JPH09234065A - 新規なゲラン分解酵素とオリゴ糖 - Google Patents
新規なゲラン分解酵素とオリゴ糖Info
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- JPH09234065A JPH09234065A JP8046363A JP4636396A JPH09234065A JP H09234065 A JPH09234065 A JP H09234065A JP 8046363 A JP8046363 A JP 8046363A JP 4636396 A JP4636396 A JP 4636396A JP H09234065 A JPH09234065 A JP H09234065A
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- lyase
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- enzyme
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 Sphingobacterium multivorum とFlavob
acterium multivorum よりなる共生菌より単離精製され
た、新規なゲランリアーゼおよびゲラン分解物。 【効果】 本発明によれば、新規なゲランリアーゼが提
供され、該酵素をゲランに作用させて得られるゲランオ
リゴ糖は、ゲランの持つ生理機能を保持し、水に溶解し
易く、しかも水に溶解しても高粘性を示さないので、医
薬品や食品素材として好適に利用できる。
acterium multivorum よりなる共生菌より単離精製され
た、新規なゲランリアーゼおよびゲラン分解物。 【効果】 本発明によれば、新規なゲランリアーゼが提
供され、該酵素をゲランに作用させて得られるゲランオ
リゴ糖は、ゲランの持つ生理機能を保持し、水に溶解し
易く、しかも水に溶解しても高粘性を示さないので、医
薬品や食品素材として好適に利用できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は新規なゲランリアー
ゼ、及び食品または医薬品素材に好適な物性と生理機能
を持つゲラン分解物に関する。
ゼ、及び食品または医薬品素材に好適な物性と生理機能
を持つゲラン分解物に関する。
【０００２】
【従来の技術】Sphingomonas paucimobilis によって分
泌生産されるゲラン（スフィンガン）はＤ−グルコース
（Glc)、Ｄ−グルクロン酸（GlcA）、Ｌ−ラムノース
(Rha)を構成糖として、〔→3)-β-D-Glc-(1→4)-β-D-G
lcA-(1→4)-β-D-Glc-(1→4)-α-L-Rha-(1→〕を基本単
位としたポリマーである。一般にゲランのグルクロン酸
残基の隣に位置するＤ−グルコシル残基はＯ−アセチル
化またはグリセリン化されていて、これら側鎖が粘性以
外でもゲランの物理的性質を変化させている。脱アセチ
ル化したゲランはカラギーナン、寒天、アルギン酸等に
比べ非常に高いゲル化能を有していることから、食品ま
たは医薬品の分野においてゲル化・安定化剤として利用
され、商業化されている。
泌生産されるゲラン（スフィンガン）はＤ−グルコース
（Glc)、Ｄ−グルクロン酸（GlcA）、Ｌ−ラムノース
(Rha)を構成糖として、〔→3)-β-D-Glc-(1→4)-β-D-G
lcA-(1→4)-β-D-Glc-(1→4)-α-L-Rha-(1→〕を基本単
位としたポリマーである。一般にゲランのグルクロン酸
残基の隣に位置するＤ−グルコシル残基はＯ−アセチル
化またはグリセリン化されていて、これら側鎖が粘性以
外でもゲランの物理的性質を変化させている。脱アセチ
ル化したゲランはカラギーナン、寒天、アルギン酸等に
比べ非常に高いゲル化能を有していることから、食品ま
たは医薬品の分野においてゲル化・安定化剤として利用
され、商業化されている。
【０００３】しかし、ゲランは非常に高粘性であるため
にその利用は制限を受けることが多く、その物性を改善
させた形、つまり低粘性で低分子サイズのゲラン分解物
として提供されることが有利であると考えられる。これ
までゲラン分解活性を有する微生物は、例えば Bacillu
s sp. [Mikolajczak, M.J.ら, Applied and Environmen
tal Microbiology, 60(2), 402-407 (1994)]、赤色色素
細菌（未同定）[Kennedy, L. and Sutherland, W., Mic
robiology, 140, 3007-3013 (1994)] は見いだされてい
たものの、その酵素は単離されておらず、未だゲラン分
解物の検討や開発には至っていないのが現状である。
にその利用は制限を受けることが多く、その物性を改善
させた形、つまり低粘性で低分子サイズのゲラン分解物
として提供されることが有利であると考えられる。これ
までゲラン分解活性を有する微生物は、例えば Bacillu
s sp. [Mikolajczak, M.J.ら, Applied and Environmen
tal Microbiology, 60(2), 402-407 (1994)]、赤色色素
細菌（未同定）[Kennedy, L. and Sutherland, W., Mic
robiology, 140, 3007-3013 (1994)] は見いだされてい
たものの、その酵素は単離されておらず、未だゲラン分
解物の検討や開発には至っていないのが現状である。
【０００４】ゲランリアーゼ、スフィンガナーゼに代表
されるゲラン分解酵素は一般には微生物菌体から分泌さ
れるゲラン（スフィンガン) 及びこの構成糖を基本骨格
としたウェランなどのゲラン関連物質を分解するエンド
グリカナーゼである。これまでゲランリアーゼとして
は、 Kennedy, L. and Sutherland, 1994, Microbiolog
y 140:3007-3013 、Schmedding, D.J.M.ら, 1987, Proc
eedings of Eurocarb IV, Darmstadt, Abstract B47
が、またスフィンガナーゼとしてはMikolajczak, M.J.
