CN112680435A - 一种鞘氨醇胶裂解酶及酶解鞘氨醇胶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鞘氨醇胶裂解酶及酶解鞘氨醇胶的制备方法，属于生物工程技术领域。本发明的鞘氨醇胶裂解酶是由含有pET28a‑WelR重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)在添加IPTG的条件下，16‑30℃诱导4‑20小时获得的；采用本发明的鞘氨醇胶裂解酶对鞘氨醇胶进行裂解克服了采用化学法制备不同分子量鞘氨醇胶过程中的耗能、分离困难、反应条件难以控制等缺陷。本发明方法制备的酶解鞘氨醇胶具备较好的羟基自由基清除活性，可用于食品、护肤品等领域，拓展了鞘氨醇胶的应用。

Description

一种鞘氨醇胶裂解酶及酶解鞘氨醇胶的制备方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种鞘氨醇胶裂解酶及酶解鞘氨醇胶的制备方法。

背景技术

微生物代谢胶也叫生物合成胶，是微生物产生的具有保护作用的一种生物高聚物。近年来研究者发现了包括结冷胶(Gellan gum,S-60)、威兰胶(Welan gum,S-130)、鼠李胶(Rhamsan gum,S-194)、迪特胶(Diutan gum,S-657)、S-88、S-198和NW-11在内的多种鞘氨醇胶。它们一般都具有相似的主链结构，即葡萄糖-葡萄糖醛酸-葡萄糖-X-(X是L-鼠李糖或L-甘露糖)，被统称为鞘氨醇胶(Sphingans)。由于鞘氨醇胶多具有优良的流变学性质、热稳定性、酸碱稳定性等性能，可广泛应用于食品、混凝土、医药、石油等工农业生活的各个方面，已经引起越来越多的关注。鞘氨醇单胞菌WG(中国专利201410485635.5，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2013161)可以生产一种新型鞘氨醇胶WL，该多糖具有优于黄原胶、威兰胶的粘弹性、触变性、耐温性及耐盐性，在石油开采领域具有重要的应用价值。

但是，由于鞘氨醇胶WL分子量较大，分离纯化后难于重新溶解，限制了其应用，因此，需要对其进行降解，适度降低分子量。同时，鞘氨醇胶WL的流变学性能、耐温耐盐性及水溶性等性能均具有分子量依赖性，因此，制备不同分子量的鞘氨醇胶WL，可以获得适用于不同领域的多糖样品。目前，多糖降解多以化学降解方法为主，但化学降解条件要求较高，过程繁琐，也会导致降解过程中产物分离困难，产物分子量分布范围较宽等缺陷。采用生物酶解方法能够克服这些困难。但是，因为鞘氨醇胶结构的特殊性，专一性降解鞘氨醇胶的生物酶较少，采用生物降解法降解鞘氨醇胶的研究较少，生物酶解法降解鞘氨醇单胞菌WG生产的鞘氨醇胶WL国内外还未曾有过报道。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种鞘氨醇胶裂解酶及酶解鞘氨醇胶的制备方法。采用本发明的鞘氨醇胶裂解酶对鞘氨醇胶进行裂解克服了采用化学法制备不同分子量鞘氨醇胶过程中的耗能、分离困难、反应条件难以控制等缺陷。本发明方法制备的酶解鞘氨醇胶具备较好的羟基自由基清除活性，可用于食品、护肤品等领域，拓展了鞘氨醇胶的应用。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种鞘氨醇胶裂解酶，由以下方法制备而成：

(1)将含有pET28a-WelR重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)接种到LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀至0.6～1.0，加入终浓度为0.2-5mM的IPTG进行诱导，在16-30℃下诱导4-20小时；

(2)将步骤(1)诱导表达后的菌液离心收集菌体，用去离子水清洗两次，并重新悬浮在pH为7.4的PBS缓冲液中，冰水浴超声破碎至菌体澄清，超声破碎后进一步离心取上清即得到鞘氨醇胶裂解酶的粗酶液。

