的制备方法。

向100L不锈钢溶解罐中加入100L纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为1.2×10⁶Da的透明质酸钠1kg，待完全溶解后，用氢氧化钠调节pH至6.0，并升温至45℃，加入实施例2中的制备得到的透明质酸水解酶1L，酶解至分子量至5000Da时，将温度升高至65℃，维持30min，加入1kg NaCl，用0.45μm的尼龙滤膜过滤酶解液，然后经过膜过滤、使用500L乙醇沉淀得到透明酸钠沉淀，该沉淀使用乙醇脱水，然后真空干燥即得寡聚透明质酸钠。

该寡聚透明质酸为白色颗粒0.87kg，采用咔唑法，通过分光光度计测定530nm处葡萄糖醛酸的吸光度值与葡萄糖醛酸含量，计算出透明质酸的含量为96.5％，分子量为5100Da，pH 6.9。

实施例5

本实施例提供一种寡聚透明质酸钠的制备方法。

向100L不锈钢溶解罐中加入100L纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为1.2×10⁶Da的透明质酸钠1kg，待完全溶解后，用氢氧化钠调节pH至6.0，并升温至45℃，加入实施例2中的制备得到的透明质酸水解酶1L，酶解至分子量至1000Da时，将温度升高至65℃，维持30min，加入1kg NaCl，用0.45μm的尼龙滤膜过滤酶解液，然后经过膜过滤、使用1000L乙醇沉淀得到透明酸钠沉淀，该沉淀使用乙醇脱水，然后真空干燥即得寡聚透明质酸钠。

该寡聚透明质酸为白色颗粒0.92kg，采用咔唑法，通过分光光度计测定530nm处葡萄糖醛酸的吸光度值与葡萄糖醛酸含量，计算出透明质酸的含量为95.8％，分子量为1200Da，pH 7.1。

综上所述，本发明提供的透明质酸水解酶在毕赤酵母中表达之后，其在发酵液中的活力为1.0×10⁵IU/mL，纯化后的透明质酸酶活力为8.0×10⁶IU/mg，当其在其他宿主(例如大肠杆菌)中表达时，其酶活力更加优异；因此，使用本发明提供的水解透明质酸酶生产寡聚透明质酸钠，操作简单，效率较高，适合大规模的工业化生产。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏诚信药业有限公司

<120> 一种透明质酸水解酶及其编码序列和利用其制备寡聚透明质酸盐的方法

<130> 20191225

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1233

<212> PRT

<213> Bacillus lentus

<400> 1

Ser Asp Ser Gln Pro Leu Leu Asn Thr Ser Phe Glu Glu Thr Glu Lys

1 5 10 15

Ala Asn Thr Gly Trp Asp Glu Leu Gly Ala Ser Lys Trp Ser Val Trp

20 25 30

Lys Pro Thr Gly Ser Pro Val Val Ser Ile Ser Asn Asp Ala Ser Tyr

35 40 45

Thr Gly Asp Tyr Gly Leu Lys Ile Ser Ala Asn Asp Asn Gly Arg Ala

50 55 60

Ala Val Ser Gln Asp Val Ser Val Glu Gly Gly Lys Ser Tyr Ala Leu

65 70 75 80

Ser Thr Trp Val Arg Thr Glu Asp Ile Val Ser Ser Gln Gly Ala Arg

85 90 95

Met Arg Val Val Leu Tyr Glu Gly Asp Gln Gln Leu Asp Leu Leu Tyr

100 105 110

Ser Asn Arg Leu Thr Gly Thr His Asp Trp Ser Gln Ile Lys Met Glu

115 120 125

Val Lys Val Pro Val Asn Val Asp Ser Ile Arg Val Gln Leu Phe Phe

130 135 140

Glu Thr Gly Thr Gly Thr Ala Met Phe Asp Asp Val Ser Leu Glu Leu

145 150 155 160

Ile Asn Pro Ala Gln Ala Ile Ala Met Glu Gln Ser Glu Met Val Leu

165 170 175

Lys Lys Gly Glu Thr Thr Leu Leu Asn Val Gln Val Asp Pro Val Asp

180 185 190

Thr Ser Ser Leu Ile Ser Trp Thr Ser Thr Asp Gly Thr Val Ala Thr

195 200 205

Val Glu Asn Gly Thr Val Thr Gly Leu Ala Val Gly Glu Thr Leu Ile

210 215 220

Thr Ala Ser Thr Asp Asn Gly Leu Ser Ala Ser Thr Leu Val Lys Val

225 230 235 240

Val Glu Lys Asp Gly Ile Glu Gly Pro Ser Ile Gly Glu Ile Glu Leu

245 250 255

His Pro Lys Glu Leu Lys Leu Glu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Lys