ら, 1994, Appl. Environ. Microbiol. 60:402-407等が
知られている。しかし、これらのゲラン分解酵素は基質
特異性が低く、ウェランやラムサンにも作用し、分子量
は110,000 (上記Mikolajczak et al.の報告) である。
されるゲラン分解酵素は一般には微生物菌体から分泌さ
れるゲラン（スフィンガン) 及びこの構成糖を基本骨格
としたウェランなどのゲラン関連物質を分解するエンド
グリカナーゼである。これまでゲランリアーゼとして
は、 Kennedy, L. and Sutherland, 1994, Microbiolog
y 140:3007-3013 、Schmedding, D.J.M.ら, 1987, Proc
eedings of Eurocarb IV, Darmstadt, Abstract B47
が、またスフィンガナーゼとしてはMikolajczak, M.J.
ら, 1994, Appl. Environ. Microbiol. 60:402-407等が
知られている。しかし、これらのゲラン分解酵素は基質
特異性が低く、ウェランやラムサンにも作用し、分子量
は110,000 (上記Mikolajczak et al.の報告) である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、新規
なゲランリアーゼを微生物より単離し、該酵素をゲラン
に作用させ、食品及び医薬品素材に好適に使用できるゲ
ラン分解物を提供することにある。
なゲランリアーゼを微生物より単離し、該酵素をゲラン
に作用させ、食品及び医薬品素材に好適に使用できるゲ
ラン分解物を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決すべく鋭意研究を重ねた結果、Sphingobacteriummu
ltivorum とFlavobacterium multivorum よりなる共生
菌より、新規なゲランリアーゼを見い出し、これを単離
精製して諸性質を明らかにするとともに、当該新規ゲラ
ンリアーゼを用いて食品または医薬品素材に好適な物性
を有するゲラン分解物を得、本発明を完成するに到っ
た。
解決すべく鋭意研究を重ねた結果、Sphingobacteriummu
ltivorum とFlavobacterium multivorum よりなる共生
菌より、新規なゲランリアーゼを見い出し、これを単離
精製して諸性質を明らかにするとともに、当該新規ゲラ
ンリアーゼを用いて食品または医薬品素材に好適な物性
を有するゲラン分解物を得、本発明を完成するに到っ
た。
【０００７】すなわち、本発明は、下記の理化学的性質
を有する新規なゲランリアーゼ： (1) 作用及び基質特異性 ゲランの末端から四糖単位を切断する。 (2) 至適ｐＨの範囲 ７〜８ (3) 安定温度の範囲（ｐＨ７．５） ４５℃以下 (4) 作用適温の範囲 ２５〜４５℃ (5) 失活の条件（温度安定性） ５０℃，１０分で５０％、７０℃，１０分で９５％以上
の酵素活性が失活する。 (6) 金属イオン、阻害剤の影響 １mMのＣａ2+，Ｍｏ2+，Ｃｕ2+，Ｆｅ2+，Ｃｏ2+，Ｚｎ
2+等の二価のカチオンによって活性が阻害されず、0.1m
M のＨｇ2+で著しく活性が阻害される。１mMジチオスレ
イトール、１mM還元型グルタチオン、1mM ２−メルカプ
トエタノール、0.1mM Ｎ−エチルマレイミド等のスルフ
ヒドリル試薬に活性が影響されず、1mM ＥＤＴＡで50％
の活性阻害を与える。 (7) 分子量 SDS-PAGEによる分子量 140,000 である。
を有する新規なゲランリアーゼ： (1) 作用及び基質特異性 ゲランの末端から四糖単位を切断する。 (2) 至適ｐＨの範囲 ７〜８ (3) 安定温度の範囲（ｐＨ７．５） ４５℃以下 (4) 作用適温の範囲 ２５〜４５℃ (5) 失活の条件（温度安定性） ５０℃，１０分で５０％、７０℃，１０分で９５％以上
の酵素活性が失活する。 (6) 金属イオン、阻害剤の影響 １mMのＣａ2+，Ｍｏ2+，Ｃｕ2+，Ｆｅ2+，Ｃｏ2+，Ｚｎ
2+等の二価のカチオンによって活性が阻害されず、0.1m
M のＨｇ2+で著しく活性が阻害される。１mMジチオスレ
イトール、１mM還元型グルタチオン、1mM ２−メルカプ
トエタノール、0.1mM Ｎ−エチルマレイミド等のスルフ
ヒドリル試薬に活性が影響されず、1mM ＥＤＴＡで50％
の活性阻害を与える。 (7) 分子量 SDS-PAGEによる分子量 140,000 である。
【０００８】本発明はまた、上記の新規ゲランリアーゼ
をゲランに作用させることにより得られるゲラン分解物
である。さらに、本発明は、下式：
をゲランに作用させることにより得られるゲラン分解物
である。さらに、本発明は、下式：
【０００９】
【化２】 Δ-4,5-GlcA-(1→4)-β-D-Glc-(1→4)-α-L-Rha-(1→3)-β-D-Glc (I)
【００１０】（式中、Glc ; D-グルコース、GlcA ; D-
グルクロン酸、Rha ; L-ラムノースを示す。）表される
ゲラン分解物である。以下、本発明を詳細に説明する。
グルクロン酸、Rha ; L-ラムノースを示す。）表される
ゲラン分解物である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明の新規なゲランリアーゼ