在上述方案的基础上，所述pET28a-WelR重组质粒中，WelR基因序列如SEQ ID NO:1所示。

上述鞘氨醇胶裂解酶在鞘氨醇胶裂解中的应用。

在上述方案的基础上，所述鞘氨醇胶由鞘氨醇单胞菌发酵产生。

在上述方案的基础上，所述鞘氨醇单胞菌为鞘氨醇单胞菌WG，保藏号为CCTCC No:M2013161。

一种酶解鞘氨醇胶的制备方法，采用上述鞘氨醇胶裂解酶进行酶解。

在上述方案的基础上，所述鞘氨醇胶裂解酶的用量为每mg鞘氨醇胶2-10μL，酶解时间为10-180min。

在上述方案的基础上，所述酶解鞘氨醇胶的制备方法，步骤如下：

(1)将鞘氨醇胶溶于pH为7.4的PBS缓冲液中，搅拌过夜，使其充分溶解，配制鞘氨醇胶溶液；

(2)将步骤(1)制备的鞘氨醇胶溶液与上述鞘氨醇胶裂解酶的粗酶液同时升温至30℃；并将预热后的粗酶液加入预热后的鞘氨醇胶溶液中进行酶解反应，粗酶液的使用量为2-10μL/mg底物；酶解反应温度为30℃，转速150r/min，pH为7.4，反应时间为10-180min；

(3)将步骤(2)酶解后的混合液升温至100℃，煮沸10min，使酶灭活，待冷却至室温；

(4)将步骤(3)灭酶后的反应液于8000r/min离心15min，除去蛋白沉淀，用截留分子量为8000～14000Da的透析袋进行透析，除去盐离子以及杂质，进行冷冻干燥，获得不同分子量的鞘氨醇胶WL样品。

上述方法制备的酶解鞘氨醇胶。

上述的酶解鞘氨醇胶在制备抗氧化制剂中的应用。

本发明技术方案的优点

采用本发明的鞘氨醇胶裂解酶对鞘氨醇胶进行裂解克服了采用化学法制备不同分子量鞘氨醇胶过程中的耗能、分离困难、反应条件难以控制等缺陷。本发明方法制备的鞘氨醇胶具备较好的羟基自由基清除活性，可用于食品、护肤品等领域，拓展了鞘氨醇胶的应用。

附图说明

图1鞘氨醇胶裂解酶诱导表达的SDS-PAGE图(M：蛋白质分子量标准，条带自上至下大小为170、130、100、70、55、40、35、25、15、10kDa，泳道1：阴性对照沉淀；泳道2-3：重组菌株16℃诱导20h获得的沉淀；泳道4：阴性对照上清；泳道5：重组菌株OD₆₀₀＝0.6时添加IPTG 16℃诱导20h获得的粗酶液；泳道6：重组菌株OD₆₀₀＝1时添加IPTG 16℃诱导20h获得的粗酶液)；

图2不同酶用量酶解后鞘氨醇胶粘度保留率曲线；

图3酶解不同时间后鞘氨醇胶粘度保留率曲线；

图4不同分子量鞘氨醇胶的羟基自由基清除活性。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

一种鞘氨醇胶裂解酶的制备方法，步骤如下：

(1)pET28a-WelR重组质粒的构建流程：

以鞘氨醇单胞菌WG(保藏号为：CCTCC No:M2013161)基因组为模板，利用PCR扩增WelR编码序列，所用引物如下(下划线部分为EcoRΙ和Hind III限制性内切酶酶切位点)：

welRfor：5’-GGAATTCATGCTTACCATGCCGGACG-3’(SEQ ID NO:2)

welRrev：5’-CCCAAGCTTTCAGACGTGGTGCAATTCC-3’(SEQ ID NO:3)