260 265 270

Ala Ser Thr Thr Pro Glu Asn Ala Asn Thr Glu Lys Leu Ile Trp Gly

275 280 285

Ser Ser Asn Lys Glu Val Ala Ser Val Gln Gly Gly Met Val Glu Ala

290 295 300

His Phe Ala Gly Thr Ala Thr Ile Thr Val Glu Thr Glu Asp Gly Lys

305 310 315 320

Ile Lys Gly Glu Ser Gln Ile Thr Val Ile Asp Thr Glu Gln Asp Glu

325 330 335

Tyr Asp Gln Leu Arg Asn Arg Trp Glu Ser Gln Ile Thr Ser Leu Asp

340 345 350

Tyr Phe Asp Ala Thr Asn Glu Arg Met Val Glu Val Ile Glu Asn Lys

355 360 365

Thr Lys Thr Ala Glu Lys Leu Trp Lys Ser Met Val Lys Asn Glu Asn

370 375 380

Arg Ser Tyr Leu Trp Ile Asp Phe Thr Ser Lys Asp Asp Ser Ala Asp

385 390 395 400

Ile Arg Ala Asn Tyr Arg Asn Leu Thr Ala Met Ala His Ala Phe Ala

405 410 415

Asn Glu His Ser Ser Leu Tyr Arg Asn Pro Ala Leu Phe Gln Asp Ile

420 425 430

Leu Ser Ala Leu Glu Trp Leu Tyr Gln Asn Gln Tyr Asn Glu Asn Ile

435 440 445

Val Gln Tyr Ser Asn Trp Trp His Trp Glu Ile Gly Val Pro Asn Glu

450 455 460

Leu Asn Asn Ile Met Val Leu Leu Tyr Asp Tyr Met Asp Lys Glu Thr

465 470 475 480

Val His Arg Tyr Leu Lys Val Val Asp His Phe Gln Pro Asp Pro Thr

485 490 495

Lys Ser Gly Ala Thr Thr Pro Gly Asn Tyr Arg Glu Ala Val Gly Ala

500 505 510

Asn Arg Ile Asp Val Ser Lys Val Val Gly Val Arg Gly Val Ile Val

515 520 525

Lys Asp Ala Asp Lys Ile Ala Ser Ala Arg Asp Ala Leu Ser Gln Thr

530 535 540

Phe Glu Asn Val Thr Glu Gly Asp Gly Phe Tyr Lys Asp Gly Ser Phe

545 550 555 560

Val Gln His Glu Asn Ile Ala Tyr Asn Gly Ser Tyr Gly Ile Val Leu

565 570 575

Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Leu Asp Leu Leu Ser Asp Ser Thr Trp