は、Sphingobacterium multivorum とFlavobacterium m
ultivorum よりなる共生菌を培地に培養し、菌体外にゲ
ランリアーゼを生産させ、これを採取することにより得
ることができる。
は、Sphingobacterium multivorum とFlavobacterium m
ultivorum よりなる共生菌を培地に培養し、菌体外にゲ
ランリアーゼを生産させ、これを採取することにより得
ることができる。
【００１２】上記の共生菌のスクリーニングは、試料と
する土壌の生理食塩水懸濁液によるゲラン含有液体培地
（0.1%硫酸アンモニウム、0.1%リン酸カリウム、、0.2%
リン酸二ナトリウム、0.01% 硫酸マグネシウム、0.2%
ゲラン) の資化能、及びゲランプレート（ゲランを除い
た前記液体培地溶液に別途調製したゲラン溶液を１：１
の割合で混ぜ合わせて調製）の液状化とを観察し、これ
らを指標として行うことができる。
する土壌の生理食塩水懸濁液によるゲラン含有液体培地
（0.1%硫酸アンモニウム、0.1%リン酸カリウム、、0.2%
リン酸二ナトリウム、0.01% 硫酸マグネシウム、0.2%
ゲラン) の資化能、及びゲランプレート（ゲランを除い
た前記液体培地溶液に別途調製したゲラン溶液を１：１
の割合で混ぜ合わせて調製）の液状化とを観察し、これ
らを指標として行うことができる。
【００１３】上記共生菌を構成する菌株のうちの一つ
（Ａ菌株と称する）の菌学的性質を以下に示す。 Ａ菌株の菌学的性質 ・培養温度 25℃ ・グラム染色 − ・胞子形成能 − ・運動性 − ・コロニー形態（ベンネットアガー） 円形、規則性、完全型、 クリーム色、酪酸発酵性 平滑、光沢、凸状、不透明 ・生育の範囲（℃） 37℃, ＋ 41℃, − 45℃, − ・カタラーゼ ＋ ・オキシダーゼ ＋ ・グルコースＯＦテスト −（酸化） ・ＮＯ3 還元 − ・インドール生成 − ・グルコースからの酸生成 − ・アルギニンデヒドロラーゼ − ・ウレアーゼ ＋ ・エスクリン加水分解 ＋ ・β−ガラクトシダーゼ ＋ ・ゼラチン加水分解 − ・グルコース資化性 ＋ ・アラビノース資化性 ＋ ・マンノース資化性 ＋ ・マンニトール資化性 − ・Ｎ−アセチル−グルコサミン資化性 ＋ ・マリオース資化性 ＋ ・グルコン酸資化性 − ・カプロン酸資化性 − ・アジピン酸資化性 − ・マレイン酸資化性 − ・クエン酸資化性 − ・フェニルアセテート資化性 − ・チトクロームオキシダーゼ ＋ ・残留硝酸塩 ＋
（Ａ菌株と称する）の菌学的性質を以下に示す。 Ａ菌株の菌学的性質 ・培養温度 25℃ ・グラム染色 − ・胞子形成能 − ・運動性 − ・コロニー形態（ベンネットアガー） 円形、規則性、完全型、 クリーム色、酪酸発酵性 平滑、光沢、凸状、不透明 ・生育の範囲（℃） 37℃, ＋ 41℃, − 45℃, − ・カタラーゼ ＋ ・オキシダーゼ ＋ ・グルコースＯＦテスト −（酸化） ・ＮＯ3 還元 − ・インドール生成 − ・グルコースからの酸生成 − ・アルギニンデヒドロラーゼ − ・ウレアーゼ ＋ ・エスクリン加水分解 ＋ ・β−ガラクトシダーゼ ＋ ・ゼラチン加水分解 − ・グルコース資化性 ＋ ・アラビノース資化性 ＋ ・マンノース資化性 ＋ ・マンニトール資化性 − ・Ｎ−アセチル−グルコサミン資化性 ＋ ・マリオース資化性 ＋ ・グルコン酸資化性 − ・カプロン酸資化性 − ・アジピン酸資化性 − ・マレイン酸資化性 − ・クエン酸資化性 − ・フェニルアセテート資化性 − ・チトクロームオキシダーゼ ＋ ・残留硝酸塩 ＋
【００１４】このＡ菌株の上記の菌学的性質について、
バージーズ マニュアル オブ デタミネイティブ バ
クテリオロジー第９改正（１９９４）を用いて検討した
結果、Ａ菌株はSphingobacterium multivorum に属する
微生物であると同定された。そして、当該菌株は、工業
技術院生命工学工業技術研究所に平成８年２月１５日に
寄託し、その寄託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１５４４１であ
る。
バージーズ マニュアル オブ デタミネイティブ バ
クテリオロジー第９改正（１９９４）を用いて検討した
結果、Ａ菌株はSphingobacterium multivorum に属する
微生物であると同定された。そして、当該菌株は、工業
技術院生命工学工業技術研究所に平成８年２月１５日に
寄託し、その寄託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１５４４１であ
る。
【００１５】上記共生菌を構成する菌株のうちのもう一
つ（Ｂ菌株と称する）の菌学的性質を以下に示す。 Ｂ菌株の菌学的性質 ・グラム染色 − ・胞子形成能 − ・運動性 − ・コロニー形態 淡黄色（48時間培養) 、円形 低凹状、平滑、不透明 ・カタラーゼ生成 ＋ ・オキシダーゼ生成 ＋ ・リン酸塩生成 ＋ ・アドニトール、ダルシトール、 − イノシトール、ソルビトール資化性 ・アルギニンデヒドロラーゼ − ・グリセロール、トレハロース、 ＋ フルクトース、マルトース、 ラムノースからの嫌気下での酸生成 ・生育の範囲 5℃, − 37℃, ＋ 42℃, − ・10% グルコースからの酸生成 ＋ 10% ラクトースからの酸生成 ＋ ・グルコースＯＦテスト ＋ ・硝酸塩還元 − ・ポリ−β−ヒドロキシブチレート − 含有顆粒 ・グルコースからのガス発生 − ・グルコン酸の酸化 − ・Ｈ2 Ｓ生成 − ・リジンまたはオルニチンの − 脱炭酸反応 − ・マロン酸の利用 ・フェニルアラニンデアミナーゼ − ・β−ガラクトシダーゼ ＋ ・インドール生産 −