PCR条件如下：98℃8min；94℃10s，58℃5s，72℃15s，30个循环；72℃10min。

其中，welR基因序列如下：

SEQ ID NO:1

采用限制性内切酶EcoRΙ和Hind III分别对扩增得到的welR基因片段和pET28a(+)质粒进行双酶切后进行纯化，将目的基因片段和酶切后的载体按4:1(摩尔比)混合，采用DNA Ligation Kit Ver.2.0试剂盒连接目的基因片段和载体。连接产物转化E.coli DH5α，在含100μg/mL卡那霉素的LB平板上进行筛选。挑取单菌落后提质粒，经PCR鉴定获得阳性克隆，将单克隆送去上海生工生物工程有限公司，利用pET28a(+)载体通用测序引物进行测序。测序结果表明，pET28a-WelR重组质粒构建成功。随后，将该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得鞘氨醇胶裂解酶WelR的重组表达菌株。

(2)将含有pET28a-WelR重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)活化后接种到10mL LB培养基中过夜培养，然后转接至50mL新鲜LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀至0.6～1.0，加入终浓度为0.4mM的IPTG进行诱导，在16℃下诱导20小时。

以相应的未转化pET28a-WelR重组质粒的空宿主作为对照，培养方法如上。

(3)将步骤(2)诱导表达后的菌液于8000rpm离心10min收集菌体，用去离子水清洗两次，并重新悬浮在适当体积的pH为7.4的PBS缓冲液中，冰水浴超声破碎至菌体澄清，超声设定程序为：超声2s、停5s，全程时间15min，功率＜4000。超声破碎后进一步离心取上清得到粗酶液，用聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测其粗酶液及沉淀中蛋白质。

结果如图1所示，与阴性对照相比，经过IPTG诱导表达后，在粗酶液中出现一条大小在74kDa的目的条带，符合预测分子量大小，表明粗酶液中确实含有鞘氨醇胶裂解酶，其酶活力为4.1U/mL(酶活力单位定义：1mL粗酶液每分钟催化威兰胶产生1μg葡萄糖的量为一个酶活力单位)，表明裂解酶粗品制备成功。

实施例2

一种鞘氨醇胶WL的制备与纯化方法，具体步骤为：

将冻存的保藏号为CCTCC No:M2013161的鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.WG接种于种子培养基中，28℃、150rpm培养16h，获得液体发酵种子培养液；按照5％(v/v)比例将2.5mL的液体发酵种子培养液接种至含50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，32.5℃、摇床转速为200rpm、发酵72h，获得鞘氨醇胶发酵液。

将上述得到的鞘氨醇胶发酵液经过4倍体积乙醇沉淀处理，将沉淀物冷冻干燥24-72小时，得到鞘氨醇胶粗品；将粗制品使用异丙醇/氯化钠体系(氯化钠的浓度为2-5％)进一步纯化，抽滤、透析、干燥得到鞘氨醇胶WL精制品。

所述种子培养基为葡萄糖10g，酵母粉1g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.1g，去离子水定容至1L；

所述发酵培养基为葡萄糖67.37g、酵母粉3.42g、K₂HPO₄ 3.89g、MgSO₄ 0.1g、ZnSO₄0.1g、CaSO₄ 0.2g，1M NaOH调节pH至7，去离子水定容至1L。

实施例3

一种酶解鞘氨醇胶的制备方法，步骤为：

(1)将实施例2方法纯化获得的鞘氨醇胶溶于pH为7.4的PBS缓冲液中，搅拌过夜，使其充分溶解，配制鞘氨醇胶溶液；

(2)将步骤(1)制备的鞘氨醇胶溶液与实施例1制备的鞘氨醇胶裂解酶的粗酶液(粗酶液活性单位为4.1U/mL)同时升温至30℃；并将预热后的粗酶液加入预热后的鞘氨醇胶溶液中进行酶解反应，粗酶液的使用量为2-10μL/mg底物；酶解反应温度为30℃，转速150r/min，pH为7.4，反应时间为10-180min；

(3)将步骤(2)酶解后的混合液升温至100℃，煮沸10min，使酶灭活，待冷却至室温；

(4)将步骤(3)灭酶后的反应液于8000r/min离心15min，除去蛋白沉淀，用截留分子量为8000～14000Da的透析袋进行透析，除去盐离子以及杂质，进行冷冻干燥，获得不同分子量的鞘氨醇胶WL样品。