580 585 590

Asp Val Thr Asp Pro Lys Val Ser Asn Val Tyr Glu Trp Ile Glu Asn

595 600 605

Ala Tyr Glu Pro Phe Met Tyr Lys Gly Ala Leu Met Asp Met Val Arg

610 615 620

Gly Arg Ala Ile Ser Arg Ser Phe Leu Gln Asp His Thr Ala Gly His

625 630 635 640

Thr Ile Ile Lys Ser Val Ile Arg Met Ala Gln Phe Ala Pro Glu Pro

645 650 655

Phe Ala Glu Lys Tyr Glu Arg Met Ala Lys Tyr Trp Leu Gln Glu Asp

660 665 670

Thr Phe Ser Asn Tyr Met Glu Asn Glu Gly Asn Phe Arg Asp Met Thr

675 680 685

Leu Ala Lys Gln Leu Leu Asp Asn Gln Gln Val Thr Ala Arg Gly Asp

690 695 700

Leu Asp Phe His Lys Thr Phe Ala Ala Met Asp Arg Val Val His Arg

705 710 715 720

Lys Thr Gly Tyr Ala Phe Gly Ile Ser Met Tyr Ser Ala Arg Ile Gln

725 730 735

Asn Tyr Glu Asp Met Asn Asn Glu Asn Arg Lys Gly Trp Tyr Thr Gly

740 745 750

Glu Gly Met Thr Tyr Leu Tyr Asn Val Asp Leu Gly Gln Tyr Ser Asn

755 760 765

Asp Phe Trp Pro Thr Val Asp Pro Tyr Arg Met Pro Gly Thr Thr Ile

770 775 780

Asp Thr Met Lys Arg Val Asp Gly Ser Gly Glu His Thr Ser Ser Glu

785 790 795 800

Thr Trp Val Gly Gly Ser Thr Leu Asn Asp Arg Phe Gly Thr Thr Gly

805 810 815

Met Ser Tyr Lys Gly Trp Asn Ser Ser Leu Thr Ala Lys Lys Ser Trp

820 825 830

Phe Met Phe Asp Asp Glu Ile Val Ala Leu Gly Ser Gly Ile His Ser

835 840 845

Asp Glu Glu Arg Asn Ile Glu Thr Ile Val Glu Asn Arg Lys Ile His

850 855 860

Asp Asp Gly Ser Asn Lys Leu Val Ile Asn Gly Glu Thr Pro Asp Leu

865 870 875 880

Ser Asp Thr Asn Asp Gln Thr Phe Asp Ala Asp Trp Ala Phe Leu Glu

885 890 895

Gly Asn Val Lys Gly Ala Asp Ile Gly Tyr Tyr Phe Pro Glu Gly Lys

900 905 910

Ala Leu Thr Val Lys Lys Glu Glu Arg Thr Gly Ala Trp Lys Asp Ile

915 920 925

Asn Tyr Gly Glu Pro Ala Asp Arg Ile Lys Arg Ser Tyr Ala Thr Met

930 935 940

Trp Phe Asn His Gly Ile Lys Pro Asn Asn Asp Thr Tyr Ser Tyr Val

945 950 955 960

Leu Leu Pro Gly Arg Ser Glu Lys Gln Thr Glu Lys Tyr Ala Lys Gln

965 970 975

Pro Asp Val Gln Ile Leu Arg Asn Asp Pro Ala Val Gln Ala Val Gln

980 985 990

Asp Val Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Asn Phe Trp Asn Asp Glu Lys