つ（Ｂ菌株と称する）の菌学的性質を以下に示す。 Ｂ菌株の菌学的性質 ・グラム染色 − ・胞子形成能 − ・運動性 − ・コロニー形態 淡黄色（48時間培養) 、円形 低凹状、平滑、不透明 ・カタラーゼ生成 ＋ ・オキシダーゼ生成 ＋ ・リン酸塩生成 ＋ ・アドニトール、ダルシトール、 − イノシトール、ソルビトール資化性 ・アルギニンデヒドロラーゼ − ・グリセロール、トレハロース、 ＋ フルクトース、マルトース、 ラムノースからの嫌気下での酸生成 ・生育の範囲 5℃, − 37℃, ＋ 42℃, − ・10% グルコースからの酸生成 ＋ 10% ラクトースからの酸生成 ＋ ・グルコースＯＦテスト ＋ ・硝酸塩還元 − ・ポリ−β−ヒドロキシブチレート − 含有顆粒 ・グルコースからのガス発生 − ・グルコン酸の酸化 − ・Ｈ2 Ｓ生成 − ・リジンまたはオルニチンの − 脱炭酸反応 − ・マロン酸の利用 ・フェニルアラニンデアミナーゼ − ・β−ガラクトシダーゼ ＋ ・インドール生産 −
【００１６】このＢ菌株の上記の菌学的性質について、
バージーズ マニュアル オブ デタミネイティブ バ
クテリオロジー第９改正（１９９４）を用いて検討した
結果、Ｂ菌株はFlavobacterium multivorum に属する微
生物であると同定された。そして、当該菌株は、工業技
術院生命工学工業技術研究所に平成８年２月１５日に寄
託し、その寄託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１５４４０であ
る。
バージーズ マニュアル オブ デタミネイティブ バ
クテリオロジー第９改正（１９９４）を用いて検討した
結果、Ｂ菌株はFlavobacterium multivorum に属する微
生物であると同定された。そして、当該菌株は、工業技
術院生命工学工業技術研究所に平成８年２月１５日に寄
託し、その寄託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１５４４０であ
る。
【００１７】上記共生菌の培養に使用する培地には該菌
が利用し得る炭素源、窒素源、無機源その他の栄養源が
添加される。すなわち、炭素源としては例えばグルコー
ス、可溶性デンプン、コーンミール、ゲラン及びその関
連物質等が挙げられ、窒素源としては、ペプトン、大豆
粕、綿実粕、酵母エキス、小麦ふすま、コーンスチープ
リカー、アンモニウム塩類、硝酸塩類、肉エキス等の有
機若しくは無機の窒素化合物が挙げられる。また、無機
塩としては、各種リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、マグネシ
ウム塩等の化合物、さらに菌の生育を促進する目的でビ
タミン、核酸等の物質を添加すると有効である。
が利用し得る炭素源、窒素源、無機源その他の栄養源が
添加される。すなわち、炭素源としては例えばグルコー
ス、可溶性デンプン、コーンミール、ゲラン及びその関
連物質等が挙げられ、窒素源としては、ペプトン、大豆
粕、綿実粕、酵母エキス、小麦ふすま、コーンスチープ
リカー、アンモニウム塩類、硝酸塩類、肉エキス等の有
機若しくは無機の窒素化合物が挙げられる。また、無機
塩としては、各種リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、マグネシ
ウム塩等の化合物、さらに菌の生育を促進する目的でビ
タミン、核酸等の物質を添加すると有効である。
【００１８】培養に当たっては、通常２５〜４０℃で、
１０〜１００時間培養する。液体培養では酵素が培養液
中に生成されるので、それより抽出して精製する。
１０〜１００時間培養する。液体培養では酵素が培養液
中に生成されるので、それより抽出して精製する。
【００１９】このようにして培地内に生成したゲランリ
アーゼは公知の精製方法を組み合わせて精製することが
できる。すなわち、培養後、常法により菌体を除去し、
濾液にイオン交換樹脂やゲル濾過クロマトグラフィー等
を組み合わせて行う。
アーゼは公知の精製方法を組み合わせて精製することが
できる。すなわち、培養後、常法により菌体を除去し、
濾液にイオン交換樹脂やゲル濾過クロマトグラフィー等
を組み合わせて行う。
【００２０】かくして得られた酵素は、下記の理化学的
性質を有する新規なゲランリアーゼである。なお、本酵
素の活性測定は、0.05％ゲランを含む50mMリン酸バッフ
ァー(pH7.0)１mlに本酵素液を添加し、30℃、30分反応
を行い、反応終了後直ちに沸騰水中に５分間浸して酵素
反応を停止し、次いで、反応停止液0.２mlを用いてチオ
バルビツール酸法（Weissbach, A., and Hurwitz, J. 1
958, J.Biol.Chem., 234:705-709) にて行う。
性質を有する新規なゲランリアーゼである。なお、本酵
素の活性測定は、0.05％ゲランを含む50mMリン酸バッフ
ァー(pH7.0)１mlに本酵素液を添加し、30℃、30分反応
