CN112725321A - 一种果胶裂解酶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种果胶裂解酶及其制备方法和应用，其制备方法包括，将基因工程菌株pEASY‑E1‑SH8/BL21接种至改良LB发酵培养液中扩培发酵，随后添加IPTG诱导产果胶裂解酶，获得成熟发酵液后添加蛋白酶抑制剂，超滤收集分子量为10‑50kD的酶液；利用该果胶裂解酶对苎麻果胶的降解方法为，将果胶裂解酶添加到苎麻果胶溶液中，再添加合适浓度的商业化果胶水解酶和果胶酯酶，酶解、中和、沉淀、洗涤、干燥、粉碎，即得果胶低聚糖成品。本发明所提供的果胶裂解酶的制备方法简单，酶活力高，发酵周期短，成本低；利用其酶解苎麻果胶，可制备高品质的苎麻低聚糖。

Description

一种果胶裂解酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，更具体地，涉及一种果胶裂解酶及其制备方法和应用。
背景技术
果胶分子由不同酯化程度的半乳糖醛酸以α-1，4糖苷键聚合而成，在植物组织中与纤维素、半纤维素、木质素和蛋白质等相互交联，维持细胞、组织结构的固有形态，侧链常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等,游离的羧基部分或全部与钙、钾、钠离子，特别是与硼化合物结合在一起。果胶彻底降解需要一系列的酶协同作用。根据酶的作用底物和作用方式不同，分为三大类：果胶裂解酶、果胶酯酶、果胶水解酶。
果胶裂解酶(Pectate lyase，Pel)通过反式消去作用以随机方式切割果胶酸或果胶的α-1,4-糖苷键，生成C4-C5不饱和寡聚半乳糖醛酸。果胶裂解酶作为果胶主链的降解酶，被认为是果胶降解的关键因子。
然而，不同来源的果胶裂解酶对不同酯化度的果胶底物降解有选择性。
Shevchik(1998)和Heikinheimo(1995)分别报道了来源于Erwinia chrysanthemi和Erwinia carotovora的果胶裂解酶最适底物分别为酯化度45％和68％的果胶，二者对低酯化度的果胶和聚半乳糖醛酸几乎没有降解能力；Boland等(2010)报道了来源于Paenibacillus amylolyticus 27C64的PelA和PelB的最适底物分别为聚半乳糖醛酸和酯化度20-34％的橘子果胶，对其他不同酯化程度的果胶也具有1-67％的酶活力；然而，Soriano等(2000)报道了来源于Bacillus sp.BP-23的PelA对聚半乳糖醛酸和不同酯化程度的果胶均有相同的酶活力，几乎不受果胶底物酯化程度的影响。因此，成功获得能高效降解苎麻果胶特定底物的果胶裂解酶对苎麻果胶寡聚糖的酶法制备非常重要。
随着分子生物学技术的发展，从天然微生物中克隆出果胶裂解酶基因，构建基因工程菌株，用于发酵生产特定的果胶裂解酶具有重要的实际生产意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种果胶裂解酶及其制备方法和应用。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种果胶裂解酶的制备方法，包括：
将基因工程菌株pEASY-E1-SH8/BL21接种至含Amp120μg/mL的改良LB发酵培养液中扩培发酵，随后添加IPTG诱导产果胶裂解酶，获得成熟发酵液后添加蛋白酶抑制剂，超滤收集分子量为10-50kD的酶液，即得。
具体地，所述改良LB发酵培养液的质量比配方为：葡萄糖0.42-0.58％+胰蛋白胨0.7-1.2％+酵母提取物0.4-0.58％+NaCl 0.8-1.2％，余量为水。
在上述技术方案中，所述IPTG的添加时间为扩培发酵至OD600为0.4-0.6。
在上述技术方案中，所述IPTG的添加量为控制其终浓度为1.15-1.25mmol/L。
进一步地，在上述技术方案中，所述蛋白酶抑制剂的添加时间为，添加所述IPTG后，在22-25℃下诱导培养18-24h，获得成熟发酵液。
优选地，在上述技术方案中，所述成熟发酵液中的果胶裂解酶活力大于800U/mL。
再进一步地，在上述技术方案中，所述蛋白酶抑制剂为PMSF和DTT的混合物。
优选地，在上述技术方案中，所述PMSF和DTT的添加量为控制其终浓度分别为0.8-1mmol/L。