实施例4

不同酶用量对鞘氨醇胶WL分子量的影响

(1)用分析天平准确称取实施例2方法纯化获得的鞘氨醇胶180mg溶于180mL pH为7.4的PBS缓冲液中，搅拌过夜，使其充分溶解，配制1mg/mL的鞘氨醇胶溶液。

(2)分别取1mg/mL的鞘氨醇胶溶液10mL于50mL离心管中，将鞘氨醇胶溶液和实施例1制得的粗酶液同时升温至30℃。将实验组分为5组，1-5组中分别添加20、40、60、80、100μL粗酶液(粗酶液活性单位为4.1U/mL)，其酶用量为2、4、6、8、10μL/mg底物，以不添加粗酶液作为空白对照(设置为0组)。酶解反应温度为30℃，转速150r/min，pH为7.4，反应时间为10min。

(3)步骤(2)反应结束后升温至100℃，煮沸10min，使酶灭活，待冷却至室温。

将酶解结束的样品用旋转粘度计测其降解后的粘度，选用SC4-18号转子，转速为15r/min，计算粘度保留率，根据粘度来判断分子量的变化情况(图2)，结果表明实施例1的裂解酶可以非常有效地降解鞘氨醇胶WL，随着酶的用量增加，鞘氨醇胶的粘度显著下降，其粘度保留率范围在85％-12％，不同酶的用量可以获得不同分子量分布的鞘氨醇胶样品。

(4)将步骤(3)的反应体系于8000r/min离心15min，除去蛋白沉淀，用截留分子量为8000～14000Da的透析袋进行透析，除去盐离子以及杂质，进行冷冻干燥，获得不同分子量的鞘氨醇胶WL样品，选取其2组和4组作为有代表性样品，利用GPC测定分子量，二者的粘均分子量分别为4.7×10⁶Da和2.0×10⁶Da，表明随着酶用量的增加，鞘氨醇胶WL分子量下降。

实施例5

酶解时间对鞘氨醇胶WL分子量的影响

(1)用分析天平准确称取实施例2方法纯化获得的鞘氨醇胶180mg溶于180mL pH为7.4的PBS缓冲液中，搅拌过夜，使其充分溶解，配制1mg/mL的鞘氨醇胶溶液。

(2)分别取1mg/mL的鞘氨醇胶溶液10mL于50mL离心管中，将鞘氨醇胶WL溶液和粗酶液同时升温至30℃。将实验组分为5组，分别添加20μL粗酶液(粗酶液活性单位为4.1U/mL)至鞘氨醇胶溶液中，不添加粗酶液作为空白对照(设置为0组)。酶解反应温度为30℃，转速150r/min，pH为7.4，反应时间为分别为10、30、60、120、180min。

(3)步骤(2)反应结束后升温至100℃，煮沸10min，使酶灭活，待冷却至室温。

利用上述实施例4步骤(3)中的方法测定不同鞘氨醇胶样品的粘度并计算粘度保留率。结果图3所示，表明在0-30min内，鞘氨醇胶裂解酶可以高效降解鞘氨醇胶，其粘度保留率迅速下降至9％，酶解60min粘度保留率降到5％，随后酶解效率变得较低，酶解180min后粘度仅为未降解样品的3％。

(4)按照上述实施例4步骤(4)中的方法处理反应体系，制备不同分子量的鞘氨醇胶WL，选取酶解60min的样品使用GPC测定其分子量，其粘均分子量为1.4×10⁶Da。

实施例6

抗氧化活性测定(羟基自由基清除活性测定)

采用羟基自由基清除活性测定来表征抗氧化活性。具体步骤如下：

分别在试管中加入1mL的1.5mmol/L FeSO₄溶液，随后，加入实施例4中1-5组获得的不同分子量鞘氨醇胶多糖溶液2mL，同一分子量鞘氨醇胶测定5个不同浓度的抗氧化活性，分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL。加入0.7mL的3％H₂O₂溶液，最后，加入20mmol/L水杨酸-乙醇溶液0.3mL，摇匀。37℃水浴加热30min后用可见分光光度计在517nm处测定。利用Vc作为阳性对照。