を行い、反応終了後直ちに沸騰水中に５分間浸して酵素
反応を停止し、次いで、反応停止液0.２mlを用いてチオ
バルビツール酸法（Weissbach, A., and Hurwitz, J. 1
958, J.Biol.Chem., 234:705-709) にて行う。
【００２１】（１）作用 ゲランの末端から四糖単位を切断する。
【００２２】（２）基質特異性 （試験方法）反応は0.05％の各基質と50mM HEPES緩衝液
(pH7.5) 中に本発明のゲランリアーゼ10μg/mlを添加
し、30℃、１時間処理し、沸騰水中で５分さらすことで
反応停止し、反応停止後のそれぞれの分解産物を調べ
る。脱アセチル化したゲラン分解活性を100％とする。
(pH7.5) 中に本発明のゲランリアーゼ10μg/mlを添加
し、30℃、１時間処理し、沸騰水中で５分さらすことで
反応停止し、反応停止後のそれぞれの分解産物を調べ
る。脱アセチル化したゲラン分解活性を100％とする。
【００２３】（結果）結果は表１の通りである。脱アセ
チル化したゲランに非常に高い基質特異性がある。
チル化したゲランに非常に高い基質特異性がある。
【００２４】
【表１】
【００２５】（３）至適ｐＨの範囲 図１、Ａに示されるように、本酵素はｐＨ７〜８におい
て至適ｐＨの範囲を有する。酵素活性は、０．０５％ゲ
ランとゲランリアーゼを３０℃，６０分，各ｐＨで反応
を行うことにより測定する。測定に用いた各ｐＨでの緩
衝液は５０ｍＭの酢酸ナトリウム（□）、リン酸カリウ
ム（▲）、ＨＥＰＥＳ（△）、トリス−塩酸（○）、及
びグリシン（■）である。各ｐＨにおける相対活性はｐ
Ｈ７．５における酵素力価を１００％として求める。
て至適ｐＨの範囲を有する。酵素活性は、０．０５％ゲ
ランとゲランリアーゼを３０℃，６０分，各ｐＨで反応
を行うことにより測定する。測定に用いた各ｐＨでの緩
衝液は５０ｍＭの酢酸ナトリウム（□）、リン酸カリウ
ム（▲）、ＨＥＰＥＳ（△）、トリス−塩酸（○）、及
びグリシン（■）である。各ｐＨにおける相対活性はｐ
Ｈ７．５における酵素力価を１００％として求める。
【００２６】（４）至適温度 図１、Ｂに示されるように、４５℃での酵素活性が最も
強い。反応条件は０．０５％ゲランを含む５０ｍＭＨＥ
ＰＥＳ（ｐＨ７．５）中で各温度条件のもと、３０分酵
素反応を行い、その力価をプロットする。なお、相対活
性は４５℃での酵素力価を１００％として求める。
強い。反応条件は０．０５％ゲランを含む５０ｍＭＨＥ
ＰＥＳ（ｐＨ７．５）中で各温度条件のもと、３０分酵
素反応を行い、その力価をプロットする。なお、相対活
性は４５℃での酵素力価を１００％として求める。
【００２７】（５）安定温度の範囲及び失活の条件 図１、Ｃに示されるように、本酵素は４５℃以下におい
て安定である。この評価は次の方法に従って行うことが
できる。すなわち、同図に示す各温度でゲランリアーゼ
を予め１０分間インキュベートした酵素液を、０．０５
％ゲランを含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）に３
０℃で３０分反応させて残存活性を測定する。なお、相
対活性は３０℃での酵素力価を１００％として求める。
また、ｐＨ７．５、反応時間１０分の条件で５０％残存
活性を示す温度は５０℃であるが、同条件下７０℃で反
応させると酵素活性はほとんど失活する。
て安定である。この評価は次の方法に従って行うことが
できる。すなわち、同図に示す各温度でゲランリアーゼ
を予め１０分間インキュベートした酵素液を、０．０５
％ゲランを含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）に３
０℃で３０分反応させて残存活性を測定する。なお、相
対活性は３０℃での酵素力価を１００％として求める。
また、ｐＨ７．５、反応時間１０分の条件で５０％残存
活性を示す温度は５０℃であるが、同条件下７０℃で反
応させると酵素活性はほとんど失活する。
【００２８】（６）分子量 12.5％のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した
結果から分子量は140,000であることが明らかとなった
（図２）。
結果から分子量は140,000であることが明らかとなった
（図２）。
【００２９】（７）二価金属イオンの存在下における基
質特異性 酵素反応時に以下に示す各物質を添加した場合と添加し
なかった場合の酵素活性の阻害を調べた。１mMのＣ
ａ2+, Ｍｏ2+, Ｃｕ2+, Ｆｅ2+, Ｃｏ2+, Ｚｎ2+等の二
価のカチオンは酵素活性に影響しなかったのに対して、
Ｈｇ2+は0.１mMの添加で100%の酵素活性の阻害があっ
た。ＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸）も１mM添加で
50％の活性低下が認められた。スルフヒドリル試薬であ
るジチオスレイトール（１mM) 、還元型グルタチオン
（１mM) 、２−メルカプトエタノール（１mM) 、Ｎ−エ
チルマレイミド（0.１mM) も活性に影響を与えなかっ
た。
質特異性 酵素反応時に以下に示す各物質を添加した場合と添加し
なかった場合の酵素活性の阻害を調べた。１mMのＣ
ａ2+, Ｍｏ2+, Ｃｕ2+, Ｆｅ2+, Ｃｏ2+, Ｚｎ2+等の二
価のカチオンは酵素活性に影響しなかったのに対して、