又进一步地，在上述技术方案中，所述扩培发酵的方法具体为：
按体积比为2-5：100的比例将所述pEASY-E1-SH8/BL21的种子液与所述改良LB发酵培养液置于密封的发酵罐中，控制灌装量为发酵罐容积的40-60％，同时通过添加NH3·H2O控制pH值为7.0-7.5，调节发酵罐温度和搅拌速度分别为35-37℃和200-220rpm，对应于每升种子液的通气量为0.4-0.6m3/h。
具体地，在上述技术方案中，在用于扩培发酵前，所述改良LB发酵培养液用NH3·H2O调pH值为7.5，并在121℃下灭菌30min，冷却后添加无菌氨苄青霉素至终浓度为120-130μg/mL。
本发明另一方面提供了上述制备方法制备得到的果胶裂解酶。
本发明又一方面提供了上述制备方法或上述果胶裂解酶在苎麻果胶低聚糖制备中的应用。
本发明还一方面提供了利用上述制备方法或上述果胶裂解酶制备苎麻果胶低聚糖的方法，具体为：
将所述果胶裂解酶添加到浓度为8-10w/v％的苎麻果胶溶液中，所述果胶裂解酶的添加量为控制其活力为200-300U/mL，再添加果胶水解酶和果胶酯酶并控制其活力分别为80-125U/mL和65-100U/mL，在40-60℃和pH为7.5-8.0条件下酶解2-3h。
在上述技术方案中，制备苎麻果胶低聚糖的方法，还包括，酶解后，采用1-1.5mol/L HCl溶液中和，真空干燥或低温蒸发浓缩至浓度为2-3g/L，随后缓慢加入乙醇并控制乙醇的终浓度为45-55％，静置沉淀后固液分离，并用98％的乙醇水溶液洗涤沉淀，烘干后粉碎过筛。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明所提供的果胶裂解酶的制备方法，采用原核微生物(大肠杆菌)为受体的基因工程菌株pEASY-E1-SH8/BL21发酵生产特定的果胶裂解酶，与真核微生物相比，具有发酵周期短的优势；
(2)本发明所提供的果胶裂解酶的制备方法，采用基因工程菌株pEASY-E1-SH8/BL21分泌的果胶裂解酶较天然菌来源的果胶裂解酶含有的外源酶少，经过粗分离即可获得满足后续要求的酶液，方法简单、成本低廉、易于推广应用；
(3)利用本发明基因工程菌生产的果胶裂解酶制备苎麻果胶低聚糖，可避免基因来源菌(DCE01菌种)产生污染，能获得品质优良的苎麻果胶低聚糖，实际应用前景广阔，理论和实际意义重大。
附图说明
图1为本发明实施例所提供的果胶裂解酶的制备方法的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
若未特别指明，本发明实施例中所用的实验试剂和材料等均可市售获得。
若未具体指明，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1一种果胶裂解酶的制备方法
如图1所示，从中国农业科学院麻类研究所农产品加工微生物遗传改良与应用团队-80℃保存的甘油管吸取1mL基因工程菌pEASY-E1-SH8/BL21菌液，接种至200mL改良LB发酵培养液(含Amp 120μg/mL)，充分混匀，随后在200rpm和37℃下培养10-12h，即为种子液。具体地，上述改良LB发酵培养液的质量比配方为：葡萄糖0.5％+胰蛋白胨1.0％+酵母提取物0.5％+NaCl 1.0％，余量为水，并用NH3·H2O调pH值为7.5。
将600mL种子液直接接种至盛有30L改良LB发酵培养液(含Amp 120μg/mL)的50L发酵罐(瑞士比欧，德国)中，不断自动补加氨水(NH3·H2O)，使pH维持至7.0，通气量0.5m3/h，37℃，200rpm培养3-4h，使OD600达到0.5左右，添加IPTG至终浓度为1.2mmol/L，改为22℃诱导培养20h，即得成熟发酵液。
具体地，上述IPTG溶液母液配制浓度为20％(0.8mol/L)，经0.2μm滤膜过滤除菌，-80℃保存备用。使用时冰上解冻，尽量减少反复冻融的次数，以免失效。
发酵液中果胶裂解酶活力检测方法为：
用pH 9.0的0.05mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配置5mg/mL的苎麻果胶溶液；取2mL底物预热到50℃，添加1mL适当稀释倍数的酶液和6μL 1mol/L的CaCl2溶液，充分混匀，50℃准确反应10min，煮沸灭活；用沸水浴充分灭活的酶液，作相同反应处理的溶液为对照，测定OD235。