羟基自由基清除率计算公式：

清除能力(％)＝[1-(A_i-A_j)/A₀]×100％

其中，A_i：加入鞘氨醇胶溶液的试验组；A_j：蒸馏水代替水杨酸为阴性对照；A₀：蒸馏水代替鞘氨醇胶溶液为空白对照

结果图4所示，未降解的鞘氨醇胶不具有羟基自由基清除活性，但是，经过酶解后的鞘氨醇胶均具备该活性，且随着浓度的增加，羟基自由基清除活性呈现递增趋势，同阳性对照相比，浓度为1mg/mL的第5组鞘氨醇胶样品抗氧化活性甚至还略高于Vc，表明经过酶解后的鞘氨醇胶样品具有较强的抗氧化活性，可以应用于食品、护肤品等诸多领域，拓展了鞘氨醇胶的应用领域。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

序列表

<110> 中国石油大学（华东）

福建师范大学

<120> 一种鞘氨醇胶裂解酶及酶解鞘氨醇胶的制备方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2028

<212> DNA

<213> 鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)

<400> 1

atgcttacca tgccggacgt catcgtcaaa aatcagagcg agcttgatgc tgccttgaag 60

gcagcgaggg gcggtgaagt gatcaagcta gcggcgggat cgtacacgac gctcggtatc 120

aacttgcgga acttcacgtc tgccgtgacc atccagtcgc tggacgtgaa caacaaggcg 180

ctcgttcaat cgatgtcgat cacatcgagc agcaacatcg tcgtcaagga tttggacatc 240

aagcagaact tccagcccga acaagactgg atgcttgcta atcgcgtggt caactccaag 300

aacgttacgc tggacggcgt cgccatcagc ggcggaacag gcgatccagc attgtcgaga 360

ggcatcggcc tggtcgtacg cgacagcagc gttgtctcga tcaagaactc ctcgatcgat 420

cattttgcgg taggtttgga tggacgcaac accgatgcga tgaccattca gaacaacgac 480

ttccatcaca atcgccggga tcacacgaac ttctcggaga tgagcaacct gttgatcgac 540

aacaatctct tcaccgatct ttatccggtg aacggcgaac accccgacaa tatccagttc 600

ttgacgagcg gacgcgcgaa aggcagctcc aacatcacca tcaccaacaa cgtcatcatg 660

caaggcaatg gaggctcgag ccagggcatc ttcatgaatg atgagaacgg caatcttccc 720

tacaccaata tcaatataaa aaataatctg gtgtacacca acggaatgta tcacggcatc 780

aatgtcgtga acggccgtaa cgtgaacatc gactccaata ccatcgtctc taagatggac 840

ggaacgtctc tttggatccg tttggacaag acggcggatg ctacgatcac gaacaacgta 900

acagacgcaa tcatcctcga cgcaacctcg accaacattc gccagtcgaa caatgcggtt 960

ctcaccagtg acgcagtaac gctgcggaag ctctacgatc tcaacgccgt gtctaccgcg 1020

gctctaagca acctcattgt cagcggcgtc ggtttccagc cgccggtcgg gagcgctgca 1080

gcatcgctgg tggccaagga actggtgacg ctggcaaagc ccacaagtcc gaacctgttg 1140

ctaaacatgc agtttaccgg cagcggcatc gtcgaccagt cgcgctggag ctcggatgaa 1200

accaagagtg ccgtcaatct ggcagcgatc aacggcggct tcttccaagt aaagactggg 1260

actggctttg aactgctccg cgagtattca cgtcagcttt acagccttcc ggcctttacc 1320

atcagcttcg atatgaagcg agactcggta acggcaccgg taggtcagat catggggatc 1380