995 1000 1005

Gln Thr Val Gly Pro Leu Thr Ala Tyr Gln Lys Ala Ser Val Thr

1010 1015 1020

Phe Gln Glu Lys Asp Gly Val Leu Glu Ile Ala Val Ser Asp Pro

1025 1030 1035

Thr Met Lys Asn Lys Gly Val Ile Glu Ile Asp Ile Asp Gly Glu

1040 1045 1050

Met Ala Lys Leu Leu Lys Ala Asp Glu Asn Ile Lys Ile Glu Gln

1055 1060 1065

Val Asn Lys Val Leu Lys Leu Glu Val Asn Val Asn Gln Ala Gln

1070 1075 1080

Gly Glu Thr Phe Thr Ala Lys Leu Gln Met Thr Ser Asp Ser Ile

1085 1090 1095

Glu Pro Ile Lys Pro Gly Ile Thr Ile Gln Ala Asn Gly His Val

1100 1105 1110

Glu Leu Leu Lys Ser Leu His Thr Gly Lys Lys Val His Ile His

1115 1120 1125

Ser Lys Trp Thr Thr Gly Ala Asp Asn Asn Leu Val Gly Lys Ala

1130 1135 1140

Ser Ile His Ile Thr Pro Gln Gly Met Arg Leu Asp Leu Lys Glu

1145 1150 1155

Ala Glu Leu Leu Arg Leu Asp Glu Asp His Ala Glu Ile Arg Ala

1160 1165 1170

Lys Ala Phe Asp Gln Asn Asn Asn Met Tyr Thr Val Gln Leu Ile

1175 1180 1185

Met Asn Ile Val Ser Lys Ser Ser Ser Gln Leu Ser Val His Val

1190 1195 1200

Trp Thr Gly Glu Ala Glu Asp Arg Lys Ser Val Ile Ala Ile Asn

1205 1210 1215

Asp Gln Ala Phe Gln Gly Ser Leu Lys Ile Ser Asn Phe Lys Glu

1220 1225 1230

<210> 2

<211> 3702

<212> DNA

<213> Bacillus lentus

<400> 2

tctgattctc aaccattgtt gaacacttct tttgaagaaa ctgaaaaggc taacactggt 60

tgggatgaat tgggtgcttc taagtggtct gtttggaagc caactggttc tccagttgtt 120

tctatttcta acgatgcttc ttacactggt gattacggtt tgaagatttc tgctaacgat 180

aacggtagag ctgctgtttc tcaagatgtt tctgttgaag gtggtaagtc ttacgctttg 240

tctacttggg ttagaactga agatattgtt tcttctcaag gtgctagaat gagagttgtt 300

ttgtacgaag gtgatcaaca attggatttg ttgtactcta acagattgac tggtactcat 360

gattggtctc aaattaagat ggaagttaag gttccagtta acgttgattc tattagagtt 420

caattgtttt ttgaaactgg tactggtact gctatgtttg atgatgtttc tttggaattg 480

attaacccag ctcaagctat tgctatggaa caatctgaaa tggttttgaa gaagggtgaa 540

actactttgt tgaacgttca agttgatcca gttgatactt cttctttgat ttcttggact 600

tctactgatg gtactgttgc tactgttgaa aacggtactg ttactggttt ggctgttggt 660

gaaactttga ttactgcttc tactgataac ggtttgtctg cttctacttt ggttaaggtt 720

gttgaaaagg atggtattga aggtccatct attggtgaaa ttgaattgca tccaaaggaa 780

ttgaagttgg aatctggtca agttagattg ttgaaggctt ctactactcc agaaaacgct 840

aacactgaaa agttgatttg gggttcttct aacaaggaag ttgcttctgt tcaaggtggt 900

atggttgaag ctcattttgc tggtactgct actattactg ttgaaactga agatggtaag 960

attaagggtg aatctcaaat tactgttatt gatactgaac aagatgaata cgatcaattg 1020

agaaacagat gggaatctca aattacttct ttggattact ttgatgctac taacgaaaga 1080

atggttgaag ttattgaaaa caagactaag actgctgaaa agttgtggaa gtctatggtt 1140

aagaacgaaa acagatctta cttgtggatt gattttactt ctaaggatga ttctgctgat 1200

attagagcta actacagaaa cttgactgct atggctcatg cttttgctaa cgaacattct 1260

tctttgtaca gaaacccagc tttgtttcaa gatattttgt ctgctttgga atggttgtac 1320

caaaaccaat acaacgaaaa cattgttcaa tactctaact ggtggcattg ggaaattggt 1380

gttccaaacg aattgaacaa cattatggtt ttgttgtacg attacatgga taaggaaact 1440

gttcatagat acttgaaggt tgttgatcat tttcaaccag atccaactaa gtctggtgct 1500

actactccag gtaactacag agaagctgtt ggtgctaaca gaattgatgt ttctaaggtt 1560

gttggtgtta gaggtgttat tgttaaggat gctgataaga ttgcttctgc tagagatgct 1620

ttgtctcaaa cttttgaaaa cgttactgaa ggtgatggtt tttacaagga tggttctttt 1680

gttcaacatg aaaacattgc ttacaacggt tcttacggta ttgttttgat tgaaggtttg 1740

actgttttgt tggatttgtt gtctgattct acttgggatg ttactgatcc aaaggtttct 1800

aacgtttacg aatggattga aaacgcttac gaaccattta tgtacaaggg tgctttgatg 1860