酶活力单位定义为：底物每分钟释放出相当于1μmol不饱和半乳糖醛酸酐所需的酶量为1个酶活力单位(以IU表示)，235nm波长下消光系数为4600M-1·cm-1。
在4-8℃的条件下，往上述30L成熟发酵液中添加蛋白酶抑制剂PMSF和DTT，同时控制PMSF和DTT的终浓度均为1.0mmol/L，通过0.2μm超滤膜包(赛多利斯，德国)过滤除菌，再先后通过50kD和10kD膜包过滤，收集到10-50kD部分的超滤液3L，即为果胶裂解酶液。
具体地，上述PMSF溶液母液的配制浓度为0.15mol/L，DTT溶液母液的配制浓度为1mol/L，分装后-20℃保存；避免反复冻溶，保质期一个月。
对比例1一种果胶裂解酶的制备方法
与实施例1类似，从中国农业科学院麻类研究所农产品加工微生物遗传改良与应用团队-80℃保存的甘油管吸取1mL基因工程菌pEASY-E1-SH8/BL21菌液，接种至200mL改良LB发酵培养液(含Amp 120μg/mL)，充分混匀，随后在200rpm和37℃下培养10-12h，即为种子液。具体地，上述改良LB发酵培养液的质量比配方为：葡萄糖0.5％+胰蛋白胨1.0％+酵母提取物0.5％+NaCl 1.0％，余量为水，并用NH3·H2O调pH值为7.5。
将600mL种子液直接接种至盛有30L改良LB发酵培养液(含Amp 120μg/mL)的50L发酵罐(瑞士比欧，德国)中，不断自动补加氨水(NH3·H2O)，使pH维持至7.0，通气量0.30m3/h，37℃，200rpm培养3-4h，使OD600达到0.3左右，添加IPTG至终浓度为1.0mmol/L，改为28℃诱导培养12-18h，即得成熟发酵液。
在4-8℃条件下，往上述30L成熟发酵液中添加蛋白酶抑制剂PMSF和DTT，同时控制PMSF和DTT的终浓度均为1.0mmol/L，成熟发酵液通过0.2μm超滤膜包(赛多利斯，德国)过滤除菌，再先后通过50kD和10kD膜包过滤，收集到10-50kD部分的超滤液3L，即为果胶裂解酶液。
对比例2一种果胶裂解酶的制备方法
与实施例1类似，从中国农业科学院麻类研究所农产品加工微生物遗传改良与应用团队-80℃保存的甘油管吸取1mL基因工程菌pEASY-E1-SH8/BL21菌液，接种至200mL改良LB发酵培养液(含Amp 120μg/mL)，充分混匀，随后在200rpm和37℃下培养10-12h，即为种子液。具体地，上述改良LB培养液的质量比配方为：葡萄糖0.5％+胰蛋白胨1.0％+酵母提取物0.5％+NaCl 1.0％，余量为水，并用NH3·H2O调pH值为7.5。
将600mL种子液直接接种至盛有30L改良LB发酵培养液(含Amp 120μg/mL)的50L发酵罐(瑞士比欧，德国)中，不断自动补加氨水(NH3·H2O)，使pH维持至7.0，通气量0.35m3/h，37℃，200rpm培养3-4h，使OD600达到0.5左右，添加IPTG至终浓度为1.2mmol/L，改为28℃诱导培养12-18h，即得成熟发酵液。
在4-8℃条件下，往上述30L成熟发酵液中添加蛋白酶抑制剂PMSF和DTT，同时控制PMSF和DTT的终浓度均为1.2mmol/L，成熟发酵液通过0.2μm超滤膜包(赛多利斯，德国)过滤除菌，再先后通过100kD和5kD膜包过滤，收集5-100kD部分的超滤液3L，即为果胶裂解酶液。
采用考马斯亮蓝G-250法测定成熟发酵液和果胶裂解酶液中的蛋白质含量。
如下表1所示为本发明实施例和对比例1-2在不同工艺条件下制备得到的果胶裂解酶的结果对比表。
表1本发明在不同工艺条件下制备得到的果胶裂解酶的结果对比表
Figure BDA0002911215980000071
分析表1的数据可以看出，本发明实施例1中对果胶裂解酶的实际酶活力、纯化倍数和回收率相对于对比例1和2均较高。
应用例果胶裂解酶酶解苎麻果胶制备低聚糖的方法
添加20-30mL实施例1中得到的果胶裂解酶液到10L 8-10w/v％的苎麻果胶液，使果胶裂解酶浓度为200-300U/mL。添加商业化的果胶水解酶100U/mL和果胶酯酶80U/mL，在50℃和pH为7.5-8.0条件下酶解2-3h。
果胶裂解酶活力的检测方法为：
用pH＝9.0的0.05mol/LGly-NaOH(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液配置5mg/mL的苎麻果胶溶液；取2mL底物预热到50℃，添加1mL适当稀释倍数的酶液和6μL的1mol/L的CaCl2溶液，充分混匀，50℃准确反应10min，煮沸灭活。