aaccagagtt ggggtatatc cctccgcgcc aacggcgaac tcgccttcac catgaccaac 1440

gcggctggca agaacttctc gctcgttacc accggcgcga acatcacgga cacggctact 1500

cacaagattg ccctcaccta tgacagcgcc aagggcaacg ctatcctcta tgttgatggc 1560

gtggcgcggg gtagcctcgc aatgacgggc agcacccgcg catccgagtt ttggggactg 1620

tatgtcggca gtccgttcag cagtgccttc agcggcggga tcggcggcat tcagatacgc 1680

gaaggcgctc tgagtgcttc ggagatcctc gtcctcggag ggggggcgaa cgcaaccttg 1740

ccgacttctg aggcagtgaa gtacagcctt accaagggcg cggcgtcgag cgcggcgctg 1800

ttgctgatgt ccggcggtac cagcacaacc aaggccgtga ccgcggtggg gacgtcaacc 1860

ttggcatcga cgctcaccgg cggcgcgacc gcgcagctgg cgctcgcatc aaaggtctcc 1920

gtcactgacg atattagctt gacgggggat ctcggcggta gcgcgttgtg gcagcgcagc 1980

acgatgatca ctggcaactc ctaccgcatg gaattgcacc acgtctga 2028

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggaattcatg cttaccatgc cggacg 26

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccaagcttt cagacgtggt gcaattcc 28

Claims (10)

1.一种鞘氨醇胶裂解酶，其特征在于，由以下方法制备而成：

(1)将含有pET28a-WelR重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)接种到LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀至0.6～1.0，加入终浓度为0.2-5mM的IPTG进行诱导，在16-30℃下诱导4-20小时；

(2)将步骤(1)诱导表达后的菌液离心收集菌体，用去离子水清洗两次，并重新悬浮在pH为7.4的PBS缓冲液中，冰水浴超声破碎至菌体澄清，超声破碎后进一步离心取上清即得到鞘氨醇胶裂解酶的粗酶液。

2.根据权利要求1所述鞘氨醇胶裂解酶，其特征在于，所述pET28a-WelR重组质粒中，WelR基因序列如SEQ ID NO:1所示。

3.权利要求1或2所述鞘氨醇胶裂解酶在鞘氨醇胶裂解中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述鞘氨醇胶由鞘氨醇单胞菌发酵产生。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述鞘氨醇单胞菌为鞘氨醇单胞菌WG，保藏号为CCTCC No:M2013161。

6.一种酶解鞘氨醇胶的制备方法，其特征在于，采用权利要求1或2所述鞘氨醇胶裂解酶进行酶解。

7.根据权利要求6所述酶解鞘氨醇胶的制备方法，其特征在于，所述鞘氨醇胶裂解酶的用量为每mg鞘氨醇胶2-10μL，酶解时间为10-180min。

8.根据权利要求7所述酶解鞘氨醇胶的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)将鞘氨醇胶溶于pH为7.4的PBS缓冲液中，搅拌过夜，使其充分溶解，配制鞘氨醇胶溶液；

(2)将步骤(1)制备的鞘氨醇胶溶液与权利要求1或2的鞘氨醇胶裂解酶的粗酶液同时升温至30℃；并将预热后的粗酶液加入预热后的鞘氨醇胶溶液中进行酶解反应，粗酶液的使用量为2-10μL/mg底物；酶解反应温度为30℃，转速150r/min，pH为7.4，反应时间为10-180min；

(3)将步骤(2)酶解后的混合液升温至100℃，煮沸10min，使酶灭活，待冷却至室温；

(4)将步骤(3)灭酶后的反应液于8000r/min离心15min，除去蛋白沉淀，用截留分子量为8000～14000Da的透析袋进行透析，除去盐离子以及杂质，进行冷冻干燥，获得不同分子量的鞘氨醇胶WL样品。

9.权利要求8所述方法制备的酶解鞘氨醇胶。

10.权利要求9所述的酶解鞘氨醇胶在制备抗氧化制剂中的应用。

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