Ｈｇ2+は0.１mMの添加で100%の酵素活性の阻害があっ
た。ＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸）も１mM添加で
50％の活性低下が認められた。スルフヒドリル試薬であ
るジチオスレイトール（１mM) 、還元型グルタチオン
（１mM) 、２−メルカプトエタノール（１mM) 、Ｎ−エ
チルマレイミド（0.１mM) も活性に影響を与えなかっ
た。
【００３０】本発明のゲランリアーゼによるゲランの分
解は一般的な多糖の酵素分解法と同様の方法で行える。
例えば、ゲランの水溶液に該酵素を添加すればよい。水
溶液のゲラン濃度は特に限定されないが、通常0.05〜３
％重量程度、好ましくは0.１〜２％重量程度とすればよ
い。ゲランリアーゼの添加量は特に制限されず、適宜選
択すればよい。反応温度は、ゲランリアーゼが作用しえ
る温度で有れば良く、通常20℃〜50℃、好適には30〜45
℃程度とすればよい。
解は一般的な多糖の酵素分解法と同様の方法で行える。
例えば、ゲランの水溶液に該酵素を添加すればよい。水
溶液のゲラン濃度は特に限定されないが、通常0.05〜３
％重量程度、好ましくは0.１〜２％重量程度とすればよ
い。ゲランリアーゼの添加量は特に制限されず、適宜選
択すればよい。反応温度は、ゲランリアーゼが作用しえ
る温度で有れば良く、通常20℃〜50℃、好適には30〜45
℃程度とすればよい。
【００３１】かくして得られるゲラン分解物は、下式：
【００３２】
【化３】 Δ-4,5-GlcA-(1→4)-β-D-Glc-(1→4)-α-L-Rha-(1→3)-β-D-Glc (I)
【００３３】（式中、Glc ; D-グルコース、GlcA ; D-
グルクロン酸、Rha ; L-ラムノースを示す。）で表され
る四糖からなるゲランオリゴ糖である。0.５重量％のゲ
ランの水溶液は、通常20〜25cp程度の粘度を有している
が、本発明のゲランリアーゼを30℃、１時間程度ゲラン
に反応することによって１／10程度の粘度を示すゲラン
分解物にすることできる。また、このゲラン分解物は水
に溶解しやすく、しかも水に溶解しても高粘性を示さな
い。尚、本発明において粘度は、例えばヴィスコメータ
ー（Haake RV11,ドイツ製) を用い、25℃で測定する。
グルクロン酸、Rha ; L-ラムノースを示す。）で表され
る四糖からなるゲランオリゴ糖である。0.５重量％のゲ
ランの水溶液は、通常20〜25cp程度の粘度を有している
が、本発明のゲランリアーゼを30℃、１時間程度ゲラン
に反応することによって１／10程度の粘度を示すゲラン
分解物にすることできる。また、このゲラン分解物は水
に溶解しやすく、しかも水に溶解しても高粘性を示さな
い。尚、本発明において粘度は、例えばヴィスコメータ
ー（Haake RV11,ドイツ製) を用い、25℃で測定する。
【００３４】上記のような物性を有するゲラン分解物
は、水溶液のまま食品、医薬品等の素材として利用でき
るほか、粉末化して用いることもできる。粉末化は、通
常の分離・精製手段に従って行うことが出来る。例え
ば、まず該水溶液を遠心分離または濾過し、未分解のゲ
ラン及び不溶物を除去する。次いで、限外濾過、イオン
交換クロマトグラフィー、電気透析等を行って遊離イオ
ンと低分子画分を分画したりして、オリゴ糖画分を乾燥
すればよい。
は、水溶液のまま食品、医薬品等の素材として利用でき
るほか、粉末化して用いることもできる。粉末化は、通
常の分離・精製手段に従って行うことが出来る。例え
ば、まず該水溶液を遠心分離または濾過し、未分解のゲ
ラン及び不溶物を除去する。次いで、限外濾過、イオン
交換クロマトグラフィー、電気透析等を行って遊離イオ
ンと低分子画分を分画したりして、オリゴ糖画分を乾燥
すればよい。
【００３５】
【発明の効果】本発明によれば、新規なゲランリアーゼ
が提供され、該酵素をゲランに作用させて得られるゲラ
ンオリゴ糖は、ゲランの持つ生理機能を保持し、水に溶
解し易く、しかも水に溶解しても高粘性を示さないの
で、医薬品や食品素材として好適に利用できる。以下に
実施例を挙げ、本発明を詳細に説明する。
が提供され、該酵素をゲランに作用させて得られるゲラ
ンオリゴ糖は、ゲランの持つ生理機能を保持し、水に溶
解し易く、しかも水に溶解しても高粘性を示さないの
で、医薬品や食品素材として好適に利用できる。以下に
実施例を挙げ、本発明を詳細に説明する。
【００３６】
［実施例１］ 本発明のゲランリアーゼの単離・精製 ゲラン分解菌のスクリーニング ゲラン分解微生物のスクリーニングは、京都府宇治市黄
檗の土壌を生理食塩水に懸濁して調製した懸濁液（１０
０μl ）による、0.１％硫酸アンモニウム、0.２％リン
酸二水素カリウム、0.２％リン酸水素二ナトリウム、0.
01％硫酸マグネシウム、0.01％酵母エキス、0.４％ゲラ
ン（和光純薬株式会社）からなる液体培地の28℃での資
化能、ならびに上記培地組成からゲランを除いた滅菌二
倍濃度溶液、及び別に２％濃度でオートクレーブして調
製したゲラン溶液を１：１の割合で混ぜ合わせて調製し
たゲランプレートで生育させてゲラン分解によるゲラン
プレートの液状化とを観察し、これらを指標として行っ
た。
檗の土壌を生理食塩水に懸濁して調製した懸濁液（１０
０μl ）による、0.１％硫酸アンモニウム、0.２％リン
酸二水素カリウム、0.２％リン酸水素二ナトリウム、0.