用沸水浴充分灭活的酶液，作相同反应处理的溶液为对照，测定OD235，换算果胶裂解酶活力。
采用旋转蒸发仪对低聚糖溶液进行低温浓缩，得到浓度3g/L的低聚糖浓缩液，用1-1.5mol/L HCl溶液中和，再把低聚糖浓缩液中缓慢加入到乙醇中，边搅拌边加入，使乙醇终浓度为50％，搅拌均匀，静置3h，直至寡聚糖充分沉淀，随后用3倍体积的浓度为98％的乙醇水溶液洗涤沉淀2次，在低于50℃下烘干，得到含水量小于2％低聚糖，粉碎过筛得到低聚糖粉末，计算果胶低聚糖得率。
设苎麻果胶质量为mp，低聚糖粉末质量为mo，果胶低聚糖得率(w)的计算公式为：w＝mo/mp×100％。
最后，以上仅为本发明的较佳实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种果胶裂解酶的制备方法，其特征在于，
包括，将基因工程菌株pEASY-E1-SH8/BL21接种至含Amp120μg/mL的改良LB发酵培养液中扩培发酵，随后添加IPTG诱导产果胶裂解酶，获得成熟发酵液后添加蛋白酶抑制剂，超滤收集分子量为10-50kD的酶液，即得；
其中，所述改良LB发酵培养液的质量比配方为：葡萄糖0.42-0.58％+胰蛋白胨0.7-1.2％+酵母提取物0.4-0.58％+NaCl 0.8-1.2％，余量为水。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述IPTG的添加时间为扩培发酵至OD600为0.4-0.6；
和/或，所述IPTG的添加量为控制其终浓度为1.15-1.25mmol/L。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，
所述蛋白酶抑制剂的添加时间为，添加所述IPTG后，在22-25℃下诱导培养18-24h，获得成熟发酵液；
优选地，所述成熟发酵液中的果胶裂解酶活力大于800U/mL。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，
所述蛋白酶抑制剂为PMSF和DTT的混合物；
优选地，所述PMSF和DTT的添加量为控制其终浓度分别为0.8-1mmol/L。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，
所述扩培发酵的方法具体为：
按体积比为2-5：100的比例将所述pEASY-E1-SH8/BL21的种子液与所述改良LB发酵培养液置于密封的发酵罐中，控制灌装量为发酵罐容积的40-60％，同时通过添加NH3·H2O控制pH值为7.0-7.5，调节发酵罐温度和搅拌速度分别为35-37℃和200-220rpm，对应于每升种子液的通气量为0.4-0.6m3/h。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，
在用于扩培发酵前，所述改良LB发酵培养液用NH3·H2O调pH值为7.5，并在121℃下灭菌30min，冷却后添加无菌氨苄青霉素至终浓度为120-130μg/mL。
7.权利要求1-6任一项所述的制备方法制备得到的果胶裂解酶。
8.权利要求1-6任一项所述的制备方法或权利要求7所述的果胶裂解酶在苎麻果胶低聚糖制备中的应用。
9.一种利用权利要求1-6任一项所述的制备方法或权利要求7所述的利用果胶裂解酶制备苎麻果胶低聚糖的方法，其特征在于，
将所述果胶裂解酶添加到浓度为8-10w/v％的苎麻果胶溶液中，所述果胶裂解酶的添加量为控制其活力为200-300U/mL，再添加果胶水解酶和果胶酯酶并控制其活力分别为80-125U/mL和65-100U/mL，在40-60℃和pH为7.5-8.0条件下酶解2-3h。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，
还包括，酶解后，采用1-1.5mol/L HCl溶液中和，真空干燥或低温蒸发浓缩至浓度为2-3g/L，随后缓慢加入乙醇并控制乙醇的终浓度为45-55％，静置沉淀后固液分离，并用98％的乙醇水溶液洗涤沉淀，烘干后粉碎过筛。
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