gatatggtta gaggtagagc tatttctaga tcttttttgc aagatcatac tgctggtcat 1920

actattatta agtctgttat tagaatggct caatttgctc cagaaccatt tgctgaaaag 1980

tacgaaagaa tggctaagta ctggttgcaa gaagatactt tttctaacta catggaaaac 2040

gaaggtaact ttagagatat gactttggct aagcaattgt tggataacca acaagttact 2100

gctagaggtg atttggattt tcataagact tttgctgcta tggatagagt tgttcataga 2160

aagactggtt acgcttttgg tatttctatg tactctgcta gaatccaaaa ctacgaagat 2220

atgaacaacg aaaacagaaa gggttggtac actggtgaag gtatgactta cttgtacaac 2280

gttgatttgg gtcaatactc taacgatttt tggccaactg ttgatccata cagaatgcca 2340

ggtactacta ttgatactat gaagagagtt gatggttctg gtgaacatac ttcttctgaa 2400

acttgggttg gtggttctac tttgaacgat agatttggta ctactggtat gtcttacaag 2460

ggttggaact cttctttgac tgctaagaag tcttggttta tgtttgatga tgaaattgtt 2520

gctttgggtt ctggtattca ttctgatgaa gaaagaaaca ttgaaactat tgttgaaaac 2580

agaaagattc atgatgatgg ttctaacaag ttggttatta acggtgaaac tccagatttg 2640

tctgatacta acgatcaaac ttttgatgct gattgggctt ttttggaagg taacgttaag 2700

ggtgctgata ttggttacta ctttccagaa ggtaaggctt tgactgttaa gaaggaagaa 2760

agaactggtg cttggaagga tattaactac ggtgaaccag ctgatagaat taagagatct 2820

tacgctacta tgtggtttaa ccatggtatt aagccaaaca acgatactta ctcttacgtt 2880

ttgttgccag gtagatctga aaagcaaact gaaaagtacg ctaagcaacc agatgttcaa 2940

attttgagaa acgatccagc tgttcaagct gttcaagatg ttaagaagaa cttgattggt 3000

gctaactttt ggaacgatga aaagcaaact gttggtccat tgactgctta ccaaaaggct 3060

tctgttactt ttcaagaaaa ggatggtgtt ttggaaattg ctgtttctga tccaactatg 3120

aagaacaagg gtgttattga aattgatatt gatggtgaaa tggctaagtt gttgaaggct 3180

gatgaaaaca ttaagattga acaagttaac aaggttttga agttggaagt taacgttaac 3240

caagctcaag gtgaaacttt tactgctaag ttgcaaatga cttctgattc tattgaacca 3300

attaagccag gtattactat tcaagctaac ggtcatgttg aattgttgaa gtctttgcat 3360

actggtaaga aggttcatat tcattctaag tggactactg gtgctgataa caacttggtt 3420

ggtaaggctt ctattcatat tactccacaa ggtatgagat tggatttgaa ggaagctgaa 3480

ttgttgagat tggatgaaga tcatgctgaa attagagcta aggcttttga tcaaaacaac 3540

aacatgtaca ctgttcaatt gattatgaac attgtttcta agtcttcttc tcaattgtct 3600

gttcatgttt ggactggtga agctgaagat agaaagtctg ttattgctat taacgatcaa 3660

gcttttcaag gttctttgaa gatttctaac tttaaggaat aa 3702

Claims

1.一种透明质酸水解酶，其特征在于，所述透明质酸水解酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述的透明质酸水解酶的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸为编码权利要求1所述的透明质酸水解酶的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种载体，其特征在于，所述载体含有至少一个拷贝的如权利要求2或3所述的核苷酸。

5.一种重组的宿主细胞，其特征在于，所述重组的宿主细胞包含如权利要求4所述的载体或编码权利要求1所述的透明质酸水解酶的核苷酸；所述宿主细胞为酵母细胞。

6.根据权利要求5所述的重组的宿主细胞，其特征在于，所述酵母细胞为毕赤酵母。

7.一种制备如权利要求1所述的透明质酸水解酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

制备重组的宿主细胞，所述宿主细胞包含编码权利要求1所述的透明质酸水解酶的核苷酸，培养所述宿主细胞，并收集所述宿主细胞表达的透明质酸水解酶。

8.一种利用如权利要求1所述的透明质酸水解酶合成寡聚透明质酸盐的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）配制含透明质酸和/或透明质酸盐的溶液，将所述透明质酸水解酶与所述溶液混合，酶解后得到酶解液；

（2）将所述酶解液灭活，加入无机盐，搅拌至完全溶解，过滤，向滤液中加入醇和/或酮，析出所述寡聚透明质酸盐。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述溶液中透明质酸和/或透明质酸盐的质量浓度为1-20%。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述酶解的温度为30-50℃，pH为4-9。

11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述灭活的温度为60-100℃，时间为10-100 min。

12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述无机盐为钠盐。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述钠盐为氯化钠。

14.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述醇和/或酮与所述滤液的体积比为(3-10):1。