01％硫酸マグネシウム、0.01％酵母エキス、0.４％ゲラ
ン（和光純薬株式会社）からなる液体培地の28℃での資
化能、ならびに上記培地組成からゲランを除いた滅菌二
倍濃度溶液、及び別に２％濃度でオートクレーブして調
製したゲラン溶液を１：１の割合で混ぜ合わせて調製し
たゲランプレートで生育させてゲラン分解によるゲラン
プレートの液状化とを観察し、これらを指標として行っ
た。
【００３７】 ゲランリアーゼの精製 共生菌をゲラン１％を含む前述した液体培地10Ｌで28
℃、72時間培養した。この液を−20℃で凍結後融解し、
6,500gで10分間遠心分離した。上清画分に対して再度同
様の操作を行って粗酵素画分とした。ついで、この粗酵
素画分を20mMのリン酸バッファーで平衡化したＤＥＡＥ
セルロースカラムクロマトグラフィー（4.７×41cm) に
供した。溶出は０〜0.７Ｍ塩化ナトリウムのリニアグラ
ジェントにより行った。0.３〜0.４Ｍのあたりで溶出し
た活性画分を集め、30％飽和の硫酸アンモニウム溶液と
した。ついで、この酵素画分（420ml)を30％飽和硫酸ア
ンモニウムを含む20mMリン酸バッファーで平衡化したブ
チルトヨパール650Ｍ（2.７×17cm）に供した。溶出は
０〜30％飽和硫酸アンモニウムによるリニアグラジェン
トでおこなった。活性画分は15％飽和硫酸アンモニウム
濃度のあたりであった。この画分を集めアミコンモデル
8200(Amicon Co. 製）により３mlに濃縮した。この濃縮
した酵素液を20mMリン酸バッファーで平衡化したセファ
デックスＧ-150によるゲル濾過に供した。これら各精製
のステップを表１に示す。尚、酵素活性測定は前記の方
法により行った。
℃、72時間培養した。この液を−20℃で凍結後融解し、
6,500gで10分間遠心分離した。上清画分に対して再度同
様の操作を行って粗酵素画分とした。ついで、この粗酵
素画分を20mMのリン酸バッファーで平衡化したＤＥＡＥ
セルロースカラムクロマトグラフィー（4.７×41cm) に
供した。溶出は０〜0.７Ｍ塩化ナトリウムのリニアグラ
ジェントにより行った。0.３〜0.４Ｍのあたりで溶出し
た活性画分を集め、30％飽和の硫酸アンモニウム溶液と
した。ついで、この酵素画分（420ml)を30％飽和硫酸ア
ンモニウムを含む20mMリン酸バッファーで平衡化したブ
チルトヨパール650Ｍ（2.７×17cm）に供した。溶出は
０〜30％飽和硫酸アンモニウムによるリニアグラジェン
トでおこなった。活性画分は15％飽和硫酸アンモニウム
濃度のあたりであった。この画分を集めアミコンモデル
8200(Amicon Co. 製）により３mlに濃縮した。この濃縮
した酵素液を20mMリン酸バッファーで平衡化したセファ
デックスＧ-150によるゲル濾過に供した。これら各精製
のステップを表１に示す。尚、酵素活性測定は前記の方
法により行った。
【００３８】
【表２】
【００３９】［実施例２］ ゲラン分解菌によるゲラン
分解物の経時変化 0.５％のゲランを含む実施例１で示した培地中でのゲラ
ン分解菌によるゲラン分解物の経時変化を薄層クロマト
グラフィーで調べた。レーン１から４の順に培養後０、
20、40、60時間、レーン５は標準品のＬ−ラムノース、
レーン６はＤ−グルコース、レーン７はＤ−グルクロン
酸である。なお、培養液10μｌを供した。結果を図３に
示す。
分解物の経時変化 0.５％のゲランを含む実施例１で示した培地中でのゲラ
ン分解菌によるゲラン分解物の経時変化を薄層クロマト
グラフィーで調べた。レーン１から４の順に培養後０、
20、40、60時間、レーン５は標準品のＬ−ラムノース、
レーン６はＤ−グルコース、レーン７はＤ−グルクロン
酸である。なお、培養液10μｌを供した。結果を図３に
示す。
【００４０】［実施例３］ ゲランリアーゼ処理による
粘度低下とゲラン分解物の経時変化 市販のゲランの0.５％水溶液200ml に、本発明のゲラン
リアーゼ酵素液を加え、45℃で作用させた。粘度は、図
４に示すように経時的に低下した [25℃、ヴィスコメー
ター（Haake RV11, ドイツ製) にて測定；図４におい
て、白抜きの四角（□）はゲランリアーゼを加えない場
合、黒四角（■）はゲランリアーゼを10μg/mlの割合で
添加した場合を示す〕。また、図５は０（レーン４）、
１（レーン５）、２（レーン６）、３（レーン７）、４
（レーン８）、１２（レーン９）、２４（レーン10）時
間反応時のサンプル５μｌを薄層クロマトグラフィーに
供したパターンを示す。レーン１〜３は標準品としての
Ｌ−ラムノース、Ｄ−グルコース、Ｄ−グルクロン酸を
サンプルとしたときのパターンである。この結果より該
酵素は末端より切断していくエキソ型の酵素であるとと
もに、ゲラン分解物に235nm での吸収極大が認められた
ことより、本酵素はリアーゼと判断され、ゲランリアー
ゼであることが判明した。
粘度低下とゲラン分解物の経時変化 市販のゲランの0.５％水溶液200ml に、本発明のゲラン
リアーゼ酵素液を加え、45℃で作用させた。粘度は、図
４に示すように経時的に低下した [25℃、ヴィスコメー
ター（Haake RV11, ドイツ製) にて測定；図４におい
て、白抜きの四角（□）はゲランリアーゼを加えない場
合、黒四角（■）はゲランリアーゼを10μg/mlの割合で
添加した場合を示す〕。また、図５は０（レーン４）、
１（レーン５）、２（レーン６）、３（レーン７）、４
（レーン８）、１２（レーン９）、２４（レーン10）時
間反応時のサンプル５μｌを薄層クロマトグラフィーに
供したパターンを示す。レーン１〜３は標準品としての
Ｌ−ラムノース、Ｄ−グルコース、Ｄ−グルクロン酸を
サンプルとしたときのパターンである。この結果より該
酵素は末端より切断していくエキソ型の酵素であるとと
もに、ゲラン分解物に235nm での吸収極大が認められた
ことより、本酵素はリアーゼと判断され、ゲランリアー
ゼであることが判明した。
【００４１】［実施例４］ ゲラン分解物の構造解析 実施例３で調製した12時間後のゲランリアーゼ処理した
時点のゲラン分解物について構造解析を行った。オリゴ
糖鎖の質量分析はＦＡＢ−ＭＳ（Fast Atom Bombardmen
t Mass Spectrometry) 及びＮＭＲで行った。その結果
から、酵素処理したオリゴ糖には中間体が存在せず、Δ
GlcA-Glc-Rha-Glcの配列を有するオリゴ糖であった。こ
れらの結果からも該酵素は末端から四糖ごとに切断して
いくエキソ型の酵素であることが証明された。
時点のゲラン分解物について構造解析を行った。オリゴ
糖鎖の質量分析はＦＡＢ−ＭＳ（Fast Atom Bombardmen
t Mass Spectrometry) 及びＮＭＲで行った。その結果
から、酵素処理したオリゴ糖には中間体が存在せず、Δ
GlcA-Glc-Rha-Glcの配列を有するオリゴ糖であった。こ
れらの結果からも該酵素は末端から四糖ごとに切断して
いくエキソ型の酵素であることが証明された。
【図１】本発明のゲランリアーゼ活性に対するpH及び温
度の影響を示す。 Ａ：至適ｐＨの範囲 Ｂ：至適温度の範囲 Ｃ：安定温度の範囲及び失活の条件
度の影響を示す。 Ａ：至適ｐＨの範囲 Ｂ：至適温度の範囲 Ｃ：安定温度の範囲及び失活の条件
【図２】本発明のゲランリアーゼのSDS-ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動写真を示す。
ミドゲル電気泳動写真を示す。
【図３】ゲラン分解菌によるゲラン分解物の経時変化を
示す。
示す。
【図４】本発明ゲランリアーゼ処理による粘度低下の経
時変化を示す。
時変化を示す。
【図５】本発明ゲランリアーゼ処理によるゲラン分解物
の経時変化を示す。
の経時変化を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 橋本 渉 京都府長岡京市梅が丘３丁目111 (72)発明者 村田 幸作 京都府京都市山科区北花山中道町84−８
Claims (3)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質を有する新規なゲラ
ンリアーゼ： (1) 作用及び基質特異性 ゲランの末端から四糖単位を切断する。 (2) 至適ｐＨの範囲 ７〜８ (3) 安定温度の範囲（ｐＨ７．５） ４５℃以下 (4) 作用適温の範囲 ２５〜４５℃ (5) 失活の条件（温度安定性） ５０℃，１０分で５０％、７０℃，１０分で９５％以上
の酵素活性が失活する。 (6) 金属イオン、阻害剤の影響 １mMのＣａ2+，Ｍｏ2+，Ｃｕ2+，Ｆｅ2+，Ｃｏ2+，Ｚｎ
2+等の二価のカチオンによって活性が阻害されず、0.1m
M のＨｇ2+で活性が100%阻害される。１mMジチオスレイ
トール、１mM還元型グルタチオン、1mM ２−メルカプト
エタノール、0.1mM Ｎ−エチルマレイミド等のスルフヒ
ドリル試薬に活性が影響されず、1mM ＥＤＴＡで50％の
活性阻害を与える。 (7) 分子量 SDS-PAGEによる分子量 140,000 - 【請求項２】 請求項１記載をゲランリアーゼをゲラン
に作用させることにより得られるゲラン分解物。 - 【請求項３】 下式： 【化１】 Δ-4,5-GlcA-(1→4)-β-D-Glc-(1→4)-α-L-Rha-(1→3)-β-D-Glc (I) （式中、Glc ; D-グルコース、GlcA ; D-グルクロン
酸、Rha ; L-ラムノースを示す。）で表される請求項２
記載のゲラン分解物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8046363A JPH09234065A (ja) | 1996-03-04 | 1996-03-04 | 新規なゲラン分解酵素とオリゴ糖 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8046363A JPH09234065A (ja) | 1996-03-04 | 1996-03-04 | 新規なゲラン分解酵素とオリゴ糖 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09234065A true JPH09234065A (ja) | 1997-09-09 |
Family
ID=12745079
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8046363A Pending JPH09234065A (ja) | 1996-03-04 | 1996-03-04 | 新規なゲラン分解酵素とオリゴ糖 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09234065A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112680435A (zh) * | 2021-01-25 | 2021-04-20 | 中国石油大学(华东) | 一种鞘氨醇胶裂解酶及酶解鞘氨醇胶的制备方法 |
-
1996
- 1996-03-04 JP JP8046363A patent/JPH09234065A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112680435A (zh) * | 2021-01-25 | 2021-04-20 | 中国石油大学(华东) | 一种鞘氨醇胶裂解酶及酶解鞘氨醇胶的制备方法 |
| CN112680435B (zh) * | 2021-01-25 | 2022-03-25 | 中国石油大学(华东) | 一种鞘氨醇胶裂解酶及酶解鞘氨醇胶的制备方法 